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Articolo metodologico

Apertura della barriera ematoencefalica (BBB) controllata da ultrasuoni in un chip microfluidico BBB-glioblastoma per studi sulla somministrazione di farmaci

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DOI:

10.3791/72041

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18 agosto 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la costruzione di un modello di chip microfluidico BBB-glioblastoma (BBB-GBM). Il modello viene convalidato per l'integrità della barriera ematoencefalica e consente lo studio dell'apertura transitoria e in gran parte reversibile della BBB indotta da ultrasuoni a bassa intensità, permettendo così la valutazione quantitativa del trasporto di nanomicelle attraverso la BBB mediato da ultrasuoni e l'efficienza di targeting tumorale.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BBB) rappresenta un ostacolo significativo nel trattamento del glioblastoma (GBM), poiché limita l'ingresso della maggior parte delle molecole terapeutiche nel cervello. Le differenze interspecifiche nella struttura e nella funzione della BBB complicano la traduzione clinica dei modelli animali, evidenziando la necessità di piattaforme in vitro della BBB pertinenti all'uomo per valutare la permeabilità dei farmaci nella terapia del GBM. In questo studio viene descritto un protocollo per la costruzione di un modello di chip microfluidico BBB-GBM. Questo modello stabilisce un sistema di tri-coltura costituito da cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HCMECs), astrociti primari (ACs) e cellule U87-MG all'interno di una piattaforma microfluidica con Matrigel. L'integrità della BBB viene verificata mediante immunomarcatura continua per la zonula occludens-1 (ZO-1) e saggio di permeabilità con dextrano-FITC. Successivamente, viene utilizzato un'ultrasuonografia a bassa intensità (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) per indurre un'apertura transitoria e in gran parte reversibile della BBB, consentendo a nanomicelle mirate al tumore (SFN@RB@SPMs) di attraversare efficacemente la barriera e accumularsi nelle cellule del GBM. Un aspetto fondamentale di questo protocollo è l'integrazione di misurazioni in tempo reale della permeabilità della BBB e del rilascio del farmaco all'interno di un singolo chip sensibile agli ultrasuoni, fornendo una piattaforma potente per analizzare i meccanismi del rilascio del farmaco potenziato da ultrasuoni nel GBM.

Introduzione

Il trattamento del glioblastoma (GBM) è fortemente limitato dalla BEE, che riduce severamente l'ingresso nel cervello di quasi tutti gli agenti terapeutici1,2. La BEE è formata da cellule endoteliali non fenestrate unite da proteine delle giunzioni strette (ad esempio, occludina, ZO-1), con ulteriore supporto fornito da periciti e prolungamenti terminali astrocitari3. Sebbene i modelli animali abbiano fornito informazioni preziose sul funzionamento della BEE, le variazioni specifiche della specie nella fisiologia e nel metabolismo limitano la loro capacità di prevedere con precisione le risposte farmacologiche umane4,5. Di conseguenza, modelli umani della BEE fisiologicamente rilevanti sono indispensabili per valutare la permeabilità dei farmaci nella terapia del GBM.

I modelli tradizionali in vitro della BEE, come il sistema di coltura Transwell, non riescono a riprodurre la complessità della BEE, inclusa l'interazione tra cellule, il cambiamento dinamico del flusso fluido e lo stress di taglio indotto dal flusso6. Al contrario, i modelli microfluidici della BEE si sono affermati come piattaforme superiori in grado di riprodurre in modo accurato queste caratteristiche simili a quelle in vivo7. Tali sistemi di BEE-su-un-cip sono stati ampiamente utilizzati per studiare la metastasi dei tumori cerebrali8, indagare la disfunzione della BEE in malattie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer9 e valutare il trasporto di farmaci attraverso la BEE10,11. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di BEE-su-cip esistenti è utilizzata principalmente per test di permeabilità dei farmaci e manca della capacità di integrare stimoli fisici esterni che modulano la permeabilità della BEE. Attualmente, l'ultrasuono focalizzato (FUS) si è rivelato una strategia promettente per aprire in modo transitorio la BEE con un sostanziale recupero, consentendo un migliorato rilascio di agenti terapeutici al cervello12,13. Studi meccanicistici precedenti hanno dimostrato che la stimolazione meccanica indotta dagli ultrasuoni può modulare transitoriamente la funzione della barriera rimodellando le giunzioni intercellulari e aumentando la permeabilità endoteliale. Ad esempio, Silvani et al. hanno mostrato che le forze meccaniche indotte dagli ultrasuoni generano la formazione reversibile di spazi interendoteliali in un modello in vitro di vaso-su-un-cip14. In linea con questi risultati, Beekers et al. hanno dimostrato che gli effetti biologici meccanici mediati dagli ultrasuoni inducono un'apertura transitoria dei contatti cellulari endoteliali, aumentando così la permeabilità endoteliale15. Più di recente, Qiao et al. hanno riportato che la permeabilità della barriera endoteliale è regolata in modo critico dai parametri di esposizione agli ultrasuoni, in particolare dalla durata dell'impulso, sottolineando l'importanza di ottimizzare i parametri acustici per ottenere una modulazione sicura e controllabile della BEE16. Nonostante questi progressi, piattaforme in vitro che consentano simultaneamente un'analisi quantitativa dell'apertura della BEE mediata dagli ultrasuoni e del suo impatto sul rilascio di nanomedicinali rimangono limitate.

Per colmare la lacuna sopra descritta, viene presentato un protocollo per la costruzione di un chip microfluidico BBB-GBM. Il dispositivo microfluidico supporta una tri-coltura di cellule HCMEC, AC primarie e cellule GBM U87-MG inglobate in Matrigel. La barriera ematoencefalica ricostruita ha mostrato caratteristiche strutturali e funzionali di una barriera integra, dimostrate dalla localizzazione continua di ZO-1 lungo le giunzioni intercellulari e dal limitato diffondersi di dextrano-FITC da 40 kDa attraverso l'interfaccia vascolare. In particolare, questo chip può essere abbinato a una stimolazione controllata ad ultrasuoni per indurre l'apertura transitoria della barriera ematoencefalica, aumentando così il trasporto e l'efficacia di targeting tumorale delle nanomicelle. Utilizzando questo sistema, è possibile valutare quantitativamente il trasporto e l'efficacia di targeting tumorale delle nanomicelle SFN@RB@SPM. Nel complesso, questa piattaforma rappresenta uno strumento utile per studiare la relazione tra i parametri degli ultrasuoni, la modulazione della barriera ematoencefalica con caratteristiche reversibili e il migliorato rilascio di nanomicelle nella terapia del GBM.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le Linee guida (GB/T35892-2018) per la valutazione etica del benessere degli animali da esperimento ed sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Istituto di Scienze della Vita e della Salute di Ningbo, UCAS (Numero di approvazione: GK-2023-XM-0073). I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fabbricazione e preparazione del dispositivo organo-su-un-chip BBB-GBM

  1. Progettazione del chip e layout della fotomaschera
    1. Progettare il chip utilizzando un software di progettazione assistita da computer (CAD).
      ​NOTA: Il chip è composto da tre canali microfluidici paralleli, inclusi un canale sanguigno, un canale cerebrale e un canale tumorale. Le larghezze del canale sanguigno e del canale tumorale sono entrambe di 1000 µm, mentre la larghezza del canale cerebrale è di 1300 µm. L'altezza dei tre canali è di 150 µm e i canali adiacenti sono separati da array di micropilastri trapezoidali con una larghezza di 200 µm, che consentono la diffusione molecolare intercompartimentale e la comunicazione cellulare. Il layout dettagliato della progettazione della fotomaschera è fornito nella Figura Supplementare 1 e nella Figura Supplementare 2. Il fotoresist SU-8 utilizzato nel presente studio è il 3050.
  2. Realizzazione di uno stampo master in silicio mediante litografia ottica standard con fotoresist SU-8.
    1. Posizionare una piastrina di silicio nuova sul mandrino del centrifugo e attivare il vuoto per immobilizzare saldamente la piastrina.
    2. Dispensare lentamente 10 mL di fotoresist SU-8 al centro della piastrina.
    3. Eseguire un processo di rivestimento centrifugo in due fasi per ottenere uno strato uniforme di fotoresist: prima a 500 giri/min per 10 s, poi a 2500 giri/min per 90 s.
    4. Trasferire la piastrina rivestita su una piastra riscaldata ed eseguire una cottura preliminare a 95 °C per 30 minuti per evaporare il solvente.
    5. Lasciare raffreddare la piastrina a temperatura ambiente e misurare lo spessore dello strato di SU-8 utilizzando un misuratore di spessore.
      NOTA: Per una formazione ottimale della barriera emato-encefalica (BBB), si raccomanda un'altezza del canale compresa tra 110 e 150 µm. Un singolo rivestimento centrifugo (passaggio 1.2.3) produce tipicamente uno spessore del film compreso tra 40 e 50 µm; pertanto, sono necessari due o tre processi di rivestimento centrifugo per raggiungere lo spessore totale desiderato.
  3. Procedimento di litografia
    1. Impostare l'intensità della luce ultravioletta (UV) dell'allineatore della maschera a 14–15 mW/cm2.
    2. Allineare la fotomaschera al cromo con la piastrina di silicio rivestita di SU-8 ed esporre alla luce UV per 10 s.
    3. Trasferire immediatamente la piastrina di silicio su una piastra riscaldata per la cottura post-esposizione nelle seguenti condizioni: 65 °C per 10 s, seguiti da 95 °C per 300 s.
    4. Dopo che la piastrina di silicio si è raffreddata a temperatura ambiente, immergerla in una soluzione sviluppatrice (propilenglicole monometil etere acetato, PGMEA) e lasciarla sviluppare per 4–6 min.
    5. Risciacquare la piastrina con isopropanolo per interrompere lo sviluppo, seguito da un lavaggio con acqua deionizzata.
    6. Asciugare la piastrina con gas azoto ed esaminare le strutture dei microcanali realizzate al microscopio ottico.
      ​NOTA: Se residui di fotoresist non sviluppati persistono, ripetere lo sviluppo fino a quando le microstrutture risultano ben definite.
    7. Cuocere lo stampo master in silicio completato in un forno a 200 °C per 1 h per migliorare l'adesione tra il fotoresist SU-8 e la superficie della piastrina di silicio.
  4. Realizzazione del chip in PDMS
    1. Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) mescolando accuratamente il prepolymer base e l'agente indurente in rapporto di peso 10:1 (p/p) per 30 minuti, ottenendo un prepolymer PDMS omogeneo.
    2. Versare la miscela di PDMS sullo stampo master in silicio realizzato, assicurandosi che le microstrutture siano completamente coperte.
    3. Posizionare lo stampo master in un essiccatore sotto vuoto per la degasificazione, al fine di rimuovere le bolle d'aria.
    4. Trasferire lo stampo master in un forno e indurirlo a 65 °C per 1,5–2 h.
    5. Dopo l'indurimento, tagliare con cura lo strato di PDMS lungo i bordi del chip utilizzando un cutter e staccarlo delicatamente dallo stampo master in silicio.
    6. Immergere il chip in PDMS in etanolo al 70%–75% per 30 minuti per una sterilizzazione preliminare, quindi risciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare all'aria.
    7. Praticare i fori di ingresso e uscita utilizzando un punch bioptico da 2 mm.
  5. Legatura al plasma e assemblaggio del dispositivo
    1. Posizionare il chip in PDMS e un vetrino pulito all'interno della camera di un pulitore al plasma, assicurandosi che il lato del PDMS con i microcanali sia rivolto verso l'alto.
    2. Evacuare la camera fino a quando la pressione scende al di sotto di 30 Pa, quindi introdurre gas ossigeno.
    3. Mantenere il flusso di ossigeno per 90 s mantenendo la pressione nella camera al di sotto di 40 Pa.
    4. Impostare la potenza a Radio Frequenza (RF) al 55% ed eseguire il trattamento al plasma per 90 s per attivare le superfici del PDMS e del vetro.
    5. Portare immediatamente il chip in PDMS attivato a contatto con il vetrino e premere delicatamente per ottenere una legatura irreversibile.
    6. Posizionare il dispositivo assemblato in un forno a 65 °C per 24 h per stabilizzare la legatura e ripristinarne l'idrofobicità.
    7. Prima della semina cellulare, sterilizzare il dispositivo legato mediante irraggiamento ultravioletto per 30 minuti.
      NOTA: Mantenere condizioni sterili conservando i chip sterilizzati in piastre di Petri sigillate all'interno di un armadio a sicurezza biologica fino all'uso.

2. Semina cellulare e stabilimento del modello BBB-GBM

  1. Preparare i seguenti reagenti:
    1. Mezzo di coltura per AC (per il canale cerebrale): mezzo basale DMEM/F12 contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S).
    2. Mezzo di coltura per HCMEC (per il canale vascolare): mezzo per cellule endoteliali (ECM) integrato con l'1% di P/S.
    3. Mezzo di coltura per cellule GBM (per il canale glioma): mezzo basale MEM contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S.
    4. Reagente per la dissociazione cellulare: utilizzare una soluzione di tripsina-EDTA 0,25% per il distacco delle cellule aderenti.
      NOTA: un'esposizione prolungata alla tripsina può ridurre la vitalità cellulare. Monitorare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare tempestivamente la tripsina con mezzo completo.
    5. Mantenere tutte le cellule (AC, HCMEC e U87-MG) in piastre di coltura da 100 mm prima del seeding nel dispositivo microfluidico.
  2. Isolamento di AC primarie
    1. Isolare AC primarie dai cortici cerebrali di ratti neonati (giorni postnatale 1–3). Dopo aver accuratamente rimosso le meningi e i vasi sanguigni su ghiaccio, tritare il tessuto corticale con forbici chirurgiche sterili e sottoporlo a digestione enzimatica.
    2. Lavare la sospensione cellulare dissociata con PBS freddo, trattare con tripsina per ottenere una dissociazione monocellulare e raccogliere i pellet mediante centrifugazione (400 x g, 5 min, temperatura ambiente).
    3. Risospendere le cellule e seminarle in fiasche di coltura T25 contenenti mezzo di coltura per AC.
    4. Identificare le AC mediante colorazione immunofluorescente per GFAP. L'immagine è riportata in Figura Supplementare 3.
  3. Seeding cellulare
    ​NOTA: Giorno 1 - Semina delle AC nel canale cerebrale.
    1. Introdurre 1 mL di tripsina-EDTA 0,25% nella piastra di coltura contenente le AC. Agitare delicatamente per garantire una copertura uniforme.
    2. Incubare a 37 °C per 1–2 minuti fino al distacco delle cellule dalla piastra.
    3. Aggiungere 3 mL di mezzo di coltura per AC (dal passaggio 2.1.1) per neutralizzare la tripsina. Pipettare delicatamente per ottenere una sospensione monocellulare.
    4. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga e centrifugare a 300 × g per 3 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di mezzo per AC.
    6. Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore cellulare automatico e regolare la densità a 2,5 × 106 cellule/mL.
    7. Mescolare la sospensione cellulare di AC con Matrigel in rapporto 3:5 (v/v) (cellule AC: Matrigel).
    8. Utilizzando una micropipetta, dispensare 10 µL della miscela Matrigel-AC nel canale cerebrale.
      NOTA: Eseguire la procedura di caricamento mantenendo il chip su ghiaccio per evitare la polimerizzazione prematura di Matrigel.
    9. Incubare il chip a 37 °C in un incubatore con 5% di CO2 per 30 minuti per consentire la polimerizzazione di Matrigel e la stabilizzazione delle cellule.
      NOTA: Giorno 1 - Semina delle HCMEC nel canale vascolare.
    10. Applicare 1 mL di tripsina-EDTA 0,25% e incubare a 37 °C per circa 30 secondi fino al distacco delle cellule.
    11. Aggiungere 3 mL di mezzo per HCMEC (passaggio 2.1.2) per arrestare la digestione enzimatica.
    12. Pipettare delicatamente per ottenere una sospensione monocellulare uniforme.
    13. Raccogliere la sospensione e centrifugare a 300 × g per 3 minuti a 4 °C.
    14. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di mezzo per HCMEC.
    15. Contare le cellule e regolare la concentrazione a 2 × 106 cellule/mL.
    16. Introdurre con attenzione 10 µL della sospensione di HCMEC nel canale vascolare del chip.
    17. Posizionare il chip di lato per 30 minuti nell'incubatore cellulare per favorire l'adesione delle cellule endoteliali lungo la parete del canale.
    18. Seminare ulteriori 10 µL di sospensione di HCMEC nel canale vascolare per aumentare la densità endoteliale nel canale.
    19. Incubare il chip per ulteriori 30–60 minuti per consentire l'adesione delle HCMEC.
    20. Aggiungere 100 µL di mezzo di coltura misto all'ingresso del chip.
      NOTA: Il mezzo misto è composto da mezzo per AC e mezzo per HCMEC in rapporto 1:1 (v/v).
      Giorno 3 - Semina delle cellule U87-MG nel canale glioma.
    21. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,25% alla piastra di coltura e incubare a 37 °C per 1–2 minuti.
    22. Aggiungere 3 mL di mezzo per U87-MG (dal passaggio 2.1.3) per interrompere la digestione.
    23. Pipettare delicatamente per ottenere una sospensione monocellulare omogenea.
    24. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga e centrifugare a 300 × g per 3 minuti.
    25. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di mezzo per U87-MG.
    26. Contare la concentrazione cellulare e regolare la densità a 2 × 106 cellule/mL.
    27. Introdurre 10 µL della sospensione cellulare U87-MG nel canale glioma del chip.
    28. Incubare il chip a 37 °C con 5% di CO2 per 30–60 minuti per consentire l'adesione cellulare.
    29. Aggiungere 100 µL di mezzo di coltura U87-MG all'ingresso del chip.
    30. Mantenere il dispositivo microfluidico a 37 °C con 5% di CO2 per ulteriori 48 ore per consentire la formazione delle giunzioni strette endoteliali.

3. Valutazione dell'integrità della barriera ematoencefalica

  1. Saggio di permeabilità
    1. Preparare il dextrano marcatore con isotiocianato di fluoresceina (FITC-dextrano) con pesi molecolari di 40 kDa in mezzo di coltura misto (mezzo ACs: mezzo HCMEC = 1:1, v/v) a una concentrazione finale di 10 µg/mL.
    2. Introdurre 10 µL della soluzione di FITC-dextrano nel canale vascolare.
    3. Posizionare il chip microfluidico sul palco di un microscopio a fluorescenza invertito per acquisire immagini di fluorescenza sia del canale vascolare che del canale cerebrale adiacente a intervalli di 20 minuti per monitorare la diffusione del dextrano attraverso la barriera endoteliale.
    4. Quantificare il coefficiente di permeabilità (Papp, cm/s) utilizzando la seguente formula:
      Papp (cm/s)= Equazione per l'efficienza del processo, che include Fs, Fc, Δt; formula matematica per la ricerca scientifica.
      Dove Papp è il coefficiente di permeabilità apparente (cm/s), FS è l'intensità di fluorescenza al tempo iniziale nel canale ematico, FC è l'intensità di fluorescenza nel canale cerebrale alla fine dell'intervallo di diffusione, Δt è il tempo di diffusione (s), VT è il volume di diffusione del FITC-dextrano nel canale cerebrale (cm3), e A è l'area superficiale endoteliale (cm2).
      NOTA: Un coefficiente di permeabilità più basso indica una maggiore integrità della BEE e una formazione più stretta della barriera endoteliale.
    5. Eseguire l'analisi dei dati e la definizione dei parametri.
      NOTA: I valori di intensità di fluorescenza provenienti sia dal canale ematico che da quello cerebrale sono stati corretti per il fondo, utilizzando misurazioni ottenute da regioni del chip prive di cellule. Le ROI sono state definite su entrambi i lati dell'interfaccia emato-encefalica in base alla lunghezza di diffusione della fluorescenza. L'area superficiale endoteliale (A) è stata calcolata a partire dall'area di interfaccia tra i canali vascolare e cerebrale (utilizzando lo spazio tra due micropilastri come riferimento): 200 µm × 150 µm = 30.000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. Il volume di diffusione del FITC-dextrano (VT) è stato ricavato moltiplicando la distanza di penetrazione della diffusione nel canale cerebrale per A. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite ogni 20 minuti (1200 s) per un periodo di 60 minuti; il coefficiente di permeabilità è stato calcolato utilizzando i dati dell'intervallo di 20 minuti. I valori di permeabilità sono stati calcolati da tre chip indipendenti per ogni gruppo sperimentale. Tutte le conversioni di unità sono state effettuate prima di esprimere la permeabilità in cm/s.
  2. Analisi di immunofluorescenza di ZO-1
    1. Lavare i canali microfluidici tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per rimuovere il mezzo di coltura residuo.
    2. Fissare le cellule introducendo il 4% di paraformaldeide (PFA) nei canali e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
    4. Bloccare il legame non specifico degli anticorpi incubando i canali con albumina sierica bovina (BSA) al 2% in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente.
    5. Introdurre l'anticorpo primario anti-ZO-1 (diluizione 1:200) nei canali e incubare a 4 °C durante la notte.
    6. Lavare accuratamente il canale con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
    7. Incubare i chip con un anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 555 anti-coniglio (diluizione 1:1000) per 45 minuti a temperatura ambiente al buio.
    8. Contrastare i nuclei con 1 µg/mL di 4’6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 1 minuto a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: Il DAPI è sensibile alla luce e deve essere protetto dalla luce durante la colorazione.
    9. Lavare i canali tre volte con PBS.
    10. Acquisire immagini del dispositivo microfluidico utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito e un microscopio confocale a scansione laser per visualizzare la localizzazione di ZO-1 lungo le giunzioni delle cellule endoteliali.

4. Consegna di nanomicelle potenziata da ultrasuoni attraverso la BEE alle cellule di GMB

  1. Stimolazione mediante ultrasuoni
    1. Estrarre con attenzione il chip dalla piastra di coltura e posizionarlo all'interno di una cappa a sicurezza biologica.
    2. Applicare una stimolazione mediante ultrasuoni utilizzando un sistema terapeutico a ultrasuoni dotato di un trasduttore a 1 MHz (area radiante efficace: 5 cm²)2).
    3. Applicare un cuscinetto di accoppiamento acustico di grado medico dello spessore di 3 mm tra la sonda ecografica e la superficie del chip microfluidico per garantire una trasmissione acustica efficiente.
    4. Posizionare la sonda ecografica direttamente sopra la regione del canale vascolare del dispositivo microfluidico.
      NOTA: Le bolle d'aria tra il trasduttore e il chip riducono in modo significativo la trasmissione dell'energia acustica e devono essere evitate.
    5. Impostare i parametri dell'ultrasuono come segue: ciclo di lavoro: 60%; frequenza: 1 MHz; intensità: 1 W/cm2; durata dell'esposizione: 30 s; frequenza di ripetizione degli impulsi (PRF): 100 Hz. I parametri dettagliati dell'ultrasuono sono forniti in Tabella supplementare 1.
    6. Per il gruppo di controllo non trattato, posizionare il trasduttore a ultrasuoni nella stessa posizione, ma assicurarsi che rimanga inattivo in modo da costituire un controllo fittizio, garantendo procedure di manipolazione identiche senza esposizione acustica.
    7. Dopo l'esposizione all'ultrasuono, rimuovere il cuscinetto di accoppiamento e riposizionare immediatamente il chip in una piastra di coltura sterile.
    8. Aggiungere mezzo di coltura fresco ai pozzi di ingresso del chip.
    9. Incubare il dispositivo a 37 °C con 5% CO2 fino ad ulteriori analisi.
  2. Valutazione della modulazione dell'BBB indotta dagli ultrasuoni
    1. Eseguire la colorazione immunofluorescente per ZO-1 immediatamente dopo il trattamento con ultrasuoni (0 h) e a 24 h dal trattamento per valutare le variazioni nell'integrità delle giunzioni strette.
    2. Seguire la procedura di colorazione immunofluorescente descritta al punto 3.2.
    3. Confrontare la distribuzione della colorazione di ZO-1 lungo l'asse z per valutare l'effetto della stimolazione a ultrasuoni sull'integrità delle giunzioni strette della BEE.
  3. Preparazione e caratterizzazione di nanomicelle SFN@RB@SPM
    1. Preparare le nanomicelle SFN@RB@SPM secondo il protocollo precedentemente stabilito17In breve, soluzioni stock del peptide anfifilico (indicato come SPM, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) e SFN (6 mM) sono state miscelate in un rapporto volumetrico di 1:1:1.
    2. Posizionare la miscela in un sonicatore e sottoporla a sonificazione a 28 kHz, 25 °C per 30 min.
    3. Dializzare la miscela (cut-off di peso molecolare: 1000 Da) per 48 h per rimuovere RB e SFN liberi.
    4. Misurare le dimensioni e il potenziale zeta delle nanomicelle mediante scattering dinamico della luce (DLS). I dati di caratterizzazione sono forniti in Figura supplementare 4.
  4. Valutazione della somministrazione di nanomicelle stimolate mediante ultrasuoni e dell'accumulo nelle cellule del glioma
    1. Immediatamente dopo l'esposizione agli ultrasuoni, introdurre il mezzo di coltura contenente nanomicelle nel canale vascolare del dispositivo microfluidico.
    2. Per valutare il trasporto delle nanomicelle attraverso la BEE, posizionare il chip microfluidico sul piatto di un microscopio a fluorescenza invertito e acquisire immagini di fluorescenza sia del canale vascolare che del canale cerebrale adiacente a intervalli di 20 minuti per un periodo totale di 60 minuti.
    3. Quantificare le immagini di fluorescenza nel canale cerebrale per valutare la permeabilità dei nanomicelli potenziata dagli ultrasuoni.
    4. Per valutare l'accumulo di nanomicelle nelle cellule di glioma, incubare il dispositivo in condizioni standard di coltura (37 °C, 5% CO₂2per 3 h dopo l'esposizione agli ultrasuoni, quindi osservare il canale del glioma mediante microscopio a fluorescenza per valutare l'assorbimento intracellulare delle nanomicelle.
  5. Analisi statistica
    1. Esprimere tutti i dati quantitativi come media±errore standard della media (SEM).
    2. Eseguire ogni esperimento con tre replicati biologici indipendenti (n = 3 chip per condizione sperimentale). Per ogni replicato biologico, sono state misurate almeno tre replicazioni tecniche (aree di interesse per canale) per garantire l'affidabilità dei dati.
    3. Calcolare il coefficiente di permeabilità (Papp, cm/s) di ogni chip indipendente è stata utilizzata come unità primaria di analisi per tutti i confronti statistici.
      NOTA: I confronti tra due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t di Student non appaiato a due code t-test. Il confronto tra tre o più gruppi è stato analizzato mediante analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. Per esperimenti che coinvolgevano due variabili indipendenti, è stata eseguita un'analisi della varianza a due fattori (ANOVA) seguita dal test di Tukey per confronti multipli. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando software statistico e grafico. Un p-valore di <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Per riassumere il in vivo struttura della BEE, è stato sviluppato un chip microfluidico a tri-coltura incorporando HCMEC, AC primarie e cellule U87-MG (denominato "modello su chip"). Come mostrato in Figura 1A,B, all'interno del dispositivo sono disposti tre canali paralleli: il canale vascolare (a sinistra, blu), il canale cerebrale riempito con Matrigel (centrale, rosa) e il canale tumorale (a destra, verde), che vengono seminati rispettivamente con cellule HCMEC,...

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Discussione

Questo protocollo descrive l'allestimento di un chip microfluidico BBB-GBM per valutare la modulazione dell'BBB mediata da ultrasuoni e il rilascio di nanomicelle. Rispetto ai modelli convenzionali in vitro dell'BBB (ad esempio, Transwell), questa piattaforma microfluidica consente una co-coltura spazialmente definita di cellule endoteliali, cellule astrogliali (AC) e cellule di glioma, permettendo così lo studio del trasporto di farmaci attraverso una barriera emato-encefalica fisiologicamente rilevante. Divers...

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Dichiarazioni

Durante la preparazione di questo manoscritto, gli autori hanno utilizzato ChatGPT (OpenAI) esclusivamente per la revisione linguistica e il miglioramento del testo. Gli autori hanno esaminato e corretto tutti i contenuti assistiti dall'intelligenza artificiale e si assumono piena responsabilità per l'accuratezza e l'integrità del manoscritto. Nessuno strumento di intelligenza artificiale è stato utilizzato per la generazione dei dati, l'analisi o la preparazione delle figure.

Ringraziamenti

Ringraziamo sentitamente per il finanziamento ricevuto dalla Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LQ24H160003), dalla Medical Scientific Research Foundation della provincia di Zhejiang (2024KY351), dalla Ningbo Natural Science Foundation (2023J365), dal programma di introduzione di talenti Yongjiang (Progetto per giovani talenti innovativi, 2021A-012-G) e dal programma di talenti Bei’An del distretto di Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
Anticorpo anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Punzone per biopsiaZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Albumina sierica bovinaAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Contatore cellulareThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Piatto per coltura cellulare (100 mm)Corning Inc.430167
CentrifugaBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Maschera cromataSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Microscopio confocale a scansione laserCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
RevelatoreSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
EtileneNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Siero fetale bovinoScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Progetto open-sourceN/A
Destrano-FITC (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Vetrini in vetroCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
Cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
IncubatriceEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Microscopio a fluorescenza invertitoNikon Instruments Inc.TS2-FL
IsopropanoloSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
AzotoNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
OssigenoNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldeide (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penicillina/streptomicinaPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
FotolitografiaIstituto di Ottica ed Elettronica, Accademia Cinese delle ScienzeURE-2000\AL
Piastra riscaldata per fotolitografiaSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Plasma asherTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Astroctiti primarieN/AN/AIsolate dal cervello di ratto neonato (giorno 1-3)
Wafer di silicioZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Spin coaterSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TripsinaScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
Cellule U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Dispositivo ad ultrasuoni Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4 (edizione blu)Carl Zeiss AGN/A

Riferimenti

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