Questo studio analizza il danno alla mucosa gastrica associato al trattamento con clopidogrel nei ratti e nelle cellule epiteliali gastriche, mettendo in evidenza la sua associazione con cambiamenti molecolari legati allo stress del reticolo endoplasmatico, apoptosi e infiammazione sistemica.
Articolo di ricerca
Danno della mucosa gastrica indotto da clopidogrel associato allo stress del reticolo endoplasmatico nei ratti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il clopidogrel è ampiamente utilizzato come agente antiaggregante per la prevenzione e il trattamento delle malattie trombotiche arteriose, ma la sua applicazione clinica può essere limitata da effetti avversi gastrointestinali, inclusi danni alla mucosa gastrica. Poiché la sopravvivenza delle cellule epiteliali è essenziale per mantenere l'integrità della mucosa gastrica, abbiamo ipotizzato che il danno epiteliale gastrico indotto dal clopidogrel fosse accompagnato da alterazioni nei marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e all'apoptosi. Per verificare questa ipotesi, le cellule epiteliali gastriche umane GES-1 sono state trattate con diverse concentrazioni di clopidogrel, valutando la vitalità cellulare, l'apoptosi, la distribuzione del ciclo cellulare e le modifiche molecolari mediante saggio con il kit per il conteggio cellulare (CCK-8), citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e immunoblotting. Parallelamente, dei ratti Sprague-Dawley sono stati trattati con clopidogrel per via orale al fine di stabilire un modello in vivo di danno gastrico. Le alterazioni patologiche della mucosa gastrica sono state valutate mediante colorazione con ematossilina ed eosina, mentre i livelli sierici di citochine infiammatorie sono stati misurati con saggio immunoenzimatico (ELISA). Il clopidogrel ha ridotto la vitalità delle cellule GES-1, promosso l'apoptosi e alterato il progresso del ciclo cellulare. Nei ratti, il clopidogrel ha indotto erosione della mucosa gastrica, edema e infiltrazione di cellule infiammatorie, accompagnate da un aumento dei livelli sierici di interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α). Il clopidogrel ha inoltre aumentato l'espressione dei marcatori dello stress del reticolo endoplasmatico, proteina omologa a C/EBP (CHOP) e fattore di trascrizione attivante 5 (ATF5), aumentato l'espressione della proteina Bcl-2 associata a X (Bax), ridotto l'espressione della linfoma cellulare B 2 (Bcl-2) e innalzato il rapporto Bax/Bcl-2 sia nei tessuti gastrici che nelle cellule GES-1. Questi risultati suggeriscono che il danno alla mucosa gastrica indotto dal clopidogrel è associato a un aumento dell'espressione dei marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e alla rottura dell'equilibrio Bax/Bcl-2, sebbene in questo studio non sia stata dimostrata una diretta relazione causale tra lo stress del reticolo endoplasmatico e la via mitocondriale dell'apoptosi.
Introduzione
I sistemi immunitari innati e adattativi della mucosa gastrica, costituiti da cellule epiteliali, cellule immunitarie e molecole di segnalazione, collaborano per mantenere l'integrità della mucosa e fungono da barriera fisiologica critica contro fattori dannosi1,2. Questa funzione protettiva è essenziale per l'omeostasi gastrointestinale e la sua alterazione può contribuire allo sviluppo di malattie gastriche, inclusa la gastrite3. Clinicamente, il danno alla mucosa gastrica indotto da farmaci è una complicanza comune, con i farmaci antiinfiammatori non steroidei e gli agenti antiaggreganti tra le cause più frequenti4. L'integrità della mucosa gastrica dipende da un equilibrio dinamico tra proliferazione cellulare e apoptosi5. L'esposizione cronica a fattori ambientali, inclusi i farmaci, può alterare questo equilibrio, favorire l'apoptosi e provocare lesioni alla mucosa6,7. Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi intracellulare. In condizioni di stress cellulare, l'accumulo di proteine mal ripiegate o non ripiegate attiva la risposta alle proteine non ripiegate, comprendente la via di segnalazione PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, che può favorire l'apoptosi e modificare l'espressione delle proteine della famiglia della linfoma B-cellula 2 (Bcl-2)8. ATF5 è coinvolto anche nelle risposte allo stress mitocondriale e nella comunicazione crociata tra disfunzione mitocondriale e stress del reticolo endoplasmatico9. Evidenze cliniche recenti indicano che la terapia antiaggregante protratta, inclusa la clopidogrel, è associata a un progressivo danno della mucosa gastrica e intestinale10.
Il clopidogrel è un agente antiaggregante piastrinico ampiamente prescritto che richiede un'attivazione metabolica prima di legarsi in modo irreversibile ai recettori piastrinici P2Y12, inibendo così l'aggregazione piastrinica mediata dall'adenosina difosfato e producendo effetti antitrombotici11. Questa bioattivazione avviene principalmente attraverso gli enzimi epatici del citocromo P450. Pertanto, l'esposizione diretta di cellule epiteliali gastriche coltivate al composto parentale del clopidogrel non riproduce il contesto metabolico e farmacocinetico completo del trattamento con clopidogrel in vivo. Tuttavia, crescenti evidenze suggeriscono che il trattamento con clopidogrel possa essere associato a ulcere gastriche ricorrenti e a sanguinamenti gastrointestinali, evidenziando l'importanza di bilanciare l'efficacia antitrombotica con la sicurezza gastrointestinale12,13,14. Sebbene questi effetti avversi siano stati riportati, i meccanismi alla base del danno alla mucosa gastrica associato al clopidogrel non sono ancora completamente compresi, limitando lo sviluppo di strategie preventive e terapeutiche mirate. Nel presente studio, abbiamo esaminato gli effetti del clopidogrel sulla mucosa gastrica utilizzando ratti Sprague–Dawley e cellule GES-1. I ratti hanno ricevuto clopidogrel per gavaggio, e sono stati condotti esperimenti complementari in vitro impiegando cellule GES-1. Sono state effettuate analisi istopatologiche, molecolari e cellulari per indagare se il danno alla mucosa gastrica indotto dal clopidogrel sia associato allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi. Di conseguenza, il presente studio si è concentrato sulla caratterizzazione dei cambiamenti molecolari associati al danno gastrico indotto dal clopidogrel, piuttosto che sull'individuazione di una via di segnalazione causale. I nostri risultati forniscono ulteriori informazioni sui cambiamenti molecolari legati al danno alla mucosa gastrica indotto dal clopidogrel e potrebbero contribuire a futuri studi volti a prevenire e gestire questi effetti avversi.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state esaminate e approvate dal Laboratorio di Controllo Etico Sperimentale sugli Animali di Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il numero di approvazione etica per gli animali era DRK-20251015210.
Animali e linee cellulari
L'approvazione etica ha coperto l'uso di 20 ratti Sprague–Dawley di grado SPF. Un totale di 12 ratti maschi Sprague–Dawley di grado SPF, di età compresa tra 6 e 8 settimane e del peso di 280–300 g all'inizio dell'esperimento, sono stati inclusi nel presente studio. I ratti sono stati ottenuti dalla Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, Cina; Licenza di produzione n. SCXK [Zhejiang] 2024-0004) e assegnati casualmente ai gruppi di controllo e a quelli trattati con clopidogrel, con sei ratti per gruppo. I ratti sono stati allevati in un ambiente controllato a circa 22°C, con un ciclo luce/buio di 12 ore, con libera disponibilità di mangime standard e acqua potabile sterilizzata. A tutti i ratti è stato consentito un periodo di acclimatazione di una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. L'idrogenosolfato di clopidogrel è stato sospeso in carbossimetilcellulosa sodica (CMC-Na) allo 0,5% a una concentrazione di 0,781 mg/mL. I ratti del gruppo trattato con clopidogrel hanno ricevuto l'idrogenosolfato di clopidogrel per gavaggio orale a 10 mL/kg di peso corporeo (equivalente a 1 mL/100 g di peso corporeo e a una dose di 7,81 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni consecutivi. I ratti del gruppo di controllo hanno ricevuto un volume equivalente di CMC-Na allo 0,5%. La dose e la durata del trattamento di 3 giorni sono state scelte in base a un modello ratto a breve termine precedentemente descritto di somministrazione orale di clopidogrel. Dopo l'ultimo gavaggio al giorno 3, il cibo è stato sospeso per 12 ore, mentre l'acqua è stata fornita ad libitum. I ratti sono stati anestetizzati in una camera di induzione con isoflurano al 3% in ossigeno, e l'anestesia è stata mantenuta con isoflurano al 1,5%–2,0% somministrato attraverso un cono nasale. La profondità anestetica adeguata è stata confermata dall'assenza di riflessi corneale e di ritrazione plantare. Il sangue è stato prelevato mediante puntura cardiaca terminale sotto anestesia profonda. Mentre rimanevano profondamente anestetizzati, i ratti sono stati soppressi mediante esanguinazione seguita da toracotomia bilaterale. La morte è stata confermata dall'assenza di respirazione spontanea e attività cardiaca per almeno 5 minuti, insieme all'assenza di riflessi corneale e di ritrazione plantare. Lo stomaco è stato quindi rapidamente asportato, aperto lungo la grande curvatura e delicatamente risciacquato con soluzione salina fredda.
La linea cellulare di epitelio mucosale gastrico umano GES-1 è stata ottenuta da iCell Bioscience Inc. (Shanghai, Cina; N. Cat. iCell-h062) ed è stata autenticata mediante analisi del profilo di ripetizioni in tandem corte da parte del fornitore. Le cellule sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina, in un incubatore umidificato a 37°C con 5% di CO₂. Per gli esperimenti sono state utilizzate cellule precoci, comprese tra il passaggio 3 e il passaggio 10. Quando la confluenza cellulare raggiungeva circa l’80%–90%, le cellule venivano suddivise in un rapporto di 1:3. Per i successivi esperimenti sono state impiegate cellule in fase logaritmica di crescita. Per il saggio CCK-8, le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 6 × 103 cellule/pozzetto. Per le analisi di apoptosi e del ciclo cellulare, le cellule sono state seminate in piastre a 6 pozzetti a una densità di circa 5 × 105 cellule/pozzetto e lasciate aderire prima del trattamento con clopidogrel.
Prodotti chimici e soluzioni
È stato utilizzato clopidogrel emisolfato (N. Cat. C874834; purezza ≥ 99%) per gli esperimenti sugli animali e sulle cellule. Una soluzione madre di clopidogrel è stata preparata sciogliendo 100 mg di polvere di clopidogrel in dimetilsulfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre 1 M. La soluzione madre è stata ulteriormente diluita alle concentrazioni operative richieste prima dell'uso. La soluzione madre 1 M è stata diluita in serie con DMSO per preparare soluzioni di dosaggio 1000× alle concentrazioni di 10, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 mM. Immediatamente prima del trattamento, ciascuna soluzione di dosaggio 1000× è stata aggiunta al mezzo di coltura completo in un rapporto di 1:1000 (v/v) per ottenere concentrazioni finali di clopidogrel rispettivamente di 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mM. Il gruppo di controllo con veicolo ha ricevuto un volume uguale di DMSO senza clopidogrel. Pertanto, la concentrazione finale di DMSO è stata mantenuta al 0,1% (v/v) in tutti i gruppi. Le cellule GES-1 in coltura non riproducono l'attivazione biochimica epatica del clopidogrel mediata dal citocromo P450. Pertanto, il trattamento diretto con clopidogrel è stato utilizzato come modello esplorativo di esposizione al composto parentale. L'intervallo di concentrazioni è stato scelto per caratterizzare le risposte cellulari dipendenti dalla concentrazione nelle condizioni sperimentali e non deve essere interpretato come equivalente a concentrazioni clinicamente raggiungibili nel plasma o nei tessuti gastrici.
Subcoltura delle cellule
Il mezzo completo è stato preparato aggiungendo al mezzo basale di coltura FBS e penicillina-streptomicina. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto circa l'80%, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state lavate tre volte con soluzione salina fosfato sterile (PBS). Le cellule sono state quindi digerite con soluzione di tripsina-edetato (EDTA) per circa 1–2 min. Dopo il distacco parziale delle cellule, è stato aggiunto mezzo completo per interrompere la digestione. La sospensione cellulare è stata centrifugata a 1.200 × g per 3 min. Dopo la rimozione del soprannatante, il pellet cellulare è stato risospeso in 1–2 mL di mezzo completo e seminato in nuove piastre di coltura in base alle esigenze sperimentali.
Saggio di vitalità cellulare CCK-8
Le cellule GES-1 in fase di crescita logaritmica sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 6 × 103 cellule/pozzetto e coltivate durante la notte per consentire l'adesione cellulare. Dopo l'adesione, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mM) per 24 h. Al gruppo di controllo è stata aggiunta la stessa concentrazione finale di veicolo. Dopo il trattamento, è stato aggiunto in ogni pozzetto la soluzione CCK-8 e le piastre sono state incubate a 37°C seguendo le istruzioni del kit. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale rispetto al gruppo di controllo. Sulla base dei risultati della curva concentrazione-risposta, è stato scelto un trattamento con clopidogrel 0,1 mM per 24 h per le successive analisi di apoptosi, ciclo cellulare, qPCR e Western blot.
Analisi di Citometria a Flusso
Le cellule GES-1 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e trattate con 0,1 mM di clopidogrel per 24 h dopo l'attaccamento cellulare. Al termine del trattamento, sono state raccolte sia le cellule in sospensione che quelle aderenti. Le cellule aderenti sono state digerite con tripsina senza EDTA, lavate due volte con PBS freddo e risospese nel binding buffer. La colorazione delle cellule è stata eseguita utilizzando un Kit per l'apoptosi Annexin V-FITC/PI secondo le istruzioni del produttore. Dopo incubazione a temperatura ambiente al buio, le cellule apoptotiche sono state rilevate mediante citometria a flusso utilizzando un citometro RaiseCyte 2L6C. I dati sono stati acquisiti con il software RaiseFlower e analizzati con il software FlowJo (versione 10.8.1). Le popolazioni cellulari apoptotiche precoci, apoptotiche tardive e l'apoptosi totale sono state quantificate utilizzando il software FlowJo.
Analisi citofluorimetrica della distribuzione del ciclo cellulare
Le cellule GES-1 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti e trattate con clopidogrel 0,1 mM per 24 h. Dopo il trattamento, le cellule sono state raccolte, lavate con PBS e fissate in etanolo al 70% preraffreddato a 4°C. Le cellule fissate sono state quindi lavate per rimuovere l'etanolo residuo e incubate con soluzione di colorazione di RNAse A e ioduro di propidio al buio, seguendo le istruzioni del produttore. La distribuzione del ciclo cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso. I dati sono stati acquisiti utilizzando il software di acquisizione e analizzati con il software FlowJo. Le distribuzioni del ciclo cellulare sono state adattate utilizzando il modello di Watson e sono state calcolate le percentuali di cellule nelle fasi G0/G1, S e G2/M.
PCR Quantitativa in Tempo Reale (qPCR)
L'RNA totale è stato estratto da cellule GES-1 e campioni di tessuto gastrico di ratto utilizzando un kit di estrazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Per i campioni di tessuto, i tessuti della mucosa gastrica sono stati raccolti rapidamente, omogeneizzati in condizioni di bassa temperatura e sottoposti all'estrazione dell'RNA. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate misurando l'assorbanza a 260 e 280 nm. Quantità uguali di RNA sono state retrotrascritte in DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit di retrotrascrizione con rimozione del DNA genomico. È stata eseguita una PCR quantitativa in tempo reale utilizzando una miscela master per PCR a base di SYBR Green. Ogni reazione è stata effettuata in un volume totale di 20 µL contenente 10 µL di miscela master 2×, 1 µL di cDNA, 0,4 µL di primer diretto, 0,4 µL di primer inverso e 8,2 µL di acqua deionizzata priva di RNasi (ddH₂O). Le condizioni del termociclatore sono state le seguenti: denaturazione iniziale a 95°C per 10 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95°C per 10 s, appaiamento a 60°C per 30 s ed estensione a 72°C per 30 s. Sono stati determinati i livelli di espressione di CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax. Il gene GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento interno. L'espressione genica relativa è stata calcolata con il metodo 2−ΔΔCt. Le sequenze dei primer sono elencate nella Tabella Supplementare 1.
Western Blot
Le proteine totali sono state estratte da cellule GES-1 e da campioni di tessuto gastrico di ratto. Per i campioni cellulari, le cellule GES-1 trattate sono state lavate con PBS freddo e lisate utilizzando un buffer di lisi RIPA (radioimmunoprecipitation assay) contenente un inibitore delle proteasi. Per i campioni di tessuto, i tessuti della mucosa gastrica sono stati omogeneizzati nel buffer RIPA in condizioni di bassa temperatura e successivamente centrifugati per raccogliere il sopranatante. Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante un saggio proteico BCA. Un totale di 20 µg di proteina per corsia è stato separato mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE) e trasferito su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF). Dopo il blocco con albumina sierica bovina (BSA), le membrane sono state incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari contro CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) e β-actina (1:5000). Dopo i lavaggi, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano (1:10000). Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un reagente di chemiluminescenza migliorata e acquisite con un sistema di imaging chemiluminescente. Le intensità delle bande sono state quantificate mediante software di analisi delle immagini e normalizzate rispetto a β-actina.
Valutazione istopatologica
Campioni di tessuto gastrico sono stati prelevati da ratti Sprague–Dawley dopo il trattamento con clopidogrel e fissati in formalina neutra tamponata al 10%. I campioni sono stati disidratati, chiarificati, inclusi in paraffina e sezionati con uno spessore di 4 µm. Le sezioni in paraffina sono state colorate con ematossilina ed eosina. I cambiamenti istopatologici sono stati valutati qualitativamente al microscopio ottico in base alla morfologia della mucosa, all'integrità epiteliale, all'edema e all'infiltrazione di cellule infiammatorie. Sono state acquisite immagini rappresentative. Non è stato applicato alcun sistema di punteggio istologico.
Immunoeistochimica
Le sezioni di tessuto gastrico in paraffina sono state disparaffinate in xilene e reidratate mediante una serie alcolica a concentrazione decrescente. Il recupero dell'antigene indotto dal calore è stato eseguito in tampone citrato. L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti e il legame non specifico è stato bloccato con siero di capra normale per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono state quindi incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari contro CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax. Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario corrispondente coniugato alla perossidasi di rafano. I segnali immunoreattivi sono stati visualizzati utilizzando una soluzione cromogenica DAB, seguita da una controstain con ematossilina. Le sezioni sono state disidratate, chiarificate, montate ed esaminate al microscopio ottico. Sono state acquisite immagini rappresentative e l'area di colorazione positiva è stata quantificata mediante software di analisi delle immagini.
Colorazione mediante immunofluorescenza
Le sezioni di tessuto gastrico in paraffina sono state disparaffinate, reidratate e sottoposte a recupero dell'antigene indotto da calore in tampone citrato. Dopo il blocco con siero di capra normale per 30 minuti, le sezioni sono state incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari contro CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) e Bax (1:200). Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate con gli anticorpi secondari fluorescenti corrispondenti (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio e quindi controstainate con DAPI. Le immagini sono state acquisite mediante microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di ×200. Sono stati analizzati tre campi scelti casualmente e non sovrapposti per ogni animale utilizzando il software Image-Pro Plus 6.0, e l'intensità della fluorescenza è stata espressa come IOD/Area. Nell'analisi sono stati inclusi tre animali per gruppo.
Saggio immunoenzimatico (ELISA)
I campioni di sangue sono stati prelevati da ratti Sprague–Dawley dopo il trattamento e lasciati coagulare a temperatura ambiente. Il siero è stato separato mediante centrifugazione e conservato a −80°C fino all'analisi. I livelli sierici di IL-1β, IL-6 e TNF-α sono stati misurati utilizzando kit ELISA seguendo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata misurata con un lettore di microtiterplate e le concentrazioni delle citochine sono state calcolate in base alle curve standard.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando un software di analisi statistica. I dati sono espressi come media ± DS. La normalità e l'omogeneità della varianza sono state valutate rispettivamente mediante il test di Shapiro–Wilk e il test di Levene. Il confronto tra due gruppi è stato effettuato utilizzando il test t di Student. I confronti tra più gruppi sono stati effettuati mediante analisi della varianza ad un solo fattore (ANOVA), seguita dal test post hoc di Dunnett. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti gli esperimenti sulle cellule sono stati eseguiti con almeno tre replicati biologici indipendenti.
Risultati
Il clopidogrel riduce la vitalità delle cellule GES-1 e aumenta l'apoptosi In Vitro
Abbiamo innanzitutto indagato se il clopidogrel influisca sulla vitalità cellulare e sull'apoptosi delle cellule GES-1. Saggi CCK-8 hanno mostrato che il trattamento con clopidogrel riduceva significativamente la vitalità delle cellule GES-1 (Figura 1A,B), indicando una riduzione della vitalità cellulare. Sulla base della riduzione complessiva della vitalità cellulare nell'intervallo di concentrazioni testato, è stato scelto un trattamento con 0,1 mM di clopidogrel per 24 h per tutti i successivi esperimenti cellulari. Successivamente è stata eseguita la citometria a flusso per analizzare l'apoptosi e la distribuzione nel ciclo cellulare (Figura 1C–F). L'analisi citometrica ha mostrato un aumento della proporzione di cellule nella fase S, accompagnato da una riduzione della popolazione G0/G1 e da nessun evidente aumento della popolazione G2/M, indicando un accumulo nella fase S piuttosto che un arresto nella fase G2/M. I risultati hanno dimostrato che il clopidogrel aumentava significativamente l'apoptosi e alterava la distribuzione nel ciclo cellulare nelle cellule GES-1 rispetto al gruppo di controllo. Nel complesso, questi risultati indicano che il clopidogrel riduce la vitalità delle cellule GES-1 ed è associato a un aumento dell'apoptosi e a modifiche nella progressione del ciclo cellulare. Questi dati dimostrano risposte citotossiche in seguito a esposizione diretta al composto parentale clopidogrel nelle condizioni sperimentali selezionate. Tuttavia, non dimostrano che effetti comparabili si verifichino a livelli di esposizione clinicamente rilevanti o che le risposte osservate siano mediate dal metabolita attivo del clopidogrel.
Figura 1. Il clopidogrel riduce la vitalità cellulare delle cellule GES-1 e aumenta l'apoptosi. (A) La vitalità cellulare della linea cellulare epiteliale gastrica umana GES-1 è stata valutata mediante saggio CCK-8 dopo trattamento con concentrazioni crescenti di clopidogrel (0–1,0 mM) per 24 h. (B) Confronto quantitativo della vitalità cellulare tra il gruppo di controllo e il gruppo trattato con clopidogrel 0,1 mM per 24 h. (C) Profili rappresentativi del ciclo cellulare analizzati mediante citometria a flusso, analizzati utilizzando il modello di Watson. (D) Quantificazione delle percentuali di cellule nelle fasi G0/G1, S e G2/M. Il trattamento con clopidogrel ha aumentato la popolazione in fase S senza un evidente incremento della popolazione in fase G2/M. (E) Diagrammi a dispersione rappresentativi della citometria a flusso per l'apoptosi dopo colorazione con Annexina V-isotiocianato di fluoresceina (FITC) e ioduro di propidio (PI). (F) Quantificazione della popolazione totale di cellule apoptotiche. Tutti gli esperimenti cellulari sono stati eseguiti con tre repliche biologiche indipendenti (n = 3). I dati sono espressi come media ± deviazione standard (DS). La significatività statistica è stata determinata mediante confronto con il gruppo di controllo. ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il danno gastrico indotto da clopidogrel è associato a infiammazione sistemica
I ratti Sprague–Dawley sono stati suddivisi casualmente in due gruppi (n = 6 per gruppo): un gruppo di controllo e un gruppo trattato con clopidogrel che ha ricevuto una somministrazione giornaliera per gavaggio. La dose di clopidogrel e il regime di trattamento di 3 giorni sono stati scelti in base a un modello di ratto precedentemente descritto di danno gastrico indotto da clopidogrel16. Dopo 3 giorni, i tessuti gastrici sono stati raccolti per la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E). L'esame istopatologico ha rivelato erosioni della mucosa gastrica, edema e infiltrazione di cellule infiammatorie nel gruppo trattato con clopidogrel rispetto al gruppo di controllo (Figura 2A). I livelli sierici delle citochine infiammatorie sono stati misurati mediante ELISA. Il gruppo trattato con clopidogrel ha mostrato livelli sierici significativamente più elevati di interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) rispetto al gruppo di controllo (Figura 2B–D). Questi risultati indicano che il trattamento con clopidogrel è associato a lesioni della mucosa gastrica e a un aumento delle risposte infiammatorie sistemiche15,16.
Figura 2. Il clopidogrel induce lesioni della mucosa gastrica e aumenta i livelli circolanti di citochine infiammatorie nei ratti. (A) Sezioni rappresentative di mucosa gastrica colorate con ematossilina ed eosina (H&E) prelevate da ratti Sprague–Dawley di controllo e trattati con clopidogrel. L’esame istologico mostra un’architettura della mucosa gastrica preservata nel gruppo di controllo e alterazioni morfologiche nel gruppo trattato con clopidogrel. Le frecce gialle indicano le cellule epiteliali della mucosa gastrica, le frecce rosse indicano congestione focale all’interno dello strato mucoso e le frecce nere indicano un lieve infiltrato di cellule infiammatorie. Ingrandimento originale, ×200; barra della scala = 100 µm. n = 6 animali per gruppo. (B–D) Le concentrazioni sieriche di interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) sono state misurate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). I dati sono espressi come media ± DS; n = 6 animali per gruppo. ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Clopidogrel modifica i marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nella mucosa gastrica del ratto
Per indagare le modifiche molecolari associate al danno gastrico indotto da clopidogrel, è stata eseguita una colorazione immunoistochimica su sezioni di tessuto gastrico. Le immagini rappresentative hanno mostrato una colorazione più intensa per CHOP, ATF5 e Bax nel gruppo trattato con clopidogrel rispetto al gruppo di controllo, mentre la colorazione per Bcl-2 è risultata più debole (Figura 3A). L'analisi quantitativa del rapporto IOD/area ha dimostrato un aumento significativo della colorazione per CHOP, ATF5 e Bax dopo il trattamento con clopidogrel (Figura 3B,C,E). La colorazione per Bcl-2 ha mostrato una tendenza alla diminuzione, sebbene la differenza non abbia raggiunto la significatività statistica (Figura 3D). Questi risultati indicano che il trattamento con clopidogrel è associato a un'espressione alterata di proteine legate allo stress e all'apoptosi nella mucosa gastrica del ratto. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato segnali più intensi per CHOP e ATF5 nel tessuto della mucosa gastrica del gruppo trattato con clopidogrel. L'analisi quantitativa ha confermato aumenti significativi per CHOP (Figure 4A e 5A) e ATF5 (Figure 4B e 5B), mentre Bcl-2 (Figure 4C e 5C) e Bax (Figure 4D e 5D) hanno mostrato rispettivamente una tendenza alla diminuzione e all'aumento, senza raggiungere la significatività statistica. Nel complesso, questi risultati indicano che il trattamento con clopidogrel è associato a un'espressione alterata di marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nella mucosa gastrica del ratto.
Figura 3. Rilevamento immunohistochimico di proteine associate allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nel tessuto gastrico. (A) Immagini rappresentative della colorazione immunohistochimica della proteina omologa a C/EBP (CHOP), del fattore di trascrizione attivante 5 (ATF5), della linfoma B-cellula 2 (Bcl-2) e della proteina associata a Bcl-2 X (Bax) nel tessuto della mucosa gastrica di ratti Sprague–Dawley del gruppo di controllo e trattati con clopidogrel. La colorazione bruna indica immunoreattività positiva, mentre i nuclei sono stati contrastati con ematossilina. Le immagini mostrate sono rappresentative di tutti i campioni analizzati, con tre animali inclusi in ciascun gruppo. Ingrandimento originale, ×200; barra della scala = 100 µm. (B–E) Analisi quantitativa della densità ottica integrata per unità di area (IOD/Area) rispettivamente per CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax. I dati sono espressi come media ± DS. *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Rilevamento mediante immunofluorescenza di proteine associate allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nei tessuti gastrici. Immagini rappresentative di immunofluorescenza che mostrano la localizzazione della proteina omologa a C/EBP (CHOP), del fattore di trascrizione attivante 5 (ATF5), della linfoma cellulare B-2 (Bcl-2) e della proteina associata a Bcl-2 X (Bax) nel tessuto della mucosa gastrica di ratti Sprague–Dawley di controllo e trattati con clopidogrel. I nuclei sono stati contrastati con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (in blu) e la colorazione positiva mediante immunofluorescenza è mostrata in rosso. Le immagini sovrapposte sono riportate nella colonna di destra. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Ingrandimento originale, ×200; barra della scala = 100 µm. Le immagini mostrate sono rappresentative di tutti i campioni analizzati, con n = 3 animali per gruppo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Analisi quantitativa dell'immunofluorescenza per le proteine associate allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nei tessuti gastrici. (A–D) Quantificazione della densità ottica integrata per unità di area (IOD/Area) della proteina omologa a C/EBP (CHOP), del fattore di trascrizione attivante 5 (ATF5), della linfoma B-cellula 2 (Bcl-2) e della proteina associata a Bcl-2 X (Bax) nel tessuto della mucosa gastrica di ratti Sprague–Dawley di controllo e trattati con clopidogrel. Per ogni animale, sono stati analizzati tre campi microscopici scelti casualmente e non sovrapposti per sezione di tessuto mediante software di analisi delle immagini, e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi statistica. I dati sono espressi come media ± DS; n = 3 animali per gruppo. *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Clopidogrel modula l'espressione genica e proteica legata allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nelle cellule GES-1 e nel tessuto gastrico di ratto
Studi precedenti hanno indicato che lo stress del reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nelle risposte cellulari allo stress e nell'apoptosi17,18. Per valutare le variazioni dei marcatori correlati allo stress del reticolo endoplasmatico in seguito al trattamento con clopidogrel, è stata esaminata l'espressione di CHOP e ATF5 in cellule GES-1. La qRT-PCR ha mostrato un aumento dell'espressione mRNA di CHOP e ATF5 dopo il trattamento con clopidogrel. L'analisi mediante Western blot ha ulteriormente confermato un aumento dell'espressione proteica di CHOP e ATF5 (Figura 6A–E). Successivamente è stata valutata l'espressione delle proteine correlate all'apoptosi in cellule GES-1 e nel tessuto gastrico di ratto. Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con clopidogrel ha aumentato l'espressione di Bax e ridotto quella di Bcl-2, determinando un incremento del rapporto Bax/Bcl-2 (Figura 6A–J). Questi profili di espressione sono stati osservati in modo coerente sia a livello di mRNA che proteico in cellule GES-1 e nel tessuto gastrico di ratto. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il trattamento con clopidogrel è associato a modifiche nell'espressione dei marcatori correlati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi in entrambi i modelli sperimentali.
Figura 6. Espressione di marcatori associati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi in cellule GES-1 e tessuto gastrico di ratto dopo trattamento con clopidogrel. (A–D) Espressione relativa dell'RNA messaggero (mRNA) della proteina omologa a C/EBP (CHOP), del fattore di trascrizione attivante 5 (ATF5), della linfoma B-cellula 2 (Bcl-2) e della proteina associata a Bcl-2 X (Bax) nella linea cellulare epiteliale gastrica umana GES-1, determinata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). (E) Immagini rappresentative di Western blot con relativa quantificazione densitometrica dell'espressione proteica di CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax in cellule GES-1. I livelli di espressione proteica sono stati normalizzati rispetto a β-actina. Gli esperimenti cellulari sono stati eseguiti con tre repliche biologiche indipendenti (n = 3). (F–I) Espressione relativa dell'mRNA di CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax nel tessuto gastrico di ratto determinata mediante qRT-PCR. (J) Immagini rappresentative di Western blot con relativa quantificazione densitometrica dell'espressione proteica di CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax nel tessuto gastrico di ratto. I livelli di espressione proteica sono stati normalizzati rispetto a β-actina. Negli esperimenti su tessuto sono stati utilizzati n = 3 animali per gruppo. I dati sono espressi come media ± DS. La significatività statistica è stata determinata mediante confronto con il gruppo di controllo. *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Nel complesso, i risultati dimostrano che il trattamento con clopidogrel ha ridotto la vitalità delle cellule GES-1, aumentato l'apoptosi, alterato l'espressione dei marcatori correlati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi ed è stato associato a lesioni della mucosa gastrica accompagnate da livelli aumentati di citochine infiammatorie circolanti nei ratti. Questi risultati confermano l'ipotesi dello studio secondo cui il trattamento con clopidogrel è associato a lesioni della mucosa gastrica e a modifiche contemporanee dei marcatori correlati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi.
Disponibilità dei dati:
Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e nei materiali supplementari. Le sequenze dei primer utilizzate per la RT-PCR sono fornite nella Tabella Supplementare 1. I dati grezzi a supporto di tutte le figure e dei singoli pannelli delle figure, inclusi i set di dati sperimentali originali e i file sorgente, sono forniti nell'archivio supplementare Dati Grezzi allegato (file compresso).
Tabella supplementare 1. Sequenze dei primer utilizzate per l'analisi di RT-PCR. Nell'orientamento 5′–3′ sono elencate le sequenze dei primer diretti (F) e inversi (R) utilizzate in questo studio per l'analisi di RT-PCR di GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Il clopidogrel è ampiamente utilizzato per la prevenzione e il trattamento delle malattie cardiovascolari; tuttavia, il suo utilizzo clinico è associato a rischi di sanguinamento e complicanze gastrointestinali, inclusi ulcere peptiche, emorragie e perforazioni19. Pertanto, comprendere i cambiamenti molecolari associati al danno gastrico indotto dal clopidogrel è importante per migliorare la prevenzione e la gestione di questi effetti avversi. Nello studio attuale, abbiamo esaminato gli effetti del clopidogrel sulle cellule epiteliali gastriche e sul tessuto gastrico di ratto, osservando modifiche nella vitalità cellulare, apoptosi, risposte infiammatorie e nell'espressione di marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e all'apoptosi. Questi risultati indicano che il danno alla mucosa gastrica indotto dal clopidogrel è associato a alterazioni nell'espressione di marcatori correlati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi. Tuttavia, poiché non sono stati eseguiti esperimenti farmacologici di recupero né esperimenti genetici di perdita di funzione, questi risultati non dimostrano una relazione causale tra lo stress del reticolo endoplasmatico e l'apoptosi.
Studi precedenti hanno indicato che il clopidogrel potrebbe compromettere la riparazione della mucosa gastrica e ritardare la guarigione delle ulcere gastriche20. Nel presente studio, i saggi CCK-8 hanno mostrato che il clopidogrel riduce la vitalità delle cellule GES-1, mentre la citometria a flusso ha evidenziato un aumento dell'apoptosi e alterazioni nel ciclo cellulare (Figura 1). Questi risultati sono coerenti con quanto precedentemente riportato riguardo all'apoptosi indotta dal clopidogrel nelle cellule epiteliali gastriche21. Tali osservazioni suggeriscono che il trattamento con clopidogrel è associato a una ridotta vitalità delle cellule epiteliali gastriche e a un aumento dell'apoptosi, che potrebbero contribuire al danno della mucosa gastrica11. Nel modello ratto, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha evidenziato un danno della mucosa gastrica dopo il trattamento con clopidogrel (Figura 2A). I livelli sierici di IL-1β, IL-6 e TNF-α sono risultati anch'essi significativamente aumentati (Figura 2B–D), indicando una risposta infiammatoria associata al danno della mucosa gastrica22. Inoltre, analisi immunohistochimiche e di immunofluorescenza hanno dimostrato un'espressione alterata di marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi nel tessuto gastrico dei ratti trattati con clopidogrel rispetto al gruppo di controllo (Figura 3, Figura 4, Figura 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax sono regolatori importanti delle risposte allo stress cellulare e dell'apoptosi23,24,25,26. In questo studio, il trattamento con clopidogrel è stato associato a un aumento dell'espressione di CHOP e ATF5 e a un'espressione alterata di Bax e Bcl-2 sia nelle cellule GES-1 che nel tessuto gastrico di ratto (Figura 6). Questi risultati indicano alterazioni contemporanee di marcatori legati allo stress e all'apoptosi. Tuttavia, lo studio attuale ha valutato soltanto i cambiamenti nell'espressione, senza determinare se queste molecole mediano direttamente il danno alla mucosa gastrica indotto dal clopidogrel. Analogamente, sebbene sia stato osservato un aumento del rapporto Bax/Bcl-2, lo studio non ha dimostrato direttamente l'attivazione della via mitocondriale dell'apoptosi. Pertanto, questi risultati devono essere interpretati come associazioni piuttosto che come evidenza di un meccanismo di segnalazione causale.
Lo studio attuale combina un modello in vivo su ratto con esperimenti esplorativi ad esposizione diretta in cellule GES-1 per valutare i cambiamenti morfologici e molecolari associati al trattamento con clopidogrel. Il modello in vivo fornisce l'evidenza principale di danno alla mucosa gastrica, mentre gli esperimenti su GES-1 offrono dati di supporto riguardo le risposte cellulari dopo l'esposizione diretta al composto parentale. La combinazione di analisi istopatologica, misurazione di citochine infiammatorie, immunohistochimica, immunofluorescenza, qRT-PCR e Western blotting consente una valutazione completa dei cambiamenti morfologici e molecolari associati al danno gastrico. Questo approccio sperimentale potrebbe risultare utile per indagare gli effetti gastrointestinali degli agenti antiaggreganti e per valutare possibili interventi protettivi in studi futuri.
Vanno riconosciuti diversi limiti. Il clopidogrel è un profarmaco che richiede un'attivazione metabolica epatica, mentre l'esposizione diretta delle cellule GES-1 al composto parentale non riproduce questo processo né riflette pienamente la farmacocinetica clinica. Inoltre, le concentrazioni relativamente elevate utilizzate in vitro potrebbero aver causato citotossicità aspecifica. Pertanto, gli esperimenti condotti sulle cellule GES-1 devono essere considerati come evidenze esplorative delle risposte cellulari in condizioni di esposizione diretta. Il saggio CCK-8 non ha incluso un controllo positivo per la ridotta vitalità cellulare, limitando la verifica indipendente delle prestazioni del saggio. I meccanismi a monte responsabili dei cambiamenti osservati correlati allo stress del reticolo endoplasmatico non sono stati indagati, e non sono stati eseguiti esperimenti di inibizione farmacologica, silenziamento genico o knockout genico per determinare se lo stress del reticolo endoplasmatico regola direttamente l'equilibrio Bax/Bcl-2 e l'apoptosi. Studi futuri dovrebbero confrontare il composto parentale con il suo metabolita attivo, includere un sistema adeguato di attivazione metabolica ed effettuare esperimenti di intervento funzionale per chiarire tali relazioni. Inoltre, nel saggio Annexin V-FITC/PI non è stato incluso un controllo positivo ben stabilito per l'induzione dell'apoptosi. Pertanto, sebbene il trattamento con clopidogrel sia stato associato a un aumento della popolazione di cellule positive all'Annexin V rispetto al controllo con veicolo, le prestazioni tecniche del saggio di apoptosi non sono state verificate indipendentemente mediante una condizione di controllo positivo. Studi futuri dovrebbero includere un inductor di apoptosi, come la staurosporina, nello stesso lotto sperimentale.
In conclusione, il trattamento orale con clopidogrel ha causato lesioni alla mucosa gastrica nei ratti ed è stato accompagnato da modifiche nei marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi. L'esposizione diretta delle cellule GES-1 al composto parentale clopidogrel ha inoltre ridotto la vitalità cellulare e alterato i marcatori molecolari correlati nelle condizioni sperimentali. Tuttavia, poiché il modello cellulare non riproduce l'attivazione epatica e sono state utilizzate concentrazioni relativamente elevate, i risultati ottenuti in vitro non possono essere direttamente estesi all'esposizione clinica, e non può essere esclusa una citotossicità aspecifica. Nel complesso, i risultati indicano che la lesione della mucosa gastrica indotta dal clopidogrel è associata a alterazioni nell'espressione dei marcatori legati allo stress del reticolo endoplasmatico e all'apoptosi, anche se ulteriori studi meccanicistici sono necessari per stabilire relazioni causali.
Dichiarazioni
Conflitto di interessi:
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro descritto in questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto „Ricerca fondamentale sul percorso di segnalazione CHOP/ATF5/Bcl-2 nell'apoptosi delle cellule epiteliali della mucosa gastrica indotta da clopidogrel” (Numero progetto 2023BWKY009).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexina V-FITC/PI | Elabscience | E-CK-A211 | Kit per il rilevamento dell'apoptosi |
| Anticorpo anti-ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | Anticorpo primario |
| Kit per saggio proteine BCA | Solarbio | PC0020 | Saggio per concentrazione proteica |
| Anticorpo anti-Bax | Proteintech | 50599-1-AP | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | Anticorpo primario |
| β-actina, anticorpo | Proteintech | 66009-1-Ig | Anticorpo primario |
| Buffer bloccante | Beyotime | P0252 | Soluzione per bloccaggio nel Western blot |
| Kit per conteggio cellulare CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | Saggio di vitalità cellulare |
| Kit per sintesi di cDNA | TransGen Biotech | AU341 | Kit per sintesi del primo filamento di cDNA con rimozione del DNA genomico |
| Kit di rilevamento del ciclo cellulare | Lianke Biotechnology | CCS012 | Kit per analisi del ciclo cellulare |
| Anticorpo anti-CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | Anticorpo primario |
| Clopidogrel idrogenosolfato (purezza ≥99%) | Macklin | C874834 | Farmaco sperimentale |
| Kit cromogeno DAB | Beyotime | P0201M | Substrato per immunohistochimica |
| Dietilsolfossido (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Solvente |
| Reagente di chemiluminescenza migliorata (ECL) | Meilunbio | MA0186 | Substrato chemiluminescente |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10099-141 | Integratore per colture cellulari |
| Linea cellulare epiteliale gastrica umana GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | Linea cellulare epiteliale gastrica umana |
| Kit di colorazione ematossilina ed eosina (H&E) | Beyotime | C0105S | Colorazione istologica |
| Anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Anticorpo secondario |
| Soluzione di perossido di idrogeno | Absin | ABS9333-100mL | Reagente per bloccaggio della perossidasi endogena |
| Kit ELISA per IL-1β | MEIMIAN | MM-0047R2 | Saggio citochina sierica |
| Kit ELISA per IL-6 | MEIMIAN | MM-0190R2 | Saggio citochina sierica |
| Lettore di micropiastre | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | Misurazione dell'assorbanza |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Solarbio | P1400 | Soluzione antibiotica |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | PBS 1× |
| Membrana in difluoruro di polivinilidene (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | Membrana per Western blot |
| Diluente per anticorpi primari | Beyotime | P0023A | Diluente per anticorpi |
| Marcatore proteico per peso molecolare | Yeasen | WJ103 | Scala proteica precolorata |
| Master mix per PCR quantitativa in tempo reale (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | Reagente per qPCR |
| Buffer di lisi RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay) | Solarbio | R0010 | Buffer per estrazione proteica |
| RNAasi A | Lianke Biotechnology | CCS012 | Reagente per analisi del ciclo cellulare |
| Mezzo RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | Mezzo basale per colture cellulari |
| Ratti Sprague-Dawley | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | Grado SPF |
| Kit ELISA per TNF-α | MEIMIAN | MM-0180R2 | Saggio citochina sierica |
| Kit per estrazione di RNA totale | TransGen Biotech | ER501-01 | Kit per estrazione di RNA |
| Soluzione tripsina-EDTA | Solarbio | T1300 | Reagente per dissociazione cellulare |
Riferimenti
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