È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Cardioidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo come modello per valutare la somministrazione di oligonucleotidi

195 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 agosto 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo consente la generazione di cardioidi auto-organizzati a base di cardiomioci da cellule staminali pluripotenti indotte umane per la valutazione microscopica dell'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescente.

Abstract

Le terapie a base di oligonucleotidi rappresentano una classe di farmaci in rapida evoluzione con un potenziale significativo nel trattamento delle malattie cardiovascolari; Tuttavia, raggiungere una consegna efficiente al tessuto cardiaco rimane una sfida critica e irrisolta. Un ostacolo chiave è la limitata disponibilità di modelli in vitro umani robusti e fisiologicamente rilevanti, in grado di supportare la valutazione quantitativa dell'assorbimento cellulare degli oligonucleotidi e della distribuzione intracellulare. Viene presentato un protocollo dettagliato e passo dopo passo per generare cardioidi 3D auto-organizzati a partire da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e applicarli come piattaforma per valutare l'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescente. Il protocollo guida gli utenti attraverso la differenziazione cardiaca diretta nella coltura a sospensione modulando temporalmente la segnalazione Wnt/β-catenina, consentendo la specificazione sequenziale degli iPSC attraverso gli stadi progenitori del mesoderma, del mesoderma cardiaco e dei cardiomiociti. In queste condizioni, le cellule si auto-assemblano spontaneamente in strutture tridimensionali contenenti cavità che esprimono marcatori cardiomiociti canonici. I cardioidi risultanti forniscono una piattaforma scalabile e sperimentalmente trattabile per la valutazione basata sull'imaging dell'efficienza dell'assorbimento degli oligonucleotidi, supportando lo sviluppo e l'ottimizzazione di strategie di somministrazione per applicazioni cardiache.

Introduzione

Le terapie a base di oligonucleotidi, principalmente oligonucleotidi antisenso (ASO) e piccoli RNA interferenti (siRNA), stanno rapidamente emergendo come un approccio trasformativo e altamente specifico per il trattamento di un'ampia gamma di malattie, incluse condizioni sia ereditarie che acquisite 1,2,3. Queste modalità consentono la modulazione diretta dell'espressione genica a livello di mRNA tramite il legame specifico della sequenza ai trascrizioni target, consentendo il silenziamento genico o la correzione dello splicing di geni associati a malattie che spesso sono inaccessibili alle terapie convenzionali a piccolemolecole 4,5. In quanto tale, le terapie geniche basate su oligonucleotidi offrono una piattaforma versatile per mirare a diversi meccanismi patogeni in molteplici aree di malattia, inclusi i disturbicardiovascolari 6. Ad oggi, diversi farmaci a base di oligonucleotide, inclusi ASO, siRNA e agenti splice-switching, sono stati approvati per l'usoclinico 7. Nonostante questi progressi, la loro efficacia terapeutica sia in contesto preclinico che clinico rimane limitata da una consegna intracellulareinefficiente 8. Le stime attuali indicano che meno dell'1% degli oligonucleotidi internalizzati esce dai compartimenti endosomici per raggiungere il citosolo e coinvolgere il loro RNA bersaglio, limitando così l'attivitàfunzionale 9,10. Questa limitazione è particolarmente evidente nei tessuti cardiaci, dove l'assorbimento e il traffico intracellulare sono poco compresi.

Storicamente, la valutazione preclinica delle terapie cardiovascolari si è basata fortemente su modelli animali, che rimangono indispensabili per valutare farmacocinetica, biodistribuzione, efficacia e sicurezza in vivo. Tuttavia, importanti differenze interspecie nella fisiologia cardiaca, nella regolazione genica e nelle risposte cellulari spesso limitano la loro capacità di prevedere con precisione l'efficacia terapeutica e la tossicità negli esseri umani. Queste limitazioni hanno guidato lo sviluppo di modelli in vitro basati sull'uomo con maggiore rilevanza fisiologica. Tra questi, la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) ha rivoluzionato la modellazione delle malattie cardiovascolari fornendo una fonte praticamente illimitata di cellule che possono essere differenziate in linee cardiovascolari. I cardiomiociti derivati da iPSC umani (iPSC-CM) riproducono molte delle proprietà molecolari, strutturali e funzionali del miocardio umano e sono diventati una piattaforma ampiamente adottata per indagare i meccanismi delle malattie, le risposte farmacologiche e le nuove modalitàterapeutiche 11. Tuttavia, le colture bidimensionali convenzionali di iPSC-CM umane presentano importanti limitazioni. La maggior parte dei protocolli di differenziazione genera cardiomioci che assomigliano a cellule fetali piuttosto che adulte, mostrando proprietà strutturali, elettrofisiologiche, metaboliche e contrattiliimmature 12.

Inoltre, le colture monostrato mancano dell'architettura tissutale tridimensionale (3D), delle interazioni multicellulari e della composizione della matrice extracellulare che influenzano la funzione dei cardiomiociti in vivo. Per affrontare queste sfide, sono stati sviluppati modelli cardiaci 3D sempre piùsofisticati 13. Tra questi, i tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT), generati dall'inserimento degli iPSC-CM in impalcature di biomateriali e dall'applicazione di stimoli meccanici ed elettrici, promuovono la maturazione strutturale e funzionale riproducendo più fedelmente l'ambiente biomeccanico del miocardionativo 13. Sebbene gli EHT forniscano piattaforme altamente rilevanti dal punto di vista fisiologico per la modellazione delle malattie e i test sui farmaci, la loro generazione richiede tipicamente competenze specializzate in bioingegneria e attrezzature dedicate. All'estremo opposto, le fette di tessuto cardiaco ex vivo preservano fedelmente l'architettura del tessuto nativo e la composizione cellulare, ma dipendono dall'accesso al tessuto cardiaco primario, hanno una vitalità limitata in coltura e non sono facilmente scalabili.

Più recentemente, gli organoidi cardiaci sono emersi come sistemi modello 3D accessibili che ripropongono aspetti chiave dell'organizzazione e della funzione del tessutocardiaco 14. I cardioidi sono organoidi cardiaci autoassemblanti composti prevalentemente da cardiomiociti che subiscono specificazione intrinseca, pattern spaziale e morfogenesi per formare strutture simili a camere contenenticavità 15,16. I metodi per formare i cardioidi si basano tipicamente su un'attivazione iniziale della segnalazione Wnt per indurre la specificazione del mesoderma, seguita da un'inibizione successiva per promuovere l'impegno della linea cardiaca. I cardioidi possono essere generati sia in colture statiche che in colture di sospensione agitate, che supportano una produzione scalabile e migliorano l'auto-organizzazionetissutale 15,16,17,18,19. Organoidi cardiaci più complessi e multi-lineage che incorporano cellule endoteliali, epicardiche o altri aumentano ulteriormente la rilevanza fisiologica ma richiedono protocolli di differenziazione più elaborati, periodi di coltura più lunghi e un'ottimizzazioneestesa 13,14.

Viene presentato un protocollo semplice, riproducibile ed efficiente per generare cardioidi auto-organizzanti a base di cardiomiociti da iPSC umani e applicarli per valutare l'assorbimento di oligonucleotidi marcati con fluorescenza. Il protocollo dovrebbe rivelarsi prezioso per i ricercatori che vogliono ottimizzare la chimica degli oligonucleotidi e le strategie di somministrazione per applicazioni cardiovascolari. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Cultura e preparazione degli iPSC per la differenziazione

ATTENZIONE: Esegui tutta la gestione aperta di cellule e mezzi in un armadietto di biosicurezza certificato di Classe II. Indossa un camice da laboratorio e guanti. Decontamina le superfici di lavoro e i rifiuti liquidi con un disinfettante appropriato.

  1. Mantenere gli iPSC.
    1. Rivestire le piastre di coltura con una matrice basale-membrana appropriata secondo le istruzioni del produttore.
    2. Nutrire gli iPSC con un mezzo cellulare pluripotente definito e privo di alimentazione e sostituire il substrato ogni 24 ore.
    3. Mantenere le colture al di sotto della sovraconfluenza e delle cellule del passaggio quando raggiungono il 70–80% di confluenza.
      NOTA: Assicurarsi che gli iPSC mantengano una morfologia di alta qualità e indifferenziata e siano confermati come privi di micoplasmi prima di iniziare la differenziazione.
  2. Passaggio pre-differenziazione.
    1. Scongelare gli iPSC ed espandere le cellule per almeno due passi prima di iniziare la differenziazione cardiaca.
    2. Cellule del passaggio che utilizzano un metodo di dissociazione senza enzimi, PBS-EDTA, compatibile con il mantenimento dell'iPSC.
      PUNTO DI PAUSA: Mantenere le iPSC in coltura fino a raggiungere il 70–80% di confluenza e mantenere la morfologia tipica senza segni di differenziazione spontanea.

2. Preparazione di aggregati iPSC in piastre di micropozzi

  1. Dissocia gli iPSC a una sospensione a singola cellula.
    1. Aspira il mezzo e lava le cellule una volta con 1 mL di 1× PBS.
    2. Aggiungere la soluzione di distacco cellulare (Accutasi) a 500 μL per pozzo di una piastra a 6 pozzi e incubare a 37 °C per 5–7 minuti.
    3. Aggiungi 1,5 mL di mezzo per pozzo e risospezioni delicatamente per ottenere una sospensione a cella singola.
    4. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
    5. Aspirare il soprandanante e risospendere la pellet cellulare in un mezzo iPSC senza alimentazione integrato con inibitore ROCK (ultimi 10 μM).
      NOTA: Regolare il tempo di incubazione della dissociazione per ogni linea iPSC controllando il distacco a 5 minuti e estendendo in brevi incrementi se necessario.
  2. Contare le celle e preparare la densità di placcatura.
    1. Contare le celle vitali utilizzando un metodo standard di conteggio delle cellule.
    2. Preparare una sospensione a singola cella a 0,9 × 106 celle/mL per ogni pozzo di una piastra di aggregazione micropozzo da 800 μm (formato 24 pozzi, ~300 micropozzi/pozzo).
      NOTA: Ottimizzare il numero di celle per pozzo, poiché la dimensione aggregata o l'efficienza di differenziazione variano tra le linee iPSC.
  3. Primer la piastra del micropozzo e rimuovi le bolle.
    1. Aggiungere 500 μL di mezzo iPSC senza alimentatore contenente inibitore ROCK (10 μM) finale in ciascun pozzo.
    2. Centrifuga la piastra del micropozzo a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzi.
      FONDAMENTALE: Rimuovere completamente tutte le bolle per consentire una deposizione cellulare uniforme sul fondo di ogni micropozzo e favorire la formazione efficiente degli aggregati.
  4. Semina gli iPSC in micropozzi.
    1. Aggiungere 1,0 mL della sospensione a singola preparata (0,9 × 106 cellule/mL) a ciascun pozzo, corrispondendo a 0,9 × 106 celle per pozzo.
    2. Sospezioni delicatamente all'interno del pozzo 3–5 volte usando un P1000 ed evita di introdurre bolle d'aria.
    3. Centrifuga la piastra a 200 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per portare le celle nei micropozzi.
    4. Verifica al microscopio che le cellule si siano depositate nei micropozzi prima di posizionare la piastra a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
      CRITICO: Maneggia la piastra con attenzione dopo la centrifugazione. Non agitare o scuotere la placca, poiché questo potrebbe far sollevare le cellule fuori dai micropozzi.

3. Espansione degli aggregati iPSC nei micropozzi

  1. Aspirare con cura e sostituire il mezzo senza disturbare o spostare gli aggregati.
    1. Inclinare la piastra e aspirare lentamente circa 1,0 mL di mezzo da ciascun pozzo utilizzando una pipetta P1000, assicurandosi che gli aggregati rimangano posizionati nei micropozzi.
    2. Aspirare lentamente i restanti ~500 μL di mezzo usando una pipetta P1000.
    3. Aggiungi 1,5 mL di mezzo iPSC senza alimentatore in ciascun pozzo erogandolo lentamente lungo il lato del pozzo usando una pipetta sierologica.
    4. Incubare a 37 °C, 5% di CO₂ e ripetere il cambio di mezzo quotidianamente.
      CRITICO: Distribuire il materiale sulla parete del pozzo ed evitare il flusso diretto sugli aggregati.

4. Differenziazione cardiaca degli aggregati iPSC (Giorno 0 al Giorno 12)

  1. Induzione del mesoderma (Giorno 0).
    1. Rimuovere il mezzo utilizzando il metodo di aspirazione delicata descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
    2. Aggiungere 1,5 mL per pozzo di mezzo basale integrato con il 2% di B27 meno insulina e l'attivatore della via Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentrazione finale: 11 μM).
      NOTA: Prepara una soluzione stock da 10 mM di CHIR99021, un inibitore a piccole molecole della glicogenosintasi chinasi-3 (GSK-3). Per ottenere una concentrazione finale di 11 μM, si aggiungono 1,65 μL della soluzione stock a 1,5 mL di mezzo.
  2. Cambio di mezzo dopo l'induzione (Giorno 1).
    1. Dopo 24 ore di aggiunta di CHIR99021, aspirare delicatamente il substrato da ciascun pozzo.
    2. Aggiungi 1,5 mL per pozzo di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 meno insulina, poi incuba per 48 ore.
      CRITICO: Rispetta rigorosamente la tempistica dei passaggi di modulazione Wnt, poiché le deviazioni possono compromettere l'efficienza della differenziazione.
      NOTA: Si prevede una certa morte cellulare dopo l'esposizione all'attivatore della via Wnt/β-catenina. Se si osserva una perdita aggregata diffusa, si considera di ridurre la concentrazione degli attivatori in futuri esperimenti.
  3. Ritiro cardiaco tramite inibizione WNT (Giorno 3).
    1. Preparare il mezzo condizionato trasferendo 760 μL di mezzo esausto da ciascun pozzo a un tubo conico sterile da 50 mL.
    2. Per ogni pozzo, aggiungere 760 μL di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 meno insulina al tubo contenente il mezzo condizionato in pool, e mescolare delicatamente.
    3. Aggiungere l'inibitore della via Wnt, IWP4, al mezzo misto fino a una concentrazione finale di 5 μM e invertire delicatamente il tubo più volte per mescolare.
    4. Aspira con cura il substrato rimanente da ogni pozzo, poi aggiungi 1,5 mL per pozzo di mezzo condizionato integrato con IWP4.
    5. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
      NOTA: Prepara una soluzione stock da 1 mM dell'inibitore della via Wnt IWP4. Per ottenere una concentrazione finale di 5 μM, si aggiungono 7,6 μL della soluzione stock per ogni 1,52 mL di mezzo totale (760 μL di mezzo condizionato + 760 μL di mezzo basale fresco) per ogni pozzo.
  4. Variazione del mezzo nei micropozzi (Giorno 5).
    1. Sostituire il mezzo utilizzando l'approccio di aspirazione dolce descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
    2. Aggiungere 1,5 mL di mezzo basale integrato con il 2% di B27 meno insulina in ciascun pozzo, poi incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
  5. Trasferire aggregati dai micropozzi alle piastre a 6 pozzi (Giorno 7).
    1. Aspirare con cura il mezzo di ciascun pozzo utilizzando il metodo di aspirazione delicata descritto nei passaggi 3.1.1–3.1.2.
    2. Aggiungere 1,0 mL di mezzo basale integrato con il 2% di B27 con insulina in ciascun pozzetto della piastra del micropozzo. Utilizzando una pipetta P1000, si pipeta delicatamente il mezzo su e giù cinque volte mentre si muove la punta della pipetta in movimento circolare sulla superficie del pozzo per slogare gli aggregati nei micropozzi e trasferirli in sospensione.
    3. Trasferire la sospensione aggregata in un singolo pozzo di una piastra di coltura a 6 pozzi non trattata.
    4. Risciacquo ogni pozzetto della piastra micropozzo con 1,0 mL aggiuntivo di mezzo fresco due o tre volte per recuperare eventuali aggregati rimanenti, trasferendo ogni risciacquo nello stesso pozzo della piastra a 6 pozzi.
    5. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 72 ore.
      NOTA: La presenza di cellule morte e detriti cellulari dopo il trasferimento degli aggregati è attesa. La maggior parte dei detriti verrà rimossa durante il successivo cambio di mezzo.
  6. Cambiamento medio durante la coltura della sospensione (giorno 10).
    1. Agita delicatamente la piastra per staccare eventuali aggregati attaccati in modo debolle.
    2. Inclinare la piastra per permettere agli aggregati di depositarsi sul fondo del pozzo per gravità.
    3. Aspirare con cura il mezzo esausto senza disturbare o aspirare gli aggregati.
    4. Aggiungere 2,0 mL di mezzo basale fresco integrato con il 2% di B27 con insulina in ciascun pozzo e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48–72 ore.
      NOTA: Il pestaggio spontaneo si osserva tipicamente a partire dal giorno 10 circa.
      PUNTO DI PAUSA: I CARDIOIDI DI BATTITURA POSSONO ESSERE MANTENUTI IN COLTURA IN SOSPENSIONE PER UNA MATURAZIONE PROLUNGATA SOSTITUENDO IL MEZZO OGNI 2–3 GIORNI.

5. Caratterizzazione microscopica dei cardioidi

NOTA: Questo metodo fornisce un flusso di lavoro per la caratterizzazione istologica dei cardioidi tramite criosezioni. Le sezioni risultanti possono essere utilizzate per una varietà di analisi istologiche, tra cui la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) per valutare l'architettura complessiva dei tessuti e l'etichettatura dell'immunofluorescenza per l'identità dei cardiomiociti.

  1. Fissazione e criosezionamento.
    1. Fissare i cardioidi al 4% di paraformaldeide durante la notte a 4 °C.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e probabilmente un cancerogeno; Maneggiarla in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata. Raccogliere tutti i rifiuti contenenti paraformaldeide (fissativi e lavaggi) in un contenitore chiaramente etichettato per aldeide/rifiuti chimici pericolosi e smaltirli secondo le procedure istituzionali relative ai rifiuti pericolosi.
      SICUREZZA: Esegui tutta la fissazione e la gestione del paraformaldeide in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
    2. Lava tre volte con PBS e crioproteggi i cardioidi fissi al 30% (w/v) in PBS durante la notte a 4 °C.
    3. Inserire i cardioidi nella gelatina, congelare e tagliare criosezioni spesse 10 μm su vetrine microscopiche. Conserva le sezioni a −20 °C fino all'uso.
  2. Immunomarcatura.
    1. Scongela le sezioni per 15 minuti a temperatura ambiente.
    2. Lava le sezioni in PBS a 37 °C per 10 minuti, due volte.
    3. Cerchia l'area di interesse su ogni diapositiva con una penna idrofobica per creare un pozzo che trattenga le soluzioni di blocco e anticorpi.
    4. Reidratare le sezioni per 2–3 minuti in un buffer di permeabilizzazione (PB; PBS contenente 0,1% Tween-20) in un barattolo di Coplin.
    5. Rimuovi i vetrini dal PB, scolla la soluzione in eccesso e metti i vetrini in una camera umida.
      CRITICO: Da questo momento in poi, è fondamentale non lasciare che le sezioni si asciughino.
    6. Bloccare le sezioni con 200–300 μL di PB contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) per 90 minuti a temperatura ambiente in una camera umida.
    7. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare le sezioni durante la notte a 4 °C con 100 μL di anticorpo primario (anti-cMYBP-C; 1:50) diluito in soluzione bloccante (PB contenente FBS all'1%).
    8. Lavare i vetrini tre volte con PB e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con un anticorpo secondario anti-topo fluorescente verde (1:200), falloidina fluorescente rosso profondo (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
    9. Lava tre volte con PB e monta con un mezzo antifade.
      ATTENZIONE: Raccogli tutte le soluzioni contenenti coloranti fluorescenti (anticorpi secondari, falloidina e soluzioni di colorazione DAPI e i relativi lavaggi) in un contenitore e smaltile come rifiuti chimici secondo le linee guida istituzionali.
  3. Acquisizione di immagini.
    1. Acquisire immagini confocali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di un rilevatore a array per immagini a superrisoluzione utilizzando un obiettivo a immersione in olio 10××/1,40.
    2. Eccitare il fluorofero rosso lontano, il fluoroforo verde e la colorazione nucleare usando linee laser a 639 nm, 488 nm e 405 nm rispettivamente con trasmissione laser del 4,0%, 4,0% e 1,0%.
    3. Acquisire singole sezioni ottiche con dimensione pixel di 0,0353 × 0,0353μm 2, scansione unidirezionale, velocità di scansione 6, zoom 1,7, media linea 1 e tempo di permanenza dei pixel di 0,935 μs per pixel.
    4. Applicare l'elaborazione delle immagini a superrisoluzione con rilevatore di array utilizzando il filtraggio automatico di Wiener.

6. Saggio di assorbimento degli oligonucleotidi fluorescenti

  1. Prepara una soluzione standard dell'oligonucleotide marcato con fluorescente coniugata con acido palmitico per aumentare la lipofilia.
    1. Ricostituire l'oligonucleotide liofilizzato marcato con fluorescenza in acqua priva di nucleasi a una concentrazione finale di 1 mM. Vortice brevemente e centrifuga a 3.000 × g per 30 secondi per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo.
    2. Preparare aliquote monouso della soluzione stock da 1 mM e conservarle a −20 °C protette dalla luce.
    3. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 1 μL dello stock da 1 mM a 1 mL di mezzo di coltura cardioide per ottenere una concentrazione finale di oligonucleotidi di 1 μM. Mescolare con una delicata agitazione della placca.
  2. Incubare i cardioidi con l'oligonucleotide marcato con fluorescenza (concentrazione finale di 1 μM) in un mezzo siero a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
  3. Lavare i cardioidi tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere gli oligonucleotidi extracellulari.
  4. Fissare i cardioidi con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente, lavare tre volte con PBS e continuare con l'etichettatura fluorescente prima dell'immagini.
  5. Incubare cardioidi fissi intatti durante la notte a 4 °C, protetti dalla luce, in PBS contenente 5 μg/mL di agglutinina germinale del grano (WGA) coniugata con un fluoroforo verde e 1 μg/mL DAPI. Lava tre volte in PBS e monta con un mezzo antifade.
    ATTENZIONE: Raccogliere tutti i mezzi e i lavaggi contenenti oligonucleotidi e coloranti fluorescenti, inclusi il mezzo di incubazione con oligonucleotidi marcati dal passo 6.2 e la soluzione di colorazione WGA/DAPI, in un contenitore separato e smaltirli come rifiuti chimici/biohazardi secondo le linee guida istituzionali.
  6. Acquisire immagini confocali dell'assorbimento e della distribuzione degli oligonucleotidi.
    1. Acquisire immagini confocali utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di un rilevatore a array per immagini a superrisoluzione e un obiettivo di immersione in acqua del 40×. Acquisire immagini come stack z a 8 sezioni con una dimensione z-step di 2 μm, coprendo una profondità totale di 16 μm.
    2. Eccitare la colorazione nucleare, il marcatore di membrana e l'oligonucleotide marcato fluorescente di rosso lontano usando linee laser da 405 nm, 488 nm e 639 nm rispettivamente con trasmissione laser dello 0,9%, 0,2% e 3,0%.
    3. Acquisire immagini con dimensione voxel di 0,0449 × 0,0449 × 2μm 3, scansione bidirezionale, velocità di scansione 5, media linea 1 e tempo di permanenza del pixel di 1,51 μs per pixel. Applica Airyscan/elaborazione immagini super-risoluzione usando il filtro automatico di Wiener.
    4. Mantieni tutte le impostazioni di acquisizione (potenza laser, guadagno del rivelatore, passo z e dimensione del voxel) costanti su tutte le posizioni z e su tutti i campioni per consentire un confronto valido del segnale oligonucleotidico tra le condizioni.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La Figura 1 riassume il flusso di lavoro di differenziazione e illustra i cambiamenti morfologici caratteristici attesi in ogni fase del protocollo, dall'aggregazione iPSC alla formazione di cardioidi auto-organizzanti. L'aggregazione di micropozzi basata su sospensione fornisce un approccio semplice e standardizzato per la generazione parallela di un gran numero di cardioidi controllati per dimensioni. La differenziazione di successo si caratterizza dalla g...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Le terapie a base di oligonucleotidi sono emerse come una potente classe di modalità di targeting genico, supportate da decenni di progressi nella chimica degli oligonucleotidi che hanno migliorato la specificità del bersaglio, la stabilità metabolica e la tollerabilitàimmunogenica 7,8. Nonostante il numero crescente di terapie a RNA clinicamente approvate, la loro applicazione più ampia rimane limitata da una consegna intracellu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, in particolare Knud Jensen per la progettazione e la sintesi degli oligonucleotidi, e Nikos S. Hatzakis e Tomas Kirchhausen per le preziose indicazioni sull'imaging quantitativo e sull'analisi del traffico intracellulare. Questo lavoro è stato finanziato dal Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287). M.F. ha ricevuto una borsa di studio dalla Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portogallo (2020.04836.BD). Ringraziamo GIMM Bioimaging e le Piattaforme di Istopatologia GIMM (Lisboa, Portogallo) per l'assistenza tecnica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Riferimenti

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule staminali pluripotenti indottemodello di cardioidedifferenziamento cardiacosegnalazione Wntmesoderma cardiacoprogenitori dei cardiomiocitioligonucleotidi fluorescentiassorbimento cellularecardioidi tridimensionali

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.