Farmacologia di rete e ricerca sperimentale del β-sitosterolo nel trattamento della broncopatia cronica ostruttiva tramite il recettore dei glucocorticoidi

Sommario

β-sitosterolo alleviava la BPCO e potenziava l'efficacia del desametasone, con il recettore dei glucocorticoidi che mediava questo effetto. Inoltre, il β-sitosterolo ha ridotto l'infiammazione, lo stress ossidativo e la senescenza cellulare sia nelle cellule epiteliali bronchiali stimolate dalla CSE sia nei topi BPCO indotti dal fumo di sigaretta.

Abstract

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è un disturbo respiratorio diffuso caratterizzato da infiammazione persistente, stress ossidativo e progressivo declino della funzione polmonare. Il potenziale terapeutico del β-sitosterolo nella BPCO rimane poco chiaro. Questo studio mirava a indagare gli effetti protettivi del β-sitosterolo contro la BPCO e a chiarirne il meccanismo sottostante. Lo screening del database ha identificato il recettore dei glucocorticoidi (GR) come potenziale bersaglio del β-sitosterolo. Sono stati stabiliti un modello murino per BPCO indotto dal fumo di sigaretta e un modello di cellule BEAS-2B stimolato con estratto di fumo di sigaretta (CSE). Funzionalità polmonare, marcatori correlati alle lesioni polmonari, infiammazione, stress ossidativo e senescenza cellulare sono stati valutati utilizzando (RT-qPCR), test fluorescenti DCFH-DA e kit di rilevamento della senescenza. Sono stati inoltre valutati gli effetti del β-sitosterolo da solo o in combinazione con desametasone (DEX). β-sitosterolo ha migliorato significativamente la funzione polmonare, ha normalizzato i marcatori correlati al danno polmonare e ha attenuato infiammazione, stress ossidativo e senescenza cellulare sia nelle cellule BEAS-2B stimolate dalla CSE sia nei topi esposti al fumo di sigaretta. Questi effetti protettivi erano accompagnati da un aumento dell'espressione della GR. Inoltre, il β-sitosterolo ha aumentato la reattività alla DEX e il trattamento combinato con β-sitosterolo e DEX ha prodotto miglioramenti maggiori nella funzione polmonare, nei marcatori di lesione polmonare, nell'infiammazione, nei livelli di specie reattive dell'ossigeno e nella senescenza cellulare rispetto al trattamento DEX da solo. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che il β-sitosterolo allevia i cambiamenti patologici associati alla BPCO, almeno in parte, regolando all'aumento l'espressione della GR e aumentando l'efficacia terapeutica della DEX, evidenziandone il potenziale come strategia adiuvante per il trattamento della BPCO.

Introduzione

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una malattia respiratoria progressiva caratterizzata da infiammazione persistente delle vie aeree, danni alveolari e ostruzione irreversibile del flusso d'aria che compromette la funzione respiratoria e riduce la qualità^{della vita 1}. La sua prevalenza aumenta significativamente con l'età e il rischio per le persone di sessantacinque anni e oltre è circa cinque volte superiore a quello di chi ha meno di^quaranta2 anni. Questa tendenza demografica è associata a un aumento dell'incidenza delle malattie, della mortalità e della^{disabilità 3}. Le proiezioni epidemiologiche indicano che entro il 2030 la BPCO potrebbe diventare la quarta causa di morte a livello mondiale, rappresentando circa il 5% di tutti i^{decessi (4,5,6}). Attualmente, i fattori di rischio identificati includono suscettibilità genetica, displasia polmonare, esposizione a particelle, bronchite cronica e infezione^{respiratoria.}

Tra i fattori di rischio, il fumo di sigaretta è il fattore patogeno più importante della^{BPCO 8}. Contiene migliaia di sostanze chimiche che possono causare danni epiteliali bronchiali, favorire l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e portare a un rimodellamento del tessuto^{polmonare 9}. L'esposizione a lungo termine può indurre lesioni epiteliali persistenti e irreversibili, favorire il rilascio di un gran numero di chemochine pro-infiammatorie, aumentare significativamente la produzione (ROS) e indurre apoptosi^{cellulare 10}. Molti studi hanno dimostrato che i livelli aumentati di chemiocine pro-infiammatorie come l'interleucina-8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), insieme a un'eccessiva produzione di ROS e senescenza cellulare, sono strettamente correlati alla gravità della^{BPCO 11,12}. Questo evidenzia la necessità di agenti che possano modulare efficacemente e in sicurezza questi fattori patogeni chiave per esercitare effetti protettivi e terapeutici nella BPCO.

I fitosteroli sono composti bioattivi naturali presenti ubiquitariamente nelle membrane cellulari delle piante. Tra questi, il β-sitosterolo è il più abbondante ed è ampiamente distribuito in alimenti vegetali ricchi di lipidi come verdure, frutta secca, semi e olio d'oliva 13,14,15,16. Gli studi hanno confermato che la somministrazione di β-sitosterolo a dosi fino a 1000 mg/kg in ratti e topi non è associata a citotossicità o^{genotossicità 17}. Inoltre, la ricerca ha dimostrato che il β-sitosterolo presenta proprietà antiossidanti attraverso i suoi effetti sugli enzimi antiossidanti e sui recettori degli estrogeni^{umani 18}.

β-sitosterolo mostra un ampio spettro di attività farmacologiche, tra cui^{antinfiammatori 19}, antipiretici²⁰,^{analgesici 21} e effetti antidiabetici¹³. Ha inoltre mostrato potenziale terapeutico in vari modelli di patologia, come la colite e l'infiammazione^{intestinale 22}, e possiede proprietà anti-aterosclerotiche²³ e^{immunomodulatrici 24}. Inoltre, ha un profilo di sicurezza favorevole. Date queste caratteristiche, il β-sitosterolo ha suscitato notevole interesse come potenziale candidato farmaco. Tuttavia, il suo ruolo preciso e i meccanismi sottostanti nella BPCO rimangono in gran parte poco chiari.

Pertanto, il presente studio ha mirato a indagare i potenziali effetti terapeutici e i meccanismi sottostanti del β-sitosterolo nella BPCO. In particolare, è stato utilizzato un modello di lesione delle cellule BEAS-2B indotto da estratto di sigaretta (CSE) per valutare se il β-sitosterolo potesse alleviare efficacemente i danni cellulari mediati dalla CSE, identificando così una nuova molecola candidata per strategie terapeutiche per la BPCO.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità alle linee guida di Farmacologia Clinica e Tossicologia di Base e Clinica per studi sperimentali^{e clinici 25}. Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale del Secondo Ospedale Affiliato, Scuola di Medicina dell'Università di Zhejiang (Approvazione n. 20230102), e tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guidatrici del Comitato Etico degli Animali. Lo studio è stato condotto in accordo con le linee guida ARRIVE.

Screening dei componenti chiave e dei target tramite farmacologia di rete

Componenti attivi di Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. sono stati recuperati dal Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database (TCMSP; consultato il 12 marzo 2024). I composti candidati sono stati selezionati secondo i seguenti criteri ADME: biodisponibilità orale (OB) ≥ 30%, somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18 e permeabilità al Caco-2 ≥ −0,4²⁵. I composti che soddisfacevano tutti e tre i criteri sono stati mantenuti come ingredienti attivi candidati per analisi successive.

La struttura canonica SMILES, il sistema semplificato di input line system (SMILES) del β-sitosterolo, è stata ottenuta da PubChem (consultato il 18 marzo 2024) e importata in SwissTargetPrediction (consultato il 21 marzo 2024) per la previsione dei bersagli. Homo sapiens fu selezionato come specie bersaglio. I potenziali bersagli sono stati previsti sulla base della somiglianza strutturale 2D e 3D tra β-sitosterolo e liganti noti nel database. I bersagli previsti con probabilità superiore a 0 venivano mantenuti e le voci duplicate venivano rimossi.

I geni associati alla BPCO sono stati recuperati dal Therapeutic Target Database (TTD; consultato il 25 marzo 2024) e dal Comparative Toxicogenomics Database (CTD; consultato il 28 marzo 2024) utilizzando la parola chiave "chronic obstructive pulmonary disease". Dopo la rimozione dei geni duplicati, i geni associati alla BPCO sono stati intersecati con i bersagli previsti di β-sitosterolo per identificare i bersagli candidati potenzialmente coinvolti negli effetti terapeutici del β-sitosterolo contro la BPCO.

Aggancio molecolare tra β-sitosterolo e GR

La struttura tridimensionale del β-sitosterolo in formato SDF è stata recuperata dal database PubChem (consultato il 2 giugno 2026), mentre la struttura cristallina del recettore dei glucocorticoidi (GR) è stata ottenuta dal Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; consultato il 3 giugno 2026). Dopo la preparazione standard delle strutture del ligando e dei recettori, è stato effettuato l'aggancio molecolare utilizzando la piattaforma online CB-Dock2 (consultato il 3 giugno 2026). I file preparati di ligando e recettore venivano caricati sulla piattaforma e i calcoli di attracco venivano effettuati utilizzando i parametri predefiniti.

Analisi di arricchimento funzionale dell'Ontologia Genica (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Tutti i geni target previsti del β-sitosterolo sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento funzionale GO e arricchimento delle vie KEGG. Gli esiti di arricchimento, inclusi processi biologici significativamente arricchiti, componenti cellulari, funzioni molecolari e vie di segnalazione, sono stati selezionati e memorizzati nel File Supplementare 1 per un'analisi bioinformatica successiva.

Modellazione e raggruppamento animale

La dimensione del campione è stata fissata a sei animali per gruppo sulla base di uno studio precedente che ha effettuato un'analisi a priori della potenza utilizzando il software G*Power (α = 0,05, potenza = 0,80) e ha dimostrato che n = 6 era sufficiente per rilevare differenze biologicamente rilevanti in condizioni sperimentali^{comparabili 26}. I maschi C57BL/6 topi di età compresa tra 6 e 8 settimane (20 ± 2 g) sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi: gruppo di controllo, gruppo modello BPCO, gruppo BPCO + desametasone (DEX), gruppo BPCO + β-sitosterolo e gruppo BPCO + DEX + β-sitosterolo. I topi sono stati ospitati in condizioni standard di laboratorio (25 °C, 12 ore di ciclo chiaro/buio) con libero accesso a cibo e acqua standard e sono stati lasciati ad acclimatarsi per 1 settimana prima della sperimentazione.

Per la costruzione del modello BPCO, i topi venivano posti in una camera di esposizione al fumo di sigaretta a corpo intero (63 cm × 55 cm × 45 cm) e esposti al fumo di sigaretta tradizionale per 12 settimane. Ogni sigaretta conteneva 10 mg di catrame, 0,9 mg di nicotina e 10 mg di monossido di carbonio. L'esposizione al fumo è stata effettuata due volte al giorno (5 giorni a settimana) alle 9:30 e alle 15:00, con il fumo generato da 18 sigarette consegnate nella camera per 90 minuti per²⁷ sessioni.

Per valutare gli effetti terapeutici degli interventi, la somministrazione di farmaci è stata avviata dopo 8 settimane di esposizione al fumo di sigaretta e proseguita per le restanti 4 settimane. A partire dalla nona settimana, i topi dei rispettivi gruppi di trattamento ricevevano una somministrazione intragastrica giornaliera di DEX (1 mg/kg)²⁸ o β-sitosterolo (50 mg/kg)^29,30 1 ora prima dell'esposizione al fumo di sigaretta. Studi farmacocinetici precedenti hanno riportato una biodisponibilità orale di circa il 4% di β-sitosterolo nei^{roditori 31}. Inoltre, diversi studi sui topi hanno impiegato dosi che vanno da 20 a 50 mg/^{kg 32}. Pertanto, è stata selezionata una dose di 50 mg/kg per garantire un'adeguata esposizione sistemica, rimanendo però entro l'intervallo comunemente utilizzato negli studi preclinici.

I topi del gruppo di controllo sono stati esposti all'aria filtrata della stanza, mentre quelli dei gruppi modello e di trattamento hanno ricevuto un volume equivalente di soluzione salina normale come veicolo. Al termine del periodo sperimentale, i topi venivano profondamente anestetizzati con isoflurano fino alla perdita del riflesso pedale e eutanasiati tramite dissanguinazione tramite raccolta di sangue dell'aorta addominale. La cavità toracica fu immediatamente aperta e i tessuti polmonari bilaterali intatti furono accuratamente escossi, sciacquati con soluzione salina fosfatata (PBS) freddo e posato sul ghiaccio. Per la raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), la trachea è stata cannulata e lavata con PBS freddo sterile, che è stato delicatamente instillato e ritirato ripetutamente per raccogliere il liquido di lavaggio. I tessuti polmonari e i campioni di BALF venivano mantenuti sul ghiaccio e successivamente processati per analisi a valle.

Coltura cellulare BEAS-2B

Le cellule bronchiali epiteliali umane BEAS-2B sono state mantenute nel Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) di Dulbecco, contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina sotto il 5% di CO₂ a 37 °C.

Preparazione del CSE ed esposizione alle cellule BEAS-2B

Le cellule BEAS-2B sono state lavate con soluzione salina tamponata fosfato e seminate in piastre da 24 pozzi in triplicato, a una densità di 5 × 10⁴ cellule per pozzo. Dopo 12 ore di coltura, le cellule hanno raggiunto circa il 60% di confluenza e sono state esposte alla CSE. Il CSE è stato preparato di nuovo come descritto in precedenza, con modifiche^{minori 33}. Per un breve periodo, una sigaretta commerciale non filtrata veniva continuamente bruciata, e il fumo principale veniva fatto bollire in 10 mL di mezzo senza siero utilizzando una pompa a vuoto a portata costante di 1,05 L/min (circa −11 kPa a pressione negativa) per circa 5 minuti fino a quando la sigaretta non era completamente bruciata. La soluzione ottenuta veniva prima sottoposta a pre-filtrazione per rimuovere grandi impurità particelle, poi sterilizzata tramite un filtro microporoso sterile di 0,22 μm per eliminare le particelle residue; la soluzione di stock risultante fu definita come 100% CSE. Tutto il CSE appena preparato veniva utilizzato per il trattamento cellulare immediatamente dopo la filtrazione senza conservazione. Le cellule sono state stimolate con un mezzo contenente il 2,5% di CSE. Dopo 24 ore di trattamento CSE, i soprannatanti della coltura sono stati raccolti e conservati a -40 °C per un'analisi^{successiva 34}.

Reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR)

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule BEAS-2B utilizzando un kit di estrazione totale di RNA e trascritto inversamente in cDNA tramite un kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni dei produttori. Successivamente, l'RT-qPCR è stato eseguito utilizzando un sistema di rilevamento PCR in tempo reale e un master mix qPCR basato su SYBR Green. Tutti gli esperimenti RT-qPCR sono stati condotti con tre repliche biologiche e tre repliche tecniche per campione per garantire l'affidabilità dei dati.

Ogni reazione qPCR è stata eseguita in un volume totale di 20 μL, contenente 10 μL di miscela master SYBR Green qPCR, 0,4 μL di primer diretto, 0,4 μL di primer inverso, 2 μL di modello di cDNA diluito e 7,2 μL di acqua priva di RNasi. Le condizioni di amplificazione erano le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 secondi e ricottura/estensione a 60 °C per 30 secondi. I livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt, con GAPDH che fungeva da gene di riferimento interno. Le sequenze di primer utilizzate in questo studio sono menzionate nella Tabella Supplementare 1.

Analisi delle specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS)

La produzione intracellulare di ROS nelle cellule BEAS-2B è stata valutata utilizzando la sonda fluorogenica 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) e analizzata tramite citometria a flusso. Durante l'acquisizione della citometria in flusso, è stata applicata una strategia standard di gating di scatter diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) per escludere detriti cellulari e selezionare cellule singole intatte. Per ogni campione sono stati acquisiti in totale 10.000 eventi cellulari validi. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione erano impostate rispettivamente a 488 nm e 525 nm. I dati citometrici di flusso sono stati successivamente analizzati per quantificare l'intensità di fluorescenza ROS intracellulare.

Determinazione del livello di malondialdeide (MDA)

Il contenuto intracellulare di MDA è stato misurato utilizzando un kit di analisi per perossidazione lipidica secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, le cellule BEAS-2B trattate venivano prelevate e lisate, quindi centrifugate a bassa temperatura per raccogliere il soprantantante. Successivamente è stata eseguita la reazione colorimetrica dell'acido tiobarbiturico (TBA) e l'assorbanza è stata misurata a 532 nm utilizzando un lettore di micropiastre. I livelli relativi di MDA sono stati calcolati secondo la curva standard.

Valutazione della senescenza cellulare

La senescenza cellulare è stata valutata utilizzando un saggio di rilevamento della senescenza basato sull'attività di β-galactosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza. Le cellule SA-β-gal-positive sono state quantificate tramite citometria a flusso. Parallelamente, i livelli di espressione dell'mRNA dei marcatori associati alla senescenza p53 e p21 sono stati determinati tramite RT-qPCR.

Saggio di proliferazione cellulare

La proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando un kit di analisi di vitalità cellulare colorimetrica. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche.

Analisi di knockdown della GR

La trasfezione cellulare è stata eseguita utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi. Sono stati trasfettati i seguenti oligonucleotidi: RNA interferente piccolo (si-GR) che mira al recettore dei glucocorticoidi e RNA interferente piccolo controllo negativo (si-NC). Le sequenze siRNA candidate mirate alla GR sono state progettate utilizzando la piattaforma online di bioinformatica siDirect 2.0. Dopo la trasfezione, le cellule sono state coltivate per 48 ore e tutti i siRNA sono stati utilizzati a una concentrazione finale di 50 nM. L'efficienza del knockdown è stata verificata misurando l'espressione dell'mRNA della GR tramite RT-qPCR.

I gruppi di controllo dei veicoli sono stati inclusi sia negli esperimenti di trattamento con β-sitosterolo sia negli esperimenti di trasfezione. Per l'intervento β-sitosterolo, le cellule trattate con solvente del veicolo servivano come gruppo di controllo del veicolo (indicato come CSE+0). L'analisi statistica ha confermato che non sono state osservate differenze significative tra i gruppi di controllo del veicolo e quello del blocco vuoto.

Analisi statistica

Tutti i risultati quantitativi sono stati espressi come deviazione media ± standard da tre esperimenti in vitro biologicamente indipendenti. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando software di analisi statistica. Il test di Shapiro–Wilk è stato utilizzato per esaminare la normalità della distribuzione del dataset prima dei test statistici; È stata adottata la correzione post-hoc di Bonferroni per adeguare i valori P per confronti multipli dopo l'analisi della varianza (ANOVA). I confronti tra due gruppi sono stati valutati tramite un test Student non accoppiato, mentre per confronti multi-gruppi è stato impiegato ANOVA unidirezionale o bidirezionale. Un p-valore ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

β-sitosterolo era un potenziale prodotto naturale per il trattamento della BPCO

A causa degli effetti curativi riportati di Fritillaria cirrhosa D. Don, fiore secco di Lonicera japonica Thunb., radice secca di Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. nel trattamento delle malattie^polmonari 35,36,37,38, questo studio ha utilizzato il database TCMSP per identificare sistematicamente i componenti attivi di queste erbe della Medicina Tradizionale Cinese (MTC). β-sitosterolo è stato identificato come un importante principio attivo condiviso da queste erbe della MTC (Figura 1A). Per esplorare sistematicamente il meccanismo molecolare sottostante del β-sitosterolo, le sue informazioni strutturali SMILES sono state recuperate dal database PubChem e importate nel database SwissTargetPrediction per la previsione dei bersagli; tutti i target previsti con probabilità predittiva superiore a 0 sono stati mantenuti per analisi successive. La rete di interazione ingrediente-bersaglio risultante tra β-sitosterolo e i suoi target candidati è stata visualizzata e presentata nella Figura 1B. Un totale di 43 geni target potati del β-sitosterolo sono stati previsti utilizzando il database SwissTargetPrediction. Successivamente, sono state effettuate analisi di arricchimento funzionale GO e di arricchimento delle vie KEGG sui geni target del β-sitosterolo, e tutti i dataset completi di arricchimento sono stati archiviati nel File Supplementare 1. In particolare, i processi metabolici degli steroidi sono stati identificati come uno dei percorsi più significativamente arricchiti. La letteratura accumulata ha dimostrato la stretta correlazione tra metabolismo aberrante degli steroidi e resistenza ai glucocorticoidi nella^{BPCO 39}. Inoltre, la GR è stata nettamente arricchita all'interno di cluster funzionali correlati al metabolismo degli steroidi. Questa scoperta fornisce un supporto bioinformatico fondamentale per i nostri successivi esperimenti cellulari che indagano il meccanismo con cui il β-sitosterolo migliora la sensibilità alla DEX e modifica i livelli di espressione della GR.

I geni correlati alla BPCO sono stati recuperati dai database TTD e CTD. L'analisi successiva dell'intersezione di Venn (Figura 1C) ha rivelato due geni sovrapposti tra bersagli di β-sitosterolo e geni correlati alla BPCO derivati dalla TTD, altri due geni sovrapposti tra bersagli di β-sitosterolo e geni legati alla BPCO derivati dalla CTD, e cinque geni della BPCO condivisi tra i dataset TTD e CTD. In definitiva, la GR era l'unico gene comune a tutti e tre i dataset ed era definita come il bersaglio centrale del β-sitosterolo contro la BPCO. I dati numerici dettagliati dell'analisi di Venn sono elencati nel Supplementare File 2. Per ulteriori verifiche dell'affinità di legame, è stato effettuato un aggancio molecolare tra β-sitosterolo e GR (Figura 1D). Le tasche di legame con punteggi di Vina inferiori a −7,0 kcal/mol sono state considerate come una favorevole affinità di legame. I punteggi di Vina delle tasche C1 e C5 erano rispettivamente −8,8 e −7,2 kcal/mol, indicando una forte interazione prevista tra β-sitosterolo e GR.

Le cellule BEAS-2B protette da β-sitosterolo dai danni CSE, che possono essere associati a un'elevata espressione di GR

β-sitosterolo ha mostrato un effetto protettivo significativo nel modello di lesione delle cellule BEAS-2B indotta dalla CSE. Il gruppo CSE + 0 è stato progettato come un controllo del veicolo che riceve CSE più un volume uguale di solvente senza β-sitosterolo. Come previsto, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra i gruppi CSE e CSE + 0. Il composto inibiva la produzione indotta dalla CSE di TNF-α e IL-6 in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 2A). Ha inoltre ridotto i livelli di ROS intracellulari (Figura 2B). β-sitosterolo ha inoltre ridotto significativamente il contenuto di MDA (Figura 2C), soppresso la senescenza cellulare indotta dalla CSE (Figura 2D) e ridotto i marcatori correlati alla senescenza p53 e p21 (Figura 2E). Questi effetti erano accompagnati da un'espressione all'alza dell'mRNA della GR (Figura 2F), suggerendo che la sua funzione protettiva possa essere strettamente collegata alla regolazione all'alza trascrizionale della GR. All'interno dell'intervallo di concentrazione testato, il β-sitosterolo non ha esercitato una citotossicità evidente sulla vitalità delle cellule BEAS-2B (Figura 2G), indicando una tolleranza cellulare favorevole a questo composto. Dato che 20 μg/mL (circa 48,2 μM) mostrava gli effetti inibitori più potenti, questa dose fu selezionata per gli esperimenti successivi. Sebbene non sia stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa tra i gruppi 10 μg/mL e 20 μg/mL riguardo alla soppressione delle citochine pro-infiammatorie, il 20 μg/mL di β-sitosterolo ha mostrato una lieve tendenza al ribasso nei livelli del fattore infiammatorio. Inoltre, rispetto a 10 μg/mL, 20 μg/mL ha raggiunto un'efficacia superiore nell'inibire l'accumulo di ROS e MDA indotti dalla CSE, nella riduzione della senescenza cellulare e nella regolazione all'aumento dell'espressione dell'mRNA della GR. Ciò supportava la selezione di 20 μg/mL come concentrazione ottimale di lavoro per i test di soccorso di follow-up.

I risultati RT-qPCR (Figura 2H) hanno confermato il successo del knockdown della GR. I livelli di mRNA della GR nel gruppo si-GR sono stati ridotti di circa il 78% rispetto al controllo si-NC, verificando l'efficacia del silenziamento della GR per i successivi saghi di salvataggio. Dopo la riduzione della GR, gli effetti inibitori del β-sitosterolo sui fattori infiammatori e sugli ROS sono stati significativamente invertiti (Figura 2I, J). Analogamente, l'attenuazione della senescenza cellulare da parte del β-sitosterolo è stata abrogata (Figura 2K). Nel complesso, questi risultati hanno mostrato che il β-sitosterolo svolgeva un ruolo protettivo contro la lesione indotta dalla CSE alle cellule epiteliali bronchiali attraverso meccanismi antinfiammatori, antiossidatori e anti-invecchiamento mediati dalla GR.

β-sitosterolo ha potenziato gli effetti terapeutici della DEX sulla funzione polmonare e sull'infiammazione in un modello murino di BPCO

In un modello murino di BPCO stabilito dall'esposizione al fumo di sigaretta, il trattamento con β-sitosterolo, DEX o la loro combinazione ha tutti esercitato evidenti effetti protettivi. I confronti statistici tra più gruppi sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale seguiti dal test post-hoc di Tukey. Sono stati applicati cinque stili di simboli distinti per distinguere le coorti sperimentali: cerchi per il gruppo di Controllo, triangoli per il gruppo Modello, asterischi per il gruppo Modello + DEX, quadrati per il gruppo Modello + β-sitosterolo e rombi per il gruppo Modello + DEX + β-sitosterolo. Ogni parentesi orizzontale rappresenta un confronto statistico tra due gruppi sperimentali collegati.

Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello BPCO hanno mostrato riduzioni marcate del volume espiratorio forzato in 0,1 s (FEV₀.₁), capacità vitale forzata (FVC), flusso espiratorio di picco (PEF) e rapporto FEV₀.₁/FVC. Come mostrato nella Figura 3A–D, un rapporto FEV₀.₁/FVC inferiore al 70% ha confermato l'istituzione riuscita del modello BPCO. La somministrazione di DEX o β-sitosterolo da sola ha invertito significativamente questi deficit della funzione polmonare rispetto ai topi modello, e il trattamento combinato ha portato a ulteriori miglioramenti rispetto alla somministrazione con un singolo agente. Inoltre, un rapporto MMP-9/TIMP-1 alterato è un marcatore molecolare caratteristico della rimodellazione delle vie aeree, e un'espressione elevata di MUC5AC rappresenta un'eccessiva ipersecrezione di^{muco 40,41}. Abbiamo inoltre rilevato i livelli di mRNA di MMP-9, TIMP-1 e il marcatore muco MUC5AC, e calcolato il rapporto MMP-9/TIMP-1 (Figura 3E, F). Il gruppo modello ha mostrato un rapporto MMP-9/TIMP-1 marcatamente aumentato e un'espressione elevata di MUC5AC. DEX o β-sitosterolo da soli hanno efficacemente ridotto entrambi i parametri, e il trattamento combinato ha raggiunto un'efficacia inibitoria superiore rispetto alla monoterapia.

I topi modello per BPCO hanno mostrato elevate elevate nei livelli di BALF di TNF-α e IL-6, oltre a un aumento del contenuto di ROS polmonare rispetto ai topi di controllo. DEX o β-sitosterolo da soli hanno ridotto notevolmente sia i livelli di citochine infiammatorie sia lo stress ossidativo, e il trattamento combinato ha prodotto effetti inibitori più forti (Figura 3G, H). Inoltre, l'espressione polmonare dell'mRNA della GR è stata notevolmente ridotta nei topi modello BPCO. DEX o β-sitosterolo da soli hanno aumentato significativamente l'espressione della GR e, in combinazione con il trattamento, hanno ulteriormente elevato i livelli di GR (Figura 3I).

Collettivamente, questi risultati indicavano che il β-sitosterolo proteggeva dalle alterazioni patologiche correlate alla BPCO nei topi mantenendo la funzione polmonare, inibendo l'infiammazione, alleviando lo stress ossidativo e aumentando l'espressione della GR. Inoltre, la somministrazione combinata di β-sitosterolo ha rafforzato l'efficacia protettiva di DEX in questo modello.

Efficacia terapeutica potenziata da DEX con β-sitosterolo, potenzialmente attraverso la regolazione della via GR nel modello di cellule BEAS-2B indotto dalla CSE

Nel modello di cellule BEAS-2B indotto dalla CSE, la monoterapia DEX ha notevolmente ridotto l'espressione dell'mRNA delle citochine pro-infiammatorie, ridotto i livelli intracellulari di ROS e MDA e ridotto la proporzione di cellule senescenti così come l'espressione dei marcatori di senescenza p53 e p21. Questi risultati confermano le attività antinfiammatorie, antiossidanti e anti-senescenze della DEX. In particolare, la co-somministrazione di β-sitosterolo ha ulteriormente aumentato gli effetti protettivi della DEX, portando a una maggiore soppressione di infiammazione, stress ossidativo e senescenza cellulare rispetto alla monoterapia DEX. Dopo il knockdown della GR (si-GR) nel gruppo di co-trattamento DEX + β-sitosterolo, la risposta cellulare alla terapia combinata è stata notevolmente attenuata. Come mostrato nella Figura 4A–E, l'inibizione co-mediata da DEX e β-sitosterolo di infiammazione, stress ossidativo e senescenza è stata significativamente invertita, indicando che la carenza di GR indebolì gli effetti benefici del β-sitosterolo sull'efficacia della DEX.

Collettivamente, questi risultati hanno dimostrato che il β-sitosterolo aumentava l'efficacia della DEX, possibilmente regolando i processi correlati alla GR, aumentando così gli effetti protettivi della DEX contro la lesione delle cellule epiteliali bronchiali indotte dalla CSE.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

Tutti i dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio sono forniti nei materiali supplementari (File Supplementare 1, File Supplementare 2).

Figura 1: Ruolo chiave del β-sitosterolo nella terapia con BPCO. (A) Componenti attivi nella Fritillaria cirrhosa D. Don, fiore secco di Lonicera japonica Thunb. e radice secca di Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. e Adenophora stricta Miq. sono stati selezionati tramite il database TCMSP. (B) I potenziali bersagli del β-sitosterolo. (C) Analisi dell'intersezione di bersagli a valle di β-sitosterolo e geni correlati alla BPCO. (D) Analisi di aggancio molecolare tra β-sitosterolo e proteina GR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Coinvolgimento della GR nella protezione correlata al β-sitosterolo contro il danno cellulare indotto dalla CSE. (A) Modulazione dipendente dalla concentrazione dei mediatori infiammatori indotti dalla CSE (TNF-α, IL-6) tramite β-sitosterolo. (B)Effetti della dose di β-sitosterolo sul livello ROS nelle cellule esposte alla CSE. (C) Effetti del β-sitosterolo sul contenuto di MDA aumentato da CSE. (D) L'influenza del β-sitosterolo sulla senescenza cellulare promossa dalla CSE. (E) Modulazione di p53 e p21 correlati alla senescenza tramite β-sitosterolo sotto stimolazione CSE. (F) Regolazione dell'espressione della GR dipendente dalla concentrazione di β-sitosterolo durante la stimolazione della CSE. (G) Vitalità cellulare del β-sitosterolo tra le concentrazioni testate nelle cellule BEAS-2B. (H) Rilevamento RT-qPCR dell'espressione di mRNA della GR per verificare l'efficienza del knockdown dopo la trasfezione di siRNA mirata alla GR. (I) Associazione regolatoria tra GR e β-sitosterolo contro i fattori infiammatori indotti dalla CSE. (J) Associazione regolatoria tra GR e β-sitosterolo contro l'accumulo di ROS indotto dalla CSE. (K) Associazione regolatoria tra GR e β-sitosterolo contro la senescenza cellulare indotta dalla CSE. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; NS, non significativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetti del β-sitosterolo combinato con DEX sulla funzione polmonare, infiammazione, stress ossidativo ed espressione di GR nei topi modello BPCO. (A) Cambiamenti nel volume espiratorio forzato in 0,1 s (FEV₀.₁) nei topi con BPCO. (B) Alterazioni nella capacità vitale forzata (FVC) nei topi con BPCO. (C) Effetti sul flusso espiratorio di picco (PEF) nei topi con BPCO. (D)Rapporto FEV₀.₁/FVC nei topi modello BPCO. (E) Rapporto relativo mRNA di MMP-9/TIMP-1 che riflette la rimodellazione delle vie aeree. (F) L'espressione relativa di mRNA di MUC5AC indica ipersecrezione di muco nei tessuti polmonari del topo. (G) Livelli di TNF-α e IL-6 nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF). (H)Produzione di ROS nel tessuto polmonare dei topi con BPCO. (I) Espressione relativa dell'mRNA della GR nel tessuto polmonare del topo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto del β-sitosterolo sulla resistenza alla DEX mediata dalla GR nelle cellule BEAS-2B indotte dalla CSE. (A) Espressione relativa di mRNA dei fattori infiammatori (TNF-α, IL-6) in ciascun gruppo. (B) Livello ROS in ogni gruppo. (C)Contenuto MDA in ciascun gruppo sperimentale. (D) Percentuale di cellule BEAS-2B senescenti in ciascun gruppo. (E) Livelli relativi di mRNA dei marcatori associati alla senescenza p53 e p21. **p < 0,01; p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Sequenze di primer utilizzate per l'analisi RT-qPCR. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 1: Completare i dataset di analisi di arricchimento GO e KEGG per i geni bersaglio β-sitosterolo. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Risultati numerici dettagliati dell'analisi di Venn che identificano i bersagli sovrapposti tra β-sitosterolo e BPCO. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La BPCO impone un notevole carico globale di malattie e rimane una grande sfida per la salute^{mondiale 1}. La gestione attuale della BPCO comprende sia interventi farmacologici che non^{farmacologici 42}. Tra i trattamenti farmacologici, i glucocorticosteroidi (GC) sono ampiamente utilizzati nei disturbi infiammatori cronici. Agiscono legandosi alla GR e reclutando la deacetilasi dell'istone 2 nei complessi trascrizionali per invertire l'acetilazione degli^{istone 43}. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato una riduzione della sensibilità alla GC nei pazienti con^{BPCO 44,45}, e le indagini hanno fornito evidenze della resistenza alla GC in questa^{malattia 46}. Questi risultati indicano che superare la resistenza alla GC rappresenta una sfida clinica significativa, evidenziando la necessità di nuovi agenti terapeutici. Pertanto, identificare opzioni terapeutiche più efficaci per la BPCO è di grande importanza.

Studi precedenti hanno dimostrato che il γ-sitosterolo esercita un effetto antiproliferativo sulle cellule epiteliali bronchiali nella^{BPCO 47}. Poiché γ-sitosterolo e β-sitosterolo sono entrambi componenti bioattivi comuni dei fitosteroli, il presente studio amplia la comprensione attuale delle azioni dei fitosteroli nella BPCO e evidenzia il potenziale valore protettivo del β-sitosterolo nella patogenesi delle malattie. I nostri risultati hanno rivelato che il β-sitosterolo inibiva significativamente il rilascio di fattori infiammatori, riduceva lo stress ossidativo e soppressava la senescenza cellulare. Ciò è coerente con rapporti precedenti che mostrano che il β-sitosterolo sopprime efficacemente la regolazione all'alza di mediatori infiammatori indotti da lipopolisaccaridi come IL-6, la sintasi ossido nitrico indotta e^{TNF-α 48}. Questi risultati confermano la sua attività antinfiammatoria e ne supportano la coerenza tra diversi modelli infiammatori.

I GC inalati sono agenti antinfiammatori efficaci per controllare l'infiammazione delle vie aeree. Agiscono principalmente legandosi e attivando il GR⁴⁹. Tuttavia, una caratteristica patologica chiave della BPCO è la ridotta sensibilità delle cellule agli effetti antinfiammatori delle GC⁴⁴. La riduzione o compromissione funzionale della GR è considerata un meccanismo principale alla base dello sviluppo della resistenza alla GC nei pazienti con^{BPCO 50}. Studi precedenti hanno dimostrato che alcuni farmaci possono aumentare la sensibilità alla GC. Ad esempio, la combinazione di azitromicina e budesonide produce un effetto inibitorio significativamente maggiore sulla produzione di IL-4 e CXCL8 rispetto a entrambi i singoli^{agenti 51}.

In particolare, il presente studio ha rilevato che sia nei modelli murini con BPCO esposti al fumo di sigaretta sia nei modelli di cellule BEAS-2B indotti dalla CSE, la combinazione di β-sitosterolo con DEX ha prodotto effetti inibitori significativamente più forti su fattori infiammatori, stress ossidativo e senescenza cellulare rispetto alla DEX da solo. Questa combinazione ha inoltre aumentato significativamente l'efficacia protettiva di DEX contro i cambiamenti patologici correlati alla BPCO e il danno delle cellule epiteliali bronchiali nei topi. Questo risultato suggerisce che il β-sitosterolo possa migliorare la sensibilità delle cellule epiteliali bronchiali alla DEX, fornendo un approccio innovativo per affrontare l'insensibilità o la resistenza alla GC in alcuni pazienti con BPCO. In linea con i risultati della PCR quantitativa in vitro , il β-sitosterolo eleva i livelli di mRNA della GR in modo dipendente dalla concentrazione, invece di fungere direttamente da agonista o antagonista della GR. L'efficienza verificata del knockdown del si-GR e i successivi saghi di salvataggio funzionale confermano inoltre che il β-sitosterolo migliora la risposta al GC cellulare aumentando i livelli totali intracellulari di GR invece di attivarla direttamente, generando così effetti terapeutici potenziati quando combinato con DEX, un agonista canonico della GR. Di conseguenza, i cambiamenti nell'espressione della GR potrebbero essere collegati all'azione del β-sitosterolo, il che è coerente con le osservazioni precedenti di una significativa riduzione della GR e della sua isoforma attiva GRα nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree da pazienti con^{BPCO 52}. È importante sottolineare che gli esperimenti di knockdown della GR hanno ulteriormente rivelato il ruolo centrale di questo recettore nella citoprotezione mediata dal β-sitosterolo, indicando che alcune delle funzioni biologiche del β-sitosterolo dipendono dall'integrità della via della GR.

Nel complesso, il presente studio rivela non solo che la GR potrebbe fungere da mediatore chiave del β-sitosterolo nell'intervento per la BPCO, ma offre anche un potenziale nuovo approccio per superare la sfida clinica della resistenza alla DEX, ponendo le basi sperimentali per lo sviluppo di terapie naturali aggiuntive mirate alla via della GR.

Tuttavia, il presente studio presentava diverse limitazioni. Innanzitutto, la funzione polmonare è stata valutata solo per confermare il successo dell'istituzione del modello murino con BPCO, e non sono state effettuate colorazioni di ematossilina-eosina (HE) e Masson per verificare ulteriormente le caratteristiche patologiche tipiche, inclusi enfisema, rimodellamento delle vie aeree e ipersecrezione mucosa. Poiché tutti i campioni polmonari fissi erano stati consumati durante esperimenti precedenti, la ricostruzione del modello murino per BPCO indotto dal fumo di sigaretta di 12 settimane non era fattibile entro il periodo di studio disponibile. Per affrontare parzialmente questa limitazione, sono stati quantificati i livelli di espressione MMP-9/TIMP-1 e mRNA MUC5AC utilizzando campioni di RNA polmonare preservati. In secondo luogo, è stata valutata in vivo solo una singola dose combinata di β-sitosterolo e DEX, e gli effetti dose-risposta o sinergici non sono stati sistematicamente investigati. Ulteriori studi che incorporano combinazioni di dosi multiple sono necessari per caratterizzare potenziali interazioni sinergiche. In terzo luogo, a causa di vincoli sperimentali e costi di ricerca, solo sei topi sono stati inclusi in ciascun gruppo. La dimensione relativamente piccola del campione potrebbe aver aumentato la suscettibilità alla variabilità inter-animale e limitato la robustezza statistica dei risultati. Sono necessari studi futuri con campioni più grandi per convalidare ulteriormente i risultati attuali. In quarto luogo, non sono state stabilite linee cellulari stabili e resistenti alla DEX; Pertanto, la capacità del β-sitosterolo di invertire la resistenza ai glucocorticoidi stabilita non poteva essere valutata direttamente. Sono necessari ulteriori studi che utilizzano modelli validati resistenti ai glucocorticoidi per approfondire ulteriormente questo potenziale meccanismo.

In conclusione, questi risultati suggeriscono che la segnalazione della GR potrebbe essere coinvolta negli effetti protettivi del β-sitosterolo contro la lesione indotta dalla CSE nelle cellule BEAS-2B, inclusa l'inibizione del rilascio di fattori infiammatori, dello stress ossidativo e della senescenza cellulare, oltre a miglioramenti nella funzione polmonare e nei biomarcatori della lesione polmonare. Inoltre, il β-sitosterolo ha aumentato la sensibilità terapeutica di queste cellule alla DEX. Collettivamente, questi risultati identificano il β-sitosterolo come una potenziale molecola naturale candidata che potrebbe contribuire allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la BPCO.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Lignaggio di cellule epiteliali bronchiali umane per lo studio in vitro
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, China	213	Modello animale per esperimento in vivo di BPCO
CB-DOCK2	Cina	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	per la simulazione di docking molecolare tra ligando e proteina recettore
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Rilevamento della vitalità e proliferazione cellulare
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Rilevamento della senescenza cellulare
Sigarette	Hongta, Cina	Non fornito	Sigaretta utilizzata per l'esposizione al fumo e la preparazione del CSE
CTD	USA	https://ctdbase.org/	per il recupero dei geni associati alla BPCO
Sonda fluorescente DCFH-DA	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Rilevamento del livello di ROS intracellulare
Desametasone (DEX)	Yeasen, Cina	40323ES03	Glucocorticoide per l'intervento combinato
Mezzo DMEM/F12	Gibco, USA	11330032	Mezzo di base per la coltura cellulare BEAS-2B
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco, USA	10270106	Supplemento per il mezzo di coltura cellulare
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Analisi statistica dei dati e disegno dei grafici
Isoflurano	RWD Life Science, Cina	R510-22-10	Anestetico inalatorio per l'eutanasia degli animali
Kit di dosaggio per la perossidazione lipidica MDA	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Rilevamento del contenuto di malondialdeide (MDA) intracellulare
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Reagente di trasfezione per la consegna di siRNA
Lettore multimode per piastre	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Rilevamento dell'assorbanza e del valore di fluorescenza
Citometro a flusso Navios EX	Beckman Coulter, USA	B80912	Analisi di ROS e cellule senescenti
Penicillina/streptomicina	HyClone, USA	SV30010	Antibiotici per prevenire la contaminazione batterica
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Amplificazione qPCR quantitativa fluorescente
Kit reagente PrimeScript™ RT	Takara, Giappone	RR037Q	Trascrittazione inversa per la sintesi di cDNA
Database PubChem	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	per l'acquisizione della sequenza SMILES canonica e il download delle informazioni strutturali 3D SDF del beta-sitosterolo
Strumento di PCR RT-qPCR QuantStudio Dx	Thermo Fisher, USA	4479889	Rilevamento RT-qPCR in tempo reale
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	per ottenere il file di struttura 3D del cristallo GR
Kit di isolamento RNA/Proteina	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Estrae l'RNA totale da cellule e tessuto polmonare
si-GR	Progettato in silico tramite siDirect 2.1	Sintesi personalizzata	Guida: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passeggero: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown per GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	utilizzato come controllo di trasfezione negativa per saggi cellulari e in vivo
Database SwissTargetPrediction	Svizzera	http://swisstargetprediction.ch/	per la previsione in silico di potenziali bersagli proteici correlati ai farmaci
Database TCMSP	Cina	https://www.tcmsp-e.com/	per lo screening degli ingredienti erboristici e la previsione dei bersagli
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	per la raccolta di geni associati alla BPCO con validazione
Camera di esposizione al fumo dell'intero corpo	Teague Enterprise, USA	TE-2	Stabilimento di modello di BPCO indotto dal fumo di sigaretta
β-sitosterolo	ChemicalBook, Cina	83-46-5	Fitosterolo attivo per il trattamento farmacologico