Conservazione della complessità tissutale In Vivo in un modello del sistema nervoso olfattivo di topi mediante analisi in toto per lo studio della rigenerazione neurale

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completo per preservare la complessità anatomica del sistema nervoso olfattivo del topo. In questo documento viene illustrato nel dettaglio l'intero flusso di lavoro, compresi dissezione, preparazione del tessuto e acquisizione delle immagini. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il sistema olfattivo in condizioni normali o patologiche, inclusi i processi naturali di riparazione.

Abstract

Nell'era dell'imaging tridimensionale (3D), l'immunohistochimica standard è stata riconosciuta come fortemente limitata negli studi di patologia e di anatomia umana complessa. Analizzando soltanto sezioni sottili, strutture più ampie e aspetti essenziali dell'architettura tissutale possono perdere dettagli contestuali critici, portando a interpretazioni incomplete o fuorvianti. Sebbene sezioni bidimensionali (2D) abbiano supportato una comprensione di base dell'architettura istologica, esse risultano insufficienti per catturare la reale realtà tridimensionale dei tessuti biologici.

Un numero crescente di studi relativi a diverse regioni anatomiche adotta ormai tecniche che isolano unità anatomiche integre — preparati in montaggio piatto, interi o en face — combinati a microscopia fluorescente ad alta risoluzione. Questi approcci permettono una visualizzazione e un'interpretazione più complete dell'organizzazione strutturale. Ciò risulta particolarmente rilevante nel sistema nervoso olfattivo, dove definire i complessi meccanismi cellulari alla base della sua notevole capacità rigenerativa richiede un contesto a tutto spessore. Sezioni sottili rischiano di non rilevare caratteristiche fisiopatologiche chiave ancora poco definite.

Date queste limitazioni e il divario conoscitivo riguardo alle interazioni cellulari che guidano la rigenerazione olfattiva, lo sviluppo di una tecnica raffinata su preparato intero in grado di preservare la complessità del tessuto a spessore completo era essenziale. Le mucose olfattive complete sono state isolate come campioni a spessore intero, accompagnate da un protocollo ottimizzato per la penetrazione degli anticorpi. L'immagine ad alta risoluzione (EVIDENT SpinSR) e la ricostruzione tridimensionale hanno permesso una visualizzazione accurata delle interazioni cellulari in vivo.

Introduzione

Il sistema nervoso olfattivo (ONS) rappresenta un modello unico e ben consolidato per lo studio dei meccanismi di rigenerazione neuronale, poiché mantiene la capacità unica di rinnovamento neuronale per tutta la vita¹. Tuttavia, il potenziale per la traduzione clinica di questa capacità neuro-riparativa rimane limitato a causa di significative lacune nella comprensione del comportamento delle cellule del sistema olfattivo^2,3,4. Le risposte cellulari e l'organizzazione anatomica dell'ONS, compresi i neuroni olfattivi primari, le cellule di rivestimento olfattive (OECs) e i fibroblasti perineurali, sono state descritte in diversi studi su animali, basati su sezioni di tessuto ultratermole (<2 µm) combinate con modelli di lesione fisica grave applicati all'ONS di roditori^1,2. Negli studi citati, gli animali venivano solitamente sacrificati a 10 giorni dalla lesione, fornendo una finestra temporale molto ristretta su un singolo momento specifico del rimodellamento esteso e complesso di tale tessuto durante la lesione neuronale². Tali studi hanno riportato che, dopo la morte assonale, le OECs e i fibroblasti persistono come canali continui lungo il sito della lesione.

Sebbene informativo, a causa delle numerose limitazioni sopra descritte, l'approccio utilizzato ha fornito una panoramica concettuale a bassa risoluzione a un livello superficiale del sistema nervoso olfattivo (ONS), impedendo infine una valutazione completa della reale organizzazione cellulare all'interno dell'ONS intatto³. Di conseguenza, alcune relazioni spaziali fondamentali potrebbero essere state trascurate.

La conservazione della struttura tissutale tridimensionale è essenziale per un'analisi anatomica e cellulare accurata ed è stata applicata con successo a diversi organi e patologie^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Gli approcci su preparati interi sono stati utilizzati per mappare l'organizzazione neuronale all'interno della mucosa olfattiva^13,14, tuttavia, la visualizzazione delle interazioni cellulari con una struttura ONS a spessore completo, inclusa una lamina propria conservata, non è ancora stata realizzata.

In questo studio, stabiliamo un flusso di lavoro che utilizza un modello murino con elaborazione del tessuto in toto, immunomarcatura, imaging ad alta risoluzione e ricostruzione tridimensionale, consentendo un'analisi dettagliata dell'architettura del sistema olfattivo. Questo protocollo è stato sviluppato per colmare una lacuna nei metodi pubblicati esistenti, poiché conserva e preserva la mucosa olfattiva a tutto spessore, inclusa la lamina propria, permettendo lo studio delle interazioni intercellulari. In particolare, questa metodologia migliorata di raccolta ed elaborazione del tessuto può essere applicata e combinata con diversi modelli del sistema olfattivo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che prevedevano animali e cellule modificate geneticamente sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la Biosicurezza dell'Università Griffith (NLRD/003/2020_var3) e del Comitato per l'Etica sugli Animali dell'Università Griffith (MHIQ/04/23/AEC), in conformità con le linee guida dell'Ufficio del Regolatore della Tecnologia Genica del Commonwealth australiano (OGTR).

NOTA: Nello studio sono stati utilizzati complessivamente 15 topi adulti da laboratorio (8–9 settimane) di entrambi i sessi. In particolare, topi transgenici S100β-DsRed in cui tutte le cellule olfattive di sostegno (OEC) esprimono la proteina rossa brillante DsRed sotto il controllo del promotore S100β. S100β fa parte di una famiglia più ampia di proteine leganti il calcio ed è comunemente espressa nelle cellule gliali del sistema nervoso centrale, come le OEC. Questo modello si è rivelato ottimale ai fini di questi esperimenti, consentendo una facile localizzazione delle popolazioni cellulari bersaglio mediante segnali di fluorescenza endogeni. I topi transgenici S100β-DsRed erano stati generati in precedenza e si è dimostrato che il loro utilizzo consente un rilevamento migliore delle OEC rispetto all'immunohistochimica per analisi di tessuti fissi^15,16,17,18.

1. Raccolta delle teste e fissazione dei tessuti

1. Sacrificare gli animali mediante inalazione crescente di CO₂ nei punti temporali sperimentali.
2. Verificare che la morte sia avvenuta attraverso l'assenza dei riflessi corneale e plantare, seguita da dislocazione cervicale, oppure in conformità con la SOP approvata.
3. Rimuovere l'intera testa e le mascelle con le forbici.
4. Rimuovere la pelle dal cranio ed eliminare la cartilagine alla punta del naso per esporre la cavità nasale e garantire una penetrazione efficace dell'agente fissante.
   NOTA: Si è osservato che questo passaggio, consistente nel tagliare la parte più frontale della cartilagine nasale dell'animale, è cruciale per permettere una corretta fissazione del tessuto all'interno della cavità nasale.
5. Risciacquare rapidamente le teste in PBS 1× per rimuovere l'eccesso di sangue.
6. Fissare il tessuto immergendolo per tutta la notte (12–18 h) in paraformaldeide al 4%, per almeno 6 h (tempo sufficiente per fissare il tessuto di interesse) a 4 °C su un rullo.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa che rilascia vapori di formaldeide. È tossica per inalazione, contatto cutaneo e ingestione; provoca irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie ed è sospettata di essere cancerogena. Manipolarla esclusivamente in cappa aspirante indossando dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione oculare. Lo smaltimento sicuro delle sostanze chimiche pericolose e dei rifiuti biologici generati durante il protocollo deve avvenire in conformità con le normative istituzionali e locali.
   ​NOTA: Durante le fasi di ottimizzazione, abbiamo osservato che 6 h erano sufficienti per fissare il tessuto di interesse; tuttavia, un tempo superiore a 12 h tendeva a causare una sovrafissazione e la degradazione delle strutture della mucosa.
7. Rimuovere le teste dall'agente fissante e lavarle per 3 h in PBS 1× a temperatura ambiente (20–25 °C) su un rullo.
8. Conservare le teste in PBS fresco a 4 °C e raccogliere il tessuto mucoso in toto entro 48 h

2. Raccolta del tessuto in montaggio intero

1. Eseguire l'isolamento del tessuto al microscopio.
2. Tagliare le teste a metà utilizzando un bisturi, seguendo la linea sagittale mediana.
3. Esponi l'interno della cavità nasaleFigura 1). Identificare le regioni anatomiche e raccogliere il tessuto mucoso che riveste l'intera sezione anatomica (Figura 1B).
4. Utilizzando un tagliaossa, rompere delicatamente ed asportare l'osso settale che ricopre parte della cavità mucosa.
   NOTA: Vedere Figura 2A; Questo passaggio è cruciale per esporre la cavità concava al di sotto dell'osso, dove i fasci di assoni attraversano la parete dorsale (Figura 1B).
5. Una volta esposta questa area, utilizzare pinze curve per staccare delicatamente ed estrarre il tessuto dalla parete dorsale concava. Sollevare il tessuto dall'osso sottostante e staccare con delicatezza la mucosa olfattiva residua per raccogliere il preparato integro in montaggio completo.
   NOTA: in questa fase era richiesta la massima cautela per evitare di lacerare il tessuto.
6. Raccogliere il tessuto di interesse da entrambe le narici, destre e sinistre: la mucosa ricopre il setto, le pareti dorsali sinistra e destra e la lamina cribrosa della cavità nasale (Figura 1A, B). Raccogliere il tessuto da entrambe le narici, inclusi il setto, le pareti dorsali e la lamina cribrosa, per isolare la regione anatomica contenente le strutture olfattive primarie (Figura 2C).
7. Lavare i tessuti raccolti in PBS 1× ed eliminare eventuali tessuti indesiderati, inclusi frammenti ossei. Conservare i tessuti a 4 °C in PBS 1× per successive analisi di immunohistochimica.
   NOTA: Se il tessuto deve essere conservato a lungo termine, si consiglia di conservarlo in una soluzione di PBS 1× e azoturo di sodio 0,001% (p/v), a 4 °C.

3. Protocollo di colorazione ottimizzato

NOTA: I protocolli di colorazione comunemente utilizzati sono generalmente ottimizzati per sezioni di spessore sottile-medio (ad esempio, fino a 50 µm). Pertanto, il protocollo doveva essere adattato a tessuti molto più spessi.
​Un passaggio cruciale osservato consiste nel mantenere il tessuto in sospensione all'interno di provette Eppendorf durante l'intero processo di colorazione, posizionando le provette su un rullo mentre i reagenti penetrano. Di conseguenza, i passaggi di colorazione non sono stati eseguiti con il tessuto su un vetrino per imaging. Il tessuto è stato prima colorato in sospensione e successivamente montato sui vetrini per imaging. Questi dettagli hanno garantito che il tessuto non si piegasse e che i reagenti e gli anticorpi potessero penetrare uniformemente in tutta la regione.

1. Rimuovere i tessuti dallo stoccaggio e posizionarli in una provetta Eppendorf con soluzione bloccante (la soluzione da utilizzare dipenderà dal tipo di colorazione).
   ​NOTA: Soluzione bloccante: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 in PBS. Un altro aggiustamento importante è stato il tempo a cui il tessuto è stato sottoposto a ciascun reagente e cocktail di anticorpi.
2. Mantenere il tessuto nella soluzione bloccante per 3 h a temperatura ambiente su un rullo.
   NOTA: È stato osservato che non era necessario aumentare la concentrazione degli anticorpi e dei reagenti di colorazione selezionati (Tabella 1) se il tempo di esposizione era maggiore rispetto all'approccio standard di immunostaining su sezioni sottili. Ciò ha permesso anche di ridurre al minimo l'uso di reagenti anticorpali costosi. Le incubazioni vengono effettuate in una provetta Eppendorf da 1,5 mL con il fermo del coperchio rimosso, in modo che possa rotolare su un rullo. Il volume del reagente era di 500 µL.
3. Incubare per 72 h a 4°C con gli anticorpi primari su rullo.
4. Lavare il tessuto due volte (1,5 h per ogni lavaggio) utilizzando PBS 1× a temperatura ambiente su rullo.
5. Incubare il tessuto con l'anticorpo secondario (avvolto nella carta d'alluminio) e il colorante per i nuclei per un minimo di 4 h a temperatura ambiente su rullo, quindi proseguire per tutta la notte (12–18 h) a 4 °C su rullo.
6. Lavare il tessuto due volte (1,5 h ogni volta) utilizzando PBS 1× a temperatura ambiente su rullo.

4. Preparazione del vetrino

1. Rimuovere delicatamente il tessuto dal tubo Eppendorf
2. Sotto un microscopio, posizionare il tessuto su un vetrino e assicurarsi che non siano presenti pieghe nel tessuto.
   NOTA: È possibile identificare, al microscopio e senza alcuna fluorescenza, l'orientamento del tessuto. Il lato della lamina propria del tessuto mucoso deve essere posizionato sul vetrino con l'epitelio rivolto verso il vetrino e la lamina propria rivolta verso il coprioggetto. La lamina propria può essere riconosciuta grazie alla presenza di spessi fasci nervosi, visibili anche senza colorazione. Disporre il tessuto in modo che la lamina propria sia rivolta verso il coprioggetto e l'epitelio giaccia sul vetrino facilita sia la colorazione che il processo di acquisizione delle immagini.
3. Coprire i vetrini con mezzo di montaggio fluorescente e sigillarli.
4. I vetrini possono essere conservati a 4 °C dopo essiccazione durante la notte (12–18 h) al buio e a temperatura ambiente

5. Acquisizione delle immagini e post-elaborazione

1. Acquisizione di immagini immunofluorescenti a basso ingrandimento
   1. Eseguire la composizione automatica durante l'acquisizione delle immagini utilizzando una fusione lineare alfa.
      ​NOTA: Il numero di fotogrammi dello z-stack deve essere regolato in base allo spessore del campione per garantire una copertura completa del volume del tessuto.
   2. Acquisire campi adiacenti con un sovrapposizione del 15%. Acquisire immagini a tasselli utilizzando un modello di acquisizione a serpentina.
   3. Regolare il numero totale di sezioni ottiche in base allo spessore del tessuto.
   4. Impostare la calibrazione dell'immagine a 215,594 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire le immagini come z-stack con un passo z di 0,8 µm.
   5. Posizionare il tessuto montato in toto sul piatto del microscopio confocale. Acquisire immagini di riferimento utilizzando un obiettivo da 30x (NA 1,04).
2. Acquisizione di immagini immunofluorescenti ad alto ingrandimento.
   1. Acquisire immagini dettagliate utilizzando un obiettivo da 60× (NA 1,5). Impostare la calibrazione dell'immagine a 107,923 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire immagini z-stack con un passo z di 0,41 µm.
   2. Regolare il numero totale di sezioni ottiche in base allo spessore del tessuto. Acquisire immagini da un singolo campo visivo.
      ​NOTA: Non è richiesta la composizione delle immagini per le acquisizioni a 60× poiché ogni dataset è costituito da un singolo campo visivo.
3. Acquisizione di immagini di riferimento istologiche
   1. Acquisire sezioni cefaliche murine al mid-sagittale colorate con ematossilina-eosina (HE) utilizzando un microscopio scanner di vetrini in illuminazione in campo chiaro.
   2. Acquisire le immagini con un obiettivo da 40× (NA 0,95) e un ingrandimento della telecamera di 0,63x, ottenendo un ingrandimento effettivo di 25,2×.
   3. Verificare una calibrazione del pixel di 136,905 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Acquisire l'immagine come singolo piano focale.
   4. Comporre automaticamente le immagini a tasselli utilizzando un modello di acquisizione a serpentina e una fusione lineare alfa.
4. Acquisizione di immagini di riferimento immunofluorescenti di riepilogo
   1. Acquisire immagini immunofluorescenti complementari di riepilogo utilizzando un obiettivo da 10x.
   2. Acquisire il campione come singola fetta z utilizzando uno 0% di sovrapposizione dei tasselli durante l'acquisizione.
   3. Impostare la calibrazione dell'immagine a 647,249 nm/pixel su entrambi gli assi X e Y. Generare un'immagine di riepilogo che comprenda l'intera regione anatomica di interesse.
5. Elaborazione delle immagini e generazione delle figure finali.
   1. Esportare i dataset delle immagini acquisite in un software di analisi delle immagini. Generare proiezioni di intensità massima (MIP) dai dataset z-stack.
   2. Selezionare le regioni di interesse (ROI) per le analisi successive e la preparazione delle figure.
   3. Combinare le immagini immunofluorescenti di riepilogo con le corrispondenti immagini HE per generare figure di riferimento anatomico. Successivamente, verificare l'allineamento e la corrispondenza anatomica tra i dataset di fluorescenza e istologici prima della preparazione delle figure.
      NOTA: Tutta la composizione delle immagini deve essere eseguita automaticamente durante l'acquisizione mediante impostazioni predeterminate del microscopio e non richiede ulteriore post-elaborazione. Nel nostro caso, la ricostruzione 3D è stata generata utilizzando il software Imaris: il plugin di rendering superficiale, basato sulla soglia di intensità per ogni canale acquisito, è stato utilizzato per produrre la ricostruzione tridimensionale. Infine, le immagini finali sono state assemblate in Adobe Illustrator.

Risultati

Il nostro approccio in toto presentato qui ha permesso l'isolamento e la conservazione della mucosa olfattiva nella sua interezza. Nel nostro caso, l'attenzione era rivolta alla comprensione dei cambiamenti cellulari e anatomici su scala macroscopica (visione anatomica completa) e microscopica (livello cellulare).

L'approccio su preparato intero ci consente di raccogliere sia il compartimento epiteliale che quello della lamina propria, preservando le relazioni spaziali tra i fasci di assoni, le cellule olfattive di sostegno (OEC) e i fibroblasti, ovvero le nostre cellule di interesse. Questo approccio ha permesso l'acquisizione di ampi dataset continui che riprendono l'intero spessore e una vasta area superficiale del tessuto mucoso (Figura 3) e ci ha consentito di osservare nei dettagli la struttura cellulare intricata e le interazioni tra le cellule (Figura 3), nonché le modifiche che queste presentano tra condizioni integre (n = 3) (Figura 3A, B) e condizioni danneggiate (n = 12) (Figura 3C, D).

Combinando questa procedura ottimizzata di manipolazione e colorazione del tessuto con la microscopia confocale ad alta risoluzione, siamo stati in grado di ottenere immagini di ampie regioni della mucosa con notevole dettaglio a livello cellulare e con precisione lungo l'intera profondità del tessuto. L'acquisizione di stack in Z su più regioni adiacenti ha permesso la ricostruzione di ampi domini anatomici senza compromettere la risoluzione o l'integrità del segnale (Figura 4A–F). Grazie ai dettagli cellulari ad alta risoluzione, siamo stati inoltre in grado di utilizzare gli stack in Z acquisiti sull'intero spessore del tessuto (Figura 4G) per generare immagini rese (Figura 4H) al fine di approfondire la comprensione della microarchitettura del tessuto.

La determinazione affidabile dell'orientamento del tessuto prima del montaggio e dell'acquisizione è stata ottenuta in modo costante senza la necessità di etichettatura fluorescente. Il lato della lamina propria era facilmente identificabile in microscopia a campo chiaro grazie alla presenza di spessi fasci nervosi, chiaramente distinguibili dallo strato epiteliale. La standardizzazione dell'orientamento del campione posizionando la lamina propria adiacente al coprioggetto e la superficie epiteliale contro il vetrino ha migliorato la coerenza dell'immagine tra i diversi campioni e ha facilitato la successiva ricostruzione tridimensionale. La penetrazione degli anticorpi può essere determinata analizzando il segnale associato osservato attraverso tutta la spessore del tessuto. Di solito è evidente a causa dell'assenza di segnale o di un segnale che diminuisce progressivamente avvicinandosi alle regioni più profonde del tessuto.

La ricostruzione tridimensionale eseguita in Imaris ha permesso una chiara visualizzazione delle reti cellulari complesse e dell'organizzazione assonale all'interno della mucosa integra. La ricostruzione basata sulle superfici, applicata mediante sogliatura dell'intensità specifica per canale, ha generato rappresentazioni tridimensionali accurate dell'architettura tissutale preservando i dettagli strutturali fini.

Per la colorazione e la visualizzazione, i risultati previsti includerebbero una chiara visualizzazione del segnale di colorazione del bersaglio senza alcuna perdita anomala del segnale o deterioramento dello stesso lungo tutto lo spessore dei tessuti. L'incapacità di visualizzare un bersaglio noto colorato al microscopio dovrebbe essere considerata un risultato non riuscito.

Figura 1. Rappresentazione della regione anatomica con sovrapposizione del tessuto della mucosa in whole-mount. (A–C). Vista sagittale dell'interno della narice sinistra (colorazione con Ematossilina ed Eosina, HE) del topo (A) con sovrapposizione della colorazione in whole-mount della mucosa della stessa regione (per l'orientamento anatomico) (B), che mostra l'orientamento e la posizione dei fasci assonali in verde e dei nuclei cellulari in blu. Questa tecnica ha permesso la conservazione dell'intera struttura anatomica: è possibile distinguere chiaramente i fasci di assoni del nervo olfattivo primario (ON) e del nervo accessorio (nervi vomeronasali, VNN), nonché seguirne il percorso dal setto al bulbo olfattivo (OB), attraverso la lamina cribrosa (B, C). Il tessuto mostrato è stato colorato con Hoechst per i nuclei (blu) e con β-III-Tubulina per i fasci assonali (verde). Immagini rappresentative ottenute da n = 15 preparazioni indipendenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Viste macroscopiche e schematiche del sistema olfattivo. (A) Utilizzando un tagliaossa, seguendo la linea tratteggiata rossa, si rimuove l'osso settale (zona gialla). (B) Una volta esposta la cavità concava della narice sottostante (marrone), è possibile raccogliere l'intero tessuto mucoso che si espande da questa regione fino alla mucosa respiratoria e olfattiva. (C) Rappresentazione grafica per illustrare la continuità di queste strutture che si estendono dall'epitelio olfattivo fino al bulbo olfattivo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3. Vista estesa dell'area anatomica ottenuta mediante un protocollo di raccolta e colorazione in toto. (A–D). Sono mostrate immagini rappresentative di mucose sane e danneggiate. Dall'alto verso il basso, mucosa integra da tessuto sano (n = 3) e mucosa danneggiata (n = 12). Nel tessuto sano (A), le OEC con la loro morfologia bipolare allungata (A, sinistra) avvolgono i fasci di assoni (A, centro), e i fibroblasti formano lo strato esterno di queste strutture simili a tunnel (A, destra, freccia bianca). Le tre aree di interesse selezionate (ROI) riflettono questi dettagli (B). Nella mucosa danneggiata, le OEC mostrano sia morfologie bipolari che rotonde (C, D, sinistra, frecce bianche). I fasci di assoni appaiono meno uniformi e compatti (C, D, centro, frecce bianche). I fibroblasti appaiono diffusi in tutta la regione (C, D, destra, frecce bianche). Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4. Imaging fluorescente tridimensionale di preparati interi della mucosa. (A–H). Immagini a basso ingrandimento delle cellule (A–F) e un'immagine ad alto ingrandimento (G) sono state ottenute da serie di immagini di più regioni consecutive utilizzando un microscopio SpinSR. Le cellule di rivestimento olfattive (OEC) sono mostrate in rosso, i fibroblasti in magenta, gli assoni in verde e i nuclei in blu. Le frecce indicano diverse morfologie delle OEC (A) e uno strato esterno di fibroblasti attorno ai fasci di assoni (B e C). Nei pannelli D–F, le frecce evidenziano somiglianze nelle strutture sane dei fibroblasti. Queste immagini mettono in risalto l'organizzazione spaziale dei componenti cellulari, che è stata quindi ricostruita utilizzando il software Imaris (H). Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Reagente	Target	Diluizione	Condizioni di incubazione	Motivazione
Anticorpo primario
β-III-Tubulin (Rabbit)	Assoni	1:300	Per 72 h a 4 °C, su roller	per consentire una penetrazione completa nello spessore
PDGFR-β (Rat)	Fibroblasti	1:100
Anticorpo secondario
Alexa 488	Anticorpi primari coniugati con coniglio	1:250	Avvolti in foglio di alluminio, per almeno 4 h a temperatura ambiente su roller, quindi tutta la notte a 4 °C su roller.	Il foglio di alluminio previene il fotoblecamento; la durata, la temperatura e l'agitazione indotta dal roller permettono una buona penetrazione
Alexa 647	Anticorpi primari coniugati con ratto	1:500
Nuclei
Hoechst	Nuclei cellulari	1:2500

Tabella 1: Elenco degli anticorpi con diluizioni ottimizzate per questo protocollo. Questa tabella elenca i reagenti per la colorazione con i relativi bersagli, diluizioni e motivazione delle condizioni di incubazione.

Discussione

Negli ultimi decenni si è assistito gradualmente all'inizio dell'era tridimensionale, con lo sviluppo di numerosi approcci innovativi nel campo scientifico. Ad esempio, gli approcci di ricostruzione tridimensionale, resi possibili grazie allo sviluppo di complessi metodi di imaging su preparati interi abbinati a microscopi fluorescenti ad alta risoluzione, hanno facilitato una migliore comprensione di diverse architetture istologiche di tessuti a tutto spessore. Questi approcci di rendering tridimensionale sono stati utilizzati per definire diverse strutture del corpo umano, come vasi, ghiandole e tumori comuni^4,5,6,7,8,9. Inoltre, sono state raccolte informazioni sulle differenze tra strutture patologiche e normali, ad esempio in cervelli interi di topo^10,11,12. Questo approccio è stato identificato come un passo fondamentale verso una migliore comprensione dei vari sistemi biologici, favorendo una più profonda comprensione dei circuiti cellulari, della loro organizzazione spaziale strutturale e funzionale e del loro potenziale contributo alle patologie umane.

Uno svantaggio delle diverse combinazioni di ricostruzione tridimensionale dei tessuti e di imaging è che la maggior parte degli approcci prevede passaggi di chiarificazione del tessuto. Sebbene questo metodo sia utile per molti tessuti, non è adatto a tutti i tipi di tessuto^8,9,19. Infatti, le procedure di chiarificazione comportano diversi passaggi di lavaggio, che potrebbero danneggiare potenzialmente gli epitopi bersaglio e influenzare i segnali endogeni²⁰.

Gli approcci sopra descritti sono stati utilizzati per definire numerose strutture cellulari importanti all'interno di diversi sistemi. Tuttavia, il sistema olfattivo e le sue strutture di interesse presentano una scarsa componente ossea, dalla quale potrebbero essere facilmente isolate; pertanto, negli ultimi anni sono stati sperimentati approcci su preparati interi che non includono passaggi di chiarificazione^13,14.

Questi studi hanno riconosciuto l'importanza di definire meglio l'organizzazione delle strutture neuronali nel sistema olfattivo. Di conseguenza, il loro principale obiettivo è stato quello di fornire una chiara mappa topografica della distribuzione dei neuroni sensoriali olfattivi in base all'espressione di diversi marcatori¹⁴, nonché di rivelare nuove informazioni sulle loro ciglia peculiari¹³.

La tecnica in toto sviluppata e presentata qui consente la raccolta e la conservazione completa del tessuto mucoso, aprendo la possibilità di ottenere informazioni fondamentali sulla struttura anatomica e fisiologica di questo ambiente, con un focus specifico, nel nostro caso, sulla relazione tra cellule olfattive di rivestimento (OEC), fibroblasti e fasci di assoni. L'accoppiamento di questa tecnica raffinata di isolamento e colorazione con l'immagine confocale ad alta risoluzione ha permesso di ottenere immagini ampie che riflettono la struttura dell'intera regione bersaglio e delle cellule in essa presenti. In particolare, la nostra tecnica migliorata offre due vantaggi distintivi: l'intera mucosa viene raccolta e processata, inclusa l'architettura della lamina propria¹³, e il metodo più delicato di preparazione del tessuto contribuisce a preservare l'anatomia su scala macroscopica così come le interazioni intercellulari (come quelle tra cellule olfattive di rivestimento, assoni e fibroblasti) rispetto ad altri protocolli di preparazione in flat-mount¹⁴. Per questo motivo, il presente protocollo non include una validazione mediante colorazione su sezioni sottili.

Come menzionato in precedenza, le tecniche su preparato intero richiedono solitamente lunghi periodi di lavorazione del tessuto e l'uso di reagenti specifici e costosi. Questo metodo è stato sviluppato concentrandosi su una lavorazione minima del tessuto, al fine di ridurre sia il tempo necessario sia il rischio di danneggiare strutture cellulari importanti. Il metodo ottimizzato rappresenta quindi un processo rapido che può essere eseguito utilizzando reagenti comunemente impiegati per l'immunohistochimica su sezioni sottili, offrendo un'alternativa valida ai metodi che richiedono tempi di lavorazione più lunghi e che non sono adatti a strutture prive di osso, come il tessuto mucoso.

L'acquisizione delle immagini e la post-elaborazione possono essere eseguite utilizzando qualsiasi piattaforma di microscopia confocale in grado di acquisire z-stack ad alta risoluzione da campioni di tessuto spessi, con una penetrazione del laser sufficiente per visualizzare attraverso le mucose di interesse (si rimanda alla sezione dei metodi per maggiori dettagli sulle impostazioni di acquisizione ed elaborazione delle immagini).

Con opportune modifiche, riteniamo che questo protocollo possa essere adattato e applicato ad altri modelli rodentici comuni. Con alcune modifiche specifiche per il tessuto, questo metodo può essere applicato a diversi contesti, inclusi lo studio dei tessuti mucosali e sottomucosali delle vie respiratorie e del tratto gastrointestinale (GIT); l'indagine dell'organizzazione tissutale e delle interazioni multisis tema nel sistema nervoso; l'analisi dei processi infiammatori e dei tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALTs); nonché l'esplorazione di diversi assi multisistema, come l'asse intestino-cervello.

Il punto di forza principale di questo protocollo risiede nei perfezionamenti metodologici che consentono un'immagine tridimensionale di alta qualità preservando al contempo l'integrità del tessuto, ma garantendo anche un approccio relativamente rapido rispetto ad altre metodologie su preparati interi precedentemente testate nel campo.

L'implementazione con successo di questo approccio è dipesa fortemente da una profonda conoscenza anatomica del tessuto di interesse. Infatti, nel nostro caso, conoscere la localizzazione prevista dei fasci assonali era essenziale per minimizzare l'invasività della procedura di raccolta una volta esposta l'interno del cranio. Questa conoscenza anatomica è risultata fondamentale per localizzare rapidamente la regione e il tessuto di interesse preservando la struttura complessiva della mucosa, evidenziando come un'efficace lavorazione del tessuto sia intrinsecamente legata a una strategia di raccolta informata piuttosto che esclusivamente a passaggi successivi di post-elaborazione.

Come menzionato nella sezione dei metodi in diverse note, diversi aggiustamenti tecnici sono stati fondamentali per lo sviluppo e l'ottimizzazione di questo metodo. Mantenere il tessuto in sospensione libera all'interno di provette Eppendorf per l'intero processo di colorazione, unito a una rotazione continua durante l'incubazione con reagenti e anticorpi, ha rappresentato un passaggio chiave rispetto ai protocolli più statici di montaggio intero e di sezioni sottili. Questa ottimizzazione ha evitato il ripiegamento del tessuto garantendo al contempo una penetrazione omogenea dei reagenti in tutto il campione, migliorando così la coerenza della colorazione senza necessità di passaggi aggiuntivi di chiarificazione. Inoltre, è risultata essenziale un'attenta ottimizzazione della durata dell'incubazione per ciascun cocktail di reagenti e anticorpi. Quest'ultimo passaggio potrebbe richiedere ulteriori aggiustamenti in base al tipo di anticorpo scelto.

Nel complesso, questi fattori specifici hanno determinato un miglioramento della riproducibilità, riducendo al contempo il tempo totale di elaborazione e un trattamento più aggressivo del campione.

Un altro importante passaggio metodologico è stata la capacità di determinare in modo affidabile l'orientamento del tessuto prima del montaggio e dell'acquisizione delle immagini, senza la necessità di etichettatura fluorescente. Il lato della lamina propria del tessuto mucosale poteva essere facilmente identificato mediante microscopia in campo chiaro grazie alla presenza di spessi fasci nervosi, chiaramente distinguibili dal tessuto epiteliale circostante. È stato riscontrato che la standardizzazione dell'orientamento del campione, posizionando la lamina propria rivolta verso il coprioggetto e lo strato epiteliale appoggiato sul vetrino, facilita la qualità dell'acquisizione delle immagini. Questo semplice ma efficace affinamento ha migliorato la coerenza dell'imaging tra i diversi campioni e ha contribuito alla qualità delle ricostruzioni tridimensionali ottenute.

Ci sono alcune limitazioni da considerare, tuttavia. Questo protocollo non è stato testato su molte delle comuni ceppi di topi né su altre specie di roditori. Analogamente, le ottimizzazioni sono state effettuate nelle specifiche condizioni sperimentali descritte in precedenza e utilizzando esclusivamente i pannelli di anticorpi indicati. Sebbene il protocollo dovrebbe funzionare con la maggior parte dei ceppi di topi e ratti, diversi anticorpi e qualsiasi modello sperimentale che consenta il prelievo delle mucose a spessore completo, potrebbero essere necessarie ulteriori ottimizzazioni accurate. Un'altra limitazione notevole è che una singola sezione in montaggio intero può essere marcata con un solo pannello di anticorpi, a differenza dei tessuti in sezioni sottili, in cui ogni sezione può essere marcata con un pannello di anticorpi specifico e, di conseguenza, possono essere testati più pannelli diversi su tessuti in sezioni sottili.

Nel complesso, queste innovazioni metodologiche dimostrano come semplici modifiche alle procedure di manipolazione dei tessuti, alle condizioni di colorazione e all'orientamento del campione possano migliorare in modo significativo i risultati dell'immagine in montaggio integrale. Evitando estesi passaggi di elaborazione e chiarificazione del tessuto, questo approccio offre un'alternativa pratica e adattabile per lo studio di tessuti delicati e privi di ossa, consentendo comunque l'acquisizione di dati tridimensionali dettagliati su larga scala.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Immunohistochemica
Adobe Illustrator		versione 28.5
Anticorpo anti-beta III tubulina - marcatore neuronale	Abcam	ab18207
Anticorpo anti-PDGFR beta [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 triidrocloruro	Sigma Aldrich	14533
COPRI-OGGETTO 24X50MM N. 1.5 100 PEZZI	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Immunohistochemica
Secondario anticorpo Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Taglierino per ossa Dumont #15A - rivestito in epossidico	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Dissezione del tessuto
Pinzetta Dumont #7 - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Dissezione del tessuto
Secondario anticorpo caprino anti-ratto IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Software Imaris	Imaris	versione 9.5.0	Immagini
Forbici da dissezione Mayo	ProSciTech	420SS	Dissezione del tessuto
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Elaborazione del tessuto
Soluzione salina tamponata al fosfato, compresse sterili di PBS (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Elaborazione del tessuto
Mezzo di montaggio antiossidante ProLong Glass	Thermo Fisher Scientific	P36980	Immunohistochemica
Lama di bisturi #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Dissezione del tessuto
Manico per bisturi #4	ProSciTech	T134	Dissezione del tessuto
Azoturo di sodio	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Elaborazione del tessuto
Saccarosio	Chem-Supply	57-50-1	Elaborazione del tessuto
Vetrini microscopici adesivi TOMO	ProSciTech	GEMS63705-09	Immunohistochemica
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Immunohistochemica