Articolo di revisione

Regolazione immunologica della metilazione del DNA e sue implicazioni nel rigetto dell'allotrapianto

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11 settembre 2026

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1Kidney Disease Center, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Institute of Nephrology, Zhejiang University, 3Zhejiang Clinical Research Center of Kidney and Urinary System Disease, Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

Questa revisione riassume il ruolo della metilazione del DNA nella regolazione immunitaria e nel rigetto del trapianto. La metilazione del DNA regola lo sviluppo e la differenziazione delle cellule immunitarie, modula la funzione delle cellule immunitarie e può fungere da biomarcatore e bersaglio terapeutico per migliorare la sopravvivenza dell'innesto.

Abstract

Il rigetto del trapianto rimane un ostacolo importante per la sopravvivenza a lungo termine del grafto ed è determinato da interazioni complesse tra risposte immunitarie e meccanismi molecolari di regolazione. La metilazione del DNA, una delle principali modificazioni epigenetiche, svolge un ruolo fondamentale nel regolare lo sviluppo, la differenziazione, la maturazione e la funzione delle cellule immunitarie. Una metilazione del DNA anomala può alterare l'espressione di geni legati al sistema immunitario e influenzare la natura e l'intensità delle risposte immunitarie. Nel contesto del trapianto, tali alterazioni possono coinvolgere linfociti T, linfociti B e cellule immunitarie innate che partecipano al rigetto del grafto. La metilazione del DNA contribuisce inoltre alla regolazione di vie di segnalazione associate all'attivazione immunitaria, alla tolleranza e alle risposte infiammatorie. Pertanto, i cambiamenti nei profili di metilazione possono influenzare sia il decorso del rigetto sia il mantenimento della funzionalità del grafto. Questa revisione riassume le attuali conoscenze sulla metilazione del DNA nella regolazione immunitaria ed esamina le sue implicazioni nel rigetto del trapianto, con particolare attenzione allo sviluppo timico, ai linfociti T helper e citotossici, ai linfociti T regolatori, ai linfociti B, alle cellule immunitarie innate e alle vie di segnalazione. Vengono inoltre considerate le potenziali applicazioni della metilazione del DNA come biomarcatore e come bersaglio terapeutico nel trapianto. La comprensione di questi meccanismi epigenetici potrebbe favorire lo sviluppo di approcci più precisi per la valutazione del rischio di rigetto, la modulazione delle risposte immunitarie e il miglioramento degli esiti a lungo termine del grafto dopo trapianto di organo solido.

Introduzione

L'immunologia è la disciplina scientifica che studia la struttura e la funzione del sistema immunitario, inclusi i meccanismi alla base delle risposte immunitarie e il mantenimento dell'omeostasi dopo il riconoscimento di componenti self e non-self. Il campo comprende anche i processi patologici derivanti da un'alterata funzione immunitaria. Il sistema immunitario svolge tre funzioni fondamentali: difesa, sorveglianza e omeostasi. Insieme, queste funzioni impediscono l'ingresso di patogeni esterni e sostanze dannose, eliminano i componenti non-self all'interno dell'organismo e mantengono un ambiente immunitario interno stabile. In base alle caratteristiche delle risposte immunitarie, l'immunità viene classificata come innata o adattativa. L'immunità innata fornisce una risposta rapida e non specifica nei confronti di patogeni estranei, mentre l'immunità adattativa fornisce una risposta altamente specifica diretta contro particolari antigeni1,2. Durante una risposta immunitaria, fattori esterni e interni regolano l'espressione di geni associati alla funzione immunitaria. Tale regolazione coinvolge meccanismi genetici classici nonché modificazioni epigenetiche, formando una rete regolatoria trascrizionale complessa e dinamica3.

La genetica classica si concentra sui cambiamenti della funzione genica derivanti da alterazioni nelle sequenze di DNA, mentre l'epigenetica esamina i cambiamenti reversibili ed ereditabili nell'espressione genica che si verificano senza modificare la sequenza di DNA sottostante. Stimoli ambientali, come infezioni, esposizioni chimiche e farmaci, così come fattori interni quali citochine e ormoni, possono alterare il paesaggio epigenetico dei geni. Questi cambiamenti regolano l'espressione genica e, in ultima analisi, modellano i fenotipi cellulari e le funzioni biologiche. I principali meccanismi epigenetici che controllano l'espressione genica includono la metilazione del DNA, le modifiche degli istoni, il rimodellamento della cromatina e la regolazione mediata da RNA non codificanti. Durante lo sviluppo embrionale precoce, i segni di metilazione del DNA vengono quasi completamente eliminati e successivamente ripristinati durante la differenziazione4,5. La rimozione e il ripristino precisi di queste modifiche epigenetiche sono essenziali per lo sviluppo, la differenziazione e la maturazione cellulari normali. Al contrario, alterazioni epigenetiche anomale possono interrompere la funzione genica e contribuire all'insorgenza e alla progressione delle malattie6. I profili di metilazione del DNA cambiano dinamicamente anche durante lo sviluppo e la differenziazione delle cellule T e delle cellule B7,8. Questi risultati evidenziano il ruolo fondamentale della regolazione epigenetica nel guidare la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo in diverse linee cellulari immunitarie. Le modifiche degli istoni regolano la differenziazione e la plasticità funzionale dei monociti/macrophagi e delle cellule T helper9,10,11,12,13,14 e influenzano vie di segnalazione chiave, tra cui le vie dei recettori tipo Toll15,16. Il rimodellatore della cromatina Mi-2beta è altamente espresso nei timociti e regola direttamente l'espressione del gene CD4 e lo sviluppo delle cellule T17. Gli RNA non codificanti svolgono inoltre un ruolo importante come regolatori delle risposte immunitarie. Ad esempio, l'interferone-γ (IFN-γ) svolge un ruolo centrale nella difesa dell'ospite contro le infezioni batteriche intracellulari, mentre miR-21 può sopprimere la produzione di IFN-γ mirando direttamente l'mRNA di IFN-γ18. Nel complesso, questi risultati sottolineano il ruolo centrale dei meccanismi epigenetici nel regolare le risposte immunitarie.

Le cellule immunitarie sono centrali per la funzione immunitaria e rappresentano fattori chiave nel rigetto del trapianto, un determinante importante della sopravvivenza dell'innesto19,20,21. Sebbene siano stati condotti numerosi studi immunologici approfonditi sui meccanismi alla base del rigetto del trapianto, molti aspetti rimangono ancora poco chiari22. Sempre più evidenze dimostrano inoltre ruoli fondamentali dei meccanismi epigenetici nello sviluppo, differenziazione e maturazione delle cellule immunitarie23,24. L'analisi della base molecolare del rigetto del trapianto dal punto di vista epigenetico potrebbe quindi favorire un intervento precoce e la prevenzione del rigetto del trapianto e della nefropatia cronica da allotrapianto dopo il trapianto d'organo, con potenziali benefici per la sopravvivenza a lungo termine dell'innesto. Tra le diverse modifiche epigenetiche, la metilazione del DNA rappresenta il meccanismo più stabile che regola la trascrizione nel genoma dei mammiferi25. Di conseguenza, questa revisione esamina il ruolo della metilazione del DNA nello sviluppo, differenziazione e funzione delle cellule immunitarie, nonché il suo coinvolgimento nel rigetto acuto successivo al trapianto d'organo.

Revisione e prospettiva

1. Metilazione del DNA e tecnologia di sequenziamento

La metilazione del DNA utilizza l'S-adenosilmetionina come donatore di gruppi metilici, e le DNA metiltransferasi catalizzano l'aggiunta covalente di un gruppo metilico al quinto carbonio della citosina all'interno dei dinucleotidi CpG (citosina–fosfato–guanina), convertendo così la citosina in 5-metilcitosina (5mC). Questa modificazione aggiunge un ulteriore livello regolatorio all'espressione genica rispetto alla sola sequenza del DNA. In generale, le regioni con bassi livelli di metilazione permettono il legame di proteine e supportano una struttura della cromatina favorevole alla trascrizione genica attiva26. Al contrario, le regioni di DNA metilato possono sopprimere la trascrizione e l'espressione genica reclutando proteine contenenti il dominio di legame al metil-CpG (MBD), promuovendo modifiche istoniche e complessi di rimodellamento della cromatina, oppure bloccando direttamente il legame di fattori di trascrizione e altre proteine leganti il DNA27,28,29. Tuttavia, la metilazione del DNA può essere associata anche all'attivazione genica, in particolare all'interno delle regioni del corpo genico, dove risulta positivamente correlata all'espressione genica. Sebbene questa relazione si verifichi con minore frequenza, la metilazione del corpo genico è comune nei geni espressi ubiquitariamente30,31.

La funzione biologica della metilazione del DNA deve essere interpretata nel contesto del suo genoma. I dinucleotidi CpG spesso si raggruppano in regioni chiamate isole CpG, definite come segmenti di DNA più lunghi di 200 paia di basi (bp), con un contenuto G+C di almeno il 50% e un rapporto osservato/atesso (Obs/Exp) di almeno 0,632. Nel genoma dei mammiferi, i dinucleotidi CpG sono relativamente rari e rappresentano solo circa l'1% del genoma. Circa il 60% dei promotori genici umani è associato a isole CpG, e queste regioni sono tipicamente non metilate nelle cellule normali. Solo una piccola proporzione (~6%) diventa metilata durante lo sviluppo precoce o la differenziazione tissutale33,34. Le "rive CpG" (CpG shores) indicano le regioni entro 2.000 bp a monte e a valle delle isole CpG, e il loro stato di metilazione è strettamente correlato al silenziamento trascrizionale. Approssimativamente il 70% delle regioni metilate in modo differenziale si verifica nelle rive CpG durante il riprogrammamento della metilazione23,35. Inoltre, la maggior parte della metilazione tissuto-specifica avviene nelle rive piuttosto che nelle isole CpG34,35. I "ripiani CpG" (CpG shelves) si trovano entro 2.000 bp a monte e a valle delle rive CpG, mentre il termine "mare aperto" ("open sea") si riferisce a tutte le restanti regioni genomiche al di fuori di isole, rive e ripiani CpG.

La metilazione del DNA avviene attraverso due processi principali: metilazione di mantenimento e metilazione de novo. La metilazione di mantenimento si verifica principalmente durante la replicazione semiconservativa del DNA, quando le metiltransferasi di mantenimento copiano i modelli di metilazione esistenti sul filamento figlio. DNMT1 funge da metiltransferasi di mantenimento principale; essa preferisce bersagliare il DNA emimetilato, rappresenta la metiltransferasi più abbondante nelle cellule ed è trascritta attivamente durante la fase S del ciclo cellulare36. Al contrario, la metilazione de novo stabilisce nuovi modelli di metilazione in modo indipendente dalla replicazione del DNA, bersagliando siti precedentemente non metilati. DNMT3A e DNMT3B svolgono il ruolo di metiltransferasi de novo primarie. Esse sono altamente espresse nelle cellule staminali embrionali e svolgono ruoli essenziali nell'instaurazione dei modelli di metilazione durante lo sviluppo embrionale, ma la loro espressione diminuisce durante la differenziazione cellulare27. La famiglia DNMT3 comprende anche DNMT3L, che manca di attività catalitica ma è fondamentale per l'instaurazione dell'imprinting genomico materno37. DNMT3L potenzia l'attività di DNMT3A e DNMT3B, migliorando così l'efficienza della metilazione del DNA38. Lungo il genoma, molti citosini metilati subiscono demetilazione del DNA, in particolare all'interno delle regioni del corpo genico. La demetilazione avviene attraverso meccanismi attivi e passivi. La demetilazione attiva coinvolge l'ossidazione della 5mC nei suoi derivati ossidati da parte degli enzimi TET39. Al contrario, la demetilazione passiva deriva dalla progressiva diluizione dei citosini metilati durante la replicazione del DNA, quando l'attività della metiltransferasi di mantenimento è assente40.

Poiché la metilazione del DNA svolge un ruolo centrale nella regolazione della trascrizione e dell'espressione genica, negli ultimi dieci anni è diventata un importante focus della ricerca, anche grazie ai progressi nelle tecnologie di rilevamento della metilazione. In base alle differenze nel pretrattamento del campione, gli approcci per il rilevamento della metilazione del DNA possono essere classificati in tre categorie41. Il primo approccio si basa su endonucleasi di restrizione sensibili alla metilazione, che non tagliano selettivamente le regioni di DNA metilato, generando così frammenti di dimensioni diverse a seconda dello stato di metilazione. Il secondo approccio arricchisce i frammenti di DNA metilato utilizzando proteine leganti la metilazione o anticorpi specifici per la 5-metilcitosina. Il terzo approccio impiega il trattamento con bisolfito per convertire le citosine non metilate in uracile, lasciando inalterate le citosine metilate, consentendo così una discriminazione precisa tra siti metilati e non metilati. Attualmente, la conversione con bisolfito combinata al sequenziamento di nuova generazione rappresenta la strategia più utilizzata per analizzare la metilazione del DNA. Tabella 1 riassume i principali approcci per il rilevamento della metilazione, inclusi i principi, i vantaggi, i limiti e le possibili applicazioni nella ricerca sui trapianti. I continui progressi nelle tecnologie di rilevamento della metilazione del DNA ampliano il toolkit tecnico per la ricerca epigenetica e supportano lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche epigenetiche41,42,43,44,45.

2. Caratteristiche della metilazione nello sviluppo e nella differenziazione precoce delle cellule timiche

Il rigetto del trapianto coinvolge meccanismi complessi che includono risposte immunitarie sia mediate da cellule che da anticorpi. Le evidenze attuali in immunologia dei trapianti indicano che l'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo centrale nel rigetto dell'innesto46,47. Il timo funziona come organo principale per lo sviluppo, la differenziazione e la maturazione delle cellule T48. Durante lo sviluppo dei timociti, lo stadio precursorio delle cellule T, i profili di metilazione del DNA subiscono un rimodellamento continuo e dinamico. Questi cambiamenti includono sia demetilazione che metilazione in regioni genomiche che regolano la trascrizione delle cellule T, anche se questi processi non avvengono in modo completamente bilanciato. Durante le fasi iniziali dello sviluppo, i geni che codificano per componenti chiave del recettore delle cellule T (TCR) e per fattori regolatori essenziali, tra cui CD3, RUNX3, RORC, RAG1 e LCK, subiscono principalmente demetilazione7. Più in generale, la demetilazione del DNA avviene più frequentemente rispetto alla metilazione durante la differenziazione delle cellule immunitarie49,50. Al contrario, la metilazione de novo è relativamente limitata e avviene principalmente durante la fase iniziale di impegno dello sviluppo dei timociti7. La metilazione de novo è inoltre fondamentale per silenziare i geni associati al potenziale pluripotente delle cellule staminali, consentendo così l'impegno verso una linea cellulare e la differenziazione7,51. Un'altra caratteristica importante della metilazione del DNA nei timociti è che la maggior parte dei cambiamenti di metilazione rimangono stabili e sostanzialmente irreversibili una volta stabiliti durante la differenziazione. Tuttavia, alcuni geni, come i geni RAG, mostrano una regolazione dinamica: subiscono demetilazione durante le prime fasi dello sviluppo delle cellule immunitarie e vengono successivamente rimetilati in fasi più avanzate7.

3. Metilazione del DNA nella differenziazione e funzione delle cellule immunitarie

La metilazione del DNA svolge un ruolo cruciale nella regolazione della differenziazione, della funzione e della plasticità di diverse popolazioni di cellule immunitarie, influenzando così l'esito delle risposte immunitarie nei trapianti.

  1. Cellule immunitarie adattative
    1. Cellule T helper (cellule T CD4+)
      Le cellule T CD4+ agiscono come principali cellule effettrici nel rigetto acuto del trapianto d'organo52,53. Le cellule T naive (Tn) si differenziano in diversi sottoinsiemi di cellule T CD4+ attraverso meccanismi coordinati di tipo genetico, epigenetico e regolatori aggiuntivi. Alla stimolazione da segnali specifici, il paesaggio epigenetico delle cellule T naive può modificarsi, alterando così la trascrizione e l'espressione genica. Questi cambiamenti possono influenzare infine sia il tipo che l'intensità del rigetto immunitario successivo al trapianto. Dopo l'attivazione delle cellule T, il gene IL2 subisce una rapida demetilazione e permane in uno stato non metilato. Questo cambiamento epigenetico è essenziale per potenziare la trascrizione e l'espressione di geni che sostengono la funzione delle cellule T54.
      La metilazione del DNA svolge inoltre un ruolo fondamentale nell'indirizzare la differenziazione delle cellule T naive nei sottoinsiemi Th1 e Th255,56. Nelle cellule T naive CD4+, il gene IFNG è altamente metilato; diventa specificamente demetilato durante la differenziazione in Th1, mentre rimane fortemente metilato nelle cellule Th257. Al contrario, il gene IL4 è fortemente metilato nelle cellule T naive e Th1, ma subisce una parziale demetilazione nelle cellule Th258. Fattori esterni possono ulteriormente regolare questi profili di metilazione modulando l'attività delle DNA metiltransferasi (DNMT). Ad esempio, la carenza di vitamina D aumenta l'attività delle DNMT e promuove l'ipermetilazione del gene IFNG, mentre la supplementazione con vitamina D può invertire questi cambiamenti59. L'invecchiamento biologico influenza inoltre i profili di metilazione del DNA. Studi, inclusi quelli di Yu, mostrano che l'espressione dell'mRNA di DNMT3a e la metilazione del promotore del gene IL4 aumentano con l'età, mentre la metilazione del promotore del gene IFNG diminuisce60. Questi risultati suggeriscono che i cambiamenti legati all'età nella metilazione del DNA possono spostare l'equilibrio tra le risposte delle cellule Th1 e Th2.
      La differenziazione delle cellule T naive coinvolge anche altri due importanti sottoinsiemi di cellule T CD4+: le cellule Th17 e le cellule T regolatorie (Treg)61,62. Questo processo è strettamente regolato dalla metilazione del DNA. L'espressione del fattore di trascrizione specifico per Th17, RORγt, e della citochina IL-17 dipende dallo stato di metilazione delle rispettive regioni promotrici dei geni63,64,65. Le cellule Th17 nei tessuti del trapianto possono aggravare il rigetto del trapianto e promuovere lesioni vascolari66. La metilazione del DNA influenza anche la plasticità funzionale delle cellule Th17. In condizioni di infiammazione cronica, il gene IFNG nelle cellule Th17 rimane demetilato, consentendo a queste cellule di produrre IFN-γ. Di conseguenza, le cellule Th17 possono acquisire caratteristiche sia del fenotipo Th1 che Th1767. Inoltre, studi in vitro mostrano che condizioni specifiche di stimolazione possono indurre le cellule Th17 a differenziarsi in cellule Treg funzionali con forte attività immunosoppressiva68.
      Al contrario, le cellule Treg svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la tolleranza immunitaria e preservare l'omeostasi nei trapianti69. Queste cellule possono originarsi nel timo o differenziarsi nella periferia sotto l'influenza del TGF-β; indipendentemente dall'origine, le cellule Treg esprimono costantemente il fattore di trascrizione Foxp370. La regolazione epigenetica, in particolare la metilazione del DNA, svolge un ruolo chiave nel controllo dell'espressione di geni associati alla funzione delle cellule Treg, inclusi Foxp3 e Ctla4, influenzandone direttamente l'attività trascrizionale71,72,73,74. Durante lo sviluppo delle cellule Treg timiche, il gene Foxp3 subisce una demetilazione progressiva. Questo stato demetilato persiste dopo la migrazione delle cellule nei tessuti periferici e richiede un segnale TCR sostenuto di intensità adeguata62,75,76,77. In assenza di DNMT1, la stimolazione del TCR può indurre efficacemente l'espressione di Foxp3 in cellule T Foxp3-negative sia nel timo che nei tessuti periferici. Tuttavia, se la stimolazione del TCR non induce un rimodellamento epigenetico sufficiente, le cellule non possono mantenere un'espressione stabile di Foxp3, essenziale per preservare il fenotipo Treg62,75,78. L'espressione stabile di Foxp3 è controllata principalmente da modifiche epigenetiche negli elementi regolatori cis, in particolare le sequenze non codificanti conservate (CNS)71,79,80. Tra queste, lo stato di metilazione della regione specifica per Treg e demetilata (TSDR) funge da marcatore affidabile per distinguere popolazioni di Treg stabili da quelle instabili71,81,82,83,84,85,86. Nelle cellule Treg naive naturali (nTreg), la TSDR rimane non metilata, consentendo il reclutamento di fattori di trascrizione come Stat5, NFAT, Runx1 e CREB, che sostengono un'espressione stabile di Foxp3. Al contrario, nelle cellule Treg indotte (iTreg), la TSDR è tipicamente metilata, portando a un'espressione di Foxp3 meno stabile72,74,87,88,89. Inoltre, la perdita di enzimi demetilanti come TET1 o TET2 porta a ipermetilazione del locus di Foxp3, compromettendo la funzione delle cellule Treg e promuovendo lo sviluppo di malattie autoimmuni90. Studi clinici dimostrano ulteriormente che livelli più elevati di demetilazione di Foxp3 in campioni bioptici di trapianti renali con rigetto subclinico sono associati a migliori esiti del trapianto82,84.
      Le cellule Treg sono state sempre più studiate come mezzo per prevenire il rigetto dell'allograft e promuovere la tolleranza immunitaria91. Un numero sufficiente di cellule Treg deve persistere nel trapianto per sopprimere efficacemente le cellule T effettrici che guidano il rigetto del trapianto, mantenendo così la tolleranza immunitaria92. Tuttavia, le cellule Treg mostrano un certo grado di instabilità fenotipica. In determinate condizioni, possono subire cambiamenti epigenetici, inclusa la demetilazione del gene RORC, che porta all'espressione della citochina pro-infiammatoria IL-1793,94. Questo cambiamento evidenzia la plasticità delle cellule Treg e rappresenta una sfida per il loro utilizzo terapeutico. Studi sperimentali suggeriscono inoltre che la modulazione epigenetica può potenziare la funzione delle cellule Treg. Ad esempio, Guo et al. hanno mostrato in modelli animali che la combinazione di inibitori della metilazione del DNA con IL-35 aumenta l'espressione di Foxp3, promuove la differenziazione delle cellule Treg e migliora la sopravvivenza del trapianto95. Nonostante questi progressi, la comprensione dei meccanismi legati alle cellule Treg rimane incompleta. Studi futuri dovrebbero definire le condizioni che favoriscono la differenziazione delle cellule Treg e stabilizzano il loro fenotipo, con l'obiettivo di applicare questi risultati al trattamento delle malattie immuno-mediate.
    2. Cellule T citotossiche (cellule T CD8+)
      Dopo l'attivazione, le cellule T naive CD8+ si differenziano in cellule effettrici citotossiche note come linfociti T citotossici (CTL). Queste cellule sono comunemente classificate in due sottoinsiemi: cellule Tc1, che producono IFN-γ, e cellule Tc2, che producono IL-4 e IL-596. Studi clinici mostrano che la proporzione di cellule T CD69+/CD8+ nel sangue periferico di pazienti sottoposti a trapianto cardiaco si correla con un rigetto grave. Inoltre, le cellule T CD8+ nel tessuto miocardico mostrano un fenotipo attivato CD69+ ed esibiscono attività citotossica mediata da perforina97,98. Evidenze sperimentali supportano ulteriormente il ruolo delle cellule T CD8+ nel rigetto del trapianto. Jones et al. hanno dimostrato che, in topi privi di cellule T generati mediante timectomia e trattamento con anti-CD4/CD8, il trasferimento di sole cellule T CD8+ specifiche per l'antigene del TCR è sufficiente a indurre il rigetto di trapianti cardiaci allogenici completamente incompatibili99. Questi risultati evidenziano il contributo fondamentale delle cellule T CD8+ al rigetto immunitario del trapianto. La metilazione del DNA regola anche lo sviluppo e la funzione delle cellule T CD8+. In assenza di DNMT1, la sopravvivenza dei timociti è compromessa100. Inoltre, l'eliminazione di DNMT3a nelle cellule T CD8+ mature promuove la differenziazione in cellule della memoria riducendo la differenziazione in cellule effettrici terminali. Questo effetto è mediato in parte dall'aumento dell'espressione del fattore 1 della cellula T (Tcf1), poiché DNMT3a bersaglia la regione promotrice del gene Tcf7 e induce metilazione de novo nelle cellule T CD8+ effettrici precoci101. Inoltre, in un modello murino di infezione virale acuta, l'eliminazione condizionale di TET2 nelle cellule T potenzia la formazione di cellule T CD8+ della memoria102. Nel complesso, questi risultati dimostrano che la metilazione del DNA regola in modo critico lo sviluppo, la differenziazione e le risposte funzionali delle cellule T CD8+.
    3. Cellule B
      Le cellule T svolgono un ruolo centrale nel rigetto del trapianto; tuttavia, anche le cellule B contribuiscono alle risposte di rigetto cellulare e umorale103,104. Il rigetto umorale è mediato principalmente dai linfociti B. Dopo l'attivazione, le cellule B si differenziano in plasmacellule che producono e secernono grandi quantità di anticorpi specifici, in grado di innescare danni infiammatori nel trapianto105. La metilazione del DNA regola ulteriormente le risposte immunitarie delle cellule B. Lee et al. hanno mostrato che durante lo sviluppo precoce delle cellule B avviene una vasta demetilazione del DNA, in particolare nelle regioni del corpo genico e nelle regioni non isole CpG. Al contrario, l'influenza regolatoria della metilazione del DNA diventa meno pronunciata negli stadi successivi della maturazione delle cellule B106. Inoltre, Shaknovich et al. hanno identificato differenze significative nei profili di metilazione del DNA tra le cellule B del centro germinale e le cellule B naive107. Le cellule B del centro germinale subiscono demetilazione, che altera l'espressione di geni funzionali e influenza vie di segnalazione chiave, tra cui le vie NF-κB e MAPK107,108. Studi funzionali dimostrano inoltre che la metilazione del DNA limita l'attività delle cellule B. L'eliminazione delle metiltransferasi de novo Dnmt3a e Dnmt3b (carenza di Dnmt3) promuove lo sviluppo e la maturazione delle cellule B. Allo stesso tempo, potenzia l'attivazione delle cellule B e favorisce l'espansione delle cellule B del centro germinale e delle plasmacellule. Questi risultati indicano che la metilazione de novo del DNA normalmente agisce limitando l'attivazione delle cellule B e frenando la differenziazione in plasmacellule109.
  2. Cellule immunitarie innate
    La risposta immunitaria successiva al trapianto di organi solidi coinvolge interazioni coordinate tra immunità innata e adattativa. Il sistema immunitario innato comprende cellule ematopoietiche e non ematopoietiche come cellule dendritiche, macrofagi, cellule natural killer e neutrofili, tutte in grado di contribuire al rigetto immunitario post-trapianto110.
    Le cellule dendritiche agiscono come regolatori chiave che collegano immunità innata e adattativa, con la capacità di promuovere sia l'attivazione immunitaria che la tolleranza111,112. Durante la differenziazione da monociti, le cellule dendritiche subiscono ampi cambiamenti nella metilazione del DNA, caratterizzati da una marcata riduzione dei livelli di metilazione in molte regioni genomiche. Questi cambiamenti avvengono principalmente in regioni enhancer e nei siti di legame dei fattori di trascrizione essenziali per la specificazione della linea cellulare e l'attivazione immunitaria113,114,115. Un tratto distintivo di questo processo di differenziazione è il downregolamento di CD14 e l'upregolamento di CD209 sulla superficie cellulare. Questo spostamento si correla con la demetilazione dei siti CpG all'interno della regione promotrice del gene CD209116. Inoltre, il trattamento con inibitori della metilazione del DNA aumenta significativamente l'espressione di molecole co-stimolatorie come CD40 e CD86, potenziando così la presentazione dell'antigene e promuovendo la maturazione funzionale delle cellule dendritiche. Questi risultati indicano che la metilazione del DNA regola direttamente la funzione e l'attività immunitaria delle cellule dendritiche117.
    I monociti e i macrofagi sono componenti essenziali del sistema immunitario poiché mediano la fagocitosi e la rimozione di cellule anomale e patogeni invasori. Ampia evidenza mostra che i macrofagi contribuiscono non solo ai danni infiammatori osservati nel rigetto acuto precoce, ma anche alla progressione della fibrosi durante il rigetto cronico tardivo118,119. L'equilibrio tra macrofagi M1 (attivati classicamente) e macrofagi M2 (attivati alternativamente) regola in modo critico le risposte immunitarie. Una tendenza al predominio dei macrofagi M1 promuove l'infiammazione e il danno tissutale. Al contrario, la riduzione dell'espressione di DNMT1, ottenuta tramite inibitori della metilazione del DNA o knockout genico, riduce la metilazione al promotore del recettore γ1 attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPARγ1). Questo cambiamento promuove l'attivazione dei macrofagi M2 e contribuisce a limitare i danni immuno-mediati120. Differenze nei profili di metilazione del DNA evidenziano ulteriormente il ruolo della regolazione epigenetica nella funzione dei macrofagi. Studi hanno identificato variazioni significative nella metilazione del promotore di geni specifici nei monociti/macrophagi del sangue periferico tra individui con e senza malattia coronarica121. Inoltre, la differenziazione dei monociti in macrofagi comporta cambiamenti sostanziali nella metilazione nei siti di legame dei fattori di trascrizione, indicando che la metilazione del DNA in regioni regolatorie chiave svolge un ruolo preciso e critico nella differenziazione dei macrofagi122.
    Le cellule natural killer (NK) svolgono funzioni sia effettrici che regolatorie nel rigetto del trapianto. Possono promuovere il rigetto del trapianto ma anche contribuire allo sviluppo della tolleranza immunitaria. Durante la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo in cellule NK, la ridotta metilazione del gene KIR porta a un aumento dell'espressione di KIR, che svolge un ruolo importante nella regolazione immunitaria. Inoltre, il trattamento con inibitori della metilazione del DNA induce la demetilazione del gene KIR e ne promuove l'espressione nelle cellule NK123,124. Questi risultati indicano che la metilazione del DNA è un regolatore chiave della funzione delle cellule NK.
    I neutrofili partecipano attivamente anche al rigetto del trapianto. I neutrofili attivati rilasciano una serie di mediatori che reclutano e attivano cellule presentanti l'antigene, avviando così risposte delle cellule T specifiche per l'antigene e amplificando il rigetto immunitario125,126,127. PRV-1, una proteina ancoraggio espressa sui neutrofili, è regolata dalla metilazione del DNA nella sua regione promotrice in condizioni fisiologiche e patologiche128.

4. Metilazione del DNA in vie di segnalazione chiave

La metilazione del DNA non solo regola direttamente la trascrizione dei geni funzionali, ma influenza anche il comportamento cellulare modulando vie di segnalazione chiave. Ad esempio, l'ipermetilazione della regione promotore del gene della proteina legata alla frizzled secreta (SFRP) porta al silenziamento genico. Questo silenziamento altera la regolazione normale della via di segnalazione Wnt/β-catenina, determinandone l'attivazione aberrante e favorendo lo sviluppo del cancro del colon-retto129. Analogamente, l'ipermetilazione di regolatori negativi a monte della via di segnalazione mTOR nelle cellule immunitarie riduce la loro espressione, portando a un'eccessiva attivazione di mTOR e contribuendo al danno infiammatorio nei reni diabetici. Interventi come il decitabine o l'interferenza dell'RNA possono ridurre la metilazione di questi geni regolatori inibendo DNMT1, attenuando così il decorso della nefropatia diabetica130. Inoltre, gli inibitori della DNA metiltransferasi possono sopprimere la proliferazione cellulare regolando vie di segnalazione come NF-κB e JAK/STAT, influenzando in tal modo lo sviluppo e il decorso delle malattie131,132 (Figura 1).

5. Implicazioni cliniche: interazioni tra farmaci immunosoppressori e metilazione del DNA

È stato dimostrato che gli agenti immunosoppressori considerati standard di cura influenzano i profili di metilazione del DNA nelle cellule immunitarie, anche se gli effetti variano a seconda del farmaco e del contesto genomico. Studi sulla metilazione del promotore di IFNγ nei linfociti T hanno mostrato che l'acido micofenolico contrasta la demetilazione indotta dall'attivazione dei linfociti T, mentre il tacrolimus non esercita lo stesso effetto in questo specifico locus133. Al contrario, è stato dimostrato che la sirolimus modula i profili globali di metilazione attraverso i suoi effetti sulle vie di segnalazione mTOR134, e la metilazione del DNA stessa è stata dimostrata regolare la via mTOR, influenzando così la sopravvivenza dell'alloinnesto e il rigetto acuto dopo trapianto renale135. Inoltre, i glucocorticoidi come la desametasone inducono un rimodellamento diffuso della metilazione del DNA nel compartimento immunitario periferico. L'indice di metilazione neutrofila alla desametasone rappresenta un marcatore farmacodinamico sensibile dell'esposizione ai glucocorticoidi ed è associato a profili immunitari immunosoppressivi136. È stato inoltre riportato che la terapia induttiva con ATG altera il metiloma del DNA nei pazienti sottoposti a trapianto renale, e modelli basati sulla metilazione si sono dimostrati più efficaci dei profili trascrittomici nel prevedere il rischio di infezione137. La variabilità epigenetica individuale potrebbe influenzare la risposta dei pazienti a queste terapie, suggerendo che i biomarcatori basati sulla metilazione potrebbero potenzialmente guidare regimi immunosoppressori personalizzati136,137. Queste interazioni tra farmaci ed epigenoma richiedono ulteriori indagini, poiché potrebbero avere importanti implicazioni nell'ottimizzazione dei risultati a lungo termine del trapianto.

6. Sfide e prospettive: bilanciare la modulazione epigenetica con la sicurezza immunitaria

Nonostante le loro potenzialità nel trapianto, gli inibitori della DNMT (DNMTis), come l'azacitidina e la decitabina, comportano rischi infettivi e oncogenici. Il trattamento con questi agenti è stato associato a gravi complicanze settiche138,139, e l'esposizione sistemica ad agenti ipometilanti è stata inoltre associata a un aumentato rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta secondaria, con pazienti colpiti che mostrano una sopravvivenza mediana complessiva inferiore a 5 mesi140. Oltre alle tossicità legate al farmaco, la mancanza di specificità per tipo cellulare rappresenta una sfida importante. La demetilazione sistemica potrebbe destabilizzare il compartimento delle cellule T regolatorie attivando al contempo le cellule T effettrici, potenzialmente aggravando il rigetto141, e potrebbe compromettere la protezione delle cellule T CD8+ di memoria contro patogeni opportunistici come il CMV101,102.

Per superare queste limitazioni, strategie emergenti mirano a ottenere una modulazione specifica per tipo cellulare e per locus. Le piattaforme a base di nanoparticelle possono consegnare DNMT in modo preferenziale alle cellule che infiltrano il trapianto142,143. La modifica del epigenoma mediante CRISPR/dCas9 consente una demetilazione mirata del TSDR di Foxp3 per stabilizzare i linfociti T regolatori senza effetti globali144,145. Il monitoraggio guidato da biomarcatori potrebbe inoltre favorire una traduzione clinica più sicura146.

Conclusioni

Il miglioramento della sopravvivenza dell'innesto rimane un obiettivo primario nella ricerca sui trapianti d'organo. Il rigetto del trapianto è un processo immunologico complesso in cui le modifiche epigenetiche provenienti sia dall'organo donatore che dal ricevente interagiscono dinamicamente per modellare il paesaggio epigenetico complessivo. Il sistema immunitario del ricevente è un fattore chiave nel rigetto dell'innesto. I meccanismi epigenetici regolano in modo critico lo sviluppo, la differenziazione e la funzione delle cellule immunitarie, influenzando così le risposte di rigetto e la sopravvivenza dell'innesto dopo il trapianto. Inoltre, fattori come farmaci immunosoppressori, infezioni e l'ambiente post-trapianto complicano ulteriormente la relazione tra regolazione epigenetica e risposte immunitarie. Questi fattori possono alterare i profili epigenetici e modificare il comportamento delle cellule immunitarie, aggiungendo un ulteriore livello di complessità agli esiti del trapianto. È pertanto necessaria un'ulteriore indagine sulla relazione tra meccanismi epigenetici e rigetto del trapianto, al fine di identificare nuovi biomarcatori e target terapeutici, nonché per migliorare gli approcci diagnostici e le strategie terapeutiche nei trapianti d'organo.

Diagramma di disregolazione della segnalazione delle cellule immunitarie; impatto di TET/DNMT sull'equilibrio immunologico e sulla funzione del trapianto.
Figura 1. La metilazione del DNA nell'immunità da trapianto. Le cellule immunitarie mantengono specifici profili intrinseci di metilazione del DNA durante tutto il loro ciclo vitale. La perturbazione di questo processo fisiologico può indurre una metilazione del DNA aberrante e la disregolazione di vie di segnalazione a valle, con conseguente alterazione dell'omeostasi immunitaria e disfunzione dell'allograft.Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

MetodoPrincipioVantaggiLimitazioniApplicazioni nel trapianto
MeDIP-seq⁴¹Arricchimento con anticorpo anti-5mC + NGSConveniente per analisi su scala genomica; adatto a coorti di campioni di grandi dimensioniBassa risoluzione (~100–300 bp); non permette di distinguere 5mC da 5hmCScreening di modifiche globali della metilazione nei PBMC di pazienti trapiantati
WGBS⁴²Conversione con bisolfito + NGSRisoluzione a singola base; copertura su scala genomicaAlto costo; richiede un elevato volume di datiMappatura completa del metiloma di biopsie del trapianto; identificazione di nuove DMR associate al rigetto
RRBS⁴³Arricchimento con enzimi di restrizione + conversione con bisolfito + NGSConveniente; elevata copertura delle regioni ricche di CpGCopertura limitata delle regioni non-CpG e povere di CpGAnalisi mirata del metiloma nel tessuto del trapianto con ridotto costo di sequenziamento
PCR specifica per metilazione⁴⁴Conversione con bisolfito + PCR con primers specifici per metilazioneElevata sensibilità; semplice, rapida e a basso costoAnalizza solo loci specifici; analisi qualitativa o quantitativa limitataConvalida di DMR candidate da coorti di scoperta; sviluppo di biomarcatori clinici
Pirosequenziamento⁴⁵Conversione con bisolfito + sequenziamento per sintesiQuantitativo; risoluzione a singola base in loci miratiProduttività moderata; richiede identificazione preventiva del targetQuantificazione precisa dei livelli di metilazione in specifici siti CpG, come la regione TSDR del gene FOXP3 nelle cellule Treg

Tabella 1: Sintesi dei principali approcci per il rilevamento della metilazione del DNA. La tabella riassume i metodi comunemente utilizzati per il rilevamento della metilazione del DNA, i loro principi, vantaggi, limitazioni e possibili applicazioni nella ricerca sui trapianti.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti o potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Figdraw per l'assistenza nella preparazione delle figure.

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