Articolo metodologico

Un modello murino di endometriosi utilizzando la marcatura ex vivo di nanoparticelle di silice dopata con Cy5.5 per la visualizzazione delle lesioni

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DOI:

10.3791/72070

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4 agosto 2026

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1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio dimostra l'induzione dell'endometriosi utilizzando la marcatura ex vivo con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5, consentendo la visualizzazione fluorescente delle lesioni endometriotiche senza manipolazione genetica.

Abstract

L'endometriosi è un comune disturbo ginecologico caratterizzato dalla crescita di tessuto simile all'endometrio al di fuori della cavità uterina, che porta a infiammazione cronica, dolore pelvico e infertilità. Modelli topini affidabili sono essenziali per indagare i meccanismi molecolari, ormonali, immunitari e ambientali alla base dello sviluppo e della progressione della malattia. I metodi convenzionali per identificare lesioni endometriotiche spesso si basano su topi reporter fluorescenti geneticamente modificati, che richiedono molto tempo e sono costosi da produrre. Qui presentiamo un approccio semplice e non genetico per indurre e visualizzare l'endometriosi nei topi marcheggiando ex vivo frammenti di tessuto uterino donato con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 prima del trapianto. Le nanoparticelle mostrano proprietà fisicochimiche favorevoli, alta stabilità di fluorescenza e citotossicità minima, consentendo una marcatura efficiente del tessuto uterino senza compromettere le procedure sperimentali. Dopo l'impianto intraperitoneale nei topi riceventi, le lesioni endometriotiche marcate con Cy5.5 possono essere facilmente distinte dai tessuti circostanti tramite imaging a fluorescenza. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e versatile per la visualizzazione e il tracciamento delle lesioni, facilitando studi sulla patogenesi dell'endometriosi e la valutazione preclinica di strategie diagnostiche e terapeutiche senza la necessità di manipolazione genetica.

Introduzione

L'endometriosi è una malattia ginecologica comune in cui le cellule che rivestono l'endometrio crescono al di fuori dell'utero. Le lesioni endometriotiche risultanti portano a una condizione infiammatoriacronica 1, e le donne colpite sperimentano comunemente dolore pelvico einfertilità 2. La disfunzione nelle cellule stromali ed epiteliali endometriali favorisce la sopravvivenza e lo sviluppo delle lesioni endometriotiche 3,4,5,6. Questo disturbo comune colpisce circa l'11% delle donne solo negli Stati Uniti. È una delle principali cause di infertilità e dolorepelvico 7, e la sua prevalenza aumenta al 50%–60% nelle donne con dolore pelvico cronico einfertilità 8,9,10,11,12,13. Il costo annuo stimato per diagnosticare e trattare l'endometriosi supera i 22 miliardi di dollari negliStati Uniti: 14,15. I trattamenti attuali includono la rimozione chirurgica delle lesioni o l'induzione di uno stato ipoestrogenico. Tuttavia, la recidiva dopo l'intervento chirurgico è comune e le terapie esistenti sono spesso inefficaci 9,16. La diagnosi viene solitamente stabilita solo tramite visualizzazione chirurgica e verificaistologica 17,18. Inoltre, l'endometriosi è spesso non diagnosticata o diagnosticata erroneamente, con un ritardo diagnostico di 9–11 anni19,20. Questo ritardo impone un significativo onere emotivo e finanziario sia ai pazienti che al sistemasanitario 20,21. Pertanto, è urgente sviluppare metodi non invasivi sia per la diagnosi che per il trattamento dell'endometriosi.

I modelli in vitro hanno fatto avanzare la ricerca sull'endometriosi. Tuttavia, rimangono limitate nella loro capacità di replicare pienamente la complessità delle malattie. Una sfida importante risiede nella natura multifattoriale dell'endometriosi, che coinvolge interazioni complesse tra ormoni, infiammazione, cellule immunitarie, nervi e diversi tipi cellulari all'interno di un ambiente dinamico tridimensionale. Inoltre, i sistemi in vitro non catturano le fluttuazioni naturali degli ormoni steroidei ovarico, limitando la capacità di studiare gli effetti della malattia sul trattoriproduttivo 21,22,23. Pertanto, un modello di endometriosi indotta utilizzando topi intatti fornisce una piattaforma versatile per indagare i ruoli individuali e interattivi del sistemaimmunitario 24, degli ormoni25,26 e dei fattoriambientali 27,28 nello sviluppo dell'endometriosi e nei suoi impatti sul trattoriproduttivo 29. Inoltre, l'uso di modelli murini transgenici, in cui specifici geni vengono selettivamente cancellati o sovraespressi nell'endometrio, permette ai ricercatori di chiarire i ruoli di vie molecolari distinte nello sviluppo e nella progressione dell'endometriosi. Tuttavia, distinguere accuratamente le lesioni endometriotiche dai tessuti circostanti dell'ospite rimane una sfida tecnica significativa.

Le nanoparticelle di silice dopate da coloranti sono sonde versatili e robuste per il tracciamento cellulare e la bioimaging. Sono semplici da sintetizzare, altamente dispersive, fotostabili, biocompatibili ed efficienti nella marcaturacellulare 30,31. La spina dorsale in silice stabilizza i fluorofori idrofobici all'interno della matrice, rendendoli efficienti e ad alto rendimento quantistico (QY) rapportatori molecolari fluorescenti. Nel corso degli anni, tali nanoparticelle di silice fluorescente sono state ampiamente adottate come marcature ex vivo brillanti e durevoli per cellule e strutture tissutali prima del trapianto e della successiva imaging invivo 32,33,34,35. Qui descriviamo una procedura dettagliata per l'induzione dell'endometriosi nei topi con marcatura ex vivo utilizzando nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5, come utilizzato in una precedentepubblicazione 35, consentendone l'applicazione come marcatori di imaging stabili per il tracciamento delle lesioni.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) dell'Università del Missouri (Protocollo n.65323) e sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e le normative nazionali applicabili per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione del coniugato Cy5.5-APTES

  1. Sciogliere 1 mg di cianina 5,5-estere NHS in 100 μL di dimetilsolossido (DMSO) in una fiala trasparente da 11,1 mL con filettatura di vetro. Copri immediatamente la fiala con carta stagnola per proteggere la soluzione dalla luce.
    NOTA: Il coniugato Cy 5.5-APTES può essere conservato a 4 °C a temperatura ambiente per una settimana.
  2. Aggiungere 1 μL di (3-aminopropil)trietossisilano (APTES) alla soluzione del colorante.
  3. Aggiungi 0,5 μL di trietilammina (TEA) e mescola immediatamente per facilitare la reazione.
  4. Mescolare la miscela di reazione a 300 giri/min a 30 °C al buio per 24 ore per consentire l'accoppiamento covalente tra Cy5.5 e APTES.
  5. Sigilla la fiala con il tappo e continua a proteggerla dalla luce avvolgendola con carta stagnola.

2. Sintesi di nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5

  1. Aggiungere 1 μL di soluzione concentrata di ammoniaca (28%) in una nuova fiala trasparente con filettatura di vetro.
  2. Aggiungi 8,5 mL di etanolo assoluto (grado biologico molecolare).
  3. Aggiungere 350 μL di tetraetil ortosilicato (TEOS).
  4. Aggiungere 15 μL della soluzione preparata di Cy5.5-APTES alla miscela di reazione di sintesi silice.
  5. Mescolare la miscela di reazione a 500 giri/min a temperatura ambiente al buio per 24 ore per consentire l'incorporazione covalente del colorante nella matrice di silice.

3. Purificazione e dispersione

  1. Trasferisci l'intera miscela di reazione in un tubo centrifuga da 15 mL.
  2. Prepara un tubo di bilanciamento contenente lo stesso volume di acqua distillata per la centrifugazione.
  3. Centrifugare entrambi i tubi a 12.074 × g per 10 minuti a 4 °C. Conferma che si sia formato un pellet visibile sul fondo del tubo dopo la centrifugazione.
  4. Lavare il pellet con 10 mL di etanolo al 95% centrifugando a 12.074 × g per 10 minuti a 4 °C. Ripeti questo lavaggio 3 volte, risospendendo il pellet tramite sonicazione per circa 3–5 minuti tra un lavaggio e l'altro, o fino a quando non è completamente disperso.
  5. Lavare il pellet con 5 mL di acqua distillata e centrifugare a 12.074 × g per 10 minuti a 4 °C. Ripeti questo lavaggio 2 volte, risospendendo il pellet tramite sonicazione per circa 3–5 minuti tra un lavaggio e l'altro, o fino a quando non è completamente disperso.
  6. Risospendere il pellet in 5 mL di acqua distillata tramite sonicazione fino a dispersione completa (non si osservano frammenti solidi a conferma della dispersione). Conferma che la sospensione particellare appare visibilmente blu dopo la completa dispersione.
  7. Trasferisci la sospensione su una fiala di vetro, avvolgi la fiala con carta stagnola per proteggerla dalla luce e conservala a temperatura ambiente.
  8. Valutare la dispersione e la fluorescenza delle particelle utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS). Usa una lunghezza d'onda di eccitazione di 680 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 710 nm per il Cy5.5.

4. Induzione dell'endometriosi tramite marcatura ex vivo con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5

  1. Iniettare una femmina di 8 settimane di topo donatore (ceppo: C57Bl6J X129Sv) sottocutaneamente con E2 (100 μL di 1 μg/mL in olio di sesamo) una volta al mattino per tre giorni consecutivi per sincronizzare gli ormoni.
  2. Eutanasiare il topo donatore tramite lussazione cervicale 6 ore dopo l'iniezione finale di E2 e rimuovere l'utero.
  3. Trita il tessuto uterino in circa 1mm 3 frammenti in una piastra di Petri usando un bisturi30,36.
  4. Incubare i frammenti di tessuto uterino (45 mg) con nanoparticelle di silice dopate con Cy5,5 al 20% (v/v) in una piastra a 24 pozzi contenente mezzo RPMI-1640 completo (10% FBS) per 3 ore a 37 °C in 5% diCO-2.
  5. Anestetizzare il topo ricevente (ceppo: C57Bl6J X129Sv) con il 3% di isoflurano in ossigeno e eseguire un'incisione addominale di 0,5 cm in linea mediana.
    NOTA: Mettere il topo in una camera di induzione con isoflurano al 3% fino a raggiungere l'anestesia. Rade l'addome e trasferisci il topo sulla piattaforma chirurgica. Posiziona il cono nasale anestetico prima di iniziare l'intervento.
  6. Lavare i frammenti di tessuto uterino marchiati ex vivo con un mezzo di coltura a temperatura ambiente tramite centrifugazione a 380 × g per 2 minuti. Ripeti il lavaggio 3 volte.
  7. In anestesia, eseguire un'incisione addominale di 1 cm nella linea mediana nei topi riceventi. Sospendere 45 mg di frammenti di tessuto marcati con Cy5.5 in 500 μL di PBS e iniettare la sospensione nella cavità peritoneale usando un ago calibro 20.
  8. Chiudi il peritoneo con una sutura assorbibile e chiudi la pelle con clip per ferite. Posiziona il topo in un ambiente caldo e monitoralo fino al recupero dall'anestesia.
  9. Eutanasiare il topo tramite lussazione cervicale al punto finale sperimentale selezionato e raccogliere le lesioni endometriotiche.

Risultati

Le nanoparticelle di silice dopate da coloranti possono essere utilizzate come sonde di imaging per applicazioni di marcatura cellulare. Le nanoparticelle di silice dopate con coloranti Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs) sono state sintetizzate in due fasi utilizzando un processo sol-gel di silice e funzionalizzate con il colorante fluorescente cianino Cy5.5 utilizzando la chimica del silano (Figura 1). La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha rivelato nanoparticelle sferiche uniformi con diametri di 156,67 ± 15,23 nm (Figura 1A). La diffusione dinamica della luce (DLS) ha dimostrato che le nanoparticelle sintetizzate (SiNPs e Cy5.5-SiNP) erano colloidalmente stabili, con diametri idrodinamici (Hd) rispettivamente di 130,67 ± 3,20 nm (PDI = 0,152 ± 0,009) e 185,9 ± 5,44 nm (PDI = 0,14 ± 0,009), rispettivamente (Figura 1B). I potenziali zeta dei SiNP nudi e dei Cy5,5-SiNP erano rispettivamente −32,39 ± 3,55 mV e −50,53 ± 2,47 mV (Figura 1C). La spettroscopia di fotoluminescenza (lunghezza d'onda di eccitazione = 680 nm; lunghezza d'onda di emissione = 710 nm) ha confermato l'incorporazione riuscita di Cy5.5 nelle nanoparticelle di silice, e i Cy5.5-SiNP hanno mostrato una fluorescenza caratteristica (Figura 1D). La coniugazione di colorante di successo è stata ulteriormente confermata dallo spettro della fotoluminescenza. Inoltre, la resa quantistica (QY) dei Cy5.5-SiNP (φ = 0,31) era comparabile a quella del colorante libero Cy5.5 (φ = 0,23)36.

Per valutare la biocompatibilità delle nanoparticelle, sono state incubate durante la notte 12Z cellule epiteliali endometriali con Cy5.5-SiNP in DMEM a 37 °C sotto il 5% di CO₂. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un saggio MTT dopo il trattamento con concentrazioni di nanoparticelle di 0, 0,5, 1, 2,5, 5 e 10 μg/mL (Figura 1E). Non è stata osservata citotossicità a concentrazioni fino a 10 μg/mL. Le cellule incubate con 5 μg/mL di Cy5.5-SiNP hanno mostrato un'assorbimento efficiente delle nanoparticelle, con la microscopia a fluorescenza che ha dimostrato la localizzazione delle particelle nella regione perinucleare (Figura 1F). Al contrario, non è stata rilevata alcuna fluorescenza di Cy5.5 nelle cellule di controllo non trattate. Anche i Cy5.5-SiNP preparati hanno dimostrato stabilità acquosa, con diametri idrodinamici variabili da 170 a 190 nm in acqua deionizzata e mantenendo un'intensità di fluorescenza stabile per sette giorni, come determinato rispettivamente da DLS e imaging di fluorescenza (Figura 1G, H).

Per stabilire l'idoneità delle nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 per la marcatura ex vivo dei tessuti, le loro proprietà di fluorescenza sono state validate prima dell'induzione dell'endometriosi. L'imaging IVIS ha dimostrato un'emissione di fluorescenza robusta dalle sospensioni di nanoparticelle, mentre nessun segnale di fluorescenza rilevabile è stato osservato nel controllo negativo contenente solo acqua, confermando la specificità e la sensibilità della rilevazione della fluorescenza Cy5.5 (Figura 2).

La concentrazione e il tempo di incubazione per l'etichettatura ex vivo dei frammenti di tessuto uterino sono stati successivamente ottimizzati. La fluorescenza è stata rilevata in frammenti di tessuto uterino incubati con nanoparticelle di silice dopate con Cy5,5 al 20% (v/v) per 3 ore a 37 °C sotto il 5% diCO235. L'imaging IVIS ha confermato segnali di fluorescenza forti e costanti dai frammenti di tessuto marcati. Questi risultati dimostrano che le nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 marcheggiano efficacemente i frammenti di tessuto uterino senza modifiche genetiche (Figura 3).

La capacità dei frammenti di tessuto uterino marcati con nanoparticelle di silice dopata con Cy5.5 di indurre l'endometriosi e facilitare l'identificazione delle lesioni èstata quindi evaluata 35. Frammenti di tessuto marcati sono stati iniettati nella cavità peritoneale dei topi riceventi e la progressione della malattia è stata monitorata per un mese. Al punto finale sperimentale, le lesioni endometriotiche sono state facilmente identificate all'interno della cavità peritoneale. Le lesioni Cy5.5-positive sono state chiaramente distinte dai tessuti ospiti circostanti tramite imaging IVIS e microscopia a fluorescenza, permettendo un'identificazione rapida e inequivocabile della lesione. La fluorescenza Cy5.5 all'interno delle lesioni è stata ulteriormente confermata dalla microscopia a fluorescenza.

Questi risultati dimostrano che la marcatura ex vivo con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 supporta l'induzione efficace dell'endometriosi e consente una visualizzazione affidabile delle lesioni endometriotiche in vivo (Figura 4).

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Figura 1: Caratterizzazione fisica delle nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs). (A) Immagine rappresentativa da microscopia elettronica a trasmissione (TEM) dei Cy5.5-SiNP. Diametro della particella = 156,67 ± 15,23 nm. Barra della scala = 100 nm. (B) Misurazioni di scattering dinamico della luce (DLS) dei diametri idrodinamici dei SiNP (130,67 ± 3,20 nm, PDI = 0,152 ± 0,009) e Cy5,5-SiNP (185,9 ± 5,44 nm, PDI = 0,14 ± 0,009). (C) Misurazioni del potenziale zeta dei SiNP (−32,39 ± 3,55 mV) e dei Cy5,5-SiNP (−50,53 ± 2,47 mV), che dimostrano la diminuzione del potenziale zeta dopo la coniugazione Cy5,5. (D) Profilo di fluorescenza dei Cy5.5-SiNP (lunghezza d'onda di eccitazione = 680 nm; lunghezza d'onda di emissione = 710 nm). Inset: Immagini in campo chiaro e fluorescenza di Cy5.5-SiNP disperse in acqua. (E) Test di vitalità delle cellule MTT di cellule 12Z trattate con Cy5.5-SiNPs a concentrazioni di 0, 0,5, 1, 2,5, 5 e 10 μg/mL. (F) Assorbimento cellulare di Cy5.5-SiNP da parte delle cellule 12Z. Le cellule sono state trattate con PBS (controllo) o Cy5.5-SiNP. Blu = DAPI; rosso = Cy5.5-SiNPs. Barra di scala = 200 μm. (G) Stabilità delle dimensioni dei Cy5.5-SiNP conservati in acqua per 7 giorni, senza alcuna variazione significativa del diametro idrodinamico. (H) Stabilità della fluorescenza dei Cy5.5-SiNP conservati in acqua per 7 giorni, senza alcuna variazione significativa dell'intensità di fluorescenza. Inset: Immagini rappresentative di fluorescenza acquisite nei giorni 1, 3 e 6. NS = non significativo. I valori sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Conferma delle nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5. (A) Immagine rappresentativa delle nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5. (B) Rilevamento della fluorescenza di Cy5.5 da nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 tramite imaging IVIS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Marcatura ex vivo di frammenti di tessuto uterino con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5. Il pannello sinistro mostra frammenti di tessuto uterino di controllo non trattati, mentre il pannello destro mostra frammenti di tessuto uterino marcati con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5. La fluorescenza Cy5.5 è stata rilevata tramite imaging IVIS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Rilevamento di lesioni endometriotiche marcate con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5. (A) Immagine IVIS della cavità peritoneale. (B) La microscopia a fluorescenza delle lesioni endometriotiche marcate con Cy5.5 consente un'identificazione chiara all'interno della cavità peritoneale. (C) Immagini rappresentative di microscopia a fluorescenza delle lesioni endometriotiche. La fluorescenza gialla indica il segnale Cy5.5, e i nuclei sono stati contrastati con DAPI. (D) Immagine rappresentativa di una lesione endometriotica. La freccia indica nanoparticelle di silice dopate con colorante Cy5.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il presente studio introduce un approccio basato su nanoparticelle di silice dopate con coloranti Cy5.5 come metodo pratico ed efficiente per visualizzare lesioni endometriotiche nei modellimurini 35. Questa strategia offre diversi vantaggi, tra cui semplicità, flessibilità e natura non genetica, eliminando la necessità di generare animali reporter transgenici. Rispetto agli approcci di visualizzazione convenzionali, come i modelli topinari con segnalatori fluorescenti, questo metodo riduce la complessità tecnica mantenendo un'efficienza robusta nell'etichettatura, ampliandone così l'accessibilità per la ricerca sull'endometriosi. Inoltre, le nanoparticelle di silice forniscono una piattaforma stabile per l'incorporazione di coloranti fluorescenti e per la loro efficiente ritenzione all'interno del tessuto, supportando così l'identificazione delle lesioni riproducibili.

Distinguere le lesioni endometriotiche dal tessuto circostante dell'ospite è essenziale per studiare l'inizio e la progressione della malattia nei modelli murini. I topi reporter Rosa26 mTmG esprimono ubiquitariamente una proteina fluorescente del pomodoro (mT) mirata alla membrana e mirata alla membrana, che viene convertita in proteina fluorescente verde (mG) mirata alla membrana dopo l'escissione mediata da Cre in tessuti targetspecifici 37. Sebbene numerosi modelli di topo transgenici siano disponibili per indagare la funzione genica nell'endometriosi, generare animali fluorescenti reporter richiede molto lavoro e richiede molto tempo. Al contrario, la marcatura ex vivo con nanoparticelle di silice dopate con Cy5.5 offre un'alternativa rapida, flessibile e non genetica per la visualizzazione delle lesioni, pur rimanendo compatibile con un'ampia gamma di modelli murini esistenti.

L'implementazione efficace di questo protocollo dipende da un attento controllo di diversi parametri sperimentali critici. Durante la sintesi delle nanoparticelle, la concentrazione del catalizzatore, la composizione del solvente, la velocità di addizione del TEOS, le condizioni di miscelazione e l'efficienza del lavaggio influenzano direttamente la dimensione delle particelle, l'intensità di fluorescenza e la riproducibilità della marcatura. Il metodo Stöber fornisce un approccio semplice, scalabile e riproducibile per la sintesi di nanoparticelle di silice fluorescente con un controllo preciso sulla dimensione delle particelle e sull'incorporazione stabile deicoloranti 38,39,40,41. Rispetto ai metodi di microemulsione inversa, l'approccio di Stöber minimizza le sfide di purificazione associate al tensioativo preservando la fluorescenza Cy5.5 in condizioni di reazionemiti 39,40,41,42. Aumentare la concentrazione del catalizzatore generalmente aumenta la dimensione delleparticelle 40, mentre una velocità di aggiunta TEOS più rapida favorisce la nucleazione, risultando in particellepiù piccole 41. Un lavaggio accurato è essenziale per rimuovere i reagenti non reattivi e migliorare la stabilità delle nanoparticelle durante la conservazione.

Diversi fattori aggiuntivi sono importanti per ottenere una marcatura tissutale ex vivo riproducibile e per l'insediamento delle lesioni. Dimensioni uniformi dei frammenti di tessuto uterino, dispersione omogenea delle nanoparticelle e condizioni di incubazione costanti migliorano l'efficienza dell'etichettatura e riducono la variabilità sperimentale. Il trattamento parallelo dei tessuti di controllo non marcati è anche essenziale per distinguere la vera fluorescenza Cy5.5 dall'autofluorescenza tissutale e dai segnali di fondo non specifici. Durante l'induzione della lesione, una preparazione ormonale costante dei topi donatori, l'impianto delicato di frammenti di tessuto marcati e un'adeguata cura postoperatoria minimizzano traumi tissutali e infiammazioni aspecifiche, migliorando così la riproducibilità della formazione della lesione.

Nonostante questi vantaggi, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. La persistenza e la stabilità del segnale di fluorescenza in vivo possono variare dopo l'impianto a causa del rimodellamento dei tessuti, della proliferazione cellulare e della clearance mediata dal sistema immunitario. Essendo un marcatore fluorescente esogeno, il segnale Cy5.5 dovrebbe diminuire gradualmente man mano che le cellule marcate si dividono, limitando potenzialmente la fattibilità di studi longitudinali a lungo termine. Inoltre, la variabilità nella preparazione del tessuto e nell'assorbimento delle nanoparticelle può influenzare l'efficienza dell'etichettatura tra esperimenti, evidenziando l'importanza di procedure sperimentali standardizzate.

Sebbene il presente studio si concentri sulla rilevazione delle lesioni ex vivo, Cy5.5 è un colorante fluorescente a rosso lontano/vicino infrarosso (NIR) che minimizza l'autofluorescenza tissutale e consente una penetrazione più profonda dei fotoni. Queste proprietà ottiche rendono Cy5.5 particolarmente adatto per applicazioni di imaging in vivo. Di conseguenza, la strategia di marcatura delle nanoparticelle di silice dopata Cy5.5 ad alto rendimento quantistico fornisce una solida piattaforma per il tracciamento longitudinale non invasivo delle lesioni utilizzando fluorescenza NIR e imagingfotoacustico 43,44.

Gli studi futuri dovrebbero concentrarsi sul miglioramento della durata della fluorescenza e sull'ottimizzazione ulteriore della coerenza dell'etichettatura in condizioni sperimentali. La valutazione sistematica della ritenzione del segnale aiuterà a definire la finestra ottimale per gli studi longitudinali, mentre il continuo perfezionamento della progettazione delle nanoparticelle e delle condizioni di etichettatura potrebbe aumentare la sensibilità ed estendere l'applicabilità di questo approccio ad altri modelli di malattia. Nel complesso, questa strategia basata su nanoparticelle offre un'alternativa rapida, riproducibile e versatile agli approcci di marcatura genetica per visualizzare lesioni endometriotiche e dovrebbe facilitare studi meccanicistici e la valutazione preclinica di strategie diagnostiche e terapeutiche.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro fu sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD108895 a T.K. e J.W.J.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(3-Aminopropil)trietossile (APTES)Sigma-Aldrich440140Purezza ≥99%
17β-EstradioloMilliporeSigmaE8875Purezza ≥98%
Idrossido di ammonioFisher ScientificA669S-500Soluzione di idrossido di ammonio al 28%
Sistema di chiusura delle ferite BD AutoclipBD427631Clip chirurgiche per ferite
Flacone di vetro trasparente filettatoFisherbrandFS60910A-3Flacone di vetro trasparente da 11,1 mL
Estere Cyanine 5.5 NHSSigma-AldrichGEPA15502Colorante fluorescente a infrarossi
Etanolo, assolutoFisher ScientificBP2818Grado per biologia molecolare
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044Supplemento per colture cellulari
Centrifugatrice ad alta velocitàBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-ECentrifugatrice ad alta velocità
Sistema di imaging in vivoPerkinElmerIVIS SpectrumSistema di imaging a fluorescenza
IsofluranoBaxterNDC1001-9-360-60Anestetico inalatorio
Agitatore magneticoFisherbrand14-513-648 mm
Piastrina magnetica per agitatoreChelmsfordSP88854200Agitatore magnetico a velocità variabile
Centrifugatrice refrigerataEppendorf5427 REquipaggiato con rotore FA-45-48-11
Medium RPMI-1640Gibco11835-030Medium per colture cellulari
Olio di sesamoMilliporeSigmaS3547Veicolo per la preparazione di estradiolo
Tetraetil ortosilicato (TEOS)Sigma-Aldrich86578Purezza ≥99%
Trietilamina (TEA)Sigma-AldrichT0886Purezza ≥99%
Bagno a ultrasuoniFisherbrandCPX1800HPer la dispersione di nanoparticelle mediante sonicazione

Riferimenti

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