Dimostrazione del targeting degli inibitori peptidilici fluorescenti del ClpXP mitocondriale tramite microscopia a fluorescenza nelle cellule di mammiferi

Sommario

Questo protocollo stabilisce un flusso di lavoro di imaging quantitativo che prevede l'applicazione della microscopia confocale per monitorare la localizzazione selettiva dell'inibitore fluorescente del peptidile ClpP FAM-FAPAL-CMK (Carboxyfluorescein-FAPAL-chloromethyl cheton) nei mitocondri per colpire ClpP, e i successivi cambiamenti morfologici nei mitocondri nelle cellule intatte causati dall'inibizione di ClpP.

Abstract

Le proteasi mitocondriali dipendenti da ATP sono essenziali per mantenere l'omeostasi proteica attraverso la degradazione di proteine danneggiate o mal piegate. Tra questi, il complesso proteasi ClpXP si trova nella matrice mitocondriale e contribuisce al controllo della qualità mitocondriale in condizioni fisiologiche e di stress. Questo lavoro dimostra un flusso di lavoro di microscopia a fluorescenza quantitativa per valutare il targeting mitocondriale dell'inibitore fluorescente del peptidile FAM-FAPAL-CMK e valutare i cambiamenti morfologici mitocondriali associati all'inibizione del ClpXP nelle cellule di mammifero. Le cellule HeLa sono state trattate con FAM-FAPAL-CMK e analizzate tramite microscopia confocale combinata con colorazione immunofluorescenza dei marcatori mitocondriali e analisi quantitativa delle immagini. L'analisi di colocalizzazione utilizzando la soglia di Costes e i coefficienti di sovrapposizione di Manders ha dimostrato arricchimenti mitocondriali del segnale inibitore. Di conseguenza, l'inibizione di ClpP alterò la morfologia mitocondriale. L'analisi immunoblot non ha mostrato cambiamenti significativi nell'abbondanza della proteina ClpP durante il trattamento con inibitori. Nel complesso, questo lavoro descrive un flusso di lavoro riproducibile basato su imaging che permetterà l'interrogazione delle funzioni mitocondriali di ClpXP in cellule intatte in risposta a perturbazioni dell'omeostasi, come lo stress ossidativo.

Introduzione

Le proteasi mitocondriali dipendenti da ATP sono centrali per l'omeostasi proteica, degradando proteine male ripiegate^{o danneggiate} 1,2,3,4,5,6. Tra questi, ClpXP è un complesso proteasi AAA+ etero-oligomerico situato nella matrice mitocondriale. L'ATPasi ClpX riconosce e spiega le proteine, poi le trasloca nella camera proteolitica^{ClpP 7,8,9}. Insieme ad altre proteasi mitocondriali, ClpXP mantiene il controllo della qualità delle proteine sia in condizioni normali che di stress, inclusi stress ossidativo e perturbazioni ^{metaboliche 1,2,4}. La disgregazione dell'omeostasi delle proteine mitocondriali è stata collegata a malattie come la neurodegenerazione e il cancro, sottolineando l'importanza di comprendere queste attività proteasi nei sistemi cellulari^{intatti 3,6,10}.

Una delle principali sfide nel campo è la mancanza di metodi per monitorare direttamente l'attività delle proteasi mitocondriali con risoluzione spaziale nelle cellule intate. Gli approcci esistenti si basano principalmente su saggi biochimici che utilizzano proteine purificate o lisati cellulari, che forniscono informazioni cinetiche dettagliate ma non preservano il contesto^subcellulare 11,12,13,14. Le strategie di biologia chimica hanno affrontato questa limitazione in parte sviluppando substrati peptidici fluorogenici e inibitori diretti al sito attivo. I substrati peptidilici fluorescenti permettono misurazioni quantitative dell'attività peptidasi dipendente da ATP, mentre gli inibitori peptidilici formano interazioni covalenti reversibili con il sito proteolitico per ottenere un'inibizione^selettiva 13,15,16,17,18,19. In precedenza, è stato dimostrato che l'inibitore di ClpXP sintetizzato in laboratorio FAPAL-CMK può formare un legame covalente con^{ClpP 20}. In questo studio, FAM-FAPAL-CMK, un derivato marcato con fluoresceina di FAPAL-CMK, è stato sviluppato come inibitore meccanistico di ClpP, consentendo la visualizzazione della sua localizzazione intracellulare.

Rispetto agli saggi biochimici, la microscopia a fluorescenza confocale consente una valutazione spazialmente risolta della distribuzione delle sonde e della morfologia mitocondriale nelle cellule intatte, fornendo informazioni che non possono essere ottenute solo dai lisati. Tuttavia, a differenza degli saggi enzimatici, la localizzazione della fluorescenza non misura direttamente l'attività catalitica o gli eventi di legame molecolare e può essere influenzata dall'efficienza dell'assorbimento della sonda, dalla dinamica mitocondriale e dalle condizioni di imaging. Inoltre, un'implementazione di successo dipende da un adeguato accumulo di sonde e da reti mitocondriali sufficientemente risolte, rendendo questo flusso di lavoro più adatto per cellule coltivate aderenti con morfologia mitocondriale chiaramente distinguibile.

L'obiettivo di questo studio è stabilire un flusso di lavoro quantitativo che integri sonde fluorescenti basate su meccanismi con microscopia confocale per monitorare la localizzazione e la funzione della proteasi mitocondriale nelle cellule intate. Combinando sonde chimiche selettive con imaging confocale ad alta risoluzione, questo flusso di lavoro consente la valutazione della localizzazione mitocondriale, della distribuzione delle sonde e delle risposte morfologiche alle perturbazioni dell'omeostasi mitocondriale in cellule intate. Può integrare gli saggi biochimici esistenti che misurano direttamente l'attività proteasi ma mancano di risoluzione spaziale.

Protocollo

Gli esperimenti furono condotti utilizzando celle HeLa disponibili in commercio. Non sono stati utilizzati partecipanti umani, animali vertebrati o materiali biologici primari derivati da uomini o vertebrati. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare e trattamento

1. Coltivare cellule HeLa nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
2. Mettere le cellule a piastra su coperture di vetro sterili e incubare per 24 ore per consentire l'attacco cellulare.
3. Sciogliere l'inibitore FAM-FAPAL-CMK in DMSO per preparare una scorta da 50 μM e congelare a -20 °C per la conservazione.
4. Aggiungi 50 nM FAM-FAPAL-CMK al mezzo di crescita cellulare nei campioni cellulari trattati.
5. Aggiungere un volume uguale di DMSO ai campioni di controllo per corrispondere alla concentrazione finale di solvente dei campioni trattati con inibitori, assicurando che eventuali effetti non siano dovuti al DMSO.
6. Incubare le cellule per ulteriori 18 ore nelle stesse condizioni di coltura prima del processo a valle.
   Nota: l'inibitore FAM-FAPAL-CMK è progettato e sintetizzato in laboratorio, e il metodo di sintesi è stato segnalato^{in precedenza 20}.

2. Fissazione e permeabilizzazione

1. Lava le cellule con D-PBS preriscaldato per 5 minuti e ripeti una volta.
2. Fissare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente utilizzando un tampone PHEM (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM_{MgCl 2}, pH 6,9) contenente 2,4% (v/v) formaldeide, 0,05% (v/v) glutaraldeide e 0,5% (v/v) saponina.
3. Prepara una soluzione fresca di boridrido di sodio (5 mg/mL in D-PBS).
4. Incubare le cellule nella soluzione di boridrido di sodio per 15 minuti a temperatura ambiente per neutralizzare il glutaraldeide residuo.
5. Risciacquare le cellule tre volte con D-PBS per 5 minuti ciascuna prima della colorazione.
   NOTA: Formaldeide e glutaraldeide sono fissativi tossici. Esegui i passaggi di fissazione nel cappuccio e indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata (guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi). Il boridrido di sodio è un agente riducente reattivo e deve essere maneggiato con attenzione. Il buffer di fissazione basato su PHEM contenente formaldeide, glutaraldeide e saponina è stato selezionato per preservare la morfologia mitocondriale mantenendo l'accessibilità agli antigeni durante l'immunocolorazione. Formaldeide e glutaraldeide forniscono reticolazioni proteiche per la conservazione strutturale, mentre la composizione tampone e il pH del PHEM aiutano a stabilizzare l'ultrastruttura^{mitocondriale 21}. La saponina facilita la permeabilizzazione della membrana per migliorare la velocità di penetrazione del fissativo. Questa strategia di fissazione minimizza la distorsione delle reti mitocondriali ed è particolarmente adatta per l'analisi quantitativa della morfologia mitocondriale.

3. Colorazione da immunofluorescenza

1. Bloccare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente in un tampone bloccante contenente albumina sierica bovina (BSA) al 3% (w/v) in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2HPO 4}, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4) con 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Incubare le cellule con anticorpi primari diluiti in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Usa anti-TOMM20 (1:500) e anti-ClpP per conigli (1:500).
3. Lava le cellule tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna per rimuovere gli anticorpi primari non legati.
4. Incubare cellule con anticorpi secondari diluiti in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Usa l'anticorpo secondario del topo coniugato con CF405S (1:500) e l'anticorpo secondario del coniglio coniugato con Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Proteggere i campioni dalla luce durante e dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi.
6. Ripeti il passo 3.3.
7. Montare i coperchissi su vedute di vetro usando un mezzo di montaggio.
   NOTA: ClpP e TOMM20 sono stati visualizzati sotto 405 nm e 647 nm per evitare qualsiasi sovrapposizione spettrale con i segnali FAM.

4. Acquisizione di immagini

1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio laser confocale dotato di un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica.
2. Eccita i fluorofori usando linee laser da 405 nm e 633 nm. Utilizzare appositi divisori di fascio dicroici per riflettere la luce di eccitazione e trasmettere la fluorescenza emessa ai rivelatori.
3. Imposta la dimensione del pixel a 35,3 nm (X, Y) e il passo Z a 0,1 μm per garantire un adeguato campionamento assiale delle strutture mitocondriali.
4. Acquisire immagini con una dimensione di fotogramma di 1900 x 1900 pixel (X, Y) e raccogliere 5 sezioni ottiche per ogni Z-stack a partire dal segnale mitocondriale superiore e terminando sotto il segnale mitocondriale per garantire che il segnale mitocondriale predominante venga raccolto.
   NOTA: Le impostazioni rappresentative per l'acquisizione del microscopio sono fornite nella Figura Supplementare 1. Per le cellule HeLa, i mitocondri sono tipicamente strutture tubulari sottili, con^{un diametro} 22 di circa 0,5-1 μm. Quindi un Z-volume di 0,5 μm è sufficiente a catturare una frazione sostanziale della matrice mitocondriale individuale, ma non necessariamente l'intera cellula. È stato selezionato uno stack a Z a 5 sezioni per bilanciare un campionamento sufficiente delle strutture mitocondriali con l'acquisizione rapida dell'immagine, minimizzando gli artefatti legati al movimento durante l'imaging cellulare.

5. Trattamento e imaging con cellule vive

1. Coltivare cellule HeLa su piatti a fondo di vetro da 35 mm in DMEM con FBS al 10% a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
2. Aggiungere un inibitore (concentrazione finale: 50 nM) o un volume equivalente di DMSO alle cellule 24 ore dopo la semina. Incubare le cellule per ulteriori 18 ore in condizioni standard di coltura.
3. Rimuovi il mezzo di coltura contenente l'inibitore o DMSO e risciacqua le cellule una volta con D-PBS preriscaldato per 5 minuti.
4. Aggiungi una soluzione di imaging a cellule vive contenente MitoTracker DeepRed da 20 nM.
5. Esegui immagini di cellule vive a temperatura ambiente utilizzando le stesse impostazioni del microscopio descritte sopra. Acquisire immagini in modalità scansione per fotogramma con una velocità approssimativa di 4,72 s per sezione ottica (circa 24 s totali per ogni pila Z a 5 sezioni).
   NOTA: Cinque sezioni ottiche per ogni Z-stack sono impostate per bilanciare un campionamento sufficiente delle strutture mitocondriali con tempi di acquisizione gestibili. Inoltre, viene utilizzata una soluzione di imaging a cellule vive a temperatura ambiente per ridurre la motilità mitocondriale rispetto all'imaging a 37 °C. Sebbene il movimento mitocondriale durante l'imaging delle cellule vive possa comunque contribuire alla variabilità nelle misurazioni di colocalizzazione, impostazioni di acquisizione coerenti su tutti i campioni aiutano a ridurre il bias sistematico. Le impostazioni rappresentative del software sono mostrate nella Figura Supplementare 2.

6. Analisi della morfologia mitocondriale

1. Apri file immagine in Fiji²³ e genera proiezioni di massima intensità da Z-stack selezionando Image → Stacks → progetto Z e selezionando Max Intensity.
2. Applica il metodo di soglia di Otsu navigando su Immagine → Regola → Soglia e selezionando Otsu tra le opzioni di soglia di soglia. Applica la soglia ai mitocondri segmentati.
3. Esegui il plugin²⁴ di Mitochondria Analyzer e seleziona la modalità di analisi 2D per mito.
4. Misurare la dimensione (area) e il perimetro mitocondriale utilizzando l'output del Mitochondria Analyzer.
5. Ottenere i valori del fattore di forma mitocondriale direttamente dall'output del Mitochondria Analyzer, dove il fattore di forma è calcolato come P²/(4πA), con P che rappresenta il perimetro e A l'area.
6. Misura la lunghezza totale dei rami per mitocondrio utilizzando la funzione di analisi di rete all'interno del plugin per valutare la connettività mitocondriale.
7. Presentare i dati come distribuzioni di singole misurazioni mitocondriali insieme a valori medi derivati da 30 cellule per condizione in tre repliche biologiche indipendenti.
8. Valuta la significatività statistica utilizzando il test t di Welch in un software di analisi statistica.

7. Analisi di colocalizzazione

1. Apri file immagine nelle Fiji e genera proiezioni 2D di massima intensità da pile di immagini 3D. Per coerenza, analizza tutti i campioni utilizzando la stessa strategia di proiezione e acquisizione.
2. Dividi i canali di fluorescenza selezionando Immagine → Colore → Canali Divisi.
3. Avvia il plugin Coloc 2 selezionando Plugin → Colocalizzazione → Coloc 2.
4. Assegna i canali appropriati per l'analisi e abilita la regressione della soglia di Costes nelle impostazioni del plugin. Esegui l'analisi su base per cella.
5. Registra i coefficienti di sovrapposizione di Mander (M1 e M2) per valutare la frazione di segnale in ciascun canale che coincide spazialmente con l'altro.
6. Abilita la randomizzazione di Costes nelle impostazioni di Coloc 2 e imposta il numero di randomizzazioni a 50 per valutare la significatività statistica.

8. Generazione del lisato cellulare

1. Semina cellule HeLa in DMEM con FBS al 10% e incuba a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
2. Aggiungere un inibitore di 50 nM o un volume equivalente di DMSO alle cellule 24 ore dopo la semina, e incubare per ulteriori 18 ore in condizioni standard di coltura.
3. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le cellule con D-PBS preriscaldato per 5 minuti, poi tripsinizzare per staccarsi.
4. Tempre la tripsinizzazione con un substrato cellulare fresco e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartate il soprannatante.
5. Risospendi la pellet cellulare in D-PBS e centrifuga a 300 x g per 3 minuti per lavare le celle. Scartate il soprannatante.
6. Risospendere la pellet cellulare in un tampone di lisi pre-raffreddato (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM cloruro di sodio, 0,1% SDS, 0,5% desossicolato di sodio, 2% CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x cocktail inibitori della proteasi).
7. Incubare i lisati sul ghiaccio per 20 minuti e sonicare i lisati in un bagno d'acqua ghiacciata per 2 minuti per garantire una lisi completa.
8. La centrifuga lisa a 13.000 x g, 4 °C per 20 minuti.
9. Trasferire il supernatant liberato in un tubo fresco pre-raffreddato per l'analisi a valle.
   NOTA: Il PMSF è tossico e dovrebbe essere maneggiato in una cappa con l'attrezzatura di protezione personale appropriata. La SDS è un irritante e la sonicazione genera calore e aerosol. Esegui passaggi di lisi e sonicazione sul ghiaccio e segui le linee guida istituzionali di sicurezza.

9. Saggio di Bradford

1. Prepara un set di soluzioni standard usando BSA in 0,15 M cloruro di sodio. Le concentrazioni sono: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Diluire il lisato cellulare sconosciuto 50 volte e 100 volte in 0,15 M cloruro di sodio.
3. La pipetta replica ogni soluzione di curva standard e campioni sconosciuti in una piastra da 96 pozzi.
4. Aggiungi reagente Bradford in ogni pozzo. Per ogni pozzo, utilizzare una soluzione proteica da 160 μL con 40 μL di reagente Bradford 5x (disponibile in commercio). Mescola delicatamente con la pipetta.
5. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti e misurare l'assorbenza a 595 nm usando un lettore di piastre.
6. Generare una curva standard tracciando le concentrazioni di BSA sull'asse x e l'assorbanza media a 595 nm da misurazioni replicate sull'asse y.
7. Determinare le concentrazioni proteiche dei campioni utilizzando la curva standard. Moltiplica i valori calcolati per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione originale.

10. Immunoblotting

1. Carica quantità uguali di lisato cellulare su un gel di poliacrilamide al 12% e separi le proteine tramite SDS-PAGE.
2. Attiva la membrana PVDF immergendola brevemente nell'etanolo. Bilanciare sia la membrana che la carta assorbente nel buffer di trasferimento.
3. Trasferire le proteine dal gel a una membrana PVDF utilizzando un sistema di trasferimento semi-secco.
4. Blocca la membrana nel latte secco scremato al 5% (w/v) in TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) a temperatura ambiente per 1 ora con una delicata agitazione.
5. Incubare la membrana con l'anticorpo primario diluito in un tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora con una leggera agitazione. Usa anti-ClpP per conigli (1:2000) e anti-beta-actin per topi (ACTB, 1:10.000).
6. Lava la membrana tre volte con TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, pH 7,6) per 5 minuti per lavaggio per rimuovere l'anticorpo non legato.
7. Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con HRP diluito in tampone bloccante (1:3000) a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione delicata.
8. Ripeti il passaggio di lavaggio.
9. Rilevare le bande proteiche utilizzando reagenti di rilevamento chemiluminescente.

11. Analisi densitometrica

1. Apri l'immagine della macchia occidentale nelle Fiji.
2. Cambia il tipo di immagine a 8 bit tramite il tipo Immagine → → 8 bit.
3. Sottrai lo sfondo dell'immagine con Process → sottrai lo sfondo. Controlla lo sfondo della luce e imposta il raggio della palla rotante a 50,0 pixel.
4. Accerchia la banda nella prima corsia usando lo strumento rettangolo, poi seleziona analizza → gel → seleziona prima corsia.
5. Sposta lo strumento rettangolo sulla seconda corsia e seleziona analizza → gel → seleziona la corsia successiva. Ripeti questo passaggio finché tutte le corsie non sono selezionate.
6. Traccia la densità delle bande analizzando → gel → tracciando le linee.
7. Usa lo strumento linea retta per tracciare una linea in fondo al picco di densità di banda, e usa lo strumento bacchetta per leggere la densità della banda.
8. Ripeti la stessa procedura dei passaggi 11.1–11.8 sull'immagine del caricamento del controllo blot.
9. Riportare la densità di banda relativa dividendo la densità (ClpP) per la densità (ACTB).

Risultati

L'inibizione della ClpP altera la morfologia mitocondriale e l'organizzazione della rete
È stata valutata la morfologia mitocondriale per determinare se l'inibizione di ClpP alteri l'organizzazione mitocondriale nelle cellule HeLa. Le immagini rappresentative di fluorescenza hanno mostrato differenze chiare nell'organizzazione mitocondriale tra cellule di controllo e quelle trattate con FAM-FAPAL-CMK (Figura 1A). L'analisi quantitativa ha...

Discussione

Il peptidile clorometilchetone FAPAL-CMK¹⁵ è stato precedentemente dimostrato essere un potenziale inibitore irreversibile della subunità proteasi (ClpP) della proteasi mitocondriale dipendente da ATP ClpXP. Sebbene gli esperimenti cinetici abbiano dimostrato la potenza dell'inibitore e il meccanismo d'azione, l'approccio in vitro non ha potuto valutare l'efficacia di FAPAL-CMK come inibitore selettivo della ClpP mitocondriale in cellule intatti. La micro...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3