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Articolo metodologico

Ritmi circadiani in una piastra di Petri: sincronizzazione delle cellule ipotalamiche di topo mHypoE-42 per l'analisi dell'espressione dei geni dell'orologio circadiano

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DOI:

10.3791/72039

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3 settembre 2026

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1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro pratico e riproducibile per la sincronizzazione di cellule in coltura, l'esecuzione di prelievi in tempi sfalsati su un arco di 24–72 h senza raccolta notturna e l'analisi dell'espressione dei geni dell'orologio circadiano.

Abstract

I ritmi circadiani sono oscillazioni endogene di circa 24 h che regolano un'ampia gamma di processi cellulari e fisiologici, inclusa l'espressione genica, il metabolismo e il comportamento. Questi ritmi derivano da circuiti di retroazione trascrizionale–traduzionale interconnessi che rispondono a stimoli temporali e ambientali. Poiché la regolazione circadiana è altamente dinamica, anche piccole variazioni sperimentali possono influenzare fase, ampiezza e ritmicità, rendendo essenziali protocolli sperimentali standardizzati per ottenere risultati affidabili e riproducibili. L'obiettivo del presente protocollo è fornire un flusso di lavoro pratico e riproducibile per la sincronizzazione di cellule in coltura, il prelievo di campioni in serie temporale e l'analisi dell'espressione genica del clock circadiano in condizioni di laboratorio standard. Il protocollo descrive la sincronizzazione mediante shock sierico, il prelievo graduale dei campioni nell'arco di 24–72 h per evitare campionamenti notturni, l'estrazione dell'acido ribonucleico, la sintesi dell'acido deossiribonucleico complementare, la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale e l'analisi dei ritmi circadiani mediante approcci statistici appropriati. Il flusso di lavoro evidenzia inoltre aspetti sperimentali critici, tra cui le condizioni di sincronizzazione, la valutazione della qualità del campione, la selezione dei geni di riferimento e l'analisi dei dati, al fine di migliorare la riproducibilità tra esperimenti. Questo metodo fornisce un approccio accessibile per lo studio dei meccanismi molecolari circadiani e la valutazione dell'espressione genica ritmica in cellule in coltura, facilitando ricerche sulla regolazione circadiana in modelli sperimentali fisiologici e legati a malattie.

Introduzione

I ritmi circadiani sono cicli endogeni con un periodo di circa 24 h che regolano un'ampia gamma di processi fisiologici, metabolici e cellulari1. Nei sistemi dei mammiferi, questi ritmi sono coordinati da un orologio centrale situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo e da orologi molecolari autonomi a livello cellulare. Questi orologi consistono in loop di retroazione trascrizionale–traduzionale intrecciati che coinvolgono geni orologio fondamentali, tra cui il gene della proteina kaput dei cicli di attività motoria circadiani (Clock), il gene basic helix-loop-helix aryl hydrocarbon receptor nuclear translocase-like 1 (Bmal1), il gene period (Per) e il gene criptocromo (Cry)2. Data l'importanza centrale dell'orologio circadiano in diversi processi biologici, i modelli cellulari in vitro sono diventati strumenti fondamentali per studiare i meccanismi molecolari della regolazione temporale in condizioni sperimentali controllate.

L'obiettivo del presente protocollo è fornire un flusso di lavoro affidabile, pratico e riproducibile per sincronizzare cellule in coltura mediante un protocollo di shock sierico, eseguire prelievi campionati in tempi sfalsati e analizzare l'espressione dei geni dell'orologio circadiano evitando il prelievo notturno dei campioni. Migliorando la fattibilità del campionamento circadiano senza compromettere la qualità dei dati, questo flusso di lavoro è pensato per facilitare lo studio dei processi biologici ritmici mediante tecniche di laboratorio standard.

Studi circadiani sono stati condotti su una vasta gamma di modelli in vitro, inclusi linee cellulari tumorali umane3, fibroblasti di ratto-14, espianti del SCN 5 e organoidi6. Sebbene la maggior parte delle cellule dei mammiferi possieda orologi circadiani funzionali, l'assenza di stimoli sincronizzanti, come la luce, porta rapidamente a una desincronizzazione in coltura, limitando lo studio dei ritmi circadiani in vitro7. Pertanto, tecniche di sincronizzazione sono essenziali per indagare i meccanismi dell'orologio molecolare e le loro implicazioni nella salute e nelle malattie.

Sono state sviluppate diverse strategie di sincronizzazione per cellule mammifere in coltura. La sincronizzazione basata sui glucocorticoidi mediante desametasone è tra gli approcci più utilizzati poiché ripristina in modo robusto i ritmi circadiani in molti tipi cellulari, riducendo al contempo alcune delle variabilità associate alla stimolazione con siero8. Analogamente, l'attivazione mediata da forskolina della segnalazione dell'adenosina monofosfato ciclico è stata impiegata con successo per sincronizzare gli orologi periferici in specifici modelli cellulari9. Altri approcci includono il trattamento con segnali ematici4, diversi composti chimici8,10, il cambio del mezzo di coltura3, lo shock termico11, i cicli di ossigeno12 e la stimolazione meccanica13. Nel complesso, questi metodi hanno notevolmente avanzato la ricerca circadiana; tuttavia, potrebbero richiedere attrezzature specializzate, condizioni sperimentali specifiche o ulteriori ottimizzazioni, rendendo fondamentale validare la strategia di sincronizzazione scelta per ciascun modello biologico e applicazione sperimentale14.

Lo shock sierico è uno degli approcci di sincronizzazione più ampiamente consolidati e consiste nell'esporre cellule in coltura a uno stimolo transitorio ad alto contenuto di siero4. Poiché lo stimolo è transitorio, si riduce al minimo la perturbazione prolungata delle vie di segnalazione cellulare4, limitando così possibili effetti confondenti sulle analisi successive. Di conseguenza, lo shock sierico è particolarmente adatto per lo studio dell'espressione genica circadiana e della funzione dell'orologio molecolare. Inoltre, la procedura è semplice da attuare e non richiede attrezzature specializzate, risultando quindi accessibile e facilmente riproducibile in diversi laboratori. Un limite pratico degli esperimenti con shock sierico, tuttavia, è il programma di campionamento intensivo necessario per caratterizzare con precisione la ritmicità circadiana. Un'analisi affidabile dei ritmi richiede tipicamente il prelievo di campioni a intervalli regolari, solitamente ogni 2–6 ore per uno o più cicli circadiani (24–72 h)14, spesso rendendo necessari prelievi notturni.

Il flusso di lavoro descritto in questo articolo affronta questa sfida logistica suddividendo l'avvio della sincronizzazione su più piastre di coltura, consentendo così un campionamento circadiano completo durante l'orario lavorativo standard ed evitando il prelievo notturno dei campioni. Piuttosto che introdurre una nuova strategia di sincronizzazione, questo protocollo fornisce un'implementazione dettagliata e riproducibile di un metodo consolidato di shock sierico, abbinato a un programma pratico di campionamento e a un'analisi dell'espressione genica a valle. Questo flusso di lavoro è particolarmente adatto per studi sull'espressione genica circadiana in cellule in coltura, utilizzando tecniche di laboratorio ampiamente disponibili. Quando si adatta il protocollo ad altri modelli cellulari, i parametri sperimentali, inclusi la densità cellulare, le condizioni di sincronizzazione, gli intervalli di campionamento e la scelta dei geni di riferimento, devono essere ottimizzati e validati per il tipo cellulare specifico prima dell'implementazione.

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Protocollo

Il seguente protocollo descrive un metodo validato di sincronizzazione per la linea cellulare ipotalamica embrionale murina mHypoE-42. Convalidare e ottimizzare autonomamente il protocollo di sincronizzazione prima di applicarlo ad altri tipi cellulari in coltura. Vedere Figura 1 per una panoramica del flusso di lavoro e Figura supplementare 1 per il programma settimanale di campionamento. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per tutti i reagenti, l'equipaggiamento e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare all'interno di un armadio a sicurezza biologica certificato, utilizzando reagenti e attrezzature sterili.

Diagramma del processo di sincronizzazione cellulare, metodo di shock sierico, linea temporale, configurazione sperimentale, intervalli CT.
Figura 1. Panoramica schematica del protocollo di sincronizzazione con shock sierico sfalsato. Schema che illustra il flusso di lavoro utilizzato per sincronizzare le cellule mHypoE-42 mediante shock sierico in due serie sperimentali sfalsate. Il disegno sperimentale sfalsato consente il prelievo di campioni circadiani durante l’orario lavorativo standard, evitando prelievi notturni. I campioni vengono successivamente processati per l’estrazione di RNA, la reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e l’analisi del ritmo circadiano. Creato con Biorender.com. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Coltura cellulare

  1. Coltivare le cellule aderenti mHypoE-42 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4500 mg/L), integrato con siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente al 10% (v/v), bicarbonato di sodio 3,7 g/L e soluzione antibiotica all'1%.
  2. Mantenere le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente 95% di aria e 5% di anidride carbonica (CO2), utilizzando fiaschi di coltura T75 con un volume finale di coltura di 10 mL.
    NOTA: Testare ogni nuovo lotto di FBS prima di iniziare gli esperimenti, poiché i lotti di siero possono variare.
  3. Passaggiare le cellule quando raggiungono una confluenza di circa l'80%–90%. Lavare le cellule con soluzione salina fosfato sterile 1× (PBS; pH 7,4), aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina al 0,5% e incubare per 3–5 minuti per staccare le cellule.
  4. Aggiungere almeno il doppio del volume di tripsina di mezzo di coltura completo contenente FBS al 10% (v/v) per neutralizzare la tripsina.
  5. Diluire le cellule con mezzo di crescita fresco in un rapporto fino a 1:2.
    NOTA: Evitare l'uso di cellule sottoposte a un numero eccessivo di passaggi (ad esempio, passaggi superiori al 40 per le cellule mHypoE-42). Riscaldare preventivamente tutte le soluzioni prima dell'uso. Effettuare regolarmente test per la contaminazione da micoplasma.
  6. Procedere con i saggi di sincronizzazione 24 ore dopo la semina delle cellule a 2,0 × 105 cellule per pozzetto, come descritto al Passaggio 2. Mantenere le colture cellulari di routine a una confluenza di circa l'80%–90% prima del passaggio.

2. Sincronizzazione della linea cellulare mHypoE-42

  1. Preparazione delle cellule
    1. Dopo la tripsinizzazione, centrifugare le cellule a 700 × g per 5 min.
    2. Eliminare il soprannuato e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di mezzo di coltura fresco.
    3. Mescolare la sospensione cellulare con il colorante blu di tripano in rapporto 1:1 (volume totale di 20 μL) e determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
      NOTA: Smaltire le soluzioni contenenti blu di tripano secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici. Non versare il colorante non utilizzato nel lavandino.
  2. Piastatura cellulare e progettazione sperimentale sfalsata
    1. Piastare 2,0 × 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti o in piatti di coltura da 35 mm. Incubare le colture a 37°C per 24 h.
      NOTA: Iniziare la sincronizzazione con il siero 24 h dopo la semina delle cellule. Pertanto, non è richiesta una confluenza cellulare predeterminata prima della sincronizzazione. Invece, esaminare le colture al microscopio per confermare che le cellule siano completamente attaccate e mostrino una morfologia appropriata prima di iniziare la procedura di sincronizzazione.
    2. Dividere casualmente le piastre di coltura in due serie sperimentali. Utilizzare la prima serie per generare i punti temporali circadiani (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 e CT32. Utilizzare la seconda serie per generare CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 e CT48 (Figura 1; Figura Supplementare 1).
    3. Aumentare il numero di pozzetti o piastre secondo necessità per includere repliche tecniche.
      NOTA: Ridurre al minimo la variabilità preparando tutte le piastre dalla stessa sospensione cellulare, mantenendo densità di semina e condizioni di coltura identiche ed eseguendo la sincronizzazione con gli stessi reagenti e impostazioni sperimentali. Regolare il formato del contenitore di coltura e la densità di piastatura secondo necessità per altri tipi cellulari. Quando si utilizzano piastre a 6 pozzetti, combinare i CT raccolti contemporaneamente per ottimizzare l'utilizzo della piastra.
  3. Sincronizzazione
    1. Dopo 24 h, aspirare il mezzo dalle prime piastre e aggiungere 1 mL di DMEM privo di siero. Incubare per 12 h per indurre la privazione di siero.
    2. Preparare immediatamente prima dell'uso una soluzione al 50% (v/v) di siero equino in DMEM ad alto contenuto di glucosio.
    3. Aspirare il mezzo di privazione dalla prima serie e esporre le cellule a 1 mL della soluzione fresca al 50% di siero equino per 2 h.
    4. Contemporaneamente, aspirare il mezzo dalla seconda serie di piastre e sostituirlo con 1 mL di DMEM privo di siero. Incubare per 12 h.
    5. Dopo lo shock di siero di 2 h, aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% (v/v) di FBS inattivato per riscaldamento. Designare questo punto temporale come CT0.
  4. Raccolta dei campioni
    1. Posizionare le piastre di coltura sul ghiaccio. Aspirare il mezzo, lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS sterile freddo 1×, eliminare la soluzione di lavaggio e lisare le cellule meccanicamente utilizzando fino a 1 mL di reagente di lisi.
      ATTENZIONE: Il reagente di lisi contiene sostanze chimiche pericolose. Eseguire tutte le operazioni di manipolazione all'interno di una cappa chimica certificata indossando l'adeguata protezione individuale. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica.
    2. Trasferire ogni lisato in un tubo sterile e conservare i campioni a −80°C fino all'estrazione dell'RNA.
    3. Ripetere i passaggi 2.4.1 e 2.4.2 per raccogliere i campioni a CT4 e CT8.
    4. A CT8, ripetere il passaggio 2.3.2 per la seconda serie sperimentale per sincronizzare le altre cellule.
    5. Dopo 2 h di shock di siero, terminare la sincronizzazione della seconda serie sperimentale sostituendo il mezzo con 1 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% (v/v) di FBS inattivato per riscaldamento.
    6. Raccogliere i campioni alternativamente dalle due serie sperimentali per ottenere CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 e CT32. Il giorno successivo, ripetere la procedura di raccolta per ottenere CT36, CT40, CT44 e CT48.
      NOTA: La privazione di siero e la sincronizzazione sono state avviate in base alla tempistica sperimentale dopo la semina delle cellule, piuttosto che a una confluenza cellulare predeterminata. Confermare che le cellule siano completamente attaccate e mostrino una morfologia appropriata prima di iniziare la sincronizzazione. Sebbene i CT consecutivi differiscano di 4 h, le raccolte non vengono effettuate a intervalli di 4 h. Fare riferimento a Figura Supplementare 1 per il programma completo di raccolta settimanale.

3. Elaborazione del campione: estrazione dell'RNA

NOTA: I protocolli possono variare a seconda del contesto sperimentale e dell'applicazione. Il seguente flusso di lavoro descrive un esempio di procedura efficace per l'estrazione di RNA totale, la sintesi del DNA complementare (cDNA) e la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Estrarre l'RNA totale utilizzando un metodo combinato di lisi basato sul fenolo e separazione in fasi, seguito da purificazione con colonnine di silice in centrifuga.

  1. Preparazione del campione e separazione delle fasi
    1. Scongelare i campioni, re-omogeneizzare i lisati e incubarli a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Aggiungere 200 μL di cloroformio per ogni 1 mL di reagente di lisi.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è volatile e tossico. Eseguire tutte le operazioni che coinvolgono il cloroformio in una cappa chimica certificata indossando idonei dispositivi di protezione individuale.
    3. Agitare vigorosamente i tubi per 15 s e incubarli a temperatura ambiente per 3 min.
    4. Centrifugare i campioni a 12.000 × g per 15 min a 4°C. Lasciare separare i campioni in tre fasi: una fase inferiore fenolo-cloroformio contenente le proteine, un'interfase bianca contenente il DNA e una fase acquosa superiore arricchita in RNA.
    5. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo sterile senza disturbare l'interfase. Conservare la fase organica a 4°C se si prevede l'isolamento successivo di proteine o DNA.
      NOTA: Eseguire l'isolamento di proteine o DNA seguendo il protocollo appropriato qualora si intenda recuperare queste biomolecole dalla fase organica.
  2. Purificazione dell'RNA
    1. Aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% (preparato con acqua priva di RNasi) alla fase acquosa e vortexare due volte per 15 s per favorire il legame dell'RNA.
    2. Caricare il campione su una colonna di silice per centrifugazione e purificare l'RNA seguendo il protocollo di purificazione della colonna.
    3. Digerire il DNA genomico contaminante con DNasi per 15 min a temperatura ambiente.
    4. Lavare la colonna utilizzando i tamponi di lavaggio forniti.
    5. Eseguire un ulteriore lavaggio con 100 μL di tampone di lavaggio e centrifugare a 11.000 × g per 2 min per asciugare la membrana di silice.
    6. Trasferire la colonna per centrifugazione in un tubo microcentrifuga pulito. Eluire l'RNA con 40–60 μL di acqua priva di RNasi applicando l'acqua direttamente al centro della membrana di silice e centrifugando a 11.000 × g per 1 min.
      NOTA: Selezionare il volume di eluizione in base al rendimento e alla concentrazione di RNA desiderati. Un volume di eluizione di 60 μL generalmente consente un recupero più completo dell'RNA dalla membrana di silice, ma produce una soluzione di RNA più diluita. Al contrario, un volume di eluizione di 40 μL fornisce una preparazione di RNA più concentrata, ma potrebbe ridurre il recupero totale di RNA. Ottimizzare il volume di eluizione in base alle raccomandazioni del produttore e alle esigenze dell'applicazione successiva.
  3. Valutazione della qualità dell'RNA
    1. Posizionare i campioni di RNA sul ghiaccio e trasferire 5 μL di ciascun campione in un nuovo tubo microcentrifuga sterile per la valutazione della qualità.
    2. Valutare l'integrità dell'RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% o elettroforesi capillare. Confermare la presenza di bande distinte di RNA ribosomiale 28S e 18S.
    3. Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA misurandone l'assorbanza con uno spettrofotometro.
      NOTA: Smaltire i rifiuti contenenti fenolo seguendo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici. Non smaltire rifiuti chimici pericolosi nel lavandino. Per campioni di cellule in coltura, le concentrazioni di RNA sono tipicamente comprese tra 200 e 1000 ng/μL e sono adatte per la sintesi di cDNA e qRT-PCR. Accettare campioni di RNA con un rapporto A260/230 compreso tra 2,0 e 2,2 e un rapporto A260/280 di circa 2,0 (vedere Tabella Supplementare 1).
  4. Conservazione dell'RNA
    1. Conservare i campioni di RNA purificati a −80°C fino alla sintesi di cDNA.

4. Elaborazione del campione: sintesi del cDNA

NOTA: Sintetizzare il cDNA da 1 μg di RNA totale utilizzando un kit per la sintesi del cDNA del primo filamento. Regolare i volumi delle reazioni e le condizioni di incubazione in base alle istruzioni del produttore.

  1. Trascrizione inversa
    1. Scongelare i campioni di RNA sul ghiaccio. Preparare una reazione di trascrizione inversa di 20 μL contenente 1 μg di RNA totale, 10 μL di 2× Master Mix (contenente inibitore della ribonucleasi, esameri casuali, primer oligo(deossitimidina), ioni magnesio [Mg2+] e tri-fosfati deossinucleotidici), 2 μL di mix enzimatico (contenente la trascrittasi inversa) e acqua trattata con pirobicarbonato di dietile fino a un volume finale di 20 μL.
    2. Incubare la reazione in un termociclatore per 10 min a 25°C per l'appaiamento dei primer, seguito da 30 min a 50°C per la sintesi del cDNA. Inattivare la trascrittasi inversa incubando la reazione a 85°C per 5 min.
    3. Aggiungere 1 μL di RNasi H e incubare la reazione per 20 min a 37°C per degradare il filamento di RNA dell'ibrido RNA-DNA.
    4. Diluire la preparazione di cDNA fino a 1:20 con acqua sterile, in base ai requisiti di ottimizzazione del saggio, e conservare il cDNA diluito a −20°C fino all'analisi mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR).

5. Elaborazione del campione: reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

NOTA: Misurare l'espressione dei geni del clock circadiano mediante qRT-PCR. Fare riferimento alla Tabella Supplementare 2 per le sequenze dei primer validati, le temperature di annealing e le concentrazioni dei primer.

  1. Ottimizzazione del saggio
    1. Convalidare e ottimizzare la concentrazione dei primer, la temperatura di annealing e l'input di cDNA utilizzando campioni di cDNA pooled e una curva standard prima di analizzare i campioni sperimentali. Eseguire l'ottimizzazione e la convalida del saggio come descritto in precedenza15,16.
  2. Preparazione della reazione
    1. Preparare ogni reazione di qRT-PCR da 10 μL combinando 5 μL di master mix 2×, 0,4 μL di primer forward e reverse, 0,2 μL di acqua trattata con diethyl pyrocarbonato e 4 μL di template di cDNA in una piastra PCR a 96 pozzetti.
    2. Sigillare la piastra con un film trasparente otticamente chiaro o con un tappo sigillante. Centrifugare la piastra a 700 × g per un massimo di 5 min a 4°C per rimuovere le bolle e raccogliere la miscela di reazione sul fondo di ogni pozzetto.
    3. Analizzare tutti i campioni di cDNA per determinare l'espressione dei geni bersaglio Bmal1 e Per2.
    4. Analizzare il gene di riferimento selezionato (B2m) utilizzando la stessa diluizione di cDNA per normalizzare l'espressione genica tra i campioni.
  3. Cicli termici
    1. Eseguire la qRT-PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale e attivazione della DNA polimerasi hot-start a 95°C per 2 min, seguita da 39 cicli di 95°C per 5 s e 60°C per 30 s.
    2. Eseguire l'analisi della curva di denaturazione riscaldando le reazioni a 95°C per 5 s, seguiti da incrementi di 0,5°C fino a 95°C, mantenendo per 5 s a ogni incremento.
      NOTA: Regolare i tempi di mantenimento e le impostazioni della curva di denaturazione in base alle raccomandazioni del master mix, se necessario.
  4. Convalida del gene di riferimento
    NOTA: Negli esperimenti di sincronizzazione con siero, valutare i geni di riferimento candidati poiché il trattamento con siero potrebbe alterare l'espressione dei geni housekeeping17. Valutare la stabilità dell'espressione utilizzando metodi come BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 o il metodo comparativo ΔCt21. Selezionare il/i gene/i più stabile/i per la normalizzazione. In questo studio, β-actin (Actb) e β-2-microglobulina (B2m) sono stati valutati utilizzando il software RefFinder22, che integra diversi algoritmi di convalida dei geni di riferimento. B2m ha mostrato la maggiore stabilità di espressione durante il corso del tempo circadiano ed è stato pertanto selezionato per la normalizzazione.
  5. Verifica del prodotto
    1. Verificare la specificità dell'amplificazione analizzando i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%.
      NOTA: Determinare la temperatura di annealing ottimale testando diverse temperature (ad esempio, 58 °C, 60°C e 62°C). Selezionare la temperatura che produce il valore più basso del ciclo di quantificazione (Cq), mantenendo un singolo picco nella curva di denaturazione e senza evidenza di formazione di primer-dimer.
      NOTA: Accettare saggi con efficienze di amplificazione comprese tra il 90% e il 110% e un coefficiente di determinazione (R2) pari o superiore a 0,99. Verificare che le temperature di denaturazione differiscano di non più di 0,5°C tra i replicati tecnici. Accettare solo replicati tecnici con una differenza di Cq ≤0,5 per l'analisi e utilizzare questi valori per calcolare i livelli medi di espressione. Eseguire tutte le reazioni in replicati tecnici (ad esempio, triplicati) e includere sia un controllo senza template sia un controllo senza trascrizione inversa.

6. Analisi dei dati

  1. Analisi dell'espressione genica
    1. Mediare i replicati tecnici per ogni campione prima dell'analisi successiva.
    2. Calcolare il valore ΔCq per ogni campione e punto temporale utilizzando la seguente equazione:
      ΔCq   = Cqgene bersaglio  -  Cqgene di controllo
    3. Calcolare il valore ΔΔCq per ogni campione e punto temporale utilizzando la seguente equazione:
      ΔΔCq   = ΔCqcampione  -  ΔCqcontrollo  
      NOTA: Per il calcolo di ΔΔCq, ΔCqcontrollo è stato definito come il valore medio di ΔCq ottenuto mediando tutti i campioni di controllo attraverso tutti i CT.
    4. Valutare i parametri circadiani, inclusi il valore medio stimato del ritmo (MESOR), l'ampiezza, il picco e la fase, utilizzando CircaCompare23. Eseguire l'analisi utilizzando l'applicazione online oppure l'implementazione tramite pacchetto R.
  2. Analisi CircaCompare online
    NOTA: L'implementazione online riporta stime complete dei parametri circadiani solo quando il set di dati soddisfa i criteri statistici per la ritmicità. Quando la ritmicità è debole o non statisticamente significativa, utilizzare l'implementazione in R per ottenere le stime dei parametri per tutti i set di dati.
    1. Preparare un file di valori separati da virgola (.csv).
      1. Inserire la variabile temporale (numerica; ore) nella Colonna 1.
      2. Inserire la variabile di raggruppamento (solo due gruppi sperimentali) nella Colonna 2.
      3. Inserire la variabile risultato (numerica; ΔΔCq) nella Colonna 3.
    2. Caricare il file .csv nell'applicazione online CircaCompare.
    3. Assegnare le variabili temporale, di gruppo e risultato alle colonne corrispondenti.
    4. Selezionare Esegui per avviare l'analisi.
  3. Analisi CircaCompare in R
    1. Eseguire l'analisi utilizzando R versione 4.5.1 e il pacchetto CircaCompare versione 0.2.024.
    2. Installare i pacchetti R richiesti.
      1. Installare il pacchetto devtools (versione 2.5.2).
      2. Installare il pacchetto circacompare (versione 0.2.0).
      3. Installare il pacchetto ggplot2 (versione 4.0.3).
      4. Installare il pacchetto svglite (versione 2.2.2).
    3. Caricare il file di input .csv.
    4. Eseguire l'analisi CircaCompare impostando alpha_threshold = 1.
      NOTA: Impostando alpha_threshold = 1 vengono riportate le stime dei parametri circadiani per tutte le oscillazioni adattate, indipendentemente dalla significatività statistica. Tuttavia, solo le oscillazioni con un p-value < 0,05 devono essere interpretate come ritmiche e statisticamente significative.
    5. Personalizzare File Supplementare 1 prima di eseguire lo script.
      1. Sostituire “XXX.csv” con il nome del file di dati di input.
      2. Sostituire “YYY.csv” con il nome desiderato per il file dei risultati.
      3. Sostituire “ZZZ.svg” con il nome desiderato per il file del grafico.
      4. Regolare i limiti dell'asse y (ylim) e qualsiasi altro parametro di rappresentazione grafica in base al set di dati.
    6. Fare riferimento a Tabella Supplementare 3 per un esempio di file di input.

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Risultati

Una sincronizzazione riuscita è indicata da una ritmicità circadiana statisticamente significativa dei geni orari analizzati nella condizione di controllo (p < 0,05). In questo studio sono stati effettuati tre esperimenti biologici indipendenti, utilizzando il dimetilsulfossido allo 0,1% come controllo negativo. Bmal1 e Per2 sono stati selezionati come marcatori ciradiani rappresentativi poiché sono componenti fondamentali dell'orologio circadiano molecolare ed esibiscono un profilo di espre...

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Discussione

I ritmi circadiani sono cicli endogeni di circa 24 h che regolano un'ampia gamma di processi fisiologici, metabolici e cellulari attraverso meccanismi molecolari dell'orologio conservati1,2. I modelli di sincronizzazione in vitro forniscono un ambiente sperimentale controllato per lo studio di questi meccanismi e si sono rivelati strumenti preziosi per indagare la regolazione circadiana in condizioni normali e patologiche, inclusa l'esposizione a contami...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato cofinanziato dall'Unione Europea (UE) tramite il Fondo europeo per la ripresa e la resilienza e dai fondi nazionali portoghesi attraverso la FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia nei progetti LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) e UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR) attraverso il Programma operativo regionale Centro 2030 nel progetto CENTRO2030-FEDER-02360200; e dai fondi nazionali portoghesi tramite la FCT nei finanziamenti 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) e 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra per coltura cellulare a 6 pozzettiNest Biotechnology15140122Piastra per coltura cellulare
AgarosioNZYtechMB02702Valutazione della qualità dell'RNA
Miscela di antibiotici (penicillina/streptomicina)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Integratore per coltura cellulare
Kit per la sintesi di cDNA (primo filamento)NZYtechMB12502Trascrizione inversa
CloroformioSigma-AldrichA5256701Reagente per separazione di fase
DMEM, ad alto contenuto di glucosio (4500 mg/L di glucosio, L-glutammina)Sigma-Aldrich26050088Mezzo di coltura cellulare
Provette microcentrifuga EppendorfEppendorf30120086Conservazione del campione
Etilene (96%)Fisher Bioreagents15552393Purificazione dell'RNA
Siero bovino fetale, inattivato termicamenteGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Integratore per coltura cellulare
Piastra PCR a 96 pozzetti rigidaBio-Rad LaboratoriesHSP9601Piastra per qRT-PCR
Siero equino, inattivato termicamenteGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Sincronizzazione mediante shock sierico
Linea cellulare mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Linea cellulare ipotalamica embrionale di topo
Primer oligonucleotidiciNZYtechMB12501Primer per qRT-PCR
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Lavaggio cellulare
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403Reagente per qRT-PCR
Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Strumento per qRT-PCR
Kit per l'isolamento dell'RNANZYtech288306Purificazione su colonna a spin in silice
Reagente di lisi per RNANZYtechMB18502Reagente per estrazione dell'RNA a base di fenolo
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichMB22401Integratore per mezzo di coltura cellulare
Piatto di coltura sterile da 35 mmThermo Fisher Scientific121VPiatto per coltura cellulare
Ciclatore termico T100Bio-Rad Laboratories1861096Sintesi di cDNA
Flacone per coltura tessutale T75Corning430641URecipiente per coltura cellulare
Soluzione di blu di tripano (0,4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Conteggio cellulare
Tripsina-EDTA (0,5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Dissociazione cellulare

Riferimenti

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Sincronizzazione tramite shock sierocellule ipotalamiche di topocampionamento in serie temporaliPCR quantitativaestrazione di RNAselezione del gene di riferimentoanalisi del ritmo circadianoritmicità dell'espressione genica

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