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Articolo metodologico

Conservazione della complessità tissutale In Vivo in un modello del sistema nervoso olfattivo di topi mediante analisi in toto per lo studio della rigenerazione neurale

117 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/72036

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18 agosto 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completo per preservare la complessità anatomica del sistema nervoso olfattivo del topo. In questo documento viene illustrato nel dettaglio l'intero flusso di lavoro, compresi dissezione, preparazione del tessuto e acquisizione delle immagini. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il sistema olfattivo in condizioni normali o patologiche, inclusi i processi naturali di riparazione.

Abstract

Nell'era dell'imaging tridimensionale (3D), l'immunohistochimica standard è stata riconosciuta come fortemente limitata negli studi di patologia e di anatomia umana complessa. Analizzando soltanto sezioni sottili, strutture più ampie e aspetti essenziali dell'architettura tissutale possono perdere dettagli contestuali critici, portando a interpretazioni incomplete o fuorvianti. Sebbene sezioni bidimensionali (2D) abbiano supportato una comprensione di base dell'architettura istologica, esse risultano insufficienti per catturare la reale realtà tridimensionale dei tessuti biologici.

Un numero crescente di studi relativi a diverse regioni anatomiche adotta ormai tecniche che isolano unità anatomiche integre — preparati in montaggio piatto, interi o en face — combinati a microscopia fluorescente ad alta risoluzione. Questi approcci permettono una visualizzazione e un'interpretazione più complete dell'organizzazione strutturale. Ciò risulta particolarmente rilevante nel sistema nervoso olfattivo, dove definire i complessi meccanismi cellulari alla base della sua notevole capacità rigenerativa richiede un contesto a tutto spessore. Sezioni sottili rischiano di non rilevare caratteristiche fisiopatologiche chiave ancora poco definite.

Date queste limitazioni e il divario conoscitivo riguardo alle interazioni cellulari che guidano la rigenerazione olfattiva, lo sviluppo di una tecnica raffinata su preparato intero in grado di preservare la complessità del tessuto a spessore completo era essenziale. Le mucose olfattive complete sono state isolate come campioni a spessore intero, accompagnate da un protocollo ottimizzato per la penetrazione degli anticorpi. L'immagine ad alta risoluzione (EVIDENT SpinSR) e la ricostruzione tridimensionale hanno permesso una visualizzazione accurata delle interazioni cellulari in vivo.

Introduzione

Il sistema nervoso olfattivo (ONS) rappresenta un modello unico e ben consolidato per lo studio dei meccanismi di rigenerazione neuronale, poiché mantiene la capacità unica di rinnovamento neuronale per tutta la vita1. Tuttavia, il potenziale per la traduzione clinica di questa capacità neuro-riparativa rimane limitato a causa di significative lacune nella comprensione del comportamento delle cellule del sistema olfattivo2,3,4. Le risposte cellulari e l'organizzazione anatomica dell'ONS, compresi i neuroni olfattivi primari, le cellule di rivestimento olfattive (OECs) e i fibroblasti perineurali, sono state descritte in diversi studi su animali, basati su sezioni di tessuto ultratermole (<2 µm) combinate con modelli di lesione fisica grave applicati all'ONS di roditori1,2. Negli studi citati, gli animali venivano solitamente sacrificati a 10 giorni dalla lesione, fornendo una finestra temporale molto ristretta su un singolo momento specifico del rimodellamento esteso e complesso di tale tessuto durante la lesione neuronale2. Tali studi hanno riportato che, dopo la morte assonale, le OECs e i fibroblasti persistono come canali continui lungo il sito della lesione.

Sebbene informativo, a causa delle numerose limitazioni sopra descritte, l'approccio utilizzato ha fornito una panoramica concettuale a bassa risoluzione a un livello superficiale del sistema nervoso olfattivo (ONS), impedendo infine una valutazione completa della reale organizzazione cellulare all'interno dell'ONS intatto3. Di conseguenza, alcune relazioni spaziali fondamentali potrebbero essere state trascurate.

La conservazione della struttura tissutale tridimensionale è essenziale per un'analisi anatomica e cellulare accurata ed è stata applicata con successo a diversi organi e patologie4,5,6,7,8,9,10,11,12. Gli approcci su preparati interi sono stati utilizzati per mappare l'organizzazione neuronale all'interno della mucosa olfattiva13,14, tuttavia, la visualizzazione delle interazioni cellulari con una struttura ONS a spessore completo, inclusa una lamina propria conservata, non è ancora stata realizzata.

In questo studio, stabiliamo un flusso di lavoro che utilizza un modello murino con elaborazione del tessuto in toto, immunomarcatura, imaging ad alta risoluzione e ricostruzione tridimensionale, consentendo un'analisi dettagliata dell'architettura del sistema olfattivo. Questo protocollo è stato sviluppato per colmare una lacuna nei metodi pubblicati esistenti, poiché conserva e preserva la mucosa olfattiva a tutto spessore, inclusa la lamina propria, permettendo lo studio delle interazioni intercellulari. In particolare, questa metodologia migliorata di raccolta ed elaborazione del tessuto può essere applicata e combinata con diversi modelli del sistema olfattivo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che prevedevano animali e cellule modificate geneticamente sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la Biosicurezza dell'Università Griffith (NLRD/003/2020_var3) e del Comitato per l'Etica sugli Animali dell'Università Griffith (MHIQ/04/23/AEC), in conformità con le linee guida dell'Ufficio del Regolatore della Tecnologia Genica del Commonwealth australiano (OGTR).

NOTA: Nello studio sono stati utilizzati complessivamente 15 topi adulti da laboratorio (8–9 settimane) di entrambi i sessi. In particolare, topi transgenici S100β-DsRed in cui tutte le cellule olfattive di sostegno (OEC) esprimono la proteina rossa brillante DsRed sotto il controllo del promotore S100β. S100β fa parte di una famiglia più ampia di proteine leganti il calcio ed è comunemente espressa nelle cellule gliali del sistema nervoso centrale, come le OEC. Questo modello si è rivelato ottimale ai fini di questi esperimenti, consentendo una facile localizzazione delle popolazioni cellulari bersaglio mediante segnali di fluorescenza endogeni. I topi transgenici S100β-DsRed erano stati generati in precedenza e si è dimostrato che il loro utilizzo consente un rilevamento migliore delle OEC rispetto all'immunohistochimica per analisi di tessuti fissi15,16,17,18.

1. Raccolta delle teste e fissazione dei tessuti

  1. Sacrificare gli animali mediante inalazione crescente di CO2 nei punti temporali sperimentali.
  2. Verificare che la morte sia avvenuta attraverso l'assenza dei riflessi corneale e plantare, seguita da dislocazione cervicale, oppure in conformità con la SOP approvata.
  3. Rimuovere l'intera testa e le mascelle con le forbici.
  4. Rimuovere la pelle dal cranio ed eliminare la cartilagine alla punta del naso per esporre la cavità nasale e garantire una penetrazione efficace dell'agente fissante.
    NOTA: Si è osservato che questo passaggio, consistente nel tagliare la parte più frontale della cartilagine nasale dell'animale, è cruciale per permettere una corretta fissazione del tessuto all'interno della cavità nasale.
  5. Risciacquare rapidamente le teste in PBS 1× per rimuovere l'eccesso di sangue.
  6. Fissare il tessuto immergendolo per tutta la notte (12–18 h) in paraformaldeide al 4%, per almeno 6 h (tempo sufficiente per fissare il tessuto di interesse) a 4 °C su un rullo.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa che rilascia vapori di formaldeide. È tossica per inalazione, contatto cutaneo e ingestione; provoca irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie ed è sospettata di essere cancerogena. Manipolarla esclusivamente in cappa aspirante indossando dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione oculare. Lo smaltimento sicuro delle sostanze chimiche pericolose e dei rifiuti biologici generati durante il protocollo deve avvenire in conformità con le normative istituzionali e locali.
    ​NOTA: Durante le fasi di ottimizzazione, abbiamo osservato che 6 h erano sufficienti per fissare il tessuto di interesse; tuttavia, un tempo superiore a 12 h tendeva a causare una sovrafissazione e la degradazione delle strutture della mucosa.
  7. Rimuovere le teste dall'agente fissante e lavarle per 3 h in PBS 1× a temperatura ambiente (20–25 °C) su un rullo.
  8. Conservare le teste in PBS fresco a 4 °C e raccogliere il tessuto mucoso in toto entro 48 h

2. Raccolta del tessuto in montaggio intero

  1. Eseguire l'isolamento del tessuto al microscopio.
  2. Tagliare le teste a metà utilizzando un bisturi, seguendo la linea sagittale mediana.
  3. Esponi l'interno della cavità nasaleFigura 1). Identificare le regioni anatomiche e raccogliere il tessuto mucoso che riveste l'intera sezione anatomica (Figura 1B).
  4. Utilizzando un tagliaossa, rompere delicatamente ed asportare l'osso settale che ricopre parte della cavità mucosa.
    NOTA: Vedere Figura 2A; Questo passaggio è cruciale per esporre la cavità concava al di sotto dell'osso, dove i fasci di assoni attraversano la parete dorsale (Figura 1B).
  5. Una volta esposta questa area, utilizzare pinze curve per staccare delicatamente ed estrarre il tessuto dalla parete dorsale concava. Sollevare il tessuto dall'osso sottostante e staccare con delicatezza la mucosa olfattiva residua per raccogliere il preparato integro in montaggio completo.
    NOTA: in questa fase era richiesta la massima cautela per evitare di lacerare il tessuto.
  6. Raccogliere il tessuto di interesse da entrambe le narici, destre e sinistre: la mucosa ricopre il setto, le pareti dorsali sinistra e destra e la lamina cribrosa della cavità nasale (Figura 1A, B). Raccogliere il tessuto da entrambe le narici, inclusi il setto, le pareti dorsali e la lamina cribrosa, per isolare la regione anatomica contenente le strutture olfattive primarie (Figura 2C).
  7. Lavare i tessuti raccolti in PBS 1× ed eliminare eventuali tessuti indesiderati, inclusi frammenti ossei. Conservare i tessuti a 4 °C in PBS 1× per successive analisi di immunohistochimica.
    NOTA: Se il tessuto deve essere conservato a lungo termine, si consiglia di conservarlo in una soluzione di PBS 1× e azoturo di sodio 0,001% (p/v), a 4 °C.

3. Protocollo di colorazione ottimizzato

NOTA: I protocolli di colorazione comunemente utilizzati sono generalmente ottimizzati per sezioni di spessore sottile-medio (ad esempio, fino a 50 µm). Pertanto, il protocollo doveva essere adattato a tessuti molto più spessi.
​Un passaggio cruciale osservato consiste nel mantenere il tessuto in sospensione all'interno di provette Eppendorf durante l'intero processo di colorazione, posizionando le provette su un rullo mentre i reagenti penetrano. Di conseguenza, i passaggi di colorazione non sono stati eseguiti con il tessuto su un vetrino per imaging. Il tessuto è stato prima colorato in sospensione e successivamente montato sui vetrini per imaging. Questi dettagli hanno garantito che il tessuto non si piegasse e che i reagenti e gli anticorpi potessero penetrare uniformemente in tutta la regione.

  1. Rimuovere i tessuti dallo stoccaggio e posizionarli in una provetta Eppendorf con soluzione bloccante (la soluzione da utilizzare dipenderà dal tipo di colorazione).
    ​NOTA: Soluzione bloccante: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 in PBS. Un altro aggiustamento importante è stato il tempo a cui il tessuto è stato sottoposto a ciascun reagente e cocktail di anticorpi.
  2. Mantenere il tessuto nella soluzione bloccante per 3 h a temperatura ambiente su un rullo.
    NOTA: È stato osservato che non era necessario aumentare la concentrazione degli anticorpi e dei reagenti di colorazione selezionati (Tabella 1) se il tempo di esposizione era maggiore rispetto all'approccio standard di immunostaining su sezioni sottili. Ciò ha permesso anche di ridurre al minimo l'uso di reagenti anticorpali costosi. Le incubazioni vengono effettuate in una provetta Eppendorf da 1,5 mL con il fermo del coperchio rimosso, in modo che possa rotolare su un rullo. Il volume del reagente era di 500 µL.
  3. Incubare per 72 h a 4°C con gli anticorpi primari su rullo.
  4. Lavare il tessuto due volte (1,5 h per ogni lavaggio) utilizzando PBS 1× a temperatura ambiente su rullo.
  5. Incubare il tessuto con l'anticorpo secondario (avvolto nella carta d'alluminio) e il colorante per i nuclei per un minimo di 4 h a temperatura ambiente su rullo, quindi proseguire per tutta la notte (12–18 h) a 4 °C su rullo.
  6. Lavare il tessuto due volte (1,5 h ogni volta) utilizzando PBS 1× a temperatura ambiente su rullo.

4. Preparazione del vetrino

  1. Rimuovere delicatamente il tessuto dal tubo Eppendorf
  2. Sotto un microscopio, posizionare il tessuto su un vetrino e assicurarsi che non siano presenti pieghe nel tessuto.
    NOTA: È possibile identificare, al microscopio e senza alcuna fluorescenza, l'orientamento del tessuto. Il lato della lamina propria del tessuto mucoso deve essere posizionato sul vetrino con l'epitelio rivolto verso il vetrino e la lamina propria rivolta verso il coprioggetto. La lamina propria può essere riconosciuta grazie alla presenza di spessi fasci nervosi, visibili anche senza colorazione. Disporre il tessuto in modo che la lamina propria sia rivolta verso il coprioggetto e l'epitelio giaccia sul vetrino facilita sia la colorazione che il processo di acquisizione delle immagini.
  3. Coprire i vetrini con mezzo di montaggio fluorescente e sigillarli.
  4. I vetrini possono essere conservati a 4 °C dopo essiccazione durante la notte (12–18 h) al buio e a temperatura ambiente

5. Acquisizione delle immagini e post-elaborazione

  1. Acquisizione di immagini immunofluorescenti a basso ingrandimento
    1. Eseguire la composizione automatica durante l'acquisizione delle immagini utilizzando una fusione lineare alfa.
      ​NOTA: Il numero di fotogrammi dello z-stack deve essere regolato in base allo spessore del campione per garantire una copertura completa del volume del tessuto.
    2. Acquisire campi adiacenti con un sovrapposizione del 15%. Acquisire immagini a tasselli utilizzando un modello di acquisizione a serpentina.
    3. Regolare il numero totale di sezioni ottiche in base allo spessore del tessuto.
    4. Impostare la calibrazione dell'immagine a 215,594 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire le immagini come z-stack con un passo z di 0,8 µm.
    5. Posizionare il tessuto montato in toto sul piatto del microscopio confocale. Acquisire immagini di riferimento utilizzando un obiettivo da 30x (NA 1,04).
  2. Acquisizione di immagini immunofluorescenti ad alto ingrandimento.
    1. Acquisire immagini dettagliate utilizzando un obiettivo da 60× (NA 1,5). Impostare la calibrazione dell'immagine a 107,923 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire immagini z-stack con un passo z di 0,41 µm.
    2. Regolare il numero totale di sezioni ottiche in base allo spessore del tessuto. Acquisire immagini da un singolo campo visivo.
      ​NOTA: Non è richiesta la composizione delle immagini per le acquisizioni a 60× poiché ogni dataset è costituito da un singolo campo visivo.
  3. Acquisizione di immagini di riferimento istologiche
    1. Acquisire sezioni cefaliche murine al mid-sagittale colorate con ematossilina-eosina (HE) utilizzando un microscopio scanner di vetrini in illuminazione in campo chiaro.
    2. Acquisire le immagini con un obiettivo da 40× (NA 0,95) e un ingrandimento della telecamera di 0,63x, ottenendo un ingrandimento effettivo di 25,2×.
    3. Verificare una calibrazione del pixel di 136,905 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire l'immagine come singolo piano focale.
    4. Comporre automaticamente le immagini a tasselli utilizzando un modello di acquisizione a serpentina e una fusione lineare alfa.
  4. Acquisizione di immagini di riferimento immunofluorescenti di riepilogo
    1. Acquisire immagini immunofluorescenti complementari di riepilogo utilizzando un obiettivo da 10x.
    2. Acquisire il campione come singola fetta z utilizzando uno 0% di sovrapposizione dei tasselli durante l'acquisizione.
    3. Impostare la calibrazione dell'immagine a 647,249 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Generare un'immagine di riepilogo che comprenda l'intera regione anatomica di interesse.
  5. Elaborazione delle immagini e generazione delle figure finali.
    1. Esportare i dataset delle immagini acquisite in un software di analisi delle immagini. Generare proiezioni di intensità massima (MIP) dai dataset z-stack.
    2. Selezionare le regioni di interesse (ROI) per le analisi successive e la preparazione delle figure.
    3. Combinare le immagini immunofluorescenti di riepilogo con le corrispondenti immagini HE per generare figure di riferimento anatomico. Successivamente, verificare l'allineamento e la corrispondenza anatomica tra i dataset di fluorescenza e istologici prima della preparazione delle figure.
      NOTA: Tutta la composizione delle immagini deve essere eseguita automaticamente durante l'acquisizione mediante impostazioni predeterminate del microscopio e non richiede ulteriore post-elaborazione. Nel nostro caso, la ricostruzione 3D è stata generata utilizzando il software Imaris: il plugin di rendering superficiale, basato sulla soglia di intensità per ogni canale acquisito, è stato utilizzato per produrre la ricostruzione tridimensionale. Infine, le immagini finali sono state assemblate in Adobe Illustrator.

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Risultati

Il nostro approccio in toto presentato qui ha permesso l'isolamento e la conservazione della mucosa olfattiva nella sua interezza. Nel nostro caso, l'attenzione era rivolta alla comprensione dei cambiamenti cellulari e anatomici su scala macroscopica (vista anatomica completa) e microscopica (livello cellulare).

L'approccio su preparato intero ci consente di raccogliere sia il compartimento epiteliale che la lamina propria, preservando le relazioni spaziali tra i fasci di assoni, le cellule ol...

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Discussione

Negli ultimi decenni si è assistito gradualmente all'inizio dell'era tridimensionale, con lo sviluppo di numerosi approcci innovativi nel campo scientifico. Ad esempio, gli approcci di ricostruzione tridimensionale, resi possibili grazie allo sviluppo di complessi metodi di imaging su preparati interi abbinati a microscopi fluorescenti ad alta risoluzione, hanno facilitato una migliore comprensione di diverse architetture istologiche di tessuti a tutto spessore. Questi approcci di rendering tridimensionale sono stati uti...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Clem Jones Foundation, della Perry Cross Spinal Research Foundation e della Motor Accident Insurance Commission a favore di JSTJ e RR, da una borsa della National Injury Insurance Scheme Queensland a favore di RR e da una borsa della Perry Cross Spinal Research Foundation a favore di FO. Parte di questo progetto è stata sostenuta dalla “Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)” e dalla Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)” a favore di FO.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GImmunohistochemica
Adobe Illustratorversione 28.5
Anticorpo anti-beta III tubulina - marcatore neuronaleAbcamab18207
Anticorpo anti-PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 triidrocloruroSigma Aldrich14533
COPRI-OGGETTO 24X50MM N. 1.5 100 PEZZIBio-strategyEPBRCS245015GPImmunohistochemica
Secondario anticorpo Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Taglierino per ossa Dumont #15A - rivestito in epossidicoDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Dissezione del tessuto
Pinzetta Dumont #7 - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Dissezione del tessuto
Secondario anticorpo caprino anti-ratto IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Software ImarisImarisversione 9.5.0Immagini
Forbici da dissezione MayoProSciTech420SSDissezione del tessuto
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148-500GElaborazione del tessuto
Soluzione salina tamponata al fosfato, compresse sterili di PBS (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Elaborazione del tessuto
Mezzo di montaggio antiossidante ProLong GlassThermo Fisher ScientificP36980Immunohistochemica
Lama di bisturi #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDissezione del tessuto
Manico per bisturi #4ProSciTechT134Dissezione del tessuto
Azoturo di sodioSigma-AldrichS2002-25GElaborazione del tessuto
SaccarosioChem-Supply57-50-1Elaborazione del tessuto
Vetrini microscopici adesivi TOMOProSciTechGEMS63705-09Immunohistochemica
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLImmunohistochemica

Riferimenti

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