Saggi semplici e accessibili per la schiusa delle uova in Caenorhabditis elegans: formati adattabili per lo screening farmacologico

Sommario

Questo studio presenta una piattaforma flessibile e standardizzata per i test della schiusa delle uova in Caenorhabditis elegans che integra molteplici formati sperimentali. L'approccio migliora riproducibilità, scalabilità e accessibilità, consentendo una valutazione robusta degli effetti dei farmaci e dei processi di sviluppo, rimanendo economicamente conveniente e facilmente adattabile sia per applicazioni di ricerca che per contesti educativi.

Abstract

I saghi di schiusa delle uova (EHA) sono ampiamente utilizzati per valutare gli effetti dei composti chimici nelle fasi iniziali dello sviluppo dei nematodi, in particolare nella ricerca sugli antihelmintici. Tuttavia, le metodologie esistenti variano sostanzialmente per formato, complessità e riproducibilità, e spesso vengono presentate come protocolli fissi piuttosto che come quadri sperimentali adattabili. In questo studio, stabiliamo una piattaforma semplice, accessibile e flessibile per i sami di schiusa delle uova in Caenorhabditis elegans integrando e confrontando direttamente tre configurazioni sperimentali: (i) incubazione controllata in tubi microcentrifughe seguita da semina su lastre di agar, (ii) esposizione diretta su piastre di agar contenenti farmaci e (iii) saghi liquidi multipozzo. Sono stati utilizzati due composti rappresentativi per illustrare il saggio: uno che inibisce la schiusa delle uova e uno che non ha effetto rilevabile. Ogni configurazione offre vantaggi distinti in termini di controllo sperimentale, throughput e accessibilità. L'approccio basato su tubo a microcentrifuga consente un controllo preciso dell'esposizione ai farmaci e supporta analisi farmacologiche quantitative. Gli saghi basati su agar offrono un'alternativa semplificata e a basso costo, adatta a esposizioni continue e contesti educativi. I formati multiwell consentono screening scalabile e standardizzato, coerente con le moderne pipeline di scoperta di farmaci. Confrontando direttamente questi formati, mostriamo come le scelte metodologiche influenzino la riproducibilità dei sani, la dinamica dell'esposizione ai farmaci e l'interpretazione biologica, in particolare in relazione a fattori specifici per stadio come il ruolo protettivo del guscio d'uovo e la variazione nello sviluppo nell'espressione molecolare del bersaglio. Nel complesso, questo lavoro stabilisce gli saggi di schiusa delle uova in C. elegans come una piattaforma versatile e scalabile, adattabile a diverse applicazioni, tra cui lo screening antiermintico, la valutazione tossicologica, gli studi di sviluppo e i laboratori didattici, facilitando così un uso più ampio e razionale di questa metodologia.

Introduzione

Gli saggi di schiusa delle uova (EHA) sono da tempo consolidati come una metodologia fondamentale della nematologia per valutare l'attività ovicida e gli effetti precoci nello sviluppo dei composti chimici. Originariamente sviluppati per nematodi parassitari, questi saghi quantificano l'inibizione dell'embrionazione o dell'emergenza larvale in condizioni controllate in vitro, fornendo endpoint robusti e biologicamente rilevanti come la percentuale di schiusa o l'analisi concentrazione-risposta (ad esempio, EC₅₀ o IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

Approcci classici basati su uova nei nematodi parassiti come Haemonchus contortus e Trichostrongylus colubriformis sono stati ampiamente utilizzati per valutare l'efficacia di farmaci sintetici e prodotti naturali, nonché per monitorare la resistenza antiermintica 1,2,6,8,9,10 . Queste metodologie comprendono una gamma di lettura, dalla valutazione diretta della vitalità e schiusa delle uova alla valutazione dello sviluppo larvale dopo la coltura fecale. Collettivamente, hanno svolto un ruolo centrale nel collegare l'esposizione ai farmaci alla produzione riproduttiva dei parassiti e al potenziale di trasmissione. Tuttavia, questi approcci spesso richiedono una preparazione complessa di campioni da ospiti infetti, periodi di incubazione prolungati e infrastrutture specializzate, il che può limitarne l'accessibilità, la scalabilità e la riproducibilità inter-laboratorio.

L'uso di Caenorhabditis elegans come organismo modello è emerso come una strategia potente per superare diverse limitazioni associate ai nematodi parassitari. Il suo breve ciclo vitale, la trattabilità genetica, la facilità di coltivazione e la conservazione di bersagli molecolari chiave condivisi con specie parassite lo rendono particolarmente adatto per studi farmacologici, tossicologici e di sviluppo. È importante sottolineare che l'embriogenesi in C. elegans è rapida e altamente riproducibile, permettendo che gli saggi di vitalità delle uova e schiusa vengano utilizzati come letture quantitative e affidabili dei processi di sviluppo precoci e della loro interruzione da parte degli xenobiotici 11,12,13,14,15,16,17.

Inoltre, la disponibilità di ceppi mutanti ben caratterizzati ha permesso intuizioni meccanicistiche sull'azione e la resistenza dei farmaci. Studi precedenti hanno dimostrato che la resistenza ai composti bioattivi può emergere in modo dipendente dallo stadio, con stadi embrionali e larvali che mostrano sensibilità differenziata. Ad esempio, alterazioni nella segnalazione glutamatergica sono state associate a fenotipi resistenti nelle larve, mentre la schiusa delle uova è rimasta^intatta 14,18,19,20. Questo evidenzia la natura specifica per stadio della sensibilità ai farmaci e suggerisce che gli stadi embrionali possano coinvolgere bersagli distinti o accessibilità differenziale rispetto alle fasi successive dello sviluppo.

Oltre alla parassitologia, i saghi di vitalità degli uova in C. elegans sono diventati sempre più rilevanti nella tossicologia e nella scoperta precoce di farmaci. Questi saggi sono stati applicati non solo per valutare l'attività antiemintica, ma anche per valutare la tossicità dello sviluppo e i difetti embrionali indotti dal farmaco, con risultati che possono correlarsi a profili di tossicità di organismi più^{elevati 15,16}. Allo stesso tempo, la presenza del guscio introduce importanti vincoli biologici, poiché agisce come barriera protettiva e selettiva di permeabilità che circonda^{l'embrione 21,22.} Di conseguenza, alcune molecole bioattive potrebbero non raggiungere l'embrione nonostante mostrino attività nelle fasi successive^{dello sviluppo} 14,19,23,24. L'accesso all'embrione è quindi probabilmente dipendente dalle proprietà fisicochimiche di ciascun composto, inclusa la dimensione molecolare e la polarità. Questo può contribuire alle differenze tra l'attività osservata nei saggi di schiusa delle uova e quella nelle fasi successive dello sviluppo. Questa distinzione sottolinea l'importanza di definire chiaramente sia il contesto sperimentale sia il punto finale biologico misurato.

Metodologicamente, i test di schiusa delle uova in Caenorhabditis elegans sono stati implementati utilizzando un'ampia gamma di formati sperimentali, tra cui incubazione liquida di uova sincronizzate, esposizione diretta a piastre agariche contenenti farmaci e saggi multi-pozzo adattati per screening a media o alta^{produttività 11,13,14,16,19,23,24}.

I formati a base liquida e micropiastre sono stati ampiamente adottati negli studi di screening farmacologico, poiché forniscono condizioni di esposizione omogenee, facilitano un controllo preciso delle concentrazioni di farmaci e consentono un'analisi quantitativa delle relazioni concentrazione-risposta. Parallelamente, strategie comparabili basate su multiwell sono state ampiamente sviluppate per nemanoi parassite, che vanno dai saghi convenzionali a 96 pozzi a piattaforme ad altissimo throughput che^{utilizzano formati 4,5} a 384 ^pozzi. Insieme, questi approcci evidenziano la versatilità e la scalabilità degli saggi di schiusa delle uova tra diverse specie di nematodi e la loro adattabilità a contesti sperimentali diversi, dagli studi meccanicistici su piccola scala allo screening su larga scala dei composti.

Ogni formato presenta vantaggi e limitazioni distinte in termini di controllo sperimentale, riproducibilità, capacità di produzione e accessibilità. Gli saggi a base liquida forniscono condizioni di esposizione omogenee e sono ben adatti per analisi farmacologiche quantitative, mentre quelli a agar permettono un'esposizione continua durante lo sviluppo ma introducono variabilità legata alla diffusione e biodisponibilità del farmaco. I formati multipozzo, a loro volta, consentono parallelizzazione e riduzione del consumo di reagenti, in linea con le moderne strategie di screening.

Nonostante l'uso diffuso, i saghi sulla schiusa delle uova sono spesso presentati come protocolli fissi piuttosto che come un quadro metodologico flessibile. I confronti diretti tra i formati sono scarsi e le indicazioni sulla scelta della configurazione più appropriata per applicazioni specifiche, che vanno dagli studi meccanicistici agli ambienti di screening o didattico ad alto rendimento, restano limitate.

In questo studio, proponiamo una piattaforma semplice, accessibile e adattabile per i saggi di schiusa delle uova in C. elegans, integrando e confrontando tre configurazioni sperimentali: (i) incubazione controllata in tubi microcentrifughe seguita da semina su piastre di agar, (ii) esposizione diretta su piastre di agar contenenti farmaci e (iii) saggi liquidi basati su più pozzi.

Valutando sistematicamente queste configurazioni, puntiamo a stabilire un quadro pratico che metta in evidenza i compromessi tra controllo sperimentale, semplicità e scalabilità. Questa prospettiva integrata collega le metodologie parassiteologiche classiche con gli approcci moderni di screening basati su modelli, posizionando gli saghi di schiusa delle uova non come una tecnica standardizzata unica, ma come una piattaforma versatile adattabile a contesti di ricerca diversi, inclusi la scoperta di antihelmintiche, la valutazione tossicologica, la biologia dello sviluppo e applicazioni educative.

Protocollo

1. Ceppi e cultura di Caenorhabditis elegans

1. Utilizzare il ceppo wild-type N2 (Bristol) e/o il ceppo transgenico PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) per sviluppare e validare la metodologia^25,26. PD4251 esprime GFP, facilitando la visualizzazione e potenziali applicazioni di imaging quando necessario, mostrando al contempo la schiusa delle uova e risposte allo sviluppo indistinguibili da quelle osservate nel ceppo di tipo selvatico N2 nelle condizioni sperimentali utilizzate in questo^{studio 27}.
2. Ottenere ceppi (ad esempio, ceppo di tipo selvatico N2) dal Caenorhabditis Genetic Center (CGC), supportato dall'Ufficio di Infrastrutture di Ricerca dei National Institutes of Health (P40 OD010440).
3. Mantenere i vermi in condizioni standard di laboratorio a 18–25 °C su piastre agar di Nematode Growth Medium (NGM) appena preparate, seminate con Escherichia coli OP50 come fonte alimentare. Prepara NGM sciogliendo 16 g di agar, 3 g di NaCl e 2,5 g di bactopeptone in 975 mL di acqua distillata o ultrapura. Sterilizza tramite autoclav. Dopo aver raffreddato il mezzo a 55 °C, aggiungere soluzioni sterili di fosfato di potassio (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) e colesterolo (1 mL, 5 mg/mL in etanolo assoluto). Mescola bene e versa i piatti in condizioni sterili.
4. Eseguire la manipolazione, la propagazione e la manutenzione di routine seguendo le procedure stabilite descritte in WormBook e negli studi^{correlati 24,26,28,29}. Mantieni i vermi in condizioni di non fame garantendo una disponibilità continua di cibo batterico ed evitando piatti sovraffollati. Mantenere le colture entro l'intervallo di temperatura raccomandato (18–25 °C) ed evitare condizioni eccessivamente secche, poiché queste potrebbero accelerare la disidratazione dell'agar.
5. Considerazioni generali prima di iniziare il test
   1. Definire in anticipo tutti i parametri sperimentali, inclusi temperatura (18–25 °C), tempo di incubazione (4–8 h), umidità (50–70%) e procedure di manipolazione.
   2. Prepara tutti i materiali prima di iniziare il test per garantire tempi adeguati e coordinamento del flusso di lavoro.
   3. Mantenere condizioni sperimentali coerenti su tutte le repliche per minimizzare la variabilità.

2. Preparazione di composti di prova e controlli

1. Prepara tutti i composti con freschezza il giorno dell'esperimento. Sciogliere le scorte in tampone M9 (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) oppure in acqua distillata sterile, a seconda della compatibilità del composto e delle condizioni di saggio^30,31.
   NOTA: La scelta del mezzo acquoso può influenzare l'attività dei composti negli saghi di C. elegans . Ad esempio, composti come la serotonina possono mostrare concentrazioni efficaci diverse quando preparati in acqua distillata sterile rispetto al tampone M9. Pertanto, sia la compatibilità dei veicoli che la risposta biologica dovrebbero essere valutate empiricamente durante l'ottimizzazione del saggio. Inoltre, per composti con bassa solubilità acquosa, possono essere utilizzati veicoli appropriati come il dimetilsolfosido (DMSO) o l'etanolo. Le concentrazioni finali di solvente dovrebbero rimanere basse (tipicamente sotto lo 0,2% v/v) per evitare tossicità. Studi precedenti su C. elegans hanno riportato che concentrazioni di DMSO fino allo 0,5% producono effetti minimi in condizioni di laboratorio^{standard 17}.
2. Preparare almeno cinque concentrazioni per composto per consentire la costruzione di curve concentrazione-risposta e la stima dei valori IC₅₀ o IC₉₀ . Utilizzare una diluizione seriale con passaggi di concentrazione da 2 a 3 volte come punto di partenza, e regolare l'intervallo finale di concentrazione in base alla potenza, solubilità e risposta sperimentale attesa di ciascun composto.
   NOTA: Se i composti di prova sono sensibili alla luce, tutti i passaggi di preparazione devono essere eseguiti in condizioni di luce fioca per prevenire il degrado. Ciò include la preparazione di soluzioni di stock, diluizioni e piastre di agar contenenti farmaci. Quando possibile, i piatti dovrebbero essere coperti con carta stagnola e conservati al buio. Allo stesso modo, le piastre multipozzo devono essere tenute coperte (ad esempio, con coperchi in alluminio o opache) durante l'incubazione. Si consiglia l'uso di contenitori chiusi o camere umide che limitino l'esposizione alla luce per mantenere la stabilità del composto durante tutto l'esperimento.
3. Includere i seguenti controlli in ogni esperimento: controllo solo con tampone (M9 o acqua) e controllo del veicolo (ad esempio, DMSO o etanolo alla stessa concentrazione utilizzata nei trattamenti).
   NOTA: La scelta del solvente è fondamentale. DMSO ed etanolo sono comunemente usati perché sciogliono i composti idrofobici pur rimanendo biocompatibili a basse concentrazioni. Approcci alternativi, come Tween 20 o ciclodestrine, possono essere considerati per migliorare la solubilità. Le soluzioni farmacologiche dovrebbero essere utilizzate immediatamente dopo la preparazione, poiché la stabilità nel tempo può variare e influire sulla riproducibilità.

3. Ottenere uova sincronizzate di C. elegans

NOTA: L'isolamento delle uova di C. elegans è stato ampiamente descritto in studi^{precedenti 29,32}. Qui vengono riassunti i passaggi principali, incorporando modifiche minori per ottimizzare il recupero di uova pulite e prive di detriti adatte a saghi sulla schiusa.

1. Collezione di vermi gravidi
   1. Inizia con 3–5 piastre NGM contenenti colture confluenti di adulti^{gravidi 25,26}. Preferisco piastre contenenti un gran numero di vermi gravidi e uova visibili, indicando una riproduzione attiva, evitando però colture sovraffollate o affamate. Il conteggio esatto dei vermi non è tipicamente determinato in questa fase, poiché i protocolli di isolamento delle uova in C. elegans si basano comunemente su colture riproduttive confluenti piuttosto che su conteggi precisi degli animali. Come riferimento generale, ogni lastra da 60 mm dovrebbe contenere diverse centinaia di adulti gravidi.
   2. Aggiungi acqua distillata a ogni piatto e lava delicatamente i vermi in un tubo conico da 15 mL. Evita di raschiare la superficie dell'agar per minimizzare i detriti.
   3. Centrifugare a 266 × g a 3 minuti (18–25 °C) per pelletare i vermi. Rimuovi i batteri contenenti il soprandante.
   4. Rimuovi il surnatante e ripeti il passaggio di lavaggio tre volte. Risospendi delicatamente il pellet ogni volta per migliorare la rimozione dei batteri residui.
2. Isolamento delle uova tramite sbiancamento
   1. Risospendere il pellet di vermi in una soluzione di sbiancamento fresca preparata (1,2% NaOCl e 0,5 M NaOH; volume finale 5 mL). Prepara la soluzione immediatamente prima dell'uso per assicurarti l'attività.
      NOTA: I campioni correttamente sbiancati sono stati definiti come preparazioni in cui le carcasse adulte sono state disturbate/digerite mentre le uova intatte sono rimaste morfologicamente normali e vitali. Campioni eccessivamente sbiancati sono stati identificati da uova danneggiate o lisate, morfologia anomala delle uova, tassi di schiusa ridotti o assenza di larve vitali dopo^{l'incubazione 25}.
   2. Agitare vigorosamente il tubo per favorire la dissoluzione dei corpi adulti e il rilascio delle uova. Mescola continuamente durante l'incubazione per garantire un'esposizione uniforme.
   3. Monitora attentamente la reazione e non superare i 5 minuti. Controlla visivamente: i corpi adulti dovrebbero essere per lo più disciolti mentre le uova restano intate.
   4. Monitora attentamente la reazione e fermala a 5 minuti aggiungendo acqua fredda sterile distillata (preferibilmente 10 °C) fino a un volume finale di 14 mL. Non permettere che l'incubazione superi questo tempo per evitare danni alle uova.
   5. Copri il tubo e inverti delicatamente più volte per diluire rapidamente la soluzione sbiancante. Esegui questo passaggio senza indugio per preservare la vitalità delle uova.
   6. Centrifugare a 266 × g per 3 minuti (18–25 °C) e scartare con cura il soprantantante.
   7. Lava la pellet di uovo tre volte con acqua distillata sterile per rimuovere completamente la candeggina residua. Assicurati una ristampa accurata tra un lavaggio e l'altro. Risospendere le uova in 5 mL di acqua tampone M9 o sterile.
      NOTA: Sbiancare gli ermafroditi gravidi produce una preparazione sterile delle uova adatta a sagaggi sincronizzati. In assenza di cibo, le larve schiuse entrano in arresto dello sviluppo L1 e riprendono lo sviluppo in modo sincrono al momento dell'alimentazione.
3. Fase di purificazione (flottazione del saccarosio)
   1. Esegui questo passaggio se dopo lo sbiancamento sono visibili detriti di vermi.
   2. Prepara una soluzione al 30% di saccarosio diluendo una soluzione sterile al 60% di saccarosio (ad esempio, miscela a pari volume: 5 mL di saccarosio al 60% con 5 mL di acqua distillata).
   3. Aggiungi la soluzione di saccarosio al pellet e mescola delicatamente per inversione. Evita il vortice.
      NOTA: Poiché questa fase di purificazione è breve e seguita da immediati passaggi di lavaggio per rimuovere il saccarosio residuo, non sono stati osservati effetti rilevabili sulla vitalità delle uova nelle condizioni utilizzate in questo studio. Al contrario, la rimozione dei detriti di vermi migliora sostanzialmente la visualizzazione delle uova, l'accuratezza del conteggio e l'uniformità dell'esposizione al farmaco tra i campioni.
   4. Centrifugare a 266 × g per 5 minuti (18–25 °C).
   5. Identifica la deposizione delle uova come un sottile anello bianco sulla parte superiore della soluzione. Raccogli immediatamente 4 mL del surnante contenente le uova spostando con attenzione la punta della pipetta lungo l'anello.
   6. Esegui questo passaggio rapidamente, poiché le uova iniziano ad affondare poco dopo la centrifugazione a causa della gravità.
   7. Trasferire il soprandanante raccolto in un tubo pulito contenente acqua distillata sterile. Lava le uova due volte con acqua fredda sterile per rimuovere il residuo di saccarosio.
      NOTA: Questo passaggio è opzionale ma fortemente consigliato. La rimozione dei detriti migliora la visualizzazione e l'accuratezza del conteggio delle uova, e garantisce un'esposizione più uniforme ai composti di prova impedendo che le uova rimangano intrappolate all'interno del materiale vermicolale residuo.
4. Preparazione della soluzione per il brodo d'uova
   1. Mescola delicatamente la sospensione delle uova prima di campionare, poiché le uova si sedimentano rapidamente.
   2. Posizionare tre gocce da 20 μL su un vetrino e contare le uova sotto uno stereomicroscopio.
   3. Calcola la media e regola la concentrazione a 50–100 uova per 100 μL usando il tampone M9. Mescola di nuovo prima di aliquotare per mantenere una distribuzione uniforme.
   4. Attribuire il volume richiesto di sospensione di uova per ogni condizione sperimentale secondo il protocollo selezionato.

4. Formati di analisi per la schiusa delle uova

1. Esposizione a breve termine alle uova in tubi microcentrifughe (formato ad alto controllo)
   NOTA: Questa configurazione sperimentale si basa sulle procedure²⁵ descritte in precedenza, con adattamenti per migliorare il controllo delle condizioni di esposizione e della riproducibilità.
   1. Preparazione delle piastre di agar per i saggi di schiusa delle uova
      1. Prepara le piastre di agar senza farmaci usando solo agar e acqua distillata (1,7 g di agar in 100 mL d'acqua). Non aggiungere nutrienti o batteri, poiché l'obiettivo è valutare la schiusa delle uova senza interferenze da parte di fonti alimentari. Versare circa 3 mL di agar per ogni piastra di Petri da 35 mm per mantenere una profondità costante di agar tra gli esperimenti.
      2. Prepara i piatti 12–24 ore prima dell'uso. Evita di superare questa finestra temporale, poiché un'essiccazione eccessiva riduce la vitalità delle uova e influisce sul movimento delle larve.
      3. Dividere ogni lastra in quattro quadranti dopo la solidificazione per facilitare il conteggio.
      4. Conservare i piatti a 8–10 °C in condizioni sigillate per prevenire la disidratazione. Lascia che le piastre si equilibrino a temperatura ambiente prima dell'uso.
   2. Trasferire 500 μL di sospensione a uova in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per ogni condizione. Mescola delicatamente tra una fase di pipettura e l'altra per prevenire la sedimentazione delle uova, poiché le uova si depositano rapidamente per gravità. Mantenere una sospensione omogenea è fondamentale per garantire un numero di uova comparabile in diverse condizioni.
   3. Aggiungere 500 μL di soluzione di trattamento o controllo corrispondente alla sospensione di uovo da 500 μL. Incubare a 22 °C per 4–8 ore. Definisci il tempo di incubazione in anticipo e mantieni costante tra gli esperimenti (ad esempio, 6 ore), poiché le variazioni in questo tempo influenzano direttamente l'esposizione ai farmaci.
      NOTA: Prepara le soluzioni di trattamento a 2 volte la concentrazione finale desiderata, in modo che la diluizione dopo aver miscelato con la sospensione d'uovo dia la concentrazione finale di lavoro desiderata.
   4. Mantieni un'agitazione continua e delicata durante l'incubazione utilizzando un rotatore a tubo (ad esempio, rotazione verticale 5–20 giri/min) o una piattaforma oscillante. Assicurarsi che i tubi rimangano in movimento costante per prevenire la sedimentazione delle uova e favorire un'esposizione uniforme. Questo passaggio è fondamentale, poiché condizioni statiche portano all'accumulo di uova e all'esposizione eterogenea di farmaci.
   5. Centrifugare i tubi a 3.420 × g per 3 minuti (18–25 °C) dopo l'incubazione. Identifica il pellet, che appare come un piccolo deposito bianco sulla parete del tubo. Orientare i tubi in modo coerente (ad esempio, segnare un lato) prima della centrifugazione per facilitare la rapida localizzazione dei pellet e prevenire perdite accidentali durante la rimozione del sovrantante.
   6. Rimuovi il sovrantante con cura senza disturbare il pellet. Lava le uova tre volte con il tampone M9 per eliminare il residuo di composto. Sospendere il pellet finale a 240 μL di buffer M9.
   7. Placca la sospensione su piastre di agar erogando 20 μL per quadrante. Usa tre piastre per condizione. Lascia asciugare completamente le gocce prima di spostare o invertire le piastre per evitare lo spostamento delle uova sulla superficie.
      NOTA: Inizia con un volume totale di sospensione delle uova maggiore rispetto a quello strettamente richiesto per compensare la perdita durante le fasi di lavaggio e assicurati una dimensione finale sufficiente per la placcattura e il conteggio. Per semplificare la procedura e ridurre l'uso delle piastre di agar, soprattutto in ambito didattico, trasferire le uova sospese direttamente in una piastra multipozzo invece che su piastre di agar. Regolare il volume finale a 200 μL per pozzo e riempire i pozzi inutilizzati con acqua sterile per minimizzare l'evaporazione.
2. Esposizione diretta alle uova su piastre di agar contenenti farmaci
   1. Prepara una soluzione di agar contenente solo agar e acqua distillata sterile (1,7 g di agar in 100 mL). Riscaldare fino a disciolta completamente e mantenere la soluzione liquida. Lascia raffreddare l'agar a 50–55 °C prima di aggiungere qualsiasi composto e monitora la temperatura con un termometro da laboratorio. Questo passaggio è fondamentale per preservare la stabilità del composto e garantire un'incorporazione omogenea, come descritto^{in precedenza 28}. Prepara almeno cinque concentrazioni per composto per consentire l'analisi concentrazione-risposta e la stima IC₅₀ .
      NOTA: Non aggiungere fonti di cibo batterici. In assenza di cibo, le larve schiuse entrano in arresto dello sviluppo sincronizzato della L1, impedendo la progressione verso stadi larvali successivi durante il periodo^{di analisi 26,33}.
   2. Aggiungi il volume appropriato di soluzione farmacologica o controllo del veicolo all'agar raffreddato. Mescola delicatamente con lenta inversione per garantire una distribuzione omogenea. Evita vortici o scuotiti vigorosi per prevenire la formazione di bolle.
   3. Versa immediatamente circa 3 mL di agar in piastre di Petri da 35 mm. Lavora costantemente per mantenere una temperatura e uno spessore costanti della placca. Prepara almeno 3–5 piastre per condizione.
   4. Conservazione e gestione delle piastre come segue: Permettere alle piastre di solidificarsi a temperatura ambiente su una superficie piana. Conservare i piatti rovesciati per evitare che la condensa raggiunga la superficie dell'agar.
   5. Prepara l'esperimento: semina 50–100 uova direttamente sulle piastre di agar. Mantenere parametri sperimentali costanti, inclusi temperatura, tempo di incubazione, umidità e tempi di preparazione delle lastre. Utilizzare almeno cinque concentrazioni per l'analisi concentrazione-risposta.
      NOTA: Preparare i piatti 12–24 ore prima dell'uso. Evita l'eccessiva seccazione, poiché potrebbe influire sulla vitalità delle uova e sul movimento delle larve. Avvolgi i piatti per ridurre la disidratazione e proteggerti dalla luce quando si lavora con composti fotosensibili. Conserva i piatti in un ambiente pulito, preferibilmente umidificato (ad esempio, un contenitore sigillato con carta umida) per minimizzare la variabilità.
3. Saggio di schiusa delle uova in piastre multipozzo (formato da media ad alta produttività)
   NOTA: Questo formato è ampiamente utilizzato sia negli studi su C. elegans che negli studi sui nematodi parassiti per lo screening a media o alta produttività, consentendo la valutazione parallela di più composti e concentrazioni in condizioni standardizzate.
   1. Preparazione delle piastre del pozzo e progettazione sperimentale: Utilizzare piastre a 96 pozzi (o un formato alternativo a seconda delle esigenze di throughthrough). Preparare in anticipo la disposizione delle placche e definire le concentrazioni di farmaci (disposte tra colonne), repliche (tra file) e controlli, inclusi controlli solo per tampone (M9 o acqua) e veicoli (ad esempio, DMSO o etanolo alla stessa concentrazione finale utilizzata nei trattamenti).
      NOTA: Utilizzare piastre multipozzo trasparenti a fondo piatto per consentire la visualizzazione diretta e il conteggio in ogni pozzo sotto illuminazione LED trasmessa con uno stereomicroscopio. Le uova e le larve di L1 schiuse vengono quantificate direttamente nei pozzi senza fasi di trasferimento, minimizzando la perdita di campioni e la gestione degli artefatti.
   2. Precarica ogni pozzo con il volume appropriato di soluzione o controllo farmacologico. Usa volumi uguali su tutti i pozzi.
   3. Aggiunta della sospensione a uova
      1. Preparare una sospensione di uova ben omogeneizzata con una concentrazione definita (vedi Sezione 2).
      2. Aggiungi un volume uguale di sospensione di uova a ciascun pozzo contenente la soluzione farmacologica. Usa un volume finale di 200 μL per pozzo.
      3. Regola la densità delle uova ad almeno 30 uova per pozzo (idealmente 30–100). Non superare le 100 uova per pozzo, poiché il sovraffollamento complica notevolmente la quantificazione manuale. Le uova individuali diventano difficili da distinguere, mentre le larve mobili di L1 nuotano attivamente attraverso il pozzo, riducendo la precisione del conteggio e aumentando la variabilità sperimentale.
      4. Mescola delicatamente la sospensione delle uova prima di dispensarla per garantire una distribuzione uniforme.
   4. Carica il piatto con attenzione. Evita di introdurre bolle d'aria. Pipetta costantemente e cambia le punte tra le condizioni per prevenire contaminazioni incrociate. Tocca delicatamente la piastra per assicurarti che tutto il contenuto si depositi sul fondo dei pozzi.
   5. Condizioni di incubazione: Incubare la piastra a 20–22 °C in condizioni controllate e umide per un totale di 24 ore dall'isolamento delle uova.
      NOTA: Minimizzare la variabilità evitando l'uso di pozzi esterni o riempirli con tampone per ridurre l'evaporazione. Incubare le piastre in una camera umidificata (ad esempio, un contenitore sigillato con carta umida) e proteggerle dalla luce quando si lavora con composti fotosensibili. Evita movimenti inutili durante l'incubazione. Mantenere una tempistica costante della preparazione delle uova e dell'esposizione al farmaco su tutte le repliche, poiché le variazioni possono influenzare la fase di sviluppo e l'interpretazione dei dati.

5. Valutazione e conteggio

1. Valutare la schiusa delle uova 24 ore dopo l'isolamento, assicurandosi che le condizioni di controllo abbiano raggiunto la schiusa completa sotto la temperatura definita. Calcola questo punto temporale dal momento della raccolta degli uova per consentire uno sviluppo embrionale sufficiente. Considera qualsiasi uovo ancora non schiuso a questo stadio come influenzato dal trattamento.
2. Esamina i campioni sotto uno stereomicroscopio. Per ogni condizione (piastre di agar o piastre multipozzo), quantificare il numero di uova non schiuse e il numero di larve L1 schiuse.
3. Scansionare l'intera area di osservazione, inclusi i bordi delle placche e i confini dei pozzi, poiché le larve mobili di L1 possono distribuirsi in modo irregolare e accumularsi in queste regioni.
   NOTA: Eseguire il conteggio diretto sotto stereomicroscopio per una valutazione rapida senza attrezzature aggiuntive. Mantenere una densità di uova costante in tutte le condizioni, utilizzare almeno 3–5 repliche tecniche per condizione e eseguire almeno tre esperimenti indipendenti utilizzando diverse preparazioni di uova per garantire confronti affidabili.

6. Acquisizione e documentazione delle immagini

1. Acquisire immagini utilizzando uno stereomicroscopio dotato di una fotocamera digitale. Per le piastre di agar, registra ogni quadrante; Per le piastre multipozzo, registra ogni singolo pozzo. Assicurarsi che tutte le aree siano catturate, inclusi i bordi delle placche e i confini dei pozzi, dove le larve possono accumularsi.
   NOTA: Gli oculari standard 10x e gli obiettivi, che variano da 0,6x a 5x (ingrandimento totale da 6x a 50x), sono ampiamente utilizzati e permettono una visualizzazione chiara sia delle uova che delle larve L1 all'interno dell'area di conteggio. Usa illuminazione LED trasmessa. Mantieni impostazioni costanti di acquisizione della fotocamera (luminosità, esposizione e contrasto) in tutte le condizioni sperimentali per garantire una qualità dell'immagine coerente e un confronto affidabile tra i campioni.
2. Utilizzare software di acquisizione appropriati per catturare le immagini. Elaborare e analizzare immagini utilizzando software di analisi delle immagini. Mantenere parametri di analisi identici in tutte le condizioni sperimentali, inclusi luminosità, contrasto, ingrandimento, stessa area/campo di acquisizione e criteri di conteggio.
3. Quantificare il numero di uova non schiuse e larve L1 dalle immagini acquisite. Considera le larve come schiuse solo quando sono completamente emerse dal guscio d'uovo. Le uova contenenti larve parzialmente emerse devono essere classificate come non schiuse. Applicare criteri di classificazione identici in tutte le condizioni sperimentali.
4. Incubare piastre o piastre multipozzo per ulteriori 12–24 ore a 16–18 °C per valutare se l'inibizione osservata della schiusa delle uova sia reversibile. Nelle condizioni sperimentali definite, le uova che non si sono schiuse in questa fase sono considerate colpite dal trattamento.

7. Analisi dei dati

1. Calcola l'inibizione della schiusa delle uova come:
   Frazione di uova non schiuse = (Numero di uova non schiuse) / (numero totale di uova + larve)
2. Esegui almeno 3–5 esperimenti indipendenti utilizzando diversi lotti di uova. Esprimi i dati come media ± deviazione standard (media ± SD).
3. Generare curve concentrazione-risposta usando una regressione non lineare e determinare i valori IC₅₀ .
4. Effettuare confronti statistici tra condizioni utilizzando il test t di Student e definire la significatività statistica a p < 0,05.
5. Analizza i dati utilizzando software statistici appropriati.

8. Applicazione di saghi per schiusa delle uova utilizzando trans-cinnamaldeide e acetato di linalile

NOTA: Questo studio non si concentra su un composto specifico, ma utilizza agenti rappresentativi per illustrare come ogni formato sperimentale possa essere implementato, controllato e interpretato in condizioni comparabili. Il trans-cinnamaldeide (TCA) è stato scelto come composto illustrativo perché è stato precedentemente caratterizzato e produce costantemente un'inibizione robusta e riproducibile della schiusa delle uova nelle tre configurazioni di test presentate qui. Importante, lo scopo dell'inclusione della TCA era dimostrare l'implementazione del protocollo e il comportamento rappresentativo di concentrazione-risposta, piuttosto che stabilire la potenza relativa o la prestazione comparativa tra i formati.

1. Allestimento sperimentale e preparazione del composto
   1. Preparare le piastre di agar (3 mL per piastra da 35 mm) 12–24 ore di anticipo utilizzando un mezzo solo ad agar (1,7% in acqua distillata). Etichetta le lastre, dividile in quattro quadranti per facilitare il conteggio, conservale in condizioni sigillate per prevenire la disidratazione e bilanciale alla temperatura ambiente prima dell'uso.
   2. Preparare soluzioni fresche di trans-cinnamaldeide (TCA) in DMSO e diluirle in acqua sterile o agar per ottenere otto concentrazioni finali (0,05–0,7 mM). Mantieni la concentrazione finale di DMSO sotto lo 0,2% in tutte le condizioni. Includere acqua, agar e/o DMSO come controlli negativi e veicoli, rispettivamente.
   3. Testare l'acetato di linalil a 5 mM come controllo negativo per valutare la capacità del saggio di discriminare tra composti attivi e inattivi in condizioni sperimentali identiche.
   4. Preparare sospensioni sincronizzate delle uova come descritto sopra e regolare la densità a 50–100 uova per 100 μL. Utilizzare volumi uguali e numeri di uova comparabili in tutti i formati per garantire la coerenza tra le condizioni.
2. Applicazione di formati sperimentali utilizzando un composto di riferimento
   1. Esposizione a breve termine in tubi a microcentrifuga (formato ad alto controllo)
      1. Mescola 500 μL di sospensione uovo con 500 μL di soluzione terapeutica contenente 0,05–0,7 mM di TCA. Incubare i tubi per 6 ore a 18–20 °C e mantenere il tempo di incubazione costantemente in tutti gli esperimenti.
      2. Tieni i tubi sotto una lenta agitazione continua e gentile usando un rotatore durante l'incubazione.
      3. Centrifugare i tubi a 3.420 × g per 3 minuti (18–25 °C) dopo l'esposizione e rimuovere con cura il soprantantante. Lavare le uova tre volte con acqua distillata per rimuovere i residui e limitare l'esposizione durante il periodo di incubazione definito.
      4. Risospendere il pellet finale in acqua distillata da 240 μL e placcare la sospensione su piastre di agar a 20 μL per quadrante usando tre piastre per condizione. Incubare le placche a 16–18 °C per 24 ore dopo l'isolamento delle uova.
   2. Esposizione diretta a piastre agar contenenti farmaci
      1. Preparare le piastre di agar contenenti farmaci aggiungendo soluzioni di TCA all'agar raffreddato a 50–55 °C e miscelando delicatamente per garantire una distribuzione omogenea. Versare circa 3 mL di agar per piastra e preparare le lastre 12–24 ore prima dell'uso.
      2. Le uova seminano direttamente sulla superficie delle lastre a densità paragonabili a quelle usate in altri formati (50–100 uova per 100 μL). Non eseguire i passaggi di lavaggio in questa configurazione.
      3. Incubare le placche a 16–18 °C fino a 24 ore dopo l'isolamento delle uova.
   3. Analisi multipozzo a piastre (formato da media ad alta produttività)
      1. Precarica le piastre a 96 pozzi con soluzioni e controlli farmacologici. Aggiungere sospensioni di uova per ottenere un volume finale di 200 μL per pozzo e una densità di 50–100 uova per pozzo.
      2. Garantire una distribuzione omogenea durante il carico evitando bolle e mantenendo volumi costanti tra i pozzi. Incubare le piastre a 20–22 °C in condizioni umide per 24 ore dopo l'isolamento delle uova.
3. Acquisizione e quantificazione dell'immagine
   1. Valutare la schiusa delle uova 24 ore dopo l'isolamento, una volta completata la schiusa in condizioni di controllo. Contare il numero di uova non schiuse e larve L1 sotto un microscopio stereoscopico per ogni condizione. Esamina attentamente i bordi delle placche e i confini dei pozzi, poiché le larve possono accumularsi in queste regioni.
   2. Acquisire immagini utilizzando uno stereomicroscopio dotato di una fotocamera digitale per scopi di documentazione. Registra ogni quadrante per le piastre di agar e immagini sistematiche di ogni pozzo per piastre multipozzo. Utilizzare software di analisi delle immagini quando necessario per supportare la quantificazione.
   3. Incubare le placche per ulteriori 12–24 ore dopo l'acquisizione dell'immagine per valutare se l'inibizione osservata della schiusa sia reversibile.
   4. Esegui tutti gli esperimenti utilizzando almeno tre repliche biologiche indipendenti.

Risultati

La TCA ha prodotto una chiara inibizione della schiusa delle uova dipendente dalla concentrazione in tutti i formati sperimentali, come mostrato nella Figura 1. Sono presentate curve concentrazione-risposta rappresentative per ogni configurazione di saggio: tubi microcentrifughe (Figura 1A), esposizione diretta su piastre di agar (Figura 1B) e piastre multipozzo (Figura 1C

Discussione

Questo studio presenta una piattaforma semplice e adattabile per saghi sulla schiusa delle uova in Caenorhabditis elegans, strutturata attorno a tre formati sperimentali complementari che differiscono per controllo, dinamica di esposizione e scalabilità. Piuttosto che definire un unico protocollo ottimale, i nostri risultati supportano l'idea che i saghi sulla schiusa delle uova debbano essere considerati un quadro metodologico flessibile adattabile a specifici obiettivi sperime...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	dovrebbe essere preparato fresco (1,7 gr in 100 mL H2O)
Soluzione candeggina	N/A	N/A	1,2 % (v/v) NaOH e 0,5 M NaOH
Centrifugatrice	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifugatrice	BiofugePICO a tubo eppendorf	Heraeus 75003235
Fotocamera digitale	ToupCam	TP605100A	Fotocamera digitale industriale. Lunghezza focale regolabile USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetato	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	dovrebbe essere preparato fresco
Terreno Lysogeny broth (LB)	N/A	N/A	10 g Bacto-triptone, 5 g estratto di lievito, 10 g NaCl per 1 L di acqua distillata
Buffer M9	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 per 1 L di acqua distillata
Mini Rotatore	BioSan	Bio RS-24
Terreno di crescita dei nematodi (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptone per 1 L di acqua distillata. Sterilizzare tramite autoclavaggio. Supplemente 1 mL di colesterolo (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL di tampone fosfato di potassio (1 M, pH 6,0) e 1 mL  MgSO4 (1 M)
Piatto Petri (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Piatto Petri (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Solo per uso in laboratorio, Polistirene.
Pipetta	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Versione 12.0
Stereomicroscopio	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Stereomicroscopio trinoccolare (ingrandimento totale 10x–40x; illuminazione LED incidente e trasmessa)
Saccarosio	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) saccarosio
Piatto di coltura cellulare 96 pozzetti	Biofil	TCP 012096	Polistirene, Coperchio a bassa evaporazione.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldeide (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Dovrebbe essere preparato fresco