Profilazione delle fibre elastiche nei tessuti polmonari utilizzando analisi di imaging quantitative

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che dettaglia la preparazione del tessuto per la visualizzazione delle fibre elastiche e il profiling quantitativo nel tessuto polmonare murino. Questo metodo consente una valutazione robusta dell'architettura tissutale, dell'organizzazione spaziale delle fibre e della rimodellazione della matrice extracellulare in condizioni fisiologiche e patologiche.

Abstract

Il rimodellamento della matrice extracellulare polmonare (ECM) è una caratteristica chiave delle lesioni polmonari e delle malattie. Le fibre elastiche sono un componente centrale dell'ECM polmonare, fornendo resilienza e rinculo necessari per la normale funzione respiratoria, e la loro interruzione contribuisce a compromessi della meccanica tissutale. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro robusto e riproducibile per la preparazione e l'analisi del tessuto polmonare murino, con un focus sulla visualizzazione e sul profiling quantitativo delle fibre elastiche. Descrive metodi ottimizzati di elaborazione dei tessuti e colorazione istologica per preservare e rilevare le strutture dell'elastina. Inoltre, il protocollo dettaglia una pipeline di analisi delle immagini che consente la valutazione quantitativa dell'abbondanza, organizzazione e distribuzione spaziale delle fibre elastiche all'interno del polmone. Il flusso di lavoro incorpora inoltre la stima del vettore di colorazione in QuPath, la deconvoluzione del colore in Fiji/ImageJ e l'analisi delle immagini basata su TWOMBLI per consentire una valutazione quantitativa dell'abbondanza di fibre elastiche, della ramificazione e della complessità della rete. Sono incluse strategie per l'acquisizione dell'immagine, la selezione della regione di interesse, l'ottimizzazione dei parametri e il controllo qualità per garantire la riproducibilità e minimizzare il bias dipendente dall'utente. Utilizzando questo flusso di lavoro, abbiamo identificato con successo alterazioni nell'organizzazione delle fibre elastiche e nell'architettura della rete nei polmoni dei topi obesi, dimostrandone l'applicabilità nel rilevare il rimodellamento ECM associato a malattie. Insieme, questi approcci forniscono un quadro completo per indagare il rimodellamento delle fibre elastiche e il suo contributo all'architettura tissutale in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali guidati dai fibroblasti e supporta intuizioni meccanicistiche sulle alterazioni ECM sottostanti alle malattie polmonari.

Introduzione

Le fibre elastiche sono componenti essenziali della matrice extracellulare polmonare (ECM), composta principalmente da elastina e da proteine microfibrillari associate che si assemblano in reti altamente organizzate^{e resilienti.} Nel polmone, le fibre elastiche sono disposte lungo i setti alveolari e le strutture peribronchiali, fornendo l'elasticità e il rinculo necessari per la normale meccanica^{respiratoria 1,2}. Essendo uno dei componenti strutturali ECM più abbondanti nei tessuti come polmone, aorta e utero, la sua integrità è fondamentale per mantenere la compliance^{tissutale 1,2}. La rottura dell'organizzazione delle fibre elastiche è stata osservata in una serie di malattie polmonari, tra cui fibrosi, enfisema e condizioni infiammatorie croniche, dove l'architettura alterata delle fibre contribuisce a una funzione polmonare compromessa e alle proprietà^{meccaniche 2,3}.

Il matrisoma polmonare è stato recentemente caratterizzato, rivelando proteine centrali ECM come collageni e laminine, insieme a componenti associati al matrisoma tra cui citochine, regolatori ECM e proteine affiliate all'ECM (ad esempio, liganti integrinari, galettine^)4,5. Oltre a fornire supporto strutturale, questi componenti regolano attivamente la funzione tissutale e formano nicchie specializzate che supportano cellule residenti e^{migratorie 6,7}. In particolare, studi recenti hanno evidenziato che condizioni metaboliche come l'obesità sono associate a significative alterazioni nell'organizzazione delle fibre elastiche, collegando la disregolazione metabolica sistemica a cambiamenti nell'architettura polmonare dell'ECM e nella funzione^{dei fibroblasti 3}. Questi risultati sottolineano l'importanza di comprendere il rimodellamento delle fibre elastiche come un processo dinamico e rilevante per la malattia.

La valutazione convenzionale delle fibre elastiche spesso si basa su una valutazione istologica qualitativa, sistemi di punteggio semi-quantitativi o misurazioni dell'abbondanza di elastina, che forniscono informazioni limitate sull'organizzazione delle fibre, la connettività e la complessità della^{rete 8,9}. Sebbene questi approcci siano utili per rilevare grossolane alterazioni nel contenuto di elastina, potrebbero non catturare cambiamenti architettonici sottili associati alla rimodellazione dei tessuti. Le analisi quantitative basate su immagini hanno il potenziale di superare queste limitazioni consentendo la caratterizzazione oggettiva e riproducibile delle reti di fibre elastiche e facilitando confronti tra condizioni sperimentali e studi. Per affrontare questo problema, il protocollo descritto qui consente un'analisi integrata dell'organizzazione della ECM polmonare con un focus specifico sull'architettura delle fibre elastiche. Oltre agli approcci consolidati per la caratterizzazione^{ECM 4,5}, questo flusso di lavoro incorpora la colorazione con Elastica e una pipeline di analisi^{a 10} immagini basata su TWOMBLI, ottimizzata per l'architettura del tessuto polmonare. Combinando la colorazione con Elastica con l'analisi quantitativa delle reti, questo flusso di lavoro va oltre la valutazione istologica convenzionale e consente una caratterizzazione dettagliata dell'abbondanza delle fibre, frammentazione, organizzazione spaziale e complessità strutturale. Il protocollo è particolarmente adatto per studi che indagano fibrosi, enfisema, rimodellamento polmonare associato all'obesità, malattie polmonari infiammatorie, invecchiamento e altre condizioni caratterizzate dal rimodellamento della matrice extracellulare nei polmoni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi descritti qui sono stati condotti in conformità con l'approvazione del Comitato di Etica Animale dello stato della Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOTA: Indossare l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (camice da laboratorio, guanti, protezione per gli occhi) durante tutta la procedura.

1. Campionamento e preparazione del tessuto polmonare murino

NOTA: I topi sono stati soppressi per overdose di isoflurano secondo le linee guida istituzionali e governative prima della raccolta dei tessuti.

1. Apri con cura la cavità toracica con un'incisione mediana, poi taglia il diaframma lungo il suo attacco ed esponi delicatamente i polmoni.
2. Rimuovere l'intero polmone estinzione insieme dei lobi destro e sinistro, facendo attenzione a mantenere tutti i lobi intatti.
3. Inserire i lobi polmonari singolarmente in un tubo da 5 mL contenente 2 mL di formalina tamponata al 10% di neutro e incubare per 15–20 ore a 4 °C.
   NOTA: La fissazione preserva l'architettura tissutale per successive analisi istologiche e delle fibre elastiche. Poiché l'obiettivo principale di questo flusso di lavoro era la visualizzazione e la valutazione quantitativa dell'organizzazione delle fibre elastiche piuttosto che le analisi morfometriche alveolari, i polmoni non venivano fissati con l'inflazione prima del processamento tissutale.
   ATTENZIONE: La formalina tamponata neutra contiene formaldeide, che è tossica, cancerogena e può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Maneggiare la formalina in una cappa chimica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
4. Immergere il tessuto polmonare fisso nella paraffina utilizzando un protocollo di immersione^{istologica standard 11}.
   NOTA: Assicurarsi una completa disidratazione e infiltrazione di paraffina per mantenere la morfologia tissutale in vista della colorazione successiva. Per minimizzare la variabilità tra i campioni e garantire la compatibilità tra le condizioni sperimentali, si utilizzano sempre gli stessi lobi polmonari per ogni analisi. Si consiglia di usare il lobo sinistro per l'istologia.
5. Tagliare il tessuto polmonare FFPE in sezioni spesse 5–7 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetri di vetro standard. Cuocere le lamine a 60 °C per 1 ora prima di procedere con le applicazioni a valle. Le vetrine possono essere conservate a RT in un ambiente privo di polvere per diverse settimane oppure a 4 °C per una conservazione a lungo termine.
   NOTA: Evitare l'esposizione all'umidità durante la conservazione, poiché l'umidità può causare ossidazione della paraffina e compromettere la qualità delle macchie. Conserva i vetri in una scatola di plastica sigillata con il disidratante se è necessario un conservamento a lungo termine.
   Punto di pausa: conservare le vetrine a RT o 4 °C fino alla macchia.

2. Colorazione delle fibre elastiche

1. Eseguire la colorazione con Elastica (resorcina-fucsina) su sezioni di tessuto polmonare incorporate in paraffina a 5–7 μm per visualizzare le fibre elastiche all'interno delle strutture alveolari e vascolari.
   NOTA: Tingi solo quante vetrine possibili sono manipolate simultaneamente per garantire un'intensità e una riproducibilità costanti tra i campioni.
   1. La deparaffinata immerge le vetrine in xilene (isomeri misti) due volte per 5 minuti ciascuna.
      ATTENZIONE: Lo xilene è tossico e infiammabile. Maneggiare in una cappa chimica e indossare l'attrezzatura protettiva appropriata.
   2. Reidratare i vetrini in serie discendente di etanolo fino all'80% di etanolo.
      1. Incubare il vetrino per 3 minuti a RT in una camera di colorazione riempita con etanolo al 100%.
      2. Trasferisci il vetrino in etanolo fresco al 100% e incuba 3 minuti a RT.
      3. Trasferisci il vetrino al 95% di etanolo e incuba per 3 minuti a RT.
      4. Trasferisci il vetrino all'80% di etanolo e incuba per 3 minuti a RT.
   3. Trasferire il vetrino in una nuova camera di colorazione contenente soluzione di Resorcina-Fucsina e incubare per 20–30 minuti a RT.
      NOTA: La soluzione di colorazione con resorcina-fucsina può essere usata più volte ed è stabile a RT.
      ATTENZIONE: La soluzione di colorazione con resorcina e fucsina contiene sostanze chimiche potenzialmente pericolose, inclusi acidi e coloranti concentrati, che possono causare irritazione della pelle e degli occhi. Maneggiare la soluzione in un'area ben ventilata o in una cappa e indossare le attrezzature di protezione individuale adeguate secondo le linee guida istituzionali di sicurezza.
   4. Metti il carrello in una camera di colorazione sotto acqua distillata corrente e lava per 1 minuto.
   5. Differenziare al 95–96% etanolo: 15–60 s, monitorare al microscopio.
      NOTA: Fermarsi quando le fibre elastiche rimangono di un viola-viola profondo e lo sfondo è adeguatamente ripulito. Le fibre elastiche macchiate appaiono di un viola scuro. Le fibre di collagene rimangono intatte e di solito appaiono pallide. La sovramacchia può aumentare lo sfondo; Regolare il tempo di incubazione in base allo spessore e alla fissazione del tessuto.
   6. Interrompere la differenziazione trasferendo immediatamente il vetrino in acqua bidistillata e risciacquando per 30 secondi. Opzionale: La controcolorazione può essere eseguita se necessario per una valutazione polmonare aggiuntiva, ma può ridurre l'efficienza della segmentazione delle fibre. Consigliamo di effettuare una colorazione H&E per valutare il polmone sui tagli adiacenti.
   7. Disidratare le vetrine in modo sequenziale con etanolo al 95% per 1–2 minuti, seguito da etanolo al 100% due volte per 1–2 minuti ciascuno per rimuovere l'acqua residua.
   8. Liberare le sezioni di xilene 2 volte per 3 minuti finché il tessuto non appare otticamente trasparente.
   9. Montare i coperchissi utilizzando una resina sintetica permanente compatibile con xilene e permettere alle slide di asciugare piano a RT.
      NOTA: La completa disidratazione e la pulizia sono essenziali per prevenire la torbidezza e garantire la conservazione a lungo termine delle sezioni colorate.
      Punto di pausa: conservare i vetrini montati con macchie a RT fino all'immagini.

3. Imaging delle fibre elastiche e analisi della rete

1. Acquisizione dell'immagine
   1. Acquisire immagini ad alta risoluzione in campo chiaro di sezioni di tessuto polmonare utilizzando uno scanner di vetrine con un obiettivo del 40×. Assicurati di esporre e bilanciare il bianco in modo coerente su tutti i campioni.
      NOTA: Le immagini sono state acquisite utilizzando impostazioni identiche dello scanner durante tutto lo studio, inclusi ingrandimento, risoluzione spaziale (0,25 μm/pixel), illuminazione ed esposizione.
   2. Disegna una regione di interesse (ROI) che copre l'intera sezione del tessuto polmonare per garantire una copertura completa durante la scansione.
   3. Definire un'area di riferimento di fondo senza tessuto per misurare e sottrarre l'intensità di fondo durante l'analisi dell'immagine.
   4. Utilizza il rilevamento automatico della messa a fuoco dello scanner per assegnare un numero ottimale di punti focali sul tessuto, garantendo nitidezza e qualità dell'immagine uniformi.
   5. Acquisire l'immagine utilizzando un'illuminazione e impostazioni di esposizione uniformi.
      NOTA: Se la messa a fuoco automatica fallisce in regioni dense o irregolari, si utilizza la regolazione manuale della messa a fuoco fine per assicurarsi che tutte le strutture tissutali, comprese le aree alveolari e vascolari, siano catturate con precisione.
2. Deconvoluzione dell'immagine: stima del vettore di colorazione in QuPath¹². I vettori di colorazione rappresentano i valori specifici di assorbanza RGB di ciascun colorante istologico, permettendo la separazione delle colorazioni sovrapposte durante la deconvoluzione del colore.
   NOTA: In questo protocollo, i vettori di colorazione sono stati definiti in QuPath, poiché vettori di colorazione predefiniti per la resorgina-fucisina non sono disponibili nelle Fiji.
   1. Apri l'immagine in QuPath e seleziona il tipo di immagine in campo chiaro.
      NOTA: Per minimizzare il bias, calcola i vettori di colorazione utilizzando immagini rappresentative dal dataset e applica gli stessi valori a tutte le immagini.
   2. Disegna una regione di interesse (ROI) che contiene prevalentemente fibre elastiche per definire la prima componente della colorazione.
   3. Nella scheda Immagine, naviga alle sezioni vettoriali Stain.
   4. Clicca su Stain 1, poi imposta il vettore di colorazione dal ROI per definire il vettore colore per le fibre elastiche (tipicamente viola-viola).
   5. Seleziona un ROI contenente tessuto non elastico (ad esempio, fondo o collagene) e clicca su colorazione 2, poi imposta il vettore di colorazione dal ROI per definire la componente di colore secondaria.
   6. QuPath calcola automaticamente la Tinta 3, corrispondente allo sfondo.
   7. Un esempio di vettori calcolati e applicati nelle Fiji: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Segnale non specifico R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Contesto R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      NOTA: Questi valori sono stati colorati solo per immagini colorate solo con resorcina-fucsina. Se è presente una controcolorazione, devono essere calcolati nuovi vettori di colorazione.
   8. Salvali come vettori di colorazione personalizzati e applicali per una deconvoluzione cromatica coerente su tutti i campioni.
      NOTA: Definire vettori di colorazione personalizzati da regioni rappresentative migliora la precisione della deconvoluzione del colore, in particolare per la colorazione con resorcina-fucsina, dove elastina e tonalità di sfondo possono variare tra i lotti.
3. Deconvoluzione del colore dell'immagine in Fiji ^13,14.
   1. Apri Fiji (ImageJ) e carica l'immagine del campo chiaro della sezione di tessuto colorato.
   2. Opzionale: Trasformare l'immagine in formato RGB (Immagine → Tipo → Colore RGB) solo se l'immagine non è già in RGB (ad esempio, immagini a 8 bit). Questo passaggio apre una nuova finestra dell'immagine; Salvali per preservare i dati grezzi originali.
   3. Esegui la deconvoluzione dei colori selezionando Image > Color > Color Deconvolution > User Values.
   4. Entra in scena il vettore di colorazione personalizzato precedentemente ottenuto da QuPath.
   5. Esegui il plugin per generare tre immagini in scala di grigi separate corrispondenti a fibre elastiche, tessuto escluso le fibre elastiche e sfondo.
   6. Usa le immagini direttamente per TWOMBLI senza preprocessing aggiuntivo. TWOMBLI richiede immagini nitide con sufficiente risoluzione; la levigatura (ad esempio, la sfocatura gaussiana) dovrebbe essere evitata per preservare i dettagli strutturali.
      NOTA: Assicurati che le regioni selezionate in QuPath per la stima vettoriale siano rappresentative della colorazione tipica, poiché questi vettori personalizzati saranno applicati uniformemente su tutte le immagini per un confronto coerente.
   7. Salva il canale elastico in fibra come file TIFF per la quantificazione e l'analisi a valle.
4. Selezione del ROI per l'analisi delle fibre
   1. Per ogni sezione polmonare, si selezionano cinque ROI quadrati non biaisati nella regione alveolare e cinque ROI nella regione peribronchiolare (100 μm x 100 μm ciascuna).
   2. Duplica ogni ROI sull'immagine raw (Immagine > Duplicata) per preservare i dati originali.
   3. Duplica gli stessi ROI nell'analisi delle fibre elastiche deconvolute.
   4. Salva tutti i ROI duplicati come singoli file TIFF per l'analisi a valle.
      NOTA: Le regioni contenenti pieghe tissutali, artefatti sezionanti, lacerazioni, grandi vasi sanguigni o architettura alveolare mal conservata sono state escluse dall'analisi. Solo i ROI in fibra elastica deconvoluti venivano utilizzati come input per l'analisi TWOMBLI, mentre i duplicati di immagini grezze corrispondenti venivano mantenuti come file di riferimento per il controllo qualità e l'ispezione visiva. Le regioni di interesse (ROI) dovrebbero essere selezionate tramite campionamento casuale sistematico per garantire una rappresentazione imparziale del tessuto. Per minimizzare ulteriormente il bias dell'operatore, uno script automatico di selezione del ROI compatibile con QuPath è fornito nel File Supplementare 1 e nel File Supplementare 2, e la sua implementazione è descritta nella Sezione 3.5.
5. Applicare la selezione automatica del ROI in QuPath utilizzando uno script di selezione ROI automatizzato.
   1. Apri l'immagine in QuPath e imposta il tipo di immagine su Brightfield.
   2. Dal menu Strumenti , seleziona lo strumento di annotazione desiderato per creare le annotazioni iniziali. Si raccomandano annotazioni quadrate.
   3. Disegna annotazioni quadrate all'interno del tessuto polmonare. Ogni annotazione dovrebbe comprendere una sola regione di interesse (ROI) per l'analisi, sia una regione alveolare che un'area peribronchiale.
   4. Una volta create le annotazioni, naviga su Annotazioni e seleziona Blocca annotazioni per prevenire movimenti o modifiche accidentali.
   5. Aggiungi le classi "alveoli" e "area peribronchiale" alla lista delle classi cliccando sul pulsante "+" accanto a Lista delle classi nel pannello di annotazione.
   6. Assegna ogni annotazione alla classe appropriata. Seleziona un'annotazione, scegli la classe corrispondente e clicca su Imposta selezionato. Il colore dell'annotazione cambierà e la classe assegnata ("alveoli" o "area peribronchiale") verrà visualizzata nel pannello delle proprietà dell'annotazione.
   7. Apri lo script corrispondente ed eseguilo. Al completamento, un messaggio indicherà che i ROI sono stati generati con successo. I ROI appena creati appariranno nella gerarchia delle annotazioni come annotazioni figlie dell'annotazione originale che definisce la classe.
   8. Per esportare i ROI, selezionali e naviga su File → Esporta Immagini → Pixel Originali. Salva i ROI esportati come file TIFF.
      NOTA: Gli script sono progettati per riconoscere solo i nomi delle classi "alveoli" e "area peribronchiale". Questi nomi devono essere inseriti esattamente come specificato. Per impostazione predefinita, gli script generano casualmente cinque ROI quadrati non sovrapposti che misurano 100 μm × 100 μm all'interno di ogni annotazione. I ROI dei candidati sono accettati solo se gli angoli e il centro sono completamente contenuti all'interno dei confini delle annotazioni, garantendo la completa inclusione nella regione selezionata. Sia il numero che le dimensioni dei ROI possono essere modificati all'interno dello script per soddisfare specifici requisiti sperimentali. Sono raccomandati almeno tre repliche biologiche e un minimo di cinque ROI per campione per le analisi.
6. Analisi TWOMBLI
   1. Salva tutte le immagini ROI delle fibre elastiche in una cartella dedicata per l'analisi.
   2. Crea due sottocartelle all'interno della directory di lavoro: a. Folder di maschere – per maschere binarie generate da TWOMBLI. b. Cartella HDM – per immagini HDM (High-Density Matrix) generate da TWOMBLI.
   3. Esegui il plugin TWOMBLI: Open Fiji e avvia TWOMBLI (Plugin -> Macros -> Run).
   4. Seleziona il file di parametri di analisi appropriato. I seguenti parametri TWOMBLI sono stati utilizzati per l'analisi delle fibre elastiche, elencati nella Tabella 1.
      NOTA: Questi parametri possono variare a seconda dell'intensità della colorazione. I parametri sono stati ottimizzati empiricamente utilizzando molteplici immagini rappresentative di sezioni di tessuto polmonare colorate in condizioni standardizzate. L'ottimizzazione è stata effettuata confrontando le maschere generate con il pattern di colorazione originale e selezionando le impostazioni che offrono la migliore sovrapposizione tra la maschera segmentata e la rete elastica sottostante. Una volta stabiliti, gli stessi parametri venivano applicati a tutte le immagini all'interno del dataset.
   5. Scegli l'opzione "fibre scure su fondo chiaro".
   6. Genera e salva maschere binarie nella cartella Mask.
   7. Genera e salva immagini binarie nella cartella HDM.
   8. Estrarre parametri quantitativi della rete come lunghezza della fibra, punti di diramazione, curvatura, densità e allineamento.
      NOTA: L'analisi TWOMBLI richiede immagini nitide e ad alta risoluzione (>1 pixel/μm). Una scarsa deconvoluzione dei colori, regioni fuori fuoco o compressione dell'immagine possono compromettere l'accuratezza della quantificazione della rete in fibra.
7. Quantificazione e analisi statistica
   1. Esporta i parametri di rete TWOMBLI come file CSV.
   2. Importa i dati CSV grezzi in GraphPad Prism per analisi statistiche e visualizzazioni.
      NOTA: Si raccomanda il seguente parametro: Maschera la lunghezza totale, che riflette la quantità totale di fibre elastiche all'interno del ROI, permettendo la quantificazione dell'abbondanza e della perdita di fibre. I punti finali della fibra indicano il grado di frammentazione della fibra; un numero aumentato di endpoint suggerisce fibre interrotte o rotte. I Punti di Ramo della Fibra misurano quanto sono interconnesse le fibre, riflettendo la complessità strutturale e l'integrità della rete ECM. Un numero maggiore di punti di diramazione indica una rete più complessa e intrecciata. La lacunarità quantifica l'omogeneità della distribuzione delle fibre attraverso il ROI. Una bassa lacunarità indica una rete uniforme con lacune di dimensioni simili, mentre un'alta lacunarità riflette una rete eterogenea con dimensioni variabili che descrivono una struttura più complessa. Il Conteggio delle Scatole - Dimensione Frattale cattura la complessità dell'architettura della fibra. Valori di dimensione frattale più alti indicano reti più complesse e dettagliate, mentre valori più bassi riflettono strutture più semplici o interrotte.
   3. Genera grafici a colonna che mostrino la media ± SEM per ogni parametro di rete quantificato (ad esempio, lunghezza della fibra, ramificazione, curvatura e densità).
   4. Normalità dei dati del test utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Per i dati parametrici, applica un test t di Student non accoppiato a due code. Per dati non parametrici, applicare un test Mann-Whitney U. Per confronti che coinvolgono più di due gruppi sperimentali, dovrebbe essere applicata un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita da un apposito test di confronto multiplo post hoc, oppure un test di Kruskal–Wallis per dati non parametrici.
      NOTA: Mantenere inalterati tutti i file CSV grezzi per garantire riproducibilità e tracciabilità dei dati. Riporta il numero di ROI e repliche biologiche analizzate per ciascuna condizione nelle legende delle figure.

Risultati

Questo protocollo fornisce parametri quantitativi della rete di fibre elastiche attraverso diverse regioni polmonari e condizioni sperimentali. L'analisi TWOMBLI, come descritta in precedenza, fornisce parametri come lunghezza della fibra, densità di ramificazione, lacunarità e dimensione frattale per la valutazione della matrice^{extracellulare 10}. Sulla base di questo quadro, il nostro approccio consente una caratterizzazione completa dell'organizzazione delle fibre elastiche, consentendo la valutazione dei cambiamenti nell'abbondanza, connettività, uniformità e complessità strutturale sia nei tessuti polmonari fisiologici che patologici.

Nel tessuto polmonare sano, le fibre elastiche formano reti lunghe, continue e ben allineate lungo i setti alveolari e le strutture peribronchiali. Al contrario, i polmoni patologici o metabolicamente alterati, come quelli dei topi obesi, spesso mostrano un aumento delle ramificazioni e una maggiore complessità di rete, riflettendo alterazioni nell'organizzazione delle fibre^{elastiche 3}. Output rappresentativi, inclusi maschere binarie e parametri quantitativi, sono raffigurati nella Figura 1A, B. Questi risultati possono essere integrati con analisi istologiche e molecolari per valutare l'integrità della ECM e l'entità della^{rimodellazione 3}. La lacunarità e il riempimento del vuoto sono esemplificati nel tessuto polmonare sano per visualizzare differenze nell'organizzazione della ECM (Figura 1C). In combinazione con altre metriche quantitative, questi parametri catturano la complessità della rete e rivelano cambiamenti nell'architettura tissutale guidati dalla riorganizzazione ECM, fornendo spunti su modelli distinti di rimodellamento strutturale all'interno della rete a fibre elastiche.

L'interpretazione accurata di questi risultati quantitativi dipende criticamente dall'acquisizione e dall'elaborazione delle immagini di alta qualità. Condizioni di imaging o di elaborazione subottimali, inclusa scarsa messa a fuoco, illuminazione incoerente o stima imprecisa del vettore di colorazione, possono causare maschere frammentate o rumorose e, di conseguenza, output quantitativi inaffidabili (Figura 1D). Pertanto, un'accurata ispezione visiva delle immagini raw e dei risultati della segmentazione è essenziale per garantire la qualità dei dati prima dell'interpretazione. Maschere subottimali possono tipicamente essere riconosciute da un'eccessiva frammentazione delle fibre continue, segmentazione discontinua o incompleta, incorporazione di rumore di fondo come strutture di fibre, o scarsa sovrapposizione tra il pattern di colorazione originale e la maschera generata, indicando che i parametri di acquisizione dell'immagine, stima del vettore di colorazione o segmentazione dovrebbero essere rivalutati. Per illustrare queste caratteristiche, sono state intenzionalmente analizzate sezioni con controcolorazione, il che interferisce con l'identificazione delle fibre elastiche e porta a una segmentazione subottimale. Un esempio di una maschera di tale bassa qualità è mostrato nella Figura 1E. Per valutare ulteriormente la robustezza e la riproducibilità del flusso di lavoro, i dataset di immagini sono stati analizzati indipendentemente da due ricercatori utilizzando gli stessi parametri di analisi ottimizzati (Figura 2A). Inoltre, sono stati inclusi campioni derivati da animali indipendenti per valutare la variabilità biologica (Figura 2B). Risultati quantitativi comparabili sono stati ottenuti tra operatori e repliche biologiche, supportando la riproducibilità e l'indipendenza dall'utente della pipeline di analisi delle immagini proposta. Insieme, queste analisi dimostrano che il flusso di lavoro consente una valutazione robusta dell'organizzazione delle fibre elastiche e facilita confronti tra condizioni fisiologiche e patologiche.

Figura 1. Workflow di analisi della colorazione di Elastica. (A) Immagine rappresentativa grezza, segnale di fibra elastica isolata ottenuto tramite deconvoluzione dell'immagine, maschera binaria generata usando TWOMBLI e sovrapposizione delle fibre elastiche originali con la maschera corrispondente, dimostrando una segmentazione accurata. (B) Parametri quantitativi rappresentativi generati dall'analisi TWOMBLI. (C) Esempi di analisi di lacunarità e riempimento del vuoto nel tessuto polmonare murino sano per illustrare differenze nell'organizzazione della matrice extracellulare. (D) Illustrazione di maschere frammentate e rumorose risultanti da acquisizione o elaborazione di immagini subottimali. (E) Sezione tissutale controcolorata con ematossilina ed eosina, dimostrando una compromessa identificazione delle fibre elastiche e una generazione di maschera subottimale. Sono indicate aree che mostrano scarsa corrispondenza tra il motivo originale di colorazione e la maschera generata. Barra della scala A, D = 100 μm, E = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Riproducibilità e robustezza del flusso di lavoro di analisi delle fibre elastiche. (A) I dataset di immagini sono stati analizzati indipendentemente da due ricercatori utilizzando parametri di analisi TWOMBLI per valutare la riproducibilità tra operatori. Sono mostrate metriche quantitative derivate da TWOMBLI. A e B indicano i due operatori indipendenti. (B) Sono stati analizzati campioni derivati da animali indipendenti per valutare la variabilità biologica. Vengono mostrate metriche quantitative derivate da TWOMBLI, che dimostrano risultati comparabili tra repliche biologiche e supportano la robustezza della pipeline di analisi. M1, M2 e M3 indicano individui animali sani. n = 3, L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametri	Valori
Saturazione del contrasto	0.75
Larghezza minima della linea	5
Larghezza massima della linea	10
Finestra di curvatura minima	20
Finestra di curvatura massima	80
Lunghezza minima dei rami	10
Display Maximun HDM	175
Diametro minimo del gap	0

Tabella 1: Riepilogo dei parametri quantitativi derivati da TWOMBLI. Panoramica dei parametri generati da TWOMBLI e della loro interpretazione per la valutazione dell'architettura delle fibre elastiche nel tessuto polmonare. Le metriche includono misure di abbondanza di fibra, ramificazione, allineamento, connettività e organizzazione della rete.

File supplementare 1: Alveoli ROI imparziali Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: ROI imparziale area peribronchiale Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro robusto e riproducibile per investigare l'architettura della matrice extracellulare polmonare (ECM) murina, con particolare attenzione al rimodellamento delle fibre elastiche guidate da fibroblasti. Le fibre elastiche sono essenziali per mantenere la compliance polmonare e il rinculo, e la loro alterazione è un segno distintivo di molteplici malattie polmonari, tra cui fibrosi, lesioni polmonari, invecchiamento e disturbi^{metabolici 2}. Nonostante il loro ruolo funzionale centrale, la valutazione quantitativa dell'organizzazione e dell'assemblaggio delle fibre elastiche è rimasta limitata. Il flusso di lavoro colma questa lacuna consentendo una caratterizzazione sistematica e quantitativa dell'architettura della rete a fibra elastica.

Un punto di forza principale di questo metodo risiede nell'integrazione di un flusso di lavoro di imaging quantitativo con l'analisi istologica strutturale. Sebbene gli approcci convenzionali spesso valutino separatamente la composizione ECM o le caratteristiche istologiche, questo protocollo consente la quantificazione oggettiva dell'organizzazione delle fibre elastiche, inclusi la lunghezza della fibra, la diramazione e la complessità della rete. Questo permette un confronto diretto tra condizioni fisiologiche e patologiche e fornisce informazioni sul rimodellamento ECM mediato da^{fibroblasti 3}.

Tuttavia, diversi aspetti tecnici sono fondamentali per garantire la coerenza sperimentale e la qualità dei dati. La colorazione con resorcina–fucsina è sensibile a variabili come il tempo di fissazione, lo spessore della sezione e la consistenza dei reagenti, rendendo la standardizzazione essenziale per la riproducibilità. I risultati quantitativi di TWOMBLI dipendono dalla qualità dell'immagine, dalla risoluzione e dalla selezione coerente della regione di interesse, e devono quindi essere interpretati insieme alla valutazione istologica e validati su più campioni. Inoltre, la densità e la morfologia delle fibre differiscono tra regioni alveolari e peribronchiali, richiedendo un'ottimizzazione specifica per regione. Questo approccio cattura l'organizzazione globale della rete a fibre elastiche in due dimensioni e non risolve le caratteristiche ultrastrutturali, che richiedono tecniche ad alta risoluzione come la microscopia elettronica. Le modalità di imaging tridimensionale, inclusa la microscopia confocale o multifotonica, possono ulteriormente migliorare l'analisi della geometria e della connettività delle fibre.

Diversi passaggi all'interno del flusso di lavoro sono particolarmente critici per garantire risultati affidabili e riproducibili. La fissazione del tessuto, la qualità della sezionazione e la colorazione costante con resorcina e fucisina influenzano notevolmente la visualizzazione delle fibre elastiche e dovrebbero quindi essere attentamente standardizzate.  Scarsa intensità di colorazione, colorazione irregolare o alto fondo possono derivare da qualità variabile dei reagenti, condizioni di colorazione incoerenti o conservazione inadeguata dei tessuti. Inoltre, si raccomanda l'inclusione di tessuti polmonari sani e malati, controlli tecnici di colorazione e campioni di riferimento processati tra i lotti sperimentali per monitorare la consistenza della colorazione e la robustezza analitica. I tessuti ricchi di fibre elastiche possono inoltre fungere da controlli positivi per convalidare le procedure di acquisizione e segmentazione delle immagini. Una stima accurata del vettore di colorazione durante la deconvoluzione dell'immagine è un altro passaggio essenziale, poiché una scelta inappropriata del vettore può portare a un'estrazione incompleta delle fibre e a maschere frammentate. A seconda della domanda sperimentale, il flusso di lavoro può essere modificato regolando la dimensione e il numero del ROI, adattando i parametri di elaborazione delle immagini o integrando approcci di imaging tridimensionale per approfondire l'organizzazione delle fibre elastiche.

Nel complesso, questo metodo rappresenta una piattaforma versatile per studiare il rimodellamento ECM sia in contesti fisiologici che patologici. Poiché l'integrità delle fibre elastiche è direttamente collegata alla compliance polmonare e alla funzione meccanica, questo approccio è particolarmente importante per comprendere come i cambiamenti strutturali nell'ECM si traducano in alterazioni della funzione polmonare. È particolarmente adatta per studiare i cambiamenti strutturali causati dai fibroblasti e offre nuove opportunità per comprendere meglio il rimodellamento ECM e il suo contributo alla progressione della malattia e alla funzione dei tessuti. L'approccio può essere esteso anche ad altri tessuti, inclusi tessuti cardiovascolari, pelle, utero, disturbi del tessuto connettivo, organi fibrotici e campioni umani, oppure combinato con tecniche avanzate di imaging spaziale e ad alta risoluzione per ampliarne ulteriormente l'applicabilità.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172