Protocolli per l'allevamento efficiente e l'analisi funzionale della vespa endoparassitoide Asobara japonica e del suo ospite Drosophila melanogaster

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è facilitare l'analisi funzionale delle interazioni parassitoide–ospite in Asobara japonica e Drosophila melanogaster. attraverso metodi di allevamento ottimizzati, un saggio di infezione a posizione unica e un knockdown genico mediato da RNAi.

Abstract

Il parassitismo è un'interazione biologica in cui un organismo sfrutta il corpo o le risorse di un altro (l'ospite), causando danni sostanziali o la morte dell'ospite. Tra gli animali parassite, le vespe parassitoidi sono una delle linee più ricche di specie, rappresentando quasi il 20% di tutte le specie di insetti. In particolare, le vespe endoparassitoidi si depositano direttamente nei corpi dell'ospite e impiegano una vasta gamma di fattori velenosi per manipolare lo sviluppo, l'immunità e la fisiologia dell'ospite. In risposta all'attacco delle vespe, gli ospiti cercano di eliminare le uova parassitoidi tramite meccanismi immunitari innati. Tuttavia, i meccanismi molecolari e cellulari attraverso cui i singoli componenti del veleno modulano la biologia dell'ospite e promuovono un parassitismo efficace restano poco compresi. Qui descriviamo un protocollo di laboratorio standardizzato per l'allevamento della vespa endoparassitoide Asobara japonica e del suo ospite Drosophila melanogaster. Sono disponibili sia ceppi partenogenetici che sessuali di A. japonica, e il ceppo partenogenetico mostra un alto tasso di successo nel parassitismo, permettendo un mantenimento stabile delle scorte di laboratorio per l'analisi genomica e i test di parassitismo. Un saggio di infezione a singolo oviposizionamento e un metodo di knockdown genico a doppio filamento basato su RNA sono stati ottimizzati per l'analisi funzionale dei geni velenosi. Insieme, questi protocolli forniscono un quadro sperimentale pratico per analizzare i meccanismi molecolari alla base delle interazioni parassitoide-ospite e faciliteranno future ricerche in biologia dello sviluppo, immunologia e fisiologia.

Introduction

Il parassitismo è uno stile di vita in cui un organismo sfrutta le risorse nutrizionali di un altro ed è diffuso tra i taxa. Si stima che fino alla metà di tutti gli organismi noti presenti parassitismo nel proprio ciclo^{vitale 1}. Tra i parassiti, le vespe parassitoidi sono un gruppo particolarmente diversificato, rappresentando circa il 20% di tutti gli^{insetti 2}. Sfruttano una vasta gamma di ospiti artropodi, come insetti, ragni e acari, e mostrano una notevole diversità nelle loro storie di vita e nelle strategie^{parassitarie 3}. Queste caratteristiche rendono le vespe parassitoidi uno dei gruppi di insetti di maggior successo sia dal punto di vista evolutivo che ecologico.

Le interazioni tra parassitoidi e i loro ospiti sono state ampiamente studiate come sistemi modello di "corse agli armamenti" evolutivi. In particolare, le vespe endoparassitoidi utilizzano una vasta gamma di fattori, tra cui veleni, virus simbiotici e teratociti ^4,5. Questi fattori manipolano la fisiologia e lo sviluppo dell'ospite, garantendo così uno sviluppo efficace all'interno dell'ospite. Nonostante questi progressi, i meccanismi molecolari alla base del parassitismo rimangono poco compresi nella maggior parte delle specie di parassitoidi. Una delle principali limitazioni è la loro piccola corporatura, che ha ostacolato l'identificazione biochimica dei componenti del veleno. Inoltre, è tecnicamente difficile mantenere i parassitoidi e i loro ospiti con stadi di sviluppo sincronizzati in condizioni di laboratorio.

I recenti progressi nel sequenziamento di nuova generazione e in altre tecnologie omiche ora permettono analisi genomiche anche in specie parassitoidi molto piccole. Questi approcci hanno aperto nuove strade per indagare meccanismi molecolari precedentemente inaccessibili, permettendo di studiare le interazioni parassitoide-ospite a una risoluzione senza precedenti. In questo contesto, il nostro laboratorio si concentra su Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), una specie originariamente identificata in^{Giappone 6,7,8}. A. japonica include un ceppo partenogenetico thelytokous, in cui le femmine producono prole senza accoppiarsi. Questa caratteristica ci permette di raccogliere quantità sostanziali di DNA genomico geneticamente uniforme per il sequenziamento dell'intero^{genoma 9}. Inoltre, questa specie parassita un'ampia gamma di specie di Drosophila, incluso l'organismo modello D. melanogaster,  che offre importanti vantaggi sperimentali grazie alle sue condizioni di allevamento ben consolidate e alle fasi di sviluppo precisamente definite, consentendo sami di infezione riproducibile e un controllo accurato dello sviluppo dei parassitoidi¹⁰.

Durante il parassitismo di A. japonica, una vespa femmina inietta veleno insieme a un singolo uovo in una larva di mosca, all'interno della quale una larva di vespa cresce insieme al suo ospite. In particolare, A. japonica mostra un alto tasso di successo del parassitismo sull'ospite D. melanogaster, rendendo questa coppia parassitoide-ospite un potente modello sperimentale. Qui descriviamo protocolli per l'allevamento stabile, un test di infezione a posizione unica e un metodo di knockdown genico basato su RNA a doppio filamento (dsRNA) in A. japonica. Questi protocolli forniscono un quadro affidabile per analizzare i meccanismi molecolari alla base delle interazioni parassitoide-ospite.

Protocol

Una panoramica schematica del metodo di allevamento sincronizzato per D. melanogaster e A. japonica è presentata nella Figura 1.

1. Allevare la mosca della frutta ospite Drosophila melanogaster in laboratorio

1. Mantieni tutti gli animali da sperimentazione a 25 °C e umidità relativa del 50-60% in un ciclo chiaro/buio di 12:12 ore. Usa il ceppo selvatico Oregon-R (OR) come ospite per A. japonica (Figura 2A).
2. Trasferire le mosche adulte in una nuova fiala alimentare contenente un mezzo standard di farina di mais, lievito e agar (0,55% agar, Tabella 1). Etichetta la fiala con la data di trasferimento e il nome del ceppo "OR".
3. Elimina queste mosche adulte un giorno dopo il trasferimento per evitare un numero eccessivo di uova nel cibo. Assicurati che le larve della prole si nutrono sulla superficie del cibo.
   NOTA: Come linea guida, mantenere circa 200-250 uova per fiala alimentare (φ30×100 mm). Densità più elevate delle uova possono ridurre il successo del parassitismo e aumentare la variazione nello sviluppo di ospiti e vespe.
4. Quattro giorni dopo il Passo 1.2, trasferire un cucchiaio di larve di mosca (4 giorni dopo la deposizione delle uova, dAEL) in una nuova fiala di cibo. Mantenere queste larve non esposte ai parassitoidi per la generazione successiva. Questa procedura aiuta anche a controllare la densità larvale dell'ospite in una fiala.

2. Allevamento della vespa endoparassitoide Asobara japonica in laboratorio

1. Utilizzare un ceppo partenogenetico Tokyo (TK) e un ceppo sessuale Iriomote-jima (IR) (Figura 2B). La prima è composta da femmine, mentre la seconda è composta da femmine e maschi. I maschi nascono due o quattro giorni prima delle femmine. Pertanto, confermare la presenza delle femmine tramite i loro ovipositori prima del trasferimento.
2. Trasferire 10-20 vespe adulte direttamente dalla fiala di stock alla fiala contenente larve di mosca a 4 dAEL. Etichetta la fiala con la data di trasferimento e il nome del ceppo "TK" o "IR". Mantieni le vespe nelle stesse condizioni del Passo 1.1.
3. Permettere alle vespe adulte di oviporsi nelle larve di mosca. Eliminare queste vespe uno o due giorni dopo per prevenire il superparassitismo, che può portare alla morte dell'ospite. Rimuovere le mosche adulte eclose che sono fuggite dal parassitismo 10 o più giorni dopo il Passo 2.2.
4. Due settimane dopo lo Step 2.2, le vespe adulte iniziano a emergersi dalla pupa della mosca ospite. Trasferire queste vespe adulte appena chiuse in una nuova fiala con carta filtrante contenente 25% di glucosio e 50 mM di soluzione di vitamina C. I pezzi di carta filtrante devono essere sterilizzati a 130 °C per 2 ore. Fornire la soluzione su carta filtrante favorisce i comportamenti di oviposizione e prolunga la vita delle vespe adulte. Il nostro approccio all'uso della vitamina C per migliorare l'oviposizione è stato ispirato dalle osservazioni degli studi su Drosophila ¹¹.

3. Saggio di infezione a oviposizione singola

1. Sincronizza lo stadio di sviluppo delle larve di mosca utilizzate per l'esperimento di infezione.
   1. Inserire le mosche adulte in un tubo da 50 mL contenente una piastra di agar di succo d'uva (3% agar) spalmata con pasta di lievito fresca e lasciarle deporre uova per 24 ore.
   2. Raccogli le larve di primo stadio appena schiuse sulla piastra di agar di succo d'uva e trasferiscile in una piccola fiala (12 mL) contenente 2-3 g di pasta alimentare per mosche (cibo per mosche mescolato con una quantità adeguata di acqua). Nella fiala vengono poste 20-30 larve. Le larve di mosca vengono lasciate crescere a 25 °C.
2. Nel momento opportuno, preparare una piastra di Petri da 4 cm contenente uno strato sottile e uniformemente diffuso di pasta alimentare per mosche che copre un'area di circa 1,5-2,0 cm di diametro (d'ora in poi denominata arena per il test di infezione). Oltre all'arena per il test per l'infezione, prepara una nuova piccola fiala (12 mL) contenente una quantità adeguata di pasta per mosche. Questa fiala viene utilizzata per allevare le larve ospiti dopo il test di infezione.
3. Raccogliere le larve a stadi e trasferirle in un piatto contenente acqua deionizzata (resistività = 15 MΩ·cm, 25 °C). Sciacquare le larve nel piatto con una delicata agitazione per rimuovere il cibo residuo dal loro corpo.
4. Dopo il risciacquo, rimuovere delicatamente l'eccesso di umidità dalle larve usando salviette di carta senza penugine, poiché l'eccesso di acqua interferisce con il comportamento di oviposizione delle vespe nell'arena del test di infezione. Poi trasferisci le larve nell'arena. Questo passaggio aumenta l'attività larvale durante l'esperimento di infezione.
5. Anestesiare le vespe adulte con gas_CO2 a una portata di 5 L·^min-1 e una pressione di 0,2 MPa. Poi, posiziona delicatamente circa tre vespe femmine nell'area del test di infezione. Chiudi il coperchio della ciotola e lascia che si rigenerino sulla pasta di mosca.
6. Osserva il comportamento di oviposizione di queste vespe sotto uno stereomicroscopio (impostazione zoom: 10× a 15×).
   NOTA: Quando una vespa tocca il corpo larvale di una mosca in movimento, inserisce rapidamente il suo ovipositore nel corpo della mosca e inietta componenti del veleno. Sebbene la larva di mosca si contorca e si agiti il corpo, diventa immediatamente paralizzata. Successivamente, la vespa fa vibrare l'addome e deposita un uovo nel corpo larvale ospite, dopo di che l'ovipositore viene ritirato. Questo comportamento di oviposizione è chiamato infezione.
7. Dopo l'infezione, aprire il coperchio e trasferire la larva di mosca infetta nella nuova piccola fiala contenente pasta alimentare per mosche preparata nello Passo 3.2. Per standardizzare il momento dell'infezione, esegui l'esperimento di infezione entro 15 minuti.
8. Etichetta la piccola fiala con informazioni sperimentali, come data, nome del campione, ora di infezione e numero di individui. Queste fiale vengono tappate e poi poste in un contenitore umido e conservate a 25 °C.

4. Generazione di vespe di interferenza RNA (RNAi) tramite iniezione di dsRNA

1. Sintetizza dsRNA di 400 bp o più per il knockdown genico mediato da dsRNA (interferenza RNA, RNAi) utilizzando un sistema di sintesi dsRNA basato su trascrizione in vitro . I campioni di dsRNA devono essere mantenuti a -20---80 °C fino all'utilizzo. I protocolli dettagliati sono come descritto^{in precedenza 9}.
2. Prepara una piastra di Petri da 5,5 cm contenente il 2% di agar per posizionare i corpi delle vespe. Riempi due terzi di ogni piastra con agar per generare uno spesso strato di piastra d'agar da iniettare.
3. Metti una salvietta di carta senza pelucchi, umidita con acqua, sul coperchio di un piatto di plastica.
4. Raccogli le pupe della mosca ospite a 7 giorni dall'infezione (dpi) dalla fiala e mettile sulle salviette di carta senza pelucchi preparate nello Passo 4.3. Aggiungere una goccia d'acqua alla parete della fiala aiuta a staccare le capsule delle pupe della mosca ospite dalla fiala.
5. Sotto lo stereomicroscopio (impostazione zoom: 20×), rimuovere il caso della pupa della mosca ospite ed esporre il corpo della vespa con la pinza. A 7 dpi, la maggior parte delle vespe è nella fase pupale, in cui sono distinguibili le parti della testa, del torace e dell'addome. Il corpo di una vespa è immobile.
6. Posizionare i corpi delle vespe recuperati sulla piastra di agar preparata nello Passo 4.2, allineando i loro assi corporei nella stessa orientazione. Disporre 20-30 corpi di vespe con il lato dorsale verso l'alto in una o due file. Rimuovi l'eccesso di umidità dalla piastra di agar usando una salvietta di carta senza pelucchi per evitare che le vespe scivolino.
7. Seguendo le istruzioni del produttore, installare l'apparato di iniezione e lo stereomicroscopio (Figura 3A). Utilizzare un sistema di microiniezione dotato di ago capillare di vetro che consente un controllo preciso del volume e della velocità di iniezione. Posizionare la piastra di agar in cui le teste delle vespe sono orientate verso la punta dell'ago di iniezione. Il volume di iniezione è di 50 nL·^wasp-1 e la velocità di iniezione è di 50 nL·^sec-1 sull'iniettore.
8. Prepara aghi capillari in vetro usando un estratore di aghi. La forma del capillare di vetro è regolabile in base alla temperatura del riscaldatore.
9. Posiziona l'ago capillare di vetro sulla smerigliatrice a aghi con un angolo di 30-35°. Molare l'ago finché la lunghezza della punta non raggiunge 0,04 mm (quattro divisioni sul reticolo dell'oculare, Figura 3B).
10. Poco prima dell'iniezione, scongelare l'RNA ds. La concentrazione di dsRNA è 0,25-1 μg·^μL-1. Per la visualizzazione, la soluzione di dsRNA viene colorata con un colorante blu (sale disodico Erioglaucina, 2% peso·^volume-1). Utilizzando una punta di microloader, riempi il capillare di vetro con soluzione di dsRNA con colorante blu. 4 μL sono sufficienti per iniettare 30 corpi di vespa. Assicurati che non ci siano bolle d'aria all'interno della soluzione.
    NOTA: Dopo aver caricato la soluzione di dsRNA, tocca delicatamente il lato dell'ago con un'unghia per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. Le bolle d'aria residue possono ostacolare il flusso della soluzione e interferire con l'iniezione efficace.
11. Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago, riempi la parte libera del capillare di vetro con olio minerale, assicurandoti che non rimangano bolle d'aria all'interno del capillare.
12. Attacca l'ago capillare di vetro contenente soluzione di dsRNA e olio minerale al portaago e poi montalo sul dispositivo di iniezione.
13. Regolare la posizione della piastra di agar e dell'ago capillare di vetro sull'iniettore, in modo che l'ago di vetro sia posizionato a un angolo di 30-45° rispetto ai corpi delle vespe (Figura 3A).
14. Inserire l'ago capillare di vetro nel lato dorsale del corpo della vespa, con il lato leggermente laterale rispetto alla linea mediana dorsale. Microinietta la soluzione di dsRNA all'interno del corpo. La soluzione di dsRNA iniettata è visibile con il colorante  blu (Figura 3C).
15. Dopo l'iniezione, posiziona le piastre di agar in un contenitore umido (70-80% di umidità relativa) e conservale in un incubatore a 25 °C per una settimana, fino alla nascita delle vespe adulte. I corpi delle vespe ferite devono essere rimossi dalla piastra di agar per prevenire la contaminazione batterica.
    PUNTO DI PAUSA: Nel Passo 4.6, le pupe della vespa possono essere mantenute sulla piastra di agar per diverse ore prima dell'iniezione. Gli aghi possono essere preparati in anticipo (Passo 4.8 e 4.9); Tuttavia, col tempo tendono a ostruirsi. Gli aghi appena preparati generalmente offrono prestazioni di iniezione più affidabili.

Results

Le varianti asessuali e sessuali di Asobara japonica
A. japonica è ampiamente diffusa in tutto il Giappone. I ceppi partenogenetici di Thelytokous sono predominanti nelle isole principali, mentre i ceppi sessuali di Arrhenotokous si trovano nelle isole subtropicali, tra cui le isole Amami-Oshima e^{Iriomote-jima 8,12}. Nei ceppi sessuali, i maschi emergono prima delle femmine di qualche giorno, così che il momento del trasferimento degli adulti sia distinto tra questi ceppi. La partenogenesi del Thelytokous in A. japonica è indotta dall'infezione da Wolbachia, un batterio endosimbiotico trasmesso^{maternamente 13}. L'eliminazione di Wolbachia tramite trattamento antibiotico porta alla produzione di maschi ^9,14, e il trapianto di Wolbachia in ceppi sessuali induce la partenogenesi¹⁵. Sia i ceppi asessuali che quelli sessuali di A. japonica mostrano un alto successo nel parassitismo in più specie di Drosophila. Ad esempio, possono parassitar D. suzukii, un parassita di frutta economicamente importante, e sono considerati potenziali agenti di controllo biologico in^{agricoltura 16}. Tra i ceppi disponibili, abbiamo utilizzato principalmente il ceppo TK infetto da Wolbachia per i nostri esperimenti. Il ceppo TK mostra un'attività parassitaria più elevata verso le larve ospiti rispetto al ceppo^{IR 14}, rendendolo adatto per l'analisi.

Il successo del parassitismo dipende dalle condizioni di allevamento
Il tasso di successo del parassitismo di A. japonica è generalmente elevato, ma è fortemente influenzato dalle condizioni di allevamento delle mosche ospiti. In condizioni povere di nutrienti, il periodo di crescita delle larve di mosca è prolungato e il momento della pupariazione è^{ritardato di 17}. In queste condizioni, le vespe potrebbero non utilizzare correttamente le risorse dell'ospite e non sincronizzarne lo sviluppo con quello degli ospiti. Per esaminare questa possibilità, abbiamo allevato mosche e vespe in condizioni di lievito normale (1×) e povere di lievito (0,1×). Abbiamo poi valutato il successo del parassitismo e il tempismo dello sviluppo (Figure 2C, 2D). Il successo del parassitismo è stato calcolato come il rapporto tra vespe adulte e larve ospiti.

In condizioni normali di lievito, il tasso di successo del parassitismo è stato dell'81,7% nel saggio di infezione a oviposizione singola (Figura 2C, a sinistra; Tabella 2). Quando il contenuto di lievito è stato ridotto al 10% (condizione povera di lievito), il tasso di successo del parassitismo è sceso al 35,0% (Figura 2C, a destra; Tabella 2). Questa riduzione può essere spiegata dal fatto che circa il 50% delle larve ospiti è morto dopo l'infezione. Questi risultati suggeriscono che l'allocazione delle risorse tra ospite e parassitoide viene interrotta in condizioni povere di nutrienti.

È importante notare che il momento dell'eclosione delle vespe non è stato ritardato allo stesso modo in condizioni povere di lievito come in condizioni normali di lievito. Mentre il momento dell'eclosione delle mosche veniva ritardato fino a 9 giorni, quello delle vespe era ritardato solo di 4-5 giorni. Questo risultato suggerisce che la disponibilità di nutrienti influisce principalmente sullo sviluppo dell'ospite. Il tempismo dell'eclosione è coerente sia nelle mosche che nelle vespe in condizioni normali di lievito, ma non in condizioni povere di lievito, suggerendo che lo sviluppo sincronizzato tra parassitoidi e ospiti dipenda dalla disponibilità di nutrienti.

Approccio basato sull'RNAi per l'analisi funzionale dei geni velenosi
Sebbene le analisi trascristatiche e proteomiche della ghiandola velenosa identifichino numerose molecole candidate, non è chiaro quali di esse siano necessarie per un parassitismo efficace. Per determinare i ruoli fisiologici di queste molecole candidate, sono necessarie analisi funzionali in vivo utilizzando approcci di knockdown genico.

Abbiamo recentemente riportato che il parassitismo di A. japonica induce apoptosi, autofagia e arresto mitotico nei dischi immaginari delle larve di D. melanogaster, causando grave degradazione tissutale, un fenomeno chiamato degradazione immaginaria del disco (IDD⁾¹⁰. Per identificare le molecole responsabili della IDD, abbiamo effettuato uno screening RNAi di geni candidati identificati tramite analisi trascrictomiche, proteomiche e genomiche comparative. Di conseguenza, sono stati identificati due geni, il fattore di degradazione del disco immaginale (IDDF)-1 e IDDF-2. Sia IDDF-1 che IDDF-2 contengono il Dominio della Funzione Sconosciuta 4803 (DUF4803). In particolare, a seguito del nostro rapporto iniziale, uno studio indipendente ha identificato molteplici proteine velenose di A. japonica (denominate Degradazione Indotta dal Veleno, VID) associate alla IDD, tutte dotate anche del dominio^{DUF4803 18}.

Sulla base di questi risultati, abbiamo ulteriormente ottimizzato il protocollo RNAi per migliorare la riproducibilità e l'efficienza. In particolare, l'uso di Nanoject III ha permesso un controllo preciso del volume e della velocità di iniezione, risultando in risultati di knockdown più coerenti.

Per valutare l'efficienza del protocollo RNAi ottimizzato, abbiamo eseguito il knockdown di IDDF-1. Nelle vespe adulte eclosed, il livello di espressione di IDDF-1 è stato significativamente diminuito rispetto al controllo (Figura 3D). Per la validazione funzionale, abbiamo eseguito saghi di infezione a posizione unica utilizzando queste vespe RNAi e larve di mosca ospite che esprimono il reporter di apoptosi GC3Ai nella regione¹⁹ della tasca alare. Un segnale GC3Ai è stato rilevato nella tasca alare dopo l'infezione con le vespe di controllo (GFP RNAi). Al contrario, il segnale GC3Ai è stato significativamente ridotto dopo l'infezione con vespe RNAi IDDF-1 (Figura 3E, 3F). Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti, confermando che la funzione IDDF-1 è effettivamente soppressa dall'RNAi.

Figura 1. Panoramica schematica delle procedure di allevamento per D. melanogaster e A. japonica. 
Le procedure a passo per passo sono mostrate secondo le fasi di sviluppo di D. melanogaster. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Parassitismo di Asobara japonica. (A) Schema della relazione di sviluppo tra D. melanogaster e il suo parassitoide A. japonica. Una vespa femmina deposita veleni e un singolo uovo in una larva di mosca. Dopo la schiusa, la larva della vespa si sviluppa in parallelo con la larva ospite, che successivamente si puparia. Dopo la pupariazione, la vespa consuma tutto il corpo della mosca e alla fine si eclosione dalla pupa della mosca. (B) Vespe adulte della linea asessuale (sinistra) e della linea sessuale (destra) di A. japonica. Barra di squama, 1 mm. (C) Tasso di emergenza di mosche o vespe in condizioni normali (1×) e povere di lieviti (0,1×). Gli saggi di infezione a oviposizione singola sono stati eseguiti utilizzando larve di mosca ospite 4 giorni dopo la deposizione delle uova (dAEL). n = 267 (1×, mosche), 120 (0,1×, mosche), 85 (1×, vespe) e 80 (0,1×, vespe), rispettivamente. (D) Tempismo di eclosione di mosche e vespe nelle due condizioni nutrizionali mostrate in (C). È indicato il rapporto tra adulti e pupe. n = 250, 107, 61 e 41, rispettivamente. La freccia nera indica il momento dell'infezione da vespa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Procedura RNAi ottimizzata usando Nanoject III. (A) Installazione dell'apparato di microiniezione sotto uno stereomicroscopio. L'ago capillare di vetro era posizionato a un angolo di 30-45° rispetto alla piastra di agaro. (B) La punta dell'ago capillare di vetro veniva affilata con una smerriferitrice. (C) Una soluzione tinta di blu veniva microiniettata nel corpo di una vespa usando un ago capillare di vetro. Il lato anteriore della vespa è indicato da A nell'immagine. P, posteriore. Barra di scala, 1 mm. (D) I livelli di espressione di IDDF-1 nelle vespe RNAi GFP e RNAi IDDF-1 sono stati quantificati utilizzando il metodo delta-delta C_t . I livelli di espressione sono stati normalizzati a RpL32-Aj. I dati rappresentano la media ± SD con singoli punti dati (n = 5). P < 0,005 (test t dello studente). (E e F) Segnali GC3Ai nei dischi alari di larve non infette e larve ospiti a 6 ore dall'infezione (hpi) dopo l'infezione con le vespe di controllo (RNAi GFP )  o RNAi IDDF-1 . I dischi alari sono contornati da linee tratteggiate bianche basate sulla colorazione DAPI dei nuclei (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). Il rapporto tra l'area positiva al GC3Ai e l'area della tasca alare è stato quantificato. P < 0,005 (ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronti multipli di Tukey). n = 11 repliche biologiche per gruppo. Barra di scala, 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componenti	Importo
Acqua	1 L
Agar	5,5 g
Lievito	40 g
Farina di mais	90 g
Glucosio	100 g
Acido propionico	3 mL
10% butil p-idrossibenzoato in 70% EtOH	3,5 mL

Tabella 1: Componenti del mezzo standard di farina di mais-lievito-agar (cibo per mosche).

Tipo di cibo	Condizioni	# di individui totali	# di individui eclosi o morti				Tasso di emergenza di mosche o vespe (%)
			Vola	Wasp	Letale pupale	Letali larvali
1×	Non infetti	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica infettata	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Non infetti	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica infettata	80	0	28	13	39	35

Tabella 2: Numero di individui e tassi di emergenza in condizioni normali (1x) e povere di lievito (0,1x).

Nome di guida	Sequenza (5'>3')	Scopo
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTAT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Clonazione CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	Clonaggio CDS, modello dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Modello dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTCCCGGCAAATT	Modello dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Modello dsRNA
※ Questi primer e modelli di dsRNA sono riportati in Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 sta per IDDF-1.

Tabella 3: Sequenze di primer e template di dsRNA utilizzati in questo studio.

Discussion

In questo studio, abbiamo creato una piattaforma sperimentale versatile per indagare le interazioni parassitoide-ospite a livello molecolare. Ottimizzando le condizioni di allevamento, un test di infezione a posizione unica e il protocollo RNAi, forniamo un sistema robusto per studi funzionali di fattori derivati dai parassitoidi. Questa piattaforma faciliterà studi futuri volti a scoprire i meccanismi attraverso cui le vespe parassitoidi manipolano lo sviluppo dell'ospite e potrebbe anche contribuire allo sviluppo di strategie biologiche di controllo dei parassiti.

Il ceppo TK infettato da Wolbachia di A. japonica fornisce un sistema sperimentale altamente riproducibile per l'analisi del parassitismo. In molti studi parassitoide-ospite, gli esiti sperimentali sono spesso variabili, con la sopravvivenza dell'ospite e il successo dei parassitoidi che dipendono sensibilmente dalle condizioni ambientali e fisiologiche. Al contrario, il ceppo TK mostra un successo costantemente elevato nel parassitismo, creando di fatto una condizione "dominante parassitoide" in cui l'esito dell'infezione è in gran parte uniforme. Inoltre, essendo un ceppo partenogenetico, riduce la variazione sperimentale tra individui grazie al suo background genetico uniforme. Questa riproducibilità consente un tracciamento affidabile del processo di parassitismo e facilita analisi quantitative delle risposte dell'ospite e dei fattori derivati dal parassitoidi.

Inoltre, la riproduzione del thelytokous facilita notevolmente le analisi genomiche permettendo la generazione di DNA genomico altamente omogeneo, fondamentale per un assemblaggio genomico^{di alta qualità 9}. Sebbene tali ceppi partenogenetici non siano disponibili in tutte le specie di parassitoidi, i nostri risultati evidenziano il potenziale del thelytoky indotto da Wolbachia come strategia per migliorare le risorse genomiche. Stabilire linee infettate da Wolbachia in altre specie di parassitoidi potrebbe quindi rappresentare un approccio potente per ampliare le risorse genomiche e accelerare studi molecolari comparativi tra parassitoidi.

Gli esiti del parassitismo sono fortemente influenzati dalle condizioni nutrizionali dell'ospite, indicando che le condizioni di allevamento sono un fattore determinante fondamentale del successo dei parassitoidi. Poiché il successo del parassitismo dipende da una precisa coordinazione temporale con lo sviluppo di ospiti e vespe, condizioni nutrizionali incontrollate tendono a interrompere questo processo e a ridurre la riproducibilità. Pertanto, una standardizzazione attenta delle condizioni di allevamento dell'ospite è essenziale per stabilire un sistema sperimentale affidabile che studi le interazioni parassitoide-ospite. Inoltre, le fiale di stock di mosche dovrebbero essere mantenute separatamente dalle fiale di stock di vespe, poiché la presenza di vespe riduce i comportamenti di oviposizione^{delle mosche 20,21}.

Per consentire una valutazione quantitativa delle interazioni parassitoide-ospite, abbiamo ideato un saggio di infezione a oviposizione singola in cui un singolo uovo viene depositato in ciascun ospite. Questo saggio contrasta con i saghi convenzionali per infezioni di massa, che spesso coinvolgono molteplici eventi di oviposizione che portano a danni eccessivi all'ospite e mortalità. Per promuovere un'efficienza nell'oviposizione entro una finestra di tempo limitata (~15 min.), gli adulti delle vespe appena chiuse sono stati precondizionati con una soluzione di glucosio e vitamina C, migliorando così l'efficienza dell'oviposizione e la riproducibilità complessiva.

Inoltre, abbiamo ottimizzato il protocollo RNAi per l'analisi della funzione genica nelle vespe parassitoidi. Utilizzando il sistema di microiniezione, abbiamo ottenuto un controllo preciso del volume di iniezione e migliorato la consistenza dell'efficienza del knockdown. La validazione funzionale con IDDF-1 ha confermato che questo metodo sopprime efficacemente l'espressione genica e produce risultati fenotipici riproducibili. Dato che gli studi trascrivertici e proteomici continuano a identificare un gran numero di fattori di veleno candidati, la disponibilità di una piattaforma di screening funzionale sarà essenziale per determinarne i ruoli biologici.

Un limite di questo protocollo RNAi è che non è adatto ad analizzare geni che funzionano nelle prime fasi dello sviluppo delle vespe, poiché è tecnicamente difficile iniettare dsRNA nelle uova di vespa presenti all'interno del corpo ospite. Per superare questo problema, l'istituzione di un sistema di allevamento ex vivo può offrire un approccio^{utile 22.} In alternativa, approcci di knockout genico che utilizzano Direct Parental (DIPA)-CRISPR possono fornire una strategia complementare, in cui i reagenti vengono iniettati nelle femmine adulte per generare prole²³ modificata dal genoma. Infatti, questo approccio ha generato con successo individui genici knockout nell'ectoparassitoide pupale Nasonia vitripennis iniettando reagenti in femmine adulte o individui al tardo stadio^{pupale 24}. Insieme al nostro metodo di knockdown genico basato su RNAi, questi approcci faciliteranno analisi più complete delle funzioni geniche coinvolte nel processo di parassitismo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infection assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injection
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infection assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injection
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Rearing
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infection assay
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Image analysis
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Rearing
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Nuclei staining, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infection assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injection
Fiji	NA	https://fiji.sc	Image analysis
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Rearing
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Rearing
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Rearing
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Sample storage
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Sample storage
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infection assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Rearing
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthesis
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Rearing
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthesis
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	dsRNA injection
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injection
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injection
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthesis
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Rearing
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infection assay
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infection assay
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Rearing
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injection
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infection assay
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Rearing
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infection assay
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Rearing