Cardioidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo come modello per valutare la somministrazione di oligonucleotidi

Sommario

Questo protocollo consente la generazione di cardioidi auto-organizzati a base di cardiomioci da cellule staminali pluripotenti indotte umane per la valutazione microscopica dell'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescente.

Abstract

Le terapie a base di oligonucleotidi rappresentano una classe di farmaci in rapida evoluzione con un potenziale significativo nel trattamento delle malattie cardiovascolari; Tuttavia, raggiungere una consegna efficiente al tessuto cardiaco rimane una sfida critica e irrisolta. Un ostacolo chiave è la limitata disponibilità di modelli in vitro umani robusti e fisiologicamente rilevanti, in grado di supportare la valutazione quantitativa dell'assorbimento cellulare degli oligonucleotidi e della distribuzione intracellulare. Viene presentato un protocollo dettagliato e passo dopo passo per generare cardioidi 3D auto-organizzati a partire da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e applicarli come piattaforma per valutare l'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescente. Il protocollo guida gli utenti attraverso la differenziazione cardiaca diretta nella coltura a sospensione modulando temporalmente la segnalazione Wnt/β-catenina, consentendo la specificazione sequenziale degli iPSC attraverso gli stadi progenitori del mesoderma, del mesoderma cardiaco e dei cardiomiociti. In queste condizioni, le cellule si auto-assemblano spontaneamente in strutture tridimensionali contenenti cavità che esprimono marcatori cardiomiociti canonici. I cardioidi risultanti forniscono una piattaforma scalabile e sperimentalmente trattabile per la valutazione basata sull'imaging dell'efficienza dell'assorbimento degli oligonucleotidi, supportando lo sviluppo e l'ottimizzazione di strategie di somministrazione per applicazioni cardiache.

Introduzione

Le terapie a base di oligonucleotidi, principalmente oligonucleotidi antisenso (ASO) e piccoli RNA interferenti (siRNA), stanno rapidamente emergendo come un approccio trasformativo e altamente specifico per il trattamento di un'ampia gamma di malattie, incluse condizioni sia ereditarie che ^{acquisite 1,2,3}. Queste modalità consentono la modulazione diretta dell'espressione genica a livello di mRNA tramite il legame specifico della sequenza ai trascrizioni target, consentendo il silenziamento genico o la correzione dello splicing di geni associati a malattie che spesso sono inaccessibili alle terapie convenzionali a piccole^{molecole 4,5}. In quanto tale, le terapie geniche basate su oligonucleotidi offrono una piattaforma versatile per mirare a diversi meccanismi patogeni in molteplici aree di malattia, inclusi i disturbi^{cardiovascolari 6}. Ad oggi, diversi farmaci a base di oligonucleotide, inclusi ASO, siRNA e agenti splice-switching, sono stati approvati per l'uso^{clinico 7}. Nonostante questi progressi, la loro efficacia terapeutica sia in contesto preclinico che clinico rimane limitata da una consegna intracellulare^{inefficiente 8}. Le stime attuali indicano che meno dell'1% degli oligonucleotidi internalizzati esce dai compartimenti endosomici per raggiungere il citosolo e coinvolgere il loro RNA bersaglio, limitando così l'attività^{funzionale 9,10}. Questa limitazione è particolarmente evidente nei tessuti cardiaci, dove l'assorbimento e il traffico intracellulare sono poco compresi.

Storicamente, la valutazione preclinica delle terapie cardiovascolari si è basata fortemente su modelli animali, che rimangono indispensabili per valutare farmacocinetica, biodistribuzione, efficacia e sicurezza in vivo. Tuttavia, importanti differenze interspecie nella fisiologia cardiaca, nella regolazione genica e nelle risposte cellulari spesso limitano la loro capacità di prevedere con precisione l'efficacia terapeutica e la tossicità negli esseri umani. Queste limitazioni hanno guidato lo sviluppo di modelli in vitro basati sull'uomo con maggiore rilevanza fisiologica. Tra questi, la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) ha rivoluzionato la modellazione delle malattie cardiovascolari fornendo una fonte praticamente illimitata di cellule che possono essere differenziate in linee cardiovascolari. I cardiomiociti derivati da iPSC umani (iPSC-CM) riproducono molte delle proprietà molecolari, strutturali e funzionali del miocardio umano e sono diventati una piattaforma ampiamente adottata per indagare i meccanismi delle malattie, le risposte farmacologiche e le nuove modalità^{terapeutiche 11}. Tuttavia, le colture bidimensionali convenzionali di iPSC-CM umane presentano importanti limitazioni. La maggior parte dei protocolli di differenziazione genera cardiomioci che assomigliano a cellule fetali piuttosto che adulte, mostrando proprietà strutturali, elettrofisiologiche, metaboliche e contrattili^{immature 12}.

Inoltre, le colture monostrato mancano dell'architettura tissutale tridimensionale (3D), delle interazioni multicellulari e della composizione della matrice extracellulare che influenzano la funzione dei cardiomiociti in vivo. Per affrontare queste sfide, sono stati sviluppati modelli cardiaci 3D sempre più^{sofisticati 13}. Tra questi, i tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT), generati dall'inserimento degli iPSC-CM in impalcature di biomateriali e dall'applicazione di stimoli meccanici ed elettrici, promuovono la maturazione strutturale e funzionale riproducendo più fedelmente l'ambiente biomeccanico del miocardio^{nativo 13}. Sebbene gli EHT forniscano piattaforme altamente rilevanti dal punto di vista fisiologico per la modellazione delle malattie e i test sui farmaci, la loro generazione richiede tipicamente competenze specializzate in bioingegneria e attrezzature dedicate. All'estremo opposto, le fette di tessuto cardiaco ex vivo preservano fedelmente l'architettura del tessuto nativo e la composizione cellulare, ma dipendono dall'accesso al tessuto cardiaco primario, hanno una vitalità limitata in coltura e non sono facilmente scalabili.

Più recentemente, gli organoidi cardiaci sono emersi come sistemi modello 3D accessibili che ripropongono aspetti chiave dell'organizzazione e della funzione del tessuto^{cardiaco 14}. I cardioidi sono organoidi cardiaci autoassemblanti composti prevalentemente da cardiomiociti che subiscono specificazione intrinseca, pattern spaziale e morfogenesi per formare strutture simili a camere contenenti^{cavità 15,16}. I metodi per formare i cardioidi si basano tipicamente su un'attivazione iniziale della segnalazione Wnt per indurre la specificazione del mesoderma, seguita da un'inibizione successiva per promuovere l'impegno della linea cardiaca. I cardioidi possono essere generati sia in colture statiche che in colture di sospensione agitate, che supportano una produzione scalabile e migliorano l'auto-organizzazione^tissutale 15,16,17,18,19. Organoidi cardiaci più complessi e multi-lineage che incorporano cellule endoteliali, epicardiche o altri aumentano ulteriormente la rilevanza fisiologica ma richiedono protocolli di differenziazione più elaborati, periodi di coltura più lunghi e un'ottimizzazione^{estesa 13,14}.

Viene presentato un protocollo semplice, riproducibile ed efficiente per generare cardioidi auto-organizzanti a base di cardiomiociti da iPSC umani e applicarli per valutare l'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescenza. Il protocollo dovrebbe rivelarsi prezioso per i ricercatori che vogliono ottimizzare la chimica degli oligonucleotidi e le strategie di somministrazione per applicazioni cardiovascolari. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Protocollo

1. Cultura e preparazione degli iPSC per la differenziazione

ATTENZIONE: Esegui tutta la gestione aperta di cellule e mezzi in un armadietto di biosicurezza certificato di Classe II. Indossa un camice da laboratorio e guanti. Decontamina le superfici di lavoro e i rifiuti liquidi con un disinfettante appropriato.

1. Mantenere gli iPSC.
   1. Rivestire le piastre di coltura con una matrice basale-membrana appropriata secondo le istruzioni del produttore.
   2. Nutrire gli iPSC con un mezzo cellulare pluripotente definito e privo di alimentazione e sostituire il substrato ogni 24 ore.
   3. Mantenere le colture al di sotto della sovraconfluenza e delle cellule del passaggio quando raggiungono il 70–80% di confluenza.
      NOTA: Assicurarsi che gli iPSC mantengano una morfologia di alta qualità e indifferenziata e siano confermati come privi di micoplasmi prima di iniziare la differenziazione.
2. Passaggio pre-differenziazione.
   1. Scongelare gli iPSC ed espandere le cellule per almeno due passi prima di iniziare la differenziazione cardiaca.
   2. Cellule del passaggio che utilizzano un metodo di dissociazione senza enzimi, PBS-EDTA, compatibile con il mantenimento dell'iPSC.
      PUNTO DI PAUSA: Mantenere le iPSC in coltura fino a raggiungere il 70–80% di confluenza e mantenere la morfologia tipica senza segni di differenziazione spontanea.

2. Preparazione di aggregati iPSC in piastre di micropozzi

1. Dissocia gli iPSC a una sospensione a singola cellula.
   1. Aspira il mezzo e lava le cellule una volta con 1 mL di 1× PBS.
   2. Aggiungere la soluzione di distacco cellulare (Accutasi) a 500 μL per pozzo di una piastra a 6 pozzi e incubare a 37 °C per 5–7 minuti.
   3. Aggiungi 1,5 mL di mezzo per pozzo e risospezioni delicatamente per ottenere una sospensione a cella singola.
   4. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il soprandanante e risospendere la pellet cellulare in un mezzo iPSC senza alimentazione integrato con inibitore ROCK (ultimi 10 μM).
      NOTA: Regolare il tempo di incubazione della dissociazione per ogni linea iPSC controllando il distacco a 5 minuti e estendendo in brevi incrementi se necessario.
2. Contare le celle e preparare la densità di placcatura.
   1. Contare le celle vitali utilizzando un metodo standard di conteggio delle cellule.
   2. Preparare una sospensione a singola cella a 0,9 × 10⁶ celle/mL per ogni pozzo di una piastra di aggregazione micropozzo da 800 μm (formato 24 pozzi, ~300 micropozzi/pozzo).
      NOTA: Ottimizzare il numero di celle per pozzo, poiché la dimensione aggregata o l'efficienza di differenziazione variano tra le linee iPSC.
3. Primer la piastra del micropozzo e rimuovi le bolle.
   1. Aggiungere 500 μL di mezzo iPSC senza alimentatore contenente inibitore ROCK (10 μM) finale in ciascun pozzo.
   2. Centrifuga la piastra del micropozzo a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzi.
      FONDAMENTALE: Rimuovere completamente tutte le bolle per consentire una deposizione cellulare uniforme sul fondo di ogni micropozzo e favorire la formazione efficiente degli aggregati.
4. Semina gli iPSC in micropozzi.
   1. Aggiungere 1,0 mL della sospensione a singola preparata (0,9 × 10⁶ cellule/mL) a ciascun pozzo, corrispondendo a 0,9 × 10⁶ celle per pozzo.
   2. Sospezioni delicatamente all'interno del pozzo 3–5 volte usando un P1000 ed evita di introdurre bolle d'aria.
   3. Centrifuga la piastra a 200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per portare le celle nei micropozzi.
   4. Verifica al microscopio che le cellule si siano depositate nei micropozzi prima di posizionare la piastra a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
      CRITICO: Maneggia la piastra con attenzione dopo la centrifugazione. Non agitare o scuotere la placca, poiché questo potrebbe far sollevare le cellule fuori dai micropozzi.

3. Espansione degli aggregati iPSC nei micropozzi

1. Aspirare con cura e sostituire il mezzo senza disturbare o spostare gli aggregati.
   1. Inclinare la piastra e aspirare lentamente circa 1,0 mL di mezzo da ciascun pozzo utilizzando una pipetta P1000, assicurandosi che gli aggregati rimangano posizionati nei micropozzi.
   2. Aspirare lentamente i restanti ~500 μL di mezzo usando una pipetta P1000.
   3. Aggiungi 1,5 mL di mezzo iPSC senza alimentatore in ciascun pozzo erogandolo lentamente lungo il lato del pozzo usando una pipetta sierologica.
   4. Incubare a 37 °C, 5% di CO₂ e ripetere il cambio di mezzo quotidianamente.
      CRITICO: Distribuire il materiale sulla parete del pozzo ed evitare il flusso diretto sugli aggregati.

4. Differenziazione cardiaca degli aggregati iPSC (Giorno 0 al Giorno 12)

1. Induzione del mesoderma (Giorno 0).
   1. Rimuovere il mezzo utilizzando il metodo di aspirazione delicata descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
   2. Aggiungere 1,5 mL per pozzo di mezzo basale integrato con il 2% di B27 meno insulina e l'attivatore della via Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentrazione finale: 11 μM).
      NOTA: Prepara una soluzione stock da 10 mM di CHIR99021, un inibitore a piccole molecole della glicogenosintasi chinasi-3 (GSK-3). Per ottenere una concentrazione finale di 11 μM, si aggiungono 1,65 μL della soluzione stock a 1,5 mL di mezzo.
2. Cambio di mezzo dopo l'induzione (Giorno 1).
   1. Dopo 24 ore di aggiunta di CHIR99021, aspirare delicatamente il substrato da ciascun pozzo.
   2. Aggiungi 1,5 mL per pozzo di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 meno insulina, poi incuba per 48 ore.
      CRITICO: Rispetta rigorosamente la tempistica dei passaggi di modulazione Wnt, poiché le deviazioni possono compromettere l'efficienza della differenziazione.
      NOTA: Si prevede una certa morte cellulare dopo l'esposizione all'attivatore della via Wnt/β-catenina. Se si osserva una perdita aggregata diffusa, si considera di ridurre la concentrazione degli attivatori in futuri esperimenti.
3. Ritiro cardiaco tramite inibizione WNT (Giorno 3).
   1. Preparare il mezzo condizionato trasferendo 760 μL di mezzo esausto da ciascun pozzo a un tubo conico sterile da 50 mL.
   2. Per ogni pozzo, aggiungere 760 μL di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 meno insulina al tubo contenente il mezzo condizionato in pool, e mescolare delicatamente.
   3. Aggiungere l'inibitore della via Wnt, IWP4, al mezzo misto fino a una concentrazione finale di 5 μM e invertire delicatamente il tubo più volte per mescolare.
   4. Aspira con cura il substrato rimanente da ogni pozzo, poi aggiungi 1,5 mL per pozzo di mezzo condizionato integrato con IWP4.
   5. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
      NOTA: Prepara una soluzione stock da 1 mM dell'inibitore della via Wnt IWP4. Per ottenere una concentrazione finale di 5 μM, si aggiungono 7,6 μL della soluzione stock per ogni 1,52 mL di mezzo totale (760 μL di mezzo condizionato + 760 μL di mezzo basale fresco) per ogni pozzo.
4. Variazione del mezzo nei micropozzi (Giorno 5).
   1. Sostituire il mezzo utilizzando l'approccio di aspirazione dolce descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
   2. Aggiungere 1,5 mL di mezzo basale integrato con il 2% di B27 meno insulina in ciascun pozzo, poi incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
5. Trasferire aggregati dai micropozzi alle piastre a 6 pozzi (Giorno 7).
   1. Aspirare con cura il mezzo di ciascun pozzo utilizzando il metodo di aspirazione delicata descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
   2. Aggiungere 1,0 mL di mezzo basale integrato con il 2% di B27 con insulina in ciascun pozzetto della piastra del micropozzo. Utilizzando una pipetta P1000, si pipeta delicatamente il mezzo su e giù cinque volte mentre si muove la punta della pipetta in movimento circolare sulla superficie del pozzo per slogare gli aggregati nei micropozzi e trasferirli in sospensione.
   3. Trasferire la sospensione aggregata in un singolo pozzo di una piastra di coltura a 6 pozzi non trattata.
   4. Risciacquo ogni pozzetto della piastra micropozzo con 1,0 mL aggiuntivo di mezzo fresco due o tre volte per recuperare eventuali aggregati rimanenti, trasferendo ogni risciacquo nello stesso pozzo della piastra a 6 pozzi.
   5. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 72 ore.
      NOTA: La presenza di cellule morte e detriti cellulari dopo il trasferimento degli aggregati è attesa. La maggior parte dei detriti verrà rimossa durante il successivo cambio di mezzo.
6. Cambiamento medio durante la coltura della sospensione (giorno 10).
   1. Agita delicatamente la piastra per staccare eventuali aggregati attaccati in modo debolle.
   2. Inclinare la piastra per permettere agli aggregati di depositarsi sul fondo del pozzo per gravità.
   3. Aspirare con cura il mezzo esausto senza disturbare o aspirare gli aggregati.
   4. Aggiungere 2,0 mL di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 con insulina in ciascun pozzo e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48–72 ore.
      NOTA: Il pestaggio spontaneo si osserva tipicamente a partire dal giorno 10 circa.
      PUNTO DI PAUSA: I CARDIOIDI DI BATTITURA POSSONO ESSERE MANTENUTI IN COLTURA IN SOSPENSIONE PER UNA MATURAZIONE PROLUNGATA SOSTITUENDO IL MEZZO OGNI 2–3 GIORNI.

5. Caratterizzazione microscopica dei cardioidi

NOTA: Questo metodo fornisce un flusso di lavoro per la caratterizzazione istologica dei cardioidi tramite criosezioni. Le sezioni risultanti possono essere utilizzate per una varietà di analisi istologiche, tra cui la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) per valutare l'architettura complessiva dei tessuti e l'etichettatura dell'immunofluorescenza per l'identità dei cardiomiociti.

1. Fissazione e criosezionamento.
   1. Fissare i cardioidi al 4% di paraformaldeide durante la notte a 4 °C.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e probabilmente un cancerogeno; Maneggiarla in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata. Raccogliere tutti i rifiuti contenenti paraformaldeide (fissativi e lavaggi) in un contenitore chiaramente etichettato per aldeide/rifiuti chimici pericolosi e smaltirli secondo le procedure istituzionali relative ai rifiuti pericolosi.
      SICUREZZA: Esegui tutta la fissazione e la gestione del paraformaldeide in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
   2. Lava tre volte con PBS e crioproteggi i cardioidi fissi al 30% (w/v) in PBS durante la notte a 4 °C.
   3. Inserire i cardioidi nella gelatina, congelare e tagliare criosezioni spesse 10 μm su vetrine microscopiche. Conserva le sezioni a −20 °C fino all'uso.
2. Immunomarcatura.
   1. Scongela le sezioni per 15 minuti a temperatura ambiente.
   2. Lava le sezioni in PBS a 37 °C per 10 minuti, due volte.
   3. Cerchia l'area di interesse su ogni diapositiva con una penna idrofobica per creare un pozzo che trattenga le soluzioni di blocco e anticorpi.
   4. Reidratare le sezioni per 2–3 minuti in un buffer di permeabilizzazione (PB; PBS contenente 0,1% Tween-20) in un barattolo di Coplin.
   5. Rimuovi i vetrini dal PB, scolla la soluzione in eccesso e metti i vetrini in una camera umida.
      CRITICO: Da questo momento in poi, è fondamentale non lasciare che le sezioni si asciughino.
   6. Bloccare le sezioni con 200–300 μL di PB contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) per 90 minuti a temperatura ambiente in una camera umida.
   7. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare le sezioni durante la notte a 4 °C con 100 μL di anticorpo primario (anti-cMYBP-C; 1:50) diluito in soluzione bloccante (PB contenente FBS all'1%).
   8. Lavare i vetrini tre volte con PB e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con un anticorpo secondario anti-topo fluorescente verde (1:200), falloidina fluorescente rosso profondo (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
   9. Lava tre volte con PB e monta con un mezzo antifade.
      ATTENZIONE: Raccogli tutte le soluzioni contenenti coloranti fluorescenti (anticorpi secondari, falloidina e soluzioni di colorazione DAPI e i relativi lavaggi) in un contenitore e smaltile come rifiuti chimici secondo le linee guida istituzionali.
3. Acquisizione di immagini.
   1. Acquisire immagini confocali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di un rilevatore a array per immagini a superrisoluzione utilizzando un obiettivo a immersione in olio 10××/1,40.
   2. Eccitare il fluorofero rosso lontano, il fluoroforo verde e la colorazione nucleare usando linee laser a 639 nm, 488 nm e 405 nm rispettivamente con trasmissione laser del 4,0%, 4,0% e 1,0%.
   3. Acquisire singole sezioni ottiche con dimensione pixel di 0,0353 × 0,0353^{μm 2}, scansione unidirezionale, velocità di scansione 6, zoom 1,7, media linea 1 e tempo di permanenza dei pixel di 0,935 μs per pixel.
   4. Applicare l'elaborazione delle immagini a superrisoluzione con rilevatore di array utilizzando il filtraggio automatico di Wiener.

6. Saggio di assorbimento degli oligonucleotidi fluorescenti

1. Prepara una soluzione standard dell'oligonucleotide marcato con fluorescente coniugata con acido palmitico per aumentare la lipofilia.
   1. Ricostituire l'oligonucleotide liofilizzato marcato con fluorescenza in acqua priva di nucleasi a una concentrazione finale di 1 mM. Vortice brevemente e centrifuga a 3.000 × g per 30 secondi per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo.
   2. Preparare aliquote monouso della soluzione stock da 1 mM e conservarle a −20 °C protette dalla luce.
   3. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 1 μL dello stock da 1 mM a 1 mL di mezzo di coltura cardioide per ottenere una concentrazione finale di oligonucleotidi di 1 μM. Mescolare con una delicata agitazione della placca.
2. Incubare i cardioidi con l'oligonucleotide marcato con fluorescenza (concentrazione finale di 1 μM) in un mezzo siero a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Lavare i cardioidi tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere gli oligonucleotidi extracellulari.
4. Fissare i cardioidi con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente, lavare tre volte con PBS e continuare con l'etichettatura fluorescente prima dell'immagini.
5. Incubare cardioidi fissi intatti durante la notte a 4 °C, protetti dalla luce, in PBS contenente 5 μg/mL di agglutinina germinale del grano (WGA) coniugata con un fluoroforo verde e 1 μg/mL DAPI. Lava tre volte in PBS e monta con un mezzo antifade.
   ATTENZIONE: Raccogliere tutti i mezzi e i lavaggi contenenti oligonucleotidi e coloranti fluorescenti, inclusi il mezzo di incubazione con oligonucleotidi marcati dal passo 6.2 e la soluzione di colorazione WGA/DAPI, in un contenitore separato e smaltirli come rifiuti chimici/biohazardi secondo le linee guida istituzionali.
6. Acquisire immagini confocali dell'assorbimento e della distribuzione degli oligonucleotidi.
   1. Acquisire immagini confocali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di un rilevatore a array per immagini a superrisoluzione e un obiettivo di immersione in acqua del 40×. Acquisire immagini come stack z a 8 sezioni con una dimensione z-step di 2 μm, coprendo una profondità totale di 16 μm.
   2. Eccitare la colorazione nucleare, il marcatore di membrana e l'oligonucleotide marcato fluorescente di rosso lontano usando linee laser da 405 nm, 488 nm e 639 nm rispettivamente con trasmissione laser dello 0,9%, 0,2% e 3,0%.
   3. Acquisire immagini con dimensione voxel di 0,0449 × 0,0449 × 2^{μm 3}, scansione bidirezionale, velocità di scansione 5, media linea 1 e tempo di permanenza del pixel di 1,51 μs per pixel. Applica Airyscan/elaborazione immagini super-risoluzione usando il filtro automatico di Wiener.
   4. Mantieni tutte le impostazioni di acquisizione (potenza laser, guadagno del rivelatore, passo z e dimensione del voxel) costanti su tutte le posizioni z e su tutti i campioni per consentire un confronto valido del segnale oligonucleotidico tra le condizioni.

Risultati

La Figura 1 riassume il flusso di lavoro di differenziazione e illustra i cambiamenti morfologici caratteristici attesi in ogni fase del protocollo, dall'aggregazione iPSC alla formazione di cardioidi auto-organizzanti. L'aggregazione di micropozzi basata su sospensione fornisce un approccio semplice e standardizzato per la generazione parallela di un gran numero di cardioidi controllati per dimensioni. La differenziazione di successo si caratterizza dalla generazione di aggregati di dimensioni uniformi, seguita dallo sviluppo di cavità interne e dall'inizio di battiti spontanei, tipicamente a partire dal giorno 10 in poi. Insieme, queste caratteristiche morfologiche forniscono punti di controllo pratici per il controllo qualità per valutare l'efficienza e la riproducibilità della generazione dei cardioidi.

L'architettura cardioide e l'organizzazione dei tessuti possono essere valutate tramite analisi istologica delle criosezioni. Come mostrato nella Figura 2, la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) di cardioidi differenziati con successo rivela tessuti tridimensionali ben organizzati contenenti una o più cavità interne circondate da strati cellulari compatti, coerenti con un'organizzazione a camera. I cardioidi riusciti tipicamente non presentano regioni necrotiche e una frammentazione strutturale minima. Al contrario, differenziazioni subottimali producono frequentemente strutture irregolari o collassate prive di cavità riconoscibili, indicativo di una compromessa auto-organizzazione tissutale.

La differenziazione cardiomiocitaria può essere ulteriormente valutata tramite colorazione immunofluorescente delle criosezioni. Come illustrato nella Figura 3A–B, i cardioidi riusciti mostrano una diffusa espressione del marcatore sarcomerico cMYBP-C, organizzato in striazioni periodiche altamente ordinate caratteristiche dei sarcomeri. Queste strutture striate sono ampiamente distribuite in tutto il tessuto e spesso sono allineate lungo l'asse longitudinale dei cardiomiociti, riflettendo un'efficiente differenziazione cardiaca. Al contrario, i cardioidi subottimali mostrano colorazioni sarcomerici debole, a chiazze o regionalmente limitate, frequentemente confinate alle regioni periferiche, con aree estese prive di segnale rilevabile, indicando una differenziazione cardiomiocitaria inefficiente.

L'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescenza può essere valutato sia tramite imaging a cellule vive sia tramite microscopia confocale di cardioidi fissi. Come mostrato nella Figura 4, l'assorbimento riuscito è caratterizzato da fluorescenza intracellulare associata agli oligonucleotidi facilmente rilevabile, distribuita come punti discreti, compatibili con la localizzazione endosomica. La WGA delinea le membrane cellulari e la DAPI controcolora i nuclei, consentendo la conferma della localizzazione intracellulare degli oligonucleotidi. Oltre a fornire una visualizzazione qualitativa dell'assorbimento degli oligonucleotidi, gli stack di immagini acquisiti possono essere utilizzati per analisi quantitative, inclusi l'intensità di fluorescenza per punctum, il numero di punti per cellula e la percentuale di cellule positive agli oligonucleotidi. Come mostrato nella Figura 5A–C, l'imaging a Z-stack consente ulteriormente di valutare la distribuzione degli oligonucleotidi in tutto il tessuto tridimensionale, con la fluorescenza rilevata su più sezioni ottiche che si estendono dalla superficie all'interno del cardioide, indicando una penetrazione efficace del tessuto.

Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di cardioidi umani derivati da iPSC. Le cellule staminali pluripotenti indotte nell'uomo (iPSC) vengono aggregate in micropozzi (Day−2) e sottoposte a differenziazione cardiaca diretta tramite modulazione temporale della segnalazione Wnt. L'induzione del mesoderma viene avviata al giorno 0 con trattamento con l'attivatore della via Wnt CHIR99021 in un mezzo basale integrato con B27 meno insulina, seguita dalla rimozione dell'attivatore al giorno 1. La specificazione cardiaca viene indotta al terzo giorno con il trattamento con l'inibitore della via Wnt IWP4, che viene rimosso al giorno 5. Al giorno 7, gli aggregati vengono trasferiti su piastre a 6 pozzi e mantenuti in un mezzo basale integrato con insulina contenente B27. Al giorno 14, i cardioidi auto-organizzanti sono stati stabiliti e adatti per applicazioni a valle, inclusi saggi di assorbimento degli oligonucleotidi. Questa immagine è stata creata dagli autori utilizzando Biorender, e la licenza di copyright richiesta è allegata. Le immagini rappresentative del campo chiaro acquisite nei momenti indicati illustrano la progressione morfologica attesa dagli aggregati iPSC di dimensioni uniformi ai cardioidi cavitati e auto-organizzanti. Barra della scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione istologica dei cardioidi umani derivati da iPSC. Criosezioni rappresentative colorate con ematossilina ed eosina (H&E) dei cardioidi del giorno 14 mostrano cavità interne circondate da strati cellulari compatti, compatibili con l'organizzazione del tessuto a forma di camera. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio di imaging. La quantificazione degli esiti di differenziazione ha mostrato che il 94,0 ± il 2,6% dei cardioidi mostrava battito spontaneo e il 60,3 ± il 20,6% presentava una o più cavità interne visibili. I dati sono presentati come media ± SD da tre differenziazioni indipendenti, con circa 115 cardioidi analizzati per ogni differenziazione. Barra della scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione immunofluorescenza della differenziazione cardiomiocitaria. Criosezioni rappresentative dei cardioidi del giorno 14. (A) Colorazione DAPI che mostra la distribuzione dei nuclei cellulari. (B) Immagine di immunofluorescenza che mostra nuclei marcati con DAPI (blu) e sarcomeri marcati con un anticorpo contro la proteina C che lega la miosina cardiaca (cMYBP-C, verde), dimostrando strutture sarcomeriche organizzate nei cardiomiociti differenziati. Le immagini sono state acquisite tramite microscopia a fluorescenza confocale a scansione laser utilizzando un obiettivo asciutto 10×/0,30 (a sinistra) e un obiettivo a immersione in olio a 63×/1,40 (a destra). Barre di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Imaging dell'assorbimento degli oligonucleotidi da parte dei cardioidi. Immagini confocali che mostrano la localizzazione intracellulare degli oligonucleotidi antisense marcati con fluorescenza (ASO, gialli) nei cardioidi del giorno 14. Le membrane cellulari sono marcate con agglutinina fluorescente del germe di grano (WGA, magenta), e i nuclei sono colorati con DAPI (blu). La fluorescenza associata all'ASO viene rilevata come punti intracellulari discreti (frecce). I pannelli inferiori mostrano cardioidi di controllo negativi che non sono stati incubati con ASO fluorescenti. Le immagini nei pannelli di destra corrispondono a viste ad ingrandimento maggiore delle regioni in scatola nei pannelli sinistri. Immagini rappresentative sono state acquisite tramite microscopia confocale a scansione laser con immagini a superrisoluzione con rilevatore di array utilizzando un obiettivo di immersione in acqua del 40×. Barre di scala = 10 μm (sinistra) e 5 μm (destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Valutazione della penetrazione degli oligonucleotidi in tutti i cardioidi. (A) Schema che illustra l'acquisizione di sezioni ottiche a profondità crescenti all'interno del cardioide. Questa immagine è stata creata dagli autori utilizzando Biorender, e la licenza di copyright richiesta è allegata. (B) Immagini confocali rappresentative che mostrano la distribuzione degli ASO marcati fluorescenti nelle posizioni z di 0 μm, 6 μm e 10 μm rispetto alla superficie tissutale. Le impostazioni di imaging sono state mantenute costanti su tutte le posizioni z. Barra di scala = 10 μm. (C) La quantificazione della percentuale di cellule contenenti almeno un segnale puntito associato all'ASO a ciascuna profondità di imaging ha mostrato un'assorbimento comparabile di oligonucleotidi in tutto il tessuto, con 83,1 ± 2,5%, 84,9 ± 4,5% e 84,0 ± 4,5% di cellule ASO-positive rispettivamente a 0 μm, 6 μm e 10 μm. I dati sono presentati come media ± SD da tre cardioidi, con tre sezioni ottiche analizzate per ogni cardioide e un totale di 1.305 cellule quantificate. Immagini rappresentative sono state acquisite tramite microscopia confocale a scansione laser con immagini a superrisoluzione con rilevatore di array utilizzando un obiettivo di immersione in acqua del 40×. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Sequenza in time-lapse. Un video acquisito a 40 fotogrammi al secondo dimostra attività contrattile spontanea nei cardioidi. L'imaging veniva eseguito utilizzando un microscopio a campo ampio equipaggiato con una telecamera sCMOS. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Le terapie a base di oligonucleotidi sono emerse come una potente classe di modalità di targeting genico, supportate da decenni di progressi nella chimica degli oligonucleotidi che hanno migliorato la specificità del bersaglio, la stabilità metabolica e la tollerabilità^{immunogenica 7,8}. Nonostante il numero crescente di terapie a RNA clinicamente approvate, la loro applicazione più ampia rimane limitata da una consegna intracellulare^{inefficiente 7,8}. A causa della loro dimensione, carica e idrofilità, gli oligonucleotidi non possono diffondere passivamente attraverso la membrana plasmatica e vengono internalizzati tramite vie^{endocitiche 9,10}. Dopo l'assorbimento, la stragrande maggioranza (~99%) degli oligonucleotidi internalizzati rimane sequestrata nei compartimenti endosomici ^9,10. Il traffico endosomico procede attraverso un processo di maturazione dagli endosomi precoci a quelli tardi e infine dai lisosomi; tuttavia, i compartimenti precisi da cui gli oligonucleotidi escono verso il citosolo rimangono incompletamente compresi e possono coinvolgere più popolazioni endosomiche⁹. Questo rilascio citosolico limitato rappresenta una barriera critica limitante e sottolinea la necessità di sistemi sperimentali fisiologicamente rilevanti che permettano la valutazione quantitativa dell'assorbimento di oligonucleotidi, del traffico intracellulare e dell'escape^{endosomico 20}.

Il protocollo descritto qui è stato sviluppato per rispondere a questa esigenza combinando cardioidi umani derivati da iPSC con letture basate sull'imaging dell'assorbimento di oligonucleotidi. La robustezza di questo sistema si basa su diversi passaggi critici che influenzano direttamente la riproducibilità e gli esiti sperimentali. Innanzitutto, la qualità delle colture iPSC iniziali è un fattore chiave per una differenziazione cardiaca di successo. Gli autori raccomandano un'analisi periodica dei cariotipi per garantire la stabilità genomica a lungo termine e la valutazione di routine della morfologia, integrità e dinamica della crescita della colonia. Le colture di alta qualità sono caratterizzate da colonie compatte e ben definite con bordi lisci, differenziazione spontanea minima e proliferazione costante. Le colture che mostrano bordi irregolari della colonia, morfologia cellulare eterogenea o aree di differenziazione dovrebbero essere scartate e sostituite da stock congelati a basso passaggio prima di iniziare la differenziazione.

Un secondo passo critico è la formazione controllata di aggregati iPSC utilizzando piastre micropozzo, che favorisce la generazione di strutture tridimensionali uniformi e definite per dimensione, essenziali per la differenziazione^{cardiaca riproducibile 21}. L'aggregazione basata su micropozzi genera corpi embrioidi con diametri definiti (ottimale 200–230 μm), standardizzando così le interazioni cellula-cellula e l'esposizione ai gradienti di morfogeno durante la modulazione temporale della segnalazione Wnt. Secondo la nostra esperienza, questa dimensione viene costantemente raggiunta seminando circa 3.000 celle per ogni singolo micropozzo (Passo 2.2), una condizione che è stata ottimizzata empiricamente e validata su più linee iPSC umane, incluse linee commerciali disponibili e linee riprogrammate internamente. Tuttavia, poiché i tassi di proliferazione degli iPSC possono variare, la densità ottimale di semina potrebbe richiedere aggiustamenti per mantenere la dimensione desiderata dell'aggregato. Il mancato controllo di questi parametri può portare a strutture eterogenee, ridotta vitalità e compromesso dell'efficienza di differenziazione.

L'analisi istologica, come mostrato nella Figura 2, fornisce una valutazione comoda del controllo della qualità della formazione dei cardioidi. In particolare, l'assenza di cavità interne o la presenza di strutture collassate o frammentate può indicare una formazione di aggregato subottimale o un controllo temporale inadeguato della segnalazione Wnt durante le fasi di differenziazione (Fasi 4.1–4.3). In alcune differenziazioni non riuscite, emergono popolazioni cellulari non contrattili all'interno o intorno ai cardioidi. Queste cellule appaiono tipicamente giallastre alla microscopia a campo chiaro e tendono ad attaccarsi a piastre di coltura a basso attacco, mentre i cardioidi ricchi di cardiomiociti sono generalmente grigi, rimangono strutture compatte tridimensionali e non si attaccano facilmente. Se una parte sostanziale degli aggregati presenta questo fenotipo aderente e non contrattile, la differenziazione dovrebbe essere considerata subottimale. In tal caso, la risoluzione dei problemi dovrebbe iniziare rivedendo la morfologia della colonia iPSC prima della differenziazione, confermando la dimensione aggregata tra il Giorno −1 e il Giorno 0 e, se necessario, riottimizzando la densità di semina e le concentrazioni di CHIR99021 e IWP4 per la specifica linea iPSC.

Un battito spontaneo basso o assente entro il giorno 10–12 di solito riflette un'induzione inefficiente del mesoderma o una specificazione cardiaca, più comunemente dovuta a una concentrazione o tempistica inappropriata dei modulatori Wnt, o a una morte cellulare eccessiva dopo CHIR99021 trattamento (Passo 4.2). Secondo la nostra esperienza, titolare CHIR99021 entro un intervallo di 9–13 μM per ogni linea iPSC e verificare la concentrazione e l'attività delle soluzioni stock può migliorare sostanzialmente l'efficienza della differenziazione. L'analisi immunofluorescenza dell'organizzazione delle proteine sarcomeriche, come mostrato nella Figura 3, fornisce una valutazione comoda di controllo della qualità della differenziazione cardiomiocitaria. La colorazione debole o a chiazze delle proteine sarcomeriche, in particolare quando limitata alle regioni periferiche del cardioide, indica generalmente una differenziazione cardiomiocitaria incompleta o eterogenea. In questi casi, si raccomanda di estendere il periodo di maturazione della sospensione-coltura (Passo 4.6 e Punto di Pausa) prima della fissazione e verificare le condizioni di fissazione e colorazione degli anticorpi.

Sebbene questo modello cardioide fornisca un microambiente cardiaco umano tridimensionale che migliora sostanzialmente le colture bidimensionali di cardiomiociti convenzionali, non ricapitola completamente la complessità del cuore umano adulto. I cardioidi rappresentano una fase iniziale dello sviluppo cardiaco umano, con i cardiomiociti che mantengono un fenotipo¹⁴ immaturo, simile a quello fetale. Inoltre, i tessuti mancano di perfusione vascolare, innervazione, cellule immunitarie residenti e l'architettura specifica della camera completa del miocardio maturo. Di conseguenza, sebbene questa piattaforma sia particolarmente adatta a studiare l'assorbimento cellulare e la distribuzione intracellulare degli oligonucleotidi in condizioni sperimentali controllate, bisogna prestare attenzione quando si estrapolano la cinetica e i meccanismi di rilascio direttamente in vivo. L'incorporazione futura di ulteriori tipi di cellule cardiache, reti vascolari e strategie di maturazione dei tessuti dovrebbe ulteriormente aumentare la rilevanza fisiologica di questa piattaforma.

La valutazione affidabile dell'assorbimento di oligonucleotidi da parte dei cardioidi descritti in questo protocollo richiede l'ottimizzazione e la standardizzazione della concentrazione di ASO, del tempo di incubazione e delle impostazioni di acquisizione dell'immagini, come mostrato nelle Figure 4 e 5. La scelta del fluoroforo è particolarmente importante, poiché i coloranti differiscono per luminosità, fotostabilità e sensibilità agli effetti ambientali. In questo studio, abbiamo utilizzato Janelia Fluor 646 (JF646)²², un fluoroforio di silicio-rodamina di un rosso profondo con alta luminosità e fotostabilità che fornisce una rilevazione robusta del segnale minimizzando l'autofluorescenza tissutale nei campioni tridimensionali. Queste proprietà lo rendono particolarmente adatto per l'imaging dell'assorbimento degli oligonucleotidi in cardioidi vivi o fissi. In particolare, la coniugazione dei fluorofori può influenzare il comportamento degli oligonucleotidi, inclusi l'assorbimento e il traffico, e dovrebbe quindi essere validata per ciascun sistema sperimentale.

Nella sua forma attuale, questo protocollo fornisce sia una valutazione qualitativa che quantitativa dell'assorbimento degli oligonucleotidi. L'imaging confocale dei punti intracellulari associati all'ASO consente la visualizzazione della localizzazione degli oligonucleotidi all'interno dei cardioidi, mentre l'efficienza dell'assorbimento viene quantificata determinando manualmente la percentuale di cellule ASO-positive utilizzando il plugin Cell Counter in Fiji/ImageJ. Sebbene questo approccio sia particolarmente adatto alle analisi a debito moderato presentate qui, l'analisi manuale delle immagini richiede molta fatida e può essere soggetta a bias da parte dell'osservatore, soprattutto se applicata a grandi dataset. I recenti progressi nell'apprendimento profondo auto-supervisionato per la microscopia tridimensionale offrono opportunità promettenti per superare queste limitazioni. L'analisi d'immagini basata sull'IA può segmentare, identificare e tracciare con precisione strutture subcellulari eterogenee in complessi ambienti tridimensionali, consentendo la quantificazione automatica dell'assorbimento degli oligonucleotidi e del traffico intracellulare, inclusa la dinamica^{endosomica 23}. L'integrazione di questi approcci nelle future implementazioni del protocollo dovrebbe migliorare la produttività, la riproducibilità e la precisione analitica.

Guardando al futuro, l'integrazione dei cardioidi umani derivati da iPSC con l'imaging quantitativo, l'analisi delle immagini basata su machine learning e metodologie a particella singola offre un potente quadro per indagare i meccanismi che governano la somministrazione di oligonucleotidi nel tessuto cardiaco umano. La combinazione di modelli cardiaci tridimensionali fisiologicamente rilevanti con strumenti analitici avanzati in grado di risolvere l'organizzazione e la dinamica subcellulare permetterà una caratterizzazione quantitativa completa dell'assorbimento degli oligonucleotidi, del traffico intracellulare e, con saghi complementari appropriati, della fuga endosomica. Tali approcci integrati dovrebbero facilitare l'identificazione sistematica dei fattori che determinano l'efficienza della somministrazione, supportare l'ottimizzazione razionale delle chimiche degli oligonucleotidi e dei veicoli di somministrazione, e fornire una piattaforma scalabile per valutare le terapie emergenti con oligonucleotidi nel contesto delle malattie cardiovascolari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021