Espressione della proteina lettrice di m6A YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule in una coorte clinica cinese

Sommario

Questo studio valuta l'espressione di YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando bioinformatica e qRT-PCR. Mentre le analisi dei database suggeriscono una ridotta espressione e una rilevanza prognostica, la validazione clinica non mostra alcuna differenza significativa. I risultati evidenziano incongruenze, indicando un'accuratezza diagnostica limitata e la necessità di ulteriori conferme prima di un'applicazione clinica.

Abstract

Il cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello mondiale, con biomarcatori disponibili limitati per la diagnosi precoce e la prognosi. La modificazione dell'RNA mediante N6-metiladenosina (m6A) e le relative proteine lettore, come YTHDC2, svolgono ruoli fondamentali nella regolazione genica e nella tumorigenesi. Questo studio mira a valutare il profilo di espressione di YTHDC2 nei tessuti di NSCLC mediante analisi bioinformatiche e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR), ad analizzare la relazione tra YTHDC2 e le caratteristiche clinicopatologiche e ad esplorarne la potenziale rilevanza clinica e biologica per future ricerche. Sono stati analizzati dati di espressione genica e di sopravvivenza provenienti da database per valutare l'accuratezza prognostica. L'espressione di YTHDC2 è stata quantificata in tessuti di NSCLC appartenenti a una coorte clinica cinese e sono state analizzate le caratteristiche clinicopatologiche. Le analisi dei database pubblici hanno mostrato che YTHDC2 è sottoespresso nei tessuti di NSCLC (p < 0,05) ed è associato alla sopravvivenza del paziente, sebbene le prestazioni prognostiche siano scarse (AUC ≈ 0,5). L'analisi qRT-PCR di 19 coppie di tessuti tumorali e tessuti normali adiacenti non ha evidenziato differenze statisticamente significative (p = 0,537) nell'espressione di YTHDC2 tra tessuto tumorale e tessuto adiacente. Nel complesso, le analisi dei database pubblici suggeriscono che YTHDC2 potrebbe essere sottoespresso e avere una potenziale rilevanza prognostica nel NSCLC, ma la validazione clinica indipendente nella nostra coorte non ha confermato una differenza significativa nell'espressione. Questi risultati evidenziano una sostanziale eterogeneità tra dataset su larga scala e coorti del mondo reale, indicando che YTHDC2 difficilmente potrà essere utilizzato come biomarcatore diagnostico o prognostico affidabile autonomo e potrebbe richiedere l'integrazione con ulteriori marcatori molecolari per un'applicabilità clinica.

Introduzione

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), che comprende il carcinoma a cellule squamose e l'adenocarcinoma, è il tipo di cancro al polmone più frequentemente diagnosticato ed è una delle principali cause di mortalità oncologica a livello globale¹. Le statistiche globali sui tumori mostrano che il cancro del polmone è una delle principali cause di decesso per neoplasia². I recenti progressi nella diagnosi, chirurgia, radioterapia e terapia mirata molecolare non hanno migliorato in modo significativo la prognosi del NSCLC, poiché la diagnosi iniziale avviene spesso in fase avanzata e la malattia è frequentemente asintomatica nei primi stadi³. Ciò sottolinea la necessità di nuovi biomarcatori per identificare, stabilire la prognosi e valutare l'efficacia del trattamento nei pazienti con NSCLC.

L'm6A è la prima e la più abbondante modificazione dell'RNA identificata negli eucarioti ed è stata associata alla stabilità dell'RNA, traduzione e trascrizione⁴. Le modificazioni m6A sono dinamiche e reversibili, favorite da metiltransferasi (scrittori), demetilasi (gommatori) e proteine leganti specifiche (lettori)⁵. Tra queste, YTHDC2, una principale proteina lettore m6A, modula la stabilità dell'RNA e il tasso di traduzione⁶. Studi recenti indicano che YTHDC2 è coinvolta nella regolazione di diversi tipi di cancro, sia sopprimendo la crescita cellulare e l'invasione, sia inducendo la morte cellulare⁷. Altri studi hanno evidenziato la rilevanza clinica di ulteriori proteine lettrici m6A, tra cui YTHDF1, YTHDF2 e YTHDC1, nella progressione del cancro polmonare, nella regolazione immunitaria e nella prognosi, sottolineando l'importanza di una valutazione sistematica dei singoli lettori m6A in coorti indipendenti di pazienti^8,9,10. Nel NSCLC, i livelli di YTHDC2 sono significativamente ridotti, condizione associata a stadi tumorali avanzati, metastasi linfonodale e prognosi sfavorevole per i pazienti, suggerendo che potrebbe agire come fattore antitumorale¹¹. Esperimenti in vitro e in vivo rivelano inoltre che un'elevata espressione di YTHDC2 inibisce la proliferazione cellulare e la metastasi nel cancro polmonare⁷.

In questo studio, la regolazione di YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è stata indagata mediante analisi computazionali integrate e validazione sperimentale tramite qRT-PCR. È stata inoltre esaminata la relazione tra l'espressione di YTHDC2 e le caratteristiche clinicopatologiche e la prognosi del paziente. Nonostante le crescenti evidenze provenienti da database pubblici suggeriscano una disregolazione di YTHDC2 nel NSCLC, studi pubblicati hanno riportato risultati discordanti riguardo all'entità e al significato clinico di tale disregolazione, e la validazione indipendente in coorti cliniche ben caratterizzate del mondo reale, in particolare nelle popolazioni asiatiche, rimane limitata. Inoltre, la maggior parte degli studi precedenti si è basata prevalentemente su dataset trascrittomici pubblici o su modelli sperimentali, con pochi studi che integrano i risultati di bioinformatica con una validazione clinica indipendente. Combinando ampie analisi trascrittomiche pubbliche con una validazione indipendente mediante qRT-PCR in una coorte clinica cinese, questo studio ha mirato a valutare la riproducibilità dei risultati precedenti e a colmare il divario traslazionale tra le analisi dei database pubblici e i campioni clinici del mondo reale. Pertanto, lo studio ha avuto l'obiettivo di valutare sistematicamente l'espressione di YTHDC2 utilizzando approcci integrati di bioinformatica e validazione clinica, e di valutarne la potenziale rilevanza biologica e clinica nel NSCLC. Si è ipotizzato che l'espressione di YTHDC2 sia disregolata nel NSCLC e che l'integrazione delle analisi di bioinformatica con una validazione clinica indipendente possa fornire una valutazione più affidabile del suo significato diagnostico e prognostico rispetto a ciascun approccio considerato singolarmente.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan (numero di approvazione HMC1984.24) ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (come rivista nel 2013).

Soggetti dello studio

È stato condotto uno studio su 50 pazienti con cancro del polmone diagnosticati tra il 2017 e il 2024 presso l'Ospedale Centrale di Sanya nella provincia di Hainan, utilizzando le Linee Guida Cliniche dell'Associazione Medica Cinese per la Diagnosi e il Trattamento del Cancro del Polmone (Edizione 2024). La stadiazione CSCO (2024) è stata allineata all'edizione ottava del sistema AJCC per garantire confrontabilità tra studi, come precedentemente validato in coorti cinesi¹², con revisione indipendente da parte di due oncologi al fine di assicurare coerenza. Il processo di selezione dei pazienti, la disponibilità dei tessuti, la valutazione della qualità dell'RNA e l'inclusione finale dei campioni per l'analisi di qRT-PCR sono riassunti in Figura 1.

Dati dello studio

Questo studio ha utilizzato la bioinformatica per analizzare i livelli di espressione di YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e la loro relazione con le caratteristiche clinicopatologiche, fornendo informazioni sui possibili meccanismi coinvolti. Le analisi bioinformatiche sono state eseguite esclusivamente utilizzando dati pubblici di sequenziamento dell'RNA provenienti da The Cancer Genome Atlas (TCGA), inclusi campioni di adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) e tessuti polmonari normali corrispondenti, scaricati tramite il GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Il set di dati scaricato includeva informazioni sull'espressione genica ottenute tramite sequenziamento dell'RNA, insieme alle variabili cliniche disponibili (identificativo del paziente, identificativo del campione, età, sesso, stadio patologico, stato di sopravvivenza e tempo di sopravvivenza globale) per i casi idonei di TCGA-LUAD e TCGA-LUSC. I campioni privi di informazioni sull'espressione genica o sullo stato di sopravvivenza sono stati esclusi dalle analisi successive di sopravvivenza e ROC. Il set di dati utilizzato in questo studio è fornito come File Supplementare 1. Nessun campione clinico raccolto presso il Sanya Central Hospital è stato utilizzato per le analisi bioinformatiche. Le procedure dettagliate relative alle analisi GEPIA, Kaplan–Meier Plotter e survivalROC sono riportate nella sezione Analisi bioinformatica riportata di seguito. L'intero flusso di lavoro bioinformatico, comprensivo di acquisizione dei dati, pre-elaborazione, analisi dell'espressione genica, analisi della sopravvivenza e analisi ROC, è riassunto nella Figura 2.

Criteri di inclusione ed esclusione

I criteri di inclusione ed esclusione dei pazienti sono riportati nella Tabella 1. Un’analisi della potenza statistica effettuata mediante software specializzato ha determinato che almeno 26 casi per gruppo avrebbero garantito una potenza dell’80% nel rilevare un effetto di entità moderata (d = 0,8, α = 0,05, test a due code). Sebbene l’arruolamento iniziale mirasse a includere 50 coppie nel gruppo di cancro polmonare, l’analisi finale di qRT-PCR ha incluso 30 campioni tumorali e 19 campioni di tessuto normale adiacente, dopo aver escluso quelli con qualità inadeguata del tessuto o dell’RNA. Questa riduzione della numerosità campionaria riflette i vincoli clinici reali e sottolinea l’importanza dell’integrità dell’RNA e della disponibilità del tessuto negli studi traslazionali. Con n = 19 per i confronti, l’entità minima dell’effetto rilevabile è d = 1,0 (potenza dell’80%, α = 0,05). Pertanto, l’esperimento aveva potenza sufficiente per rilevare differenze elevate, ma non piccole o moderate, nell’espressione di YTHDC2.

Campioni di tessuto e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

Le diagnosi patologiche sono state determinate in modo doppio cieco da due diversi patologi. La purezza tumorale è stata stimata dai patologi (>70% di cellule maligne) e confermata tramite ESTIMATE (TCGA). I tessuti normali adiacenti sono stati macrodissecati per minimizzare la contaminazione stromale. I tipi istologici di cancro del polmone includevano adenocarcinoma polmonare e carcinoma a cellule squamose, con 26 casi di adenocarcinoma polmonare e 4 casi di carcinoma a cellule squamose. Lo stadio clinico dei 50 pazienti con cancro del polmone è stato stabilito secondo i criteri di stadiazione riportati nelle “Linee guida cliniche dell'Associazione Medica Cinese per il cancro del polmone (Edizione 2024)”. I campioni di NSCLC confermati istopatologicamente (n = 50) rappresentavano distribuzioni cliniche tipiche (vedi Tabella 2). Dei 50 pazienti inizialmente arruolati, 30 campioni di tessuto tumorale e 19 campioni abbinati di tessuto normale adiacente hanno soddisfatto i criteri di qualità dell'RNA. Poiché l'analisi statistica accoppiata richiede campioni abbinati dello stesso paziente, il confronto tra l'espressione nel tumore e nel tessuto normale adiacente è stato effettuato utilizzando le 19 coppie disponibili. Questi campioni clinici sono stati utilizzati esclusivamente per la validazione sperimentale mediante qRT-PCR e sono stati analizzati indipendentemente dai dataset pubblici TCGA utilizzati per l'analisi bioinformatica. I campioni selezionati sono stati processati immediatamente dopo la conferma istopatologica e manipolati in condizioni prive di RNasi prima dell'estrazione dell'RNA. Questo sottogruppo rappresenta i casi in cui è stato possibile ottenere sia una quantità adeguata di tessuto sia un RNA totale di alta qualità (numero di integrità dell'RNA, RIN >7,0). La concentrazione e la purezza dell'RNA totale sono state misurate prima della trascrizione inversa, e solo i campioni con qualità dell'RNA adeguata (RIN >7,0) sono stati inclusi per le analisi successive. Quantità uguali di RNA totale sono state retrotrascritte in DNA complementare (cDNA) seguendo il protocollo del produttore prima della PCR quantitativa. Questo processo ha garantito la validità dei dati sull'espressione genica analizzati. Gli esperimenti di qRT-PCR sono stati eseguiti su un termociclatore per PCR in tempo reale, utilizzando un saggio di PCR quantitativa basato su sonde. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplice replicazione, insieme a controlli senza stampo per garantire la riproducibilità analitica. L'amplificazione PCR è stata effettuata nelle seguenti condizioni di ciclaggio: un passaggio iniziale di attivazione/denaturazione enzimatica a 95°C per 10 minuti, seguito da 40 cicli di denaturazione a 95°C per 15 secondi e di annealing/estensione a 60°C per 60 secondi. I segnali di fluorescenza sono stati acquisiti al termine di ogni ciclo di amplificazione. Tutti i reagenti e i materiali monouso sono stati ottenuti da fornitori commerciali (vedi Tabella dei Materiali). Le sequenze dei primer e delle sonde utilizzate nella qRT-PCR sono riportate nella Tabella 3.

Analisi bioinformatica

Analisi del database GEPIA dell'espressione del gene YTHDC2

Il database GEPIA è stato utilizzato per analizzare l'espressione di YTHDC2 nel NSCLC. Il server web GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) è stato accessibile tramite un browser web. È stato selezionato il modulo Expression DIY, è stato inserito il simbolo genico "YTHDC2", sono stati selezionati i set di dati LUAD e LUSC, sono stati mantenuti i parametri di normalizzazione predefiniti e sono stati generati direttamente tramite l'interfaccia GEPIA i box plot dell'espressione differenziale. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05.

Database del grafico di Kaplan-Meier per l'analisi della sopravvivenza nei pazienti con cancro del polmone

Lo studio ha analizzato la relazione tra l'espressione di YTHDC2 e la prognosi nei pazienti con cancro del polmone utilizzando il database Kaplan-Meier Plotter. È stato selezionato il dataset relativo al cancro del polmone, è stato inserito il simbolo genico "YTHDC2", è stata applicata l'opzione di cutoff migliore selezionata automaticamente e sono state generate le curve di Kaplan-Meier per la sopravvivenza complessiva e la sopravvivenza dopo la progressione, utilizzando le impostazioni di analisi predefinite. I pazienti sono stati automaticamente suddivisi in gruppi ad alta e bassa espressione mediante il cutoff ottimale determinato dalla piattaforma Kaplan-Meier Plotter, e i rapporti di rischio con i corrispondenti intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati utilizzando le impostazioni predefinite della piattaforma.

Eseguire pacchetti R nel software R per la creazione di grafici di curve ROC

I dati di espressione da sequenziamento dell'RNA e i corrispondenti metadati clinici per i casi idonei di TCGA-LUAD e TCGA-LUSC sono stati scaricati dal GDC Data Portal. I set di dati scaricati sono stati uniti in base all'identificatore del paziente e importati in R per le analisi successive. Il pacchetto survivalROC è stato utilizzato per generare curve ROC dipendenti dal tempo ai punti di previsione a 1, 3 e 5 anni, e i corrispondenti valori dell'area sotto la curva (AUC) sono stati calcolati per valutare le prestazioni prognostiche dell'espressione di YTHDC2. Solo i pazienti con dati disponibili di espressione da RNA-seq e informazioni sulla sopravvivenza di TCGA-LUAD e TCGA-LUSC sono stati inclusi nell'analisi survival ROC. La coorte clinica locale non è stata utilizzata per la previsione della sopravvivenza poiché non erano disponibili dati di follow-up a lungo termine.

Espressione tissutale di YTHDC2 mediante qRT-PCR

Per analizzare i livelli di espressione genica, è stata eseguita una qRT-PCR. Volumi uguali di cDNA sono stati aggiunti a ciascuna reazione secondo le condizioni raccomandate dal produttore. L'amplificazione è stata effettuata mediante un saggio di PCR quantitativa basato su sonde, e i dati di fluorescenza sono stati raccolti automaticamente al termine di ogni ciclo di amplificazione. In breve, il processo di estrazione dell'RNA ha comportato diverse fasi, tra cui la preparazione del campione, la deparaffinizzazione, la rimozione del liquido residuo, la digestione con proteinasi K, l'incubazione, la centrifugazione, il trattamento con DNasi, l'aggiunta di DNasi I e la precipitazione con etanolo. Il campione è stato quindi legato a una colonna di purificazione dell'RNA a base di silice e centrifugato a 8.000 × g per 30 s. La colonna è stata quindi lavata con wash buffer 1, wash buffer 2 e wash buffer 2 diluito con etanolo, e asciugata a 13.000 × g per 2 min. L'RNA è stato quindi eluito aggiungendo 70 µL di acqua priva di RNasi al centro della membrana della colonna, seguito da centrifugazione a 13.000 × g per 1 min. Ogni coppia di primer ha mostrato un singolo prodotto di amplificazione, confermato dall'analisi della curva di denaturazione prima del calcolo dell'espressione genica relativa. L'efficienza dei primer (90–110%) è stata validata mediante curve standard prima dell'analisi dei campioni. Le analisi delle curve di denaturazione hanno confermato la presenza di un singolo amplicone e l'assenza di dimeri di primer. L'espressione relativa di YTHDC2 è stata calcolata utilizzando il metodo 2^-ΔCt, in cui i valori di Ct sono stati normalizzati rispetto al gene di riferimento endogeno GAPDH. Poiché i valori di espressione sono stati presentati come livelli di espressione normalizzati anziché come variazioni di fold rispetto a un campione calibratore, i risultati sono riportati come valori di 2^−ΔCt. Il gene GAPDH è stato scelto come gene di controllo perché la sua espressione ha mostrato una variabilità minima (CV < 5%) rispetto alle alternative testate (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), in accordo con i criteri di selezione dei geni di riferimento negli studi sull'm6A.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software statistici, inclusa la creazione di grafici e diagrammi. Per analizzare i dati quantitativi e categorici sull'espressione del gene YTHDC2 in pazienti con NSCLC, è stato utilizzato il software R per le analisi bioinformatiche e la generazione delle curve ROC. Le curve ROC e l'AUC sono state utilizzate per valutare le prestazioni diagnostiche dell'espressione di YTHDC2 nella previsione della sopravvivenza. Per le analisi basate su regressione, sono stati riportati, ove applicabile, le stime dell'effetto (odds ratio) con i corrispondenti intervalli di confidenza al 95%. Il test di Wilcoxon per campioni appaiati è stato utilizzato per confrontare l'espressione di YTHDC2 tra campioni tumorali e tessuti normali adiacenti appaiati, mentre l'analisi di correlazione di Pearson è stata impiegata per valutare l'associazione tra l'espressione di YTHDC2 e le caratteristiche clinicopatologiche. Sono stati riportati i coefficienti di correlazione (r) e i corrispondenti valori p. Poiché i dati di qRT-PCR comprendevano campioni appaiati di tessuto tumorale e tessuto normale adiacente provenienti dagli stessi pazienti e i dati sull'espressione genica non presentavano distribuzione normale, è stato utilizzato il test di Wilcoxon per campioni appaiati per confrontare i livelli di espressione di YTHDC2 tra i tessuti appaiati. Questo test non presuppone la normalità dei dati ed è comunemente usato per dati biologici asimmetrici. Tutti i test statistici erano a due code e un valore di p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le variabili continue sono state valutate per la normalità prima dell'analisi. Le variabili continue sono presentate come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile), a seconda dei casi.

Risultati

Espressione del gene YTHDC2 nei tumori in base al database TCGA

Figura 3 illustra l'associazione tra NSCLC e YTHDC2 esaminando i livelli di espressione di YTHDC2 in diversi tipi di cancro mediante l'uso dello strumento GDC nel database TCGA.

Espressione del gene YTHDC2 nel NSCLC nel database GEPIA

Sono stati ottenuti 483 campioni di tessuto di adenocarcinoma polmonare, 347 campioni di tessuto polmonare normale, 486 campioni di tessuto di carcinoma polmonare a cellule squamose e 338 campioni di tessuto polmonare normale mediante ulteriore screening dei livelli di espressione di YTHDC2 nell'adenocarcinoma polmonare (LUAD) e nel carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) all'interno del database GEPIA. Mediante analisi statistiche, è stato riscontrato che sia i tessuti di adenocarcinoma polmonare sia quelli di carcinoma polmonare a cellule squamose presentano livelli di espressione di YTHDC2 notevolmente inferiori rispetto ai tessuti polmonari normali (p < 0,05), come illustrato nella Figura 4.

Analisi GEPIA dell'espressione di YTHDC2 attraverso le fasi patologiche

È stato utilizzato il database GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) per generare un grafico per stadi al fine di valutare l'espressione differenziale di YTHDC2 attraverso le fasi del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Come mostrato nella Figura 5, non sono state osservate differenze statisticamente significative nell'espressione di YTHDC2 tra le diverse fasi patologiche del NSCLC (p = 0.644).

Analisi di Kaplan-Meier di YTHDC2 e sopravvivenza nel cancro del polmone

È stato utilizzato il database Kaplan-Meier Plotter per eseguire un'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier del gene YTHDC2. Secondo i risultati, i pazienti con elevata espressione di YTHDC2 hanno mostrato una sopravvivenza complessiva (OS) significativamente maggiore rispetto a quelli con bassa espressione (p < 0,05). Come mostrato in Figura 6A (OS), i pazienti con cancro del polmone che esprimevano livelli più elevati di YTHDC2 avevano una prognosi migliore, e questa differenza era statisticamente significativa (p < 0,05). Secondo la Figura 6B (PPS), il gruppo con alta espressione di YTHDC2 ha avuto una prognosi migliore rispetto al gruppo con bassa espressione nel dataset relativo alla sopravvivenza dopo la progressione (Post-Progression Survival, PPS); la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05).

Modello predittivo del tasso di sopravvivenza di YTHDC2

L'analisi ROC dipendente dal tempo basata sui dati di espressione da RNA-seq e di sopravvivenza del TCGA ha rivelato una capacità predittiva limitata dell'espressione di YTHDC2 per la sopravvivenza nel NSCLC, con valori di AUC pari a 0,50 (IC 95%: 0,38-0,62), 0,51 (IC 95%: 0,39-0,63), 0,52 (IC 95%: 0,40-0,64) e 0,52 (IC 95%: 0,39–0,65) rispettivamente a 1, 3, 5 e 8 anni (Figura 7). Tutti gli intervalli di confidenza dell'AUC includevano il valore 0,5, indicando una prestazione equivalente al caso casuale. Questi risultati indicano che l'espressione di YTHDC2 da sola non possiede potere discriminatorio nella previsione della sopravvivenza e non dovrebbe essere considerata un biomarcatore prognostico autonomo. L'integrazione con variabili clinicopatologiche o firme multigeniche potrebbe migliorare le prestazioni predittive.

Espressione di YTHDC2 nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali mediante qRT-PCR

L'espressione genica di YTHDC2 è stata analizzata sia nei tessuti maligni che nei tessuti normali adiacenti provenienti da pazienti con NSCLC mediante qRT-PCR. L'espressione normalizzata di YTHDC2 (2^−ΔCt) era di 3,24 ± 2,34 nei tessuti maligni e di 3,60 ± 1,70 nei tessuti normali vicini. Non è stata osservata una differenza significativa nell'espressione di YTHDC2 tra 19 coppie di tessuti tumorali NSCLC e i corrispondenti tessuti normali adiacenti (p = 0,537), come mostrato in Figura 8. Mentre l'analisi bioinformatica di grandi dataset ha suggerito un significativo downregolamento di YTHDC2 nell'NSCLC, la qRT-PCR eseguita sul nostro cohort non ha evidenziato differenze significative, evidenziando possibili discrepanze dovute alle dimensioni del gruppo, all'eterogeneità del campione e alla variabilità tecnica. Inoltre, il basso valore di AUC (0,5) indica che YTHDC2 da solo non possiede un'accuratezza diagnostica o prognostica.

Espressione di YTHDC2 e caratteristiche clinico-patologiche nel NSCLC

Lo studio ha coinvolto 50 individui con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). C'erano 32 pazienti di sesso maschile (64,00%) e 18 pazienti di sesso femminile (36,00%), con un'età media di 63,10 ± 9,85 anni. L'età variava tra i 37 e i 86 anni. Tra i pazienti, 25 avevano fumato in passato, mentre 25 non avevano mai fumato. Tra i tipi istopatologici, si sono riscontrati nove casi di carcinoma a cellule squamose (18,00%) e quarantuno casi di adenocarcinoma polmonare (82,0%). Ventidue pazienti erano in stadio III–IV (44,00%) e 28 in stadio I–II (56,00%) secondo la classificazione clinica del CSCO. Ventiquattro pazienti non presentavano metastasi linfonodali, mentre ventisei individui (54,00%) le presentavano. Nove pazienti avevano tumori scarsamente differenziati (18,00%), mentre 41 pazienti avevano tumori ben differenziati a moderatamente differenziati (82,00%).

È stata esaminata l'associazione tra le caratteristiche patologiche cliniche e i livelli di espressione di YTHDC2 nei tessuti di NSCLC. Sono state osservate differenze nell'espressione di YTHDC2 tra i sottotipi patologici e in base allo stato di metastasi linfonodale (p < 0,05). Tuttavia, poiché erano disponibili soltanto quattro campioni di carcinoma a cellule squamose, il confronto tra i sottotipi patologici deve essere interpretato con cautela e considerato esplorativo. Come mostrato nelle Figure 9A,B, l'espressione di YTHDC2 era significativamente più elevata nel carcinoma a cellule squamose rispetto al carcinoma adenocarcinoma polmonare ed era significativamente più alta nei tessuti di NSCLC con metastasi linfonodale rispetto a quelli senza metastasi linfonodale (5,70 ± 2,53 vs. 3,83 ± 0,91, p = 0,027). Tuttavia, poiché sono stati inclusi soltanto quattro campioni di carcinoma a cellule squamose, il confronto tra i sottotipi patologici deve essere interpretato con cautela e considerato esplorativo, in attesa di una validazione in coorti più ampie. Un'espressione più elevata di YTHDC2 nei pazienti con metastasi linfonodale potrebbe indicare un'associazione potenziale tra YTHDC2 e lo stato di metastasi linfonodale; tuttavia, questo risultato deve essere interpretato con cautela a causa della limitata dimensione del campione e richiede una validazione in coorti indipendenti più ampie. D'altro canto, età, storia del fumo, stadio clinico CSCO e grado di differenziazione istologica non hanno influenzato significativamente l'espressione di YTHDC2 (p > 0,05). Ulteriori informazioni sono riportate nella Tabella 4, nella Tabella 5 e nella Figura 9.

Regressione logistica binaria della metastasi linfonodale nel NSCLC

In linea con l'analisi di correlazione, l'espressione di YTHDC2 era significativamente associata alla metastasi linfonodale (p < 0,05). Utilizzando la metastasi linfonodale come variabile dipendente e età, sesso, storia del fumo, stadio del tumore, tipo istopatologico, livello di espressione di YTHDC2 e grado di differenziazione come variabili indipendenti, è stata condotta un'analisi di regressione logistica binaria nei pazienti con NSCLC. I risultati hanno mostrato che l'espressione di YTHDC2 nei pazienti con NSCLC era significativamente associata alla metastasi linfonodale (p = 0,027, OR = 2,286, IC 95%: 1,101–4,748).

Nei dati clinici generali, lo stadio del tumore nei pazienti con NSCLC era statisticamente correlato in modo significativo alla metastasi linfonodale (p = 0,007, OR = 27, IC 95%: 2,504-291,186). Tuttavia, età, sesso, storia del fumo, tipo istopatologico e grado di differenziazione non erano significativamente correlati alla metastasi linfonodale nel NSCLC (p > 0,05), come mostrato nella Tabella 6.

Disponibilità dei dati: I set di dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili nel repository Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). Il repository include i metadati clinici del TCGA, le annotazioni dei campioni, le specifiche per il recupero dei dati e il manifesto dell'analisi utilizzati per le analisi bioinformatiche. Altri dati sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole.

Figura 1: Diagramma di flusso della selezione dei pazienti e dell'inclusione dei tessuti per l'analisi di qRT-PCR. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Flusso di lavoro delle analisi bioinformatiche effettuate per valutare l'espressione e il significato prognostico di YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Espressione del gene YTHDC2 nel database TCGA. I livelli di espressione del gene YTHDC2 nel carcinoma polmonare a cellule adenocinomatose (LUAD) e nel carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) sono stati confrontati con quelli nei tessuti polmonari normali, utilizzando dati di sequenziamento dell'RNA ottenuti da The Cancer Genome Atlas (TCGA) tramite il portale GDC Data Portal e analizzati mediante la piattaforma web GEPIA. I dati sono stati analizzati attraverso la piattaforma GEPIA. La significatività statistica è stata determinata con un valore di p < 0,05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Espressione differenziale di YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in base all'analisi del database GEPIA. I livelli di espressione di YTHDC2 nel carcinoma polmonare a cellule adenocinomatose (LUAD) e nel carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) sono stati confrontati con quelli nei tessuti polmonari normali utilizzando dati provenienti dal Progetto del Genoma del Cancro (TCGA) e dal Progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) tramite la piattaforma GEPIA. I grafici a scatola (box plot) rappresentano i livelli di espressione genica normalizzati. La significatività statistica è stata determinata con un valore p < 0,05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Analisi dell'espressione di YTHDC2 in base allo stadio nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) mediante il database GEPIA. I livelli di espressione di YTHDC2 sono stati analizzati attraverso diversi stadi patologici (I–IV) del NSCLC utilizzando la piattaforma GEPIA. Il grafico per stadio illustra la variazione dell'espressione genica nei diversi stadi tumorali. Non sono state osservate differenze statisticamente significative nell'espressione di YTHDC2 tra gli stadi (p = 0.644). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier dell'espressione di YTHDC2 in pazienti con NSCLC (Kaplan-Meier Plotter). (A) Sopravvivenza complessiva (OS): curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier che confrontano la sopravvivenza complessiva in pazienti con NSCLC suddivisi in gruppi ad alta (n = 140) e bassa (n = 364) espressione di YTHDC2, utilizzando l'impostazione ottimale della soglia (“auto-select best cutoff”) fornita dallo strumento Kaplan-Meier Plotter. Il test del log-rank è stato utilizzato per valutare la significatività statistica (p = 0,0093); hazard ratio (HR) = 0,61; intervallo di confidenza al 95% (CI): 0,42–0,89. Un'espressione elevata di YTHDC2 è associata a una sopravvivenza complessiva significativamente migliore. (B) Sopravvivenza dopo la progressione (PPS): curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier che confrontano la sopravvivenza dopo la progressione in pazienti con NSCLC suddivisi in gruppi ad alta (n = 181) e bassa (n = 296) espressione di YTHDC2, utilizzando l'impostazione ottimale della soglia (“auto-select best cutoff”) fornita dallo strumento Kaplan-Meier Plotter. Il test del log-rank è stato utilizzato per il confronto statistico (p = 4,2 × 10⁻⁵); hazard ratio (HR) = 0,63 (intervallo di confidenza al 95%: 0,51–0,79). Un'elevata espressione di YTHDC2 è associata a una sopravvivenza dopo la progressione significativamente più lunga. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Modello predittivo del tasso di sopravvivenza di YTHDC2. Curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che valutano l'accuratezza predittiva di YTHDC2 per la sopravvivenza complessiva nei pazienti TCGA-LUAD e TCGA-LUSC con dati disponibili di espressione da RNA-seq e dati di sopravvivenza ai punti temporali di 1, 3, 5 e 8 anni. Valori AUC: 1 anno = 0.50, 3 anni = 0.51, 5 anni = 0.52 e 8 anni = 0.52. La linea diagonale tratteggiata indica una probabilità casuale (AUC = 0,5). L'analisi è stata eseguita utilizzando il pacchetto survival ROC in R. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Espressione di YTHDC2 in tessuti tumorali di NSCLC e tessuti normali adiacenti accoppiati misurata mediante qRT-PCR. L'espressione relativa di YTHDC2 è stata calcolata utilizzando il metodo 2^–ΔCt e normalizzata rispetto a GAPDH. I valori di espressione rappresentano livelli di espressione normalizzati piuttosto che variazioni di espressione rispetto a un campione calibratore. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando le 19 coppie accoppiate di tessuti tumorali e tessuti normali adiacenti disponibili per il confronto accoppiato. I dati sono presentati come singole osservazioni accoppiate con media ± deviazione standard. Le differenze tra i campioni accoppiati sono state analizzate mediante il test dei ranghi con segno di Wilcoxon (p = 0.537). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Associazione tra l'espressione di YTHDC2 e le caratteristiche clinicopatologiche nei pazienti con NSCLC. (A) Espressione di YTHDC2 nei diversi tipi patologici, con espressione più elevata nel carcinoma a cellule squamose rispetto all'adenocarcinoma (p < 0,05). (B) Espressione di YTHDC2 in base allo stato di metastasi linfonodale, con espressione più elevata nei pazienti con metastasi linfonodale rispetto a quelli senza metastasi (p < 0,05). (C) Espressione di YTHDC2 nei diversi gradi di differenziazione istologica, senza differenza statisticamente significativa (p = 0,181). (D) Espressione di YTHDC2 nei diversi stadi clinici CSCO, senza differenza statisticamente significativa (p = 0,08). I livelli di espressione di YTHDC2 sono stati misurati mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e calcolati utilizzando il metodo 2^–ΔCt, normalizzati rispetto a GAPDH. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. *p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

N. S.	Criteri di inclusione	Criteri di esclusione
1	Età ≥18 anni, indipendentemente dal sesso.	Diagnosi di altre neoplasie maligne.
2	Diagnosi confermata di NSCLC secondo le Linee Guida Cliniche per il Cancro Polmonare dell'Associazione Medica Cinese (Edizione 2024).	Presenza di malattie respiratorie o cardiovascolari croniche (ad esempio, BPCO, cardiopatia polmonare, insufficienza cardiaca).
3	Disponibilità di dati clinici completi, inclusi dettagli demografici, marcatori tumorali sierici e immagini TC toracica con contrasto, con consenso informato firmato.	Disfunzione grave di organi, inclusa insufficienza renale (eGFR <30 ml/min/1.73m²) o cirrosi epatica.
4	Pazienti senza trattamenti precedenti e privi di terapie dirette contro il tumore.	Popolazioni speciali, inclusi donne in gravidanza o in allattamento (confermato con test β-hCG, se applicabile).
5	Disponibilità di campioni tumorali e/o di tessuto adiacente adeguati, idonei all'analisi molecolare.	Qualità scadente del campione, inclusa quantità insufficiente di tessuto o RNA degradato (confermato dalla revisione del patologo).

Tabella 1: Criteri di inclusione ed esclusione per i pazienti con NSCLC nello studio

Tipo di tessuto	Campioni accoppiati analizzati (n)	Espressione relativa (Media ± DS)
Tessuto tumorale	19	3.24 ± 2.34
Tessuto normale adiacente abbinato	19	3.60 ± 1.70

Tabella 2: Espressione di YTHDC2 in tessuti tumorali di NSCLC e tessuti normali adiacenti appaiati. L'espressione relativa di YTHDC2 è stata misurata utilizzando il metodo 2^–ΔCt e normalizzata rispetto a GAPDH. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (DS). Il confronto statistico delle 19 coppie appaiate di tessuti tumorali e normali adiacenti è stato effettuato mediante il test dei ranghi con segno di Wilcoxon (p = 0.537).

Gene bersaglio	Primer/sonda	Sequenza (5′→3′)
YTHDC2	Forward (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Reverse (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Probe (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Forward (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Reverse (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Probe (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabella 3: Sequenze di primer e sonde utilizzate per la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). L'espressione di YTHDC2 è stata quantificata utilizzando la chimica TaqMan, con GAPDH come controllo interno.

Caratteristica	Categoria	n	%
Tipo patologico	Adenocarcinoma	41	82
	Carcinoma a cellule squamose	9	18
Stadiazione CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Metastasi linfonodale	No	24	48
	Sì	26	52
Grado di differenziazione	Bassa differenziazione	9	18
	Differenziazione moderata–alta	41	82
Età	≥60 anni	36	72
	<60 anni	14	28
Sesso	Maschio	32	64
	Femmina	18	36
Anamnesi del fumo	Sì	25	50
	No	25	50

Tabella 4: Caratteristiche cliniche e patologiche dei pazienti con NSCLC. I dati sono presentati come numeri (n) e percentuali (%) in base alla popolazione totale dello studio (n = 50).

Caratteristica clinicopatologica	Gruppo	n	Espressione di YTHDC2 (Media ± DS)	p-valore
Tipo di tessuto	Tumorale	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Normale adiacente	19	3.60 ± 1.70
Tipo patologico	Adenocarcinoma	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Carcinoma a cellule squamose	4	7.50 ± 3.41
Stadiazione CSCO	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Metastasi linfonodale	No	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Sì	11	5.70 ± 2.53
Differenziazione istologica	Moderatamente–ben differenziato	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Poco differenziato	5	5.18 ± 1.60
Età	≥60 anni	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 anni	10	4.16 ± 1.12
Anamnesi tabagica	Sì	12	4.62 ± 2.40	0.845
	No	18	4.38 ± 1.40

Tabella 5: Associazione tra l'espressione di YTHDC2 e le caratteristiche clinicopatologiche nei pazienti con NSCLC. L'espressione di YTHDC2 è stata misurata mediante qRT-PCR e calcolata utilizzando il metodo 2^–ΔCt, normalizzata rispetto a GAPDH. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (DS). Le dimensioni dei gruppi (n) rappresentano il numero di campioni validi analizzati. I confronti statistici tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. *p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Variabile	β	Wald	Valore p	OR	IC 95%
Età (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Sesso (Femmina vs Maschio)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Anamnesi tabagica (Sì vs No)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Stadio del tumore (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Differenziazione (Scarso vs Moderato–buono)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Espressione di YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tabella 6: Analisi di regressione logistica multivariata dei fattori associati alla metastasi linfonodale nei pazienti con NSCLC. È stata eseguita una regressione logistica binaria utilizzando la metastasi linfonodale come variabile dipendente. Sono riportati i rapporti di probabilità (OR) con intervalli di confidenza al 95% (CI). Categorie di riferimento: età (<60 anni), sesso (maschile), storia del fumo (no), stadio del tumore (I–II) e differenziazione (moderata–buona). *p < 0,05 indica significatività statistica.

Discussione

YTHDC2, la proteina legante l'N6-metiladenosina (m6A) più grande della famiglia YTH, è unica per la sua attività di elicasa RNA dipendente dall'ATP, distinguendola come un regolatore chiave del metabolismo dell'RNA¹³. A differenza di altri membri della famiglia YTH, YTHDC2 è presente sia nel nucleo che nel citoplasma, dove regola la traduzione dell'mRNA e la stabilità dell'RNA¹⁴. Studi sperimentali precedenti hanno dimostrato che YTHDC2 sopprime la progressione del carcinoma polmonare adenoide (LUAD) inibendo l'espressione degli mRNA di ADIRF e MRPL12, potenziando l'apoptosi e riducendo la proliferazione cellulare e le metastasi^15,16. Studi sperimentali precedenti hanno inoltre suggerito che YTHDC2 stabilizza lncRNA come ZNRD1-AS1 per sopprimere la proliferazione del LUAD e modula mRNA modificati da m6A come CYLD e SLC7A11, inibendo la via di segnalazione NF-κB, l'assorbimento di cisteina e i processi antiossidanti, mentre promuove la ferroptosi e l'attività antitumorale^17,18.

In questo studio, l'espressione e il significato clinico della proteina lettore m6A YTHDC2 nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) sono stati indagati mediante un approccio integrato che combina analisi bioinformatiche e validazione sperimentale. L'analisi bioinformatica dei database TCGA e GEPIA ha rivelato un significativo downregolazione di YTHDC2 nei tessuti tumorali del NSCLC rispetto ai tessuti polmonari normali, e un'espressione più elevata di YTHDC2 è risultata associata a una migliore sopravvivenza complessiva e post-progressione, suggerendo un potenziale ruolo prognostico. Curiosamente, i nostri esperimenti di qRT-PCR, condotti sui 19 campioni accoppiati disponibili di tessuto tumorale e tessuto normale adiacente nel presente coorte, non hanno evidenziato una differenza statisticamente significativa nell'espressione di YTHDC2 tra tessuto tumorale e tessuto normale adiacente. Questa discordanza evidenzia le difficoltà nel tradurre i risultati ottenuti da grandi dataset pubblici a coorti cliniche indipendenti e sottolinea la necessità di un'interpretazione cauta delle analisi in silico. Comprendere le ragioni alla base di queste differenze è fondamentale per valutare con precisione l'utilità di YTHDC2 come biomarcatore e bersaglio terapeutico nel NSCLC. L'attenzione del presente studio su YTHDC2 è coerente con la sua unica attività di elicasi tra i lettori della famiglia YTH¹⁹, ma analisi pan-cancro recenti rivelano ruoli dipendenti dal contesto per altri membri della famiglia. Ad esempio, Li et al. hanno dimostrato che YTHDF1/2 sono upregolati nella maggior parte dei tumori (ad esempio, LIHC, LUAD) e correlano con una prognosi sfavorevole, mentre YTHDC1/2 mostrano effetti soppressori del tumore in KIRC e BRCA²⁰. In particolare, il ruolo oncogenico di YTHDF1 mediato dall'attivazione della via Wnt/β-catenina contrasta con la funzione anti-metastatica di YTHDC2 nel NSCLC, evidenziando la necessità di strategie biomarcatorialie specifiche per sottotipo. Rispetto ai marcatori prognostici consolidati (ad esempio, PD-L1 per la risposta all'immunoterapia), il potere predittivo di YTHDC2 potrebbe essere potenziato combinandolo con altri regolatori m6A (ad esempio, METTL3, YTHDF1) o geni dei checkpoint immunitari, come suggerito da analisi di infiltrazione immunitaria pan-cancro. Sebbene studi precedenti suggeriscano che YTHDC2 regola la via NF-κB/CYLD¹², il presente studio è stato limitato dall'assenza di validazione a livello proteico mediante immunohistochimica o Western blotting, nonché da una mancanza di validazione funzionale. Studi futuri dovrebbero combinare saggi di silenziamento genico con m6A-sequenziamento per mappare i bersagli diretti.

Analisi precedenti hanno rivelato che l'espressione di YTHDC2 è ridotta nei tessuti di NSCLC e si correla con una prognosi sfavorevole²¹. L'analisi di Kaplan-Meier ha indicato una sopravvivenza più lunga nei pazienti con espressione più elevata di YTHDC2, ma l'analisi della curva ROC ha suggerito un potere predittivo limitato per la sopravvivenza²⁰. L'analisi ROC per la sopravvivenza nel presente studio è stata effettuata utilizzando i dati di espressione da RNA-seq e di sopravvivenza del TCGA, poiché informazioni di follow-up a lungo termine non erano disponibili per la nostra coorte clinica locale. È importante notare che i bassi valori di AUC (~0,5) osservati in questo studio suggeriscono che l'espressione di YTHDC2 non possiede sensibilità e specificità sufficienti per un utilizzo clinico come biomarcatore autonomo²². Tale limitazione è in linea con le evidenze emergenti secondo cui i biomarcatori basati su un singolo gene sono spesso insufficienti per malattie complesse come il NSCLC, in cui sono sempre più necessari approcci multi-omici e pannelli di biomarcatori integrati per ottenere prestazioni predittive clinicamente significative. Un'espressione più elevata di YTHDC2 è stata osservata nei tessuti di NSCLC con metastasi linfonodali, suggerendo una possibile associazione tra l'espressione di YTHDC2 e lo stato di metastasi linfonodale nella presente coorte. Sebbene siano state osservate anche differenze nell'espressione di YTHDC2 tra adenocarcinoma e carcinoma a cellule squamose, questo confronto va interpretato con cautela, poiché solo 4 campioni di carcinoma a cellule squamose erano disponibili per l'analisi, limitando notevolmente la potenza statistica di questo confronto tra sottogruppi. Nessuna differenza significativa è stata osservata per stadio clinico, grado di differenziazione, età o storia del fumo, probabilmente a causa di limitazioni dello studio, tra cui la dimensione del campione e il disegno monocentrico. Sebbene l'associazione osservata tra ridotta espressione di YTHDC2 e metastasi linfonodale suggerisca un possibile ruolo biologico nel NSCLC, il suo scarso potere discriminatorio (AUC ~0,5) e la rilevazione non costante mediante qRT-PCR escludono il suo utilizzo come marcatore clinico autonomo. Studi futuri dovrebbero valutare se la combinazione di YTHDC2 con altre proteine correlate all'm6A possa migliorare il valore predittivo.

Le analisi bioinformatiche hanno suggerito che l'espressione di YTHDC2 è ridotta nel NSCLC e potrebbe essere associata a migliori esiti nei pazienti. Sebbene una ridotta espressione sia stata osservata anche nei pazienti con metastasi linfonodali e siano state notate differenze tra i sottotipi patologici, questi risultati nei sottogruppi devono essere interpretati con cautela a causa della limitata dimensione del campione, in particolare per il carcinoma a cellule squamose. Tuttavia, questi risultati non sono stati confermati dall'analisi di qRT-PCR nel nostro coorte clinico, il che potrebbe riflettere differenze nelle caratteristiche della coorte, nella dimensione del campione, nella variabilità tecnica, nella regolazione post-trascrizionale o nella mancanza di validazione a livello proteico. Ricerche future dovrebbero esplorare i meccanismi di YTHDC2 in altri sottotipi del cancro del polmone mediante esperimenti in vitro e in vivo. Tali studi potrebbero chiarire ulteriormente il ruolo biologico di YTHDC2 e determinare se possa avere un'utilità clinica nell'ambito di un approccio multimarcatore piuttosto che come biomarcatore singolo.

Limitazioni

Questo studio presenta diversi limiti. Si tratta di uno studio retrospettivo monocentrico con un numero relativamente ridotto di campioni, il che potrebbe limitare la generalizzabilità. L'uso di tessuti in paraffina (FFPE) potrebbe aver compromesso la qualità dell'RNA e la sensibilità della qRT-PCR. Inoltre, è stata valutata soltanto l'espressione dell'mRNA di YTHDC2, mentre non è stata effettuata una validazione a livello proteico mediante immunoeistochimica (IHC) o Western blotting. Poiché l'espressione dell'mRNA non sempre si correla con l'abbondanza proteica a causa della regolazione post-trascrizionale, questo potrebbe in parte spiegare la discrepanza tra i nostri risultati clinici e le analisi effettuate su database pubblici. Lo studio inoltre non dispone di dati di follow-up a lungo termine e le analisi per sottogruppi (ad esempio, carcinoma a cellule squamose) avevano una potenza statistica insufficiente.

Prospettive future

Ricerche future dovrebbero esplorare i meccanismi di YTHDC2 nel NSCLC attraverso esperimenti in vitro e in vivo per comprendere meglio il suo ruolo funzionale. Sono necessari studi multicentrici con campioni di dimensioni maggiori per validare i risultati e migliorare la generalizzabilità. Inoltre, l'integrazione di YTHDC2 con altri regolatori legati all'm6A e con variabili clinicopatologiche potrebbe potenziarne l'utilità predittiva e prognostica. Studi ulteriori che incorporino approcci multi-omici, inclusi trascrittomica, proteomica ed epigenomica, sono necessari per chiarire i meccanismi biologici alla base della disregolazione di YTHDC2. Dovrebbe inoltre essere effettuata una validazione a livello proteico mediante immunoeistochimica (IHC) o Western blotting per valutare la concordanza tra espressione dell'mRNA e delle proteine. La standardizzazione delle procedure di lavorazione dei campioni e delle tecniche di validazione sarà inoltre fondamentale per garantire riproducibilità e applicabilità clinica.

Conclusione

Questo studio fornisce una valutazione esplorativa dell'espressione di YTHDC2 nel NSCLC integrando analisi bioinformatiche con una validazione clinica mediante qRT-PCR. Tuttavia, la sua rilevazione inconsistente tra le diverse piattaforme analitiche e l'accuratezza diagnostica limitata (AUC ≈0,5) attualmente ne escludono l'uso come biomarcatore clinico autonomo. Sebbene le analisi bioinformatiche suggeriscano un potenziale significato prognostico, una validazione clinica indipendente non ne conferma l'affidabilità per applicazioni diagnostiche o prognostiche. Questi risultati devono essere interpretati con cautela e richiedono una validazione in coorti più ampie e multicentriche, insieme a studi a livello proteico e funzionali, prima che possa essere presa in considerazione qualsiasi applicazione clinica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Primer e sonde personalizzati	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina	Sintesi su misura	Sequenze di primer e sonde elencate nella Tabella 6
DNasi I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	DNasi I (HiPure FFPE RNA Kit)	Rimozione della contaminazione da DNA genomico
Algoritmo ESTIMATE	Yoshihara et al.	Pacchetto R (Versione 1.0.13)	Stima della purezza tumorale
Kit per l'estrazione di RNA da FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Estrazione di RNA da tessuto FFPE
Portale dei dati GDC	Istituto Nazionale del Cancro (NCI), NIH, Stati Uniti	https://portal.gdc.cancer.gov	Download dei set di dati TCGA
Server web GEPIA	Università di Pechino, Cina	http://gepia.cancer-pku.cn	Analisi dell'espressione genica
Tracciato di Kaplan–Meier	Università Semmelweis, Ungheria	https://kmplot.com	Analisi della sopravvivenza
Micracentrifuga	Eppendorf AG, Amburgo, Germania	5424 R	Procedure di purificazione dell'RNA
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	NanoDrop 2000/2000c	Quantificazione dell'RNA
Mix master per qPCR basato su sonde	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplificazione PCR quantitativa
Software statistico R	Fondazione R per il Calcolo Statistico, Vienna, Austria	Versione 4.4.1	Analisi statistiche e analisi ROC
Sistema PCR in tempo reale	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Stati Uniti	CFX Opus 96	PCR quantitativa in tempo reale
Kit di trascrizione inversa	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Sintesi di cDNA
Colonna di purificazione dell'RNA	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	HiPure Mini Column I	Colonna di purificazione dell'RNA con membrana di silice
Acqua priva di RNasi	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	Acqua priva di RNasi	Eluizione dell'RNA
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, Stati Uniti	IBM SPSS Statistics Versione 27.0	Analisi statistiche
Pacchetto survivalROC	CRAN (Fondazione R per il Calcolo Statistico)	Versione 1.0.3.1	Analisi ROC dipendente dal tempo
Database TCGA	Istituto Nazionale del Cancro (NCI), NIH, Stati Uniti	https://portal.gdc.cancer.gov	Database pubblico di genomica del cancro
Buffer di lavaggio RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	Buffer RW1	Buffer di lavaggio per la purificazione dell'RNA
Buffer di lavaggio RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina	Buffer RW2	Buffer di lavaggio per la purificazione dell'RNA