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Articolo metodologico

Profilazione delle fibre elastiche nei tessuti polmonari utilizzando analisi di imaging quantitative

90 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/72114

⸱

4 agosto 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che dettaglia la preparazione del tessuto per la visualizzazione delle fibre elastiche e il profiling quantitativo nel tessuto polmonare murino. Questo metodo consente una valutazione robusta dell'architettura tissutale, dell'organizzazione spaziale delle fibre e della rimodellazione della matrice extracellulare in condizioni fisiologiche e patologiche.

Abstract

Il rimodellamento della matrice extracellulare polmonare (ECM) è una caratteristica chiave delle lesioni polmonari e delle malattie. Le fibre elastiche sono un componente centrale dell'ECM polmonare, fornendo resilienza e rinculo necessari per la normale funzione respiratoria, e la loro interruzione contribuisce a compromessi della meccanica tissutale. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro robusto e riproducibile per la preparazione e l'analisi del tessuto polmonare murino, con un focus sulla visualizzazione e sul profiling quantitativo delle fibre elastiche. Descrive metodi ottimizzati di elaborazione dei tessuti e colorazione istologica per preservare e rilevare le strutture dell'elastina. Inoltre, il protocollo dettaglia una pipeline di analisi delle immagini che consente la valutazione quantitativa dell'abbondanza, organizzazione e distribuzione spaziale delle fibre elastiche all'interno del polmone. Il flusso di lavoro incorpora inoltre la stima del vettore di colorazione in QuPath, la deconvoluzione del colore in Fiji/ImageJ e l'analisi delle immagini basata su TWOMBLI per consentire una valutazione quantitativa dell'abbondanza di fibre elastiche, della ramificazione e della complessità della rete. Sono incluse strategie per l'acquisizione dell'immagine, la selezione della regione di interesse, l'ottimizzazione dei parametri e il controllo qualità per garantire la riproducibilità e minimizzare il bias dipendente dall'utente. Utilizzando questo flusso di lavoro, abbiamo identificato con successo alterazioni nell'organizzazione delle fibre elastiche e nell'architettura della rete nei polmoni dei topi obesi, dimostrandone l'applicabilità nel rilevare il rimodellamento ECM associato a malattie. Insieme, questi approcci forniscono un quadro completo per indagare il rimodellamento delle fibre elastiche e il suo contributo all'architettura tissutale in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali guidati dai fibroblasti e supporta intuizioni meccanicistiche sulle alterazioni ECM sottostanti alle malattie polmonari.

Introduzione

Le fibre elastiche sono componenti essenziali della matrice extracellulare polmonare (ECM), composta principalmente da elastina e da proteine microfibrillari associate che si assemblano in reti altamente organizzatee resilienti. Nel polmone, le fibre elastiche sono disposte lungo i setti alveolari e le strutture peribronchiali, fornendo l'elasticità e il rinculo necessari per la normale meccanicarespiratoria 1,2. Essendo uno dei componenti strutturali ECM più abbondanti nei tessuti come polmone, aorta e utero, la sua integrità è fondamentale per mantenere la compliancetissutale 1,2. La rottura dell'organizzazione delle fibre elastiche è stata osservata in una serie di malattie polmonari, tra cui fibrosi, enfisema e condizioni infiammatorie croniche, dove l'architettura alterata delle fibre contribuisce a una funzione polmonare compromessa e alle proprietàmeccaniche 2,3.

Il matrisoma polmonare è stato recentemente caratterizzato, rivelando proteine centrali ECM come collageni e laminine, insieme a componenti associati al matrisoma tra cui citochine, regolatori ECM e proteine affiliate all'ECM (ad esempio, liganti integrinari, galettine)4,5. Oltre a fornire supporto strutturale, questi componenti regolano attivamente la funzione tissutale e formano nicchie specializzate che supportano cellule residenti emigratorie 6,7. In particolare, studi recenti hanno evidenziato che condizioni metaboliche come l'obesità sono associate a significative alterazioni nell'organizzazione delle fibre elastiche, collegando la disregolazione metabolica sistemica a cambiamenti nell'architettura polmonare dell'ECM e nella funzionedei fibroblasti 3. Questi risultati sottolineano l'importanza di comprendere il rimodellamento delle fibre elastiche come un processo dinamico e rilevante per la malattia.

La valutazione convenzionale delle fibre elastiche spesso si basa su una valutazione istologica qualitativa, sistemi di punteggio semi-quantitativi o misurazioni dell'abbondanza di elastina, che forniscono informazioni limitate sull'organizzazione delle fibre, la connettività e la complessità dellarete 8,9. Sebbene questi approcci siano utili per rilevare grossolane alterazioni nel contenuto di elastina, potrebbero non catturare cambiamenti architettonici sottili associati alla rimodellazione dei tessuti. Le analisi quantitative basate su immagini hanno il potenziale di superare queste limitazioni consentendo la caratterizzazione oggettiva e riproducibile delle reti di fibre elastiche e facilitando confronti tra condizioni sperimentali e studi. Per affrontare questo problema, il protocollo descritto qui consente un'analisi integrata dell'organizzazione della ECM polmonare con un focus specifico sull'architettura delle fibre elastiche. Oltre agli approcci consolidati per la caratterizzazioneECM 4,5, questo flusso di lavoro incorpora la colorazione con Elastica e una pipeline di analisia 10 immagini basata su TWOMBLI, ottimizzata per l'architettura del tessuto polmonare. Combinando la colorazione con Elastica con l'analisi quantitativa delle reti, questo flusso di lavoro va oltre la valutazione istologica convenzionale e consente una caratterizzazione dettagliata dell'abbondanza delle fibre, frammentazione, organizzazione spaziale e complessità strutturale. Il protocollo è particolarmente adatto per studi che indagano fibrosi, enfisema, rimodellamento polmonare associato all'obesità, malattie polmonari infiammatorie, invecchiamento e altre condizioni caratterizzate dal rimodellamento della matrice extracellulare nei polmoni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi descritti qui sono stati condotti in conformità con l'approvazione del Comitato di Etica Animale dello stato della Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOTA: Indossare l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (camice da laboratorio, guanti, protezione per gli occhi) durante tutta la procedura.

1. Campionamento e preparazione del tessuto polmonare murino

NOTA: I topi sono stati soppressi per overdose di isoflurano secondo le linee guida istituzionali e governative prima della raccolta dei tessuti.

  1. Apri con cura la cavità toracica con un'incisione mediana, poi taglia il diaframma lungo il suo attacco ed esponi delicatamente i polmoni.
  2. Rimuovere l'intero polmone estinzione insieme dei lobi destro e sinistro, facendo attenzione a mantenere tutti i lobi intatti.
  3. Inserire i lobi polmonari singolarmente in un tubo da 5 mL contenente 2 mL di formalina tamponata al 10% di neutro e incubare per 15–20 ore a 4 °C.
    NOTA: La fissazione preserva l'architettura tissutale per successive analisi istologiche e delle fibre elastiche. Poiché l'obiettivo principale di questo flusso di lavoro era la visualizzazione e la valutazione quantitativa dell'organizzazione delle fibre elastiche piuttosto che le analisi morfometriche alveolari, i polmoni non venivano fissati con l'inflazione prima del processamento tissutale.
    ATTENZIONE: La formalina tamponata neutra contiene formaldeide, che è tossica, cancerogena e può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Maneggiare la formalina in una cappa chimica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
  4. Immergere il tessuto polmonare fisso nella paraffina utilizzando un protocollo di immersioneistologica standard 11.
    NOTA: Assicurarsi una completa disidratazione e infiltrazione di paraffina per mantenere la morfologia tissutale in vista della colorazione successiva. Per minimizzare la variabilità tra i campioni e garantire la compatibilità tra le condizioni sperimentali, si utilizzano sempre gli stessi lobi polmonari per ogni analisi. Si consiglia di usare il lobo sinistro per l'istologia.
  5. Tagliare il tessuto polmonare FFPE in sezioni spesse 5–7 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetri di vetro standard. Cuocere le lamine a 60 °C per 1 ora prima di procedere con le applicazioni a valle. Le vetrine possono essere conservate a RT in un ambiente privo di polvere per diverse settimane oppure a 4 °C per una conservazione a lungo termine.
    NOTA: Evitare l'esposizione all'umidità durante la conservazione, poiché l'umidità può causare ossidazione della paraffina e compromettere la qualità delle macchie. Conserva i vetri in una scatola di plastica sigillata con il disidratante se è necessario un conservamento a lungo termine.
    Punto di pausa: conservare le vetrine a RT o 4 °C fino alla macchia.

2. Colorazione delle fibre elastiche

  1. Eseguire la colorazione con Elastica (resorcina-fucsina) su sezioni di tessuto polmonare incorporate in paraffina a 5–7 μm per visualizzare le fibre elastiche all'interno delle strutture alveolari e vascolari.
    NOTA: Tingi solo quante vetrine possibili sono manipolate simultaneamente per garantire un'intensità e una riproducibilità costanti tra i campioni.
    1. La deparaffinata immerge le vetrine in xilene (isomeri misti) due volte per 5 minuti ciascuna.
      ATTENZIONE: Lo xilene è tossico e infiammabile. Maneggiare in una cappa chimica e indossare l'attrezzatura protettiva appropriata.
    2. Reidratare i vetrini in serie discendente di etanolo fino all'80% di etanolo.
      1. Incubare il vetrino per 3 minuti a RT in una camera di colorazione riempita con etanolo al 100%.
      2. Trasferisci il vetrino in etanolo fresco al 100% e incuba 3 minuti a RT.
      3. Trasferisci il vetrino al 95% di etanolo e incuba per 3 minuti a RT.
      4. Trasferisci il vetrino all'80% di etanolo e incuba per 3 minuti a RT.
    3. Trasferire il vetrino in una nuova camera di colorazione contenente soluzione di Resorcina-Fucsina e incubare per 20–30 minuti a RT.
      NOTA: La soluzione di colorazione con resorcina-fucsina può essere usata più volte ed è stabile a RT.
      ATTENZIONE: La soluzione di colorazione con resorcina e fucsina contiene sostanze chimiche potenzialmente pericolose, inclusi acidi e coloranti concentrati, che possono causare irritazione della pelle e degli occhi. Maneggiare la soluzione in un'area ben ventilata o in una cappa e indossare le attrezzature di protezione individuale adeguate secondo le linee guida istituzionali di sicurezza.
    4. Metti il carrello in una camera di colorazione sotto acqua distillata corrente e lava per 1 minuto.
    5. Differenziare al 95–96% etanolo: 15–60 s, monitorare al microscopio.
      NOTA: Fermarsi quando le fibre elastiche rimangono di un viola-viola profondo e lo sfondo è adeguatamente ripulito. Le fibre elastiche macchiate appaiono di un viola scuro. Le fibre di collagene rimangono intatte e di solito appaiono pallide. La sovramacchia può aumentare lo sfondo; Regolare il tempo di incubazione in base allo spessore e alla fissazione del tessuto.
    6. Interrompere la differenziazione trasferendo immediatamente il vetrino in acqua bidistillata e risciacquando per 30 secondi. Opzionale: La controcolorazione può essere eseguita se necessario per una valutazione polmonare aggiuntiva, ma può ridurre l'efficienza della segmentazione delle fibre. Consigliamo di effettuare una colorazione H&E per valutare il polmone sui tagli adiacenti.
    7. Disidratare le vetrine in modo sequenziale con etanolo al 95% per 1–2 minuti, seguito da etanolo al 100% due volte per 1–2 minuti ciascuno per rimuovere l'acqua residua.
    8. Liberare le sezioni di xilene 2 volte per 3 minuti finché il tessuto non appare otticamente trasparente.
    9. Montare i coperchissi utilizzando una resina sintetica permanente compatibile con xilene e permettere alle slide di asciugare piano a RT.
      NOTA: La completa disidratazione e la pulizia sono essenziali per prevenire la torbidezza e garantire la conservazione a lungo termine delle sezioni colorate.
      Punto di pausa: conservare i vetrini montati con macchie a RT fino all'immagini.

3. Imaging delle fibre elastiche e analisi della rete

  1. Acquisizione dell'immagine
    1. Acquisire immagini ad alta risoluzione in campo chiaro di sezioni di tessuto polmonare utilizzando uno scanner di vetrine con un obiettivo del 40×. Assicurati di esporre e bilanciare il bianco in modo coerente su tutti i campioni.
      NOTA: Le immagini sono state acquisite utilizzando impostazioni identiche dello scanner durante tutto lo studio, inclusi ingrandimento, risoluzione spaziale (0,25 μm/pixel), illuminazione ed esposizione.
    2. Disegna una regione di interesse (ROI) che copre l'intera sezione del tessuto polmonare per garantire una copertura completa durante la scansione.
    3. Definire un'area di riferimento di fondo senza tessuto per misurare e sottrarre l'intensità di fondo durante l'analisi dell'immagine.
    4. Utilizza il rilevamento automatico della messa a fuoco dello scanner per assegnare un numero ottimale di punti focali sul tessuto, garantendo nitidezza e qualità dell'immagine uniformi.
    5. Acquisire l'immagine utilizzando un'illuminazione e impostazioni di esposizione uniformi.
      NOTA: Se la messa a fuoco automatica fallisce in regioni dense o irregolari, si utilizza la regolazione manuale della messa a fuoco fine per assicurarsi che tutte le strutture tissutali, comprese le aree alveolari e vascolari, siano catturate con precisione.
  2. Deconvoluzione dell'immagine: stima del vettore di colorazione in QuPath12. I vettori di colorazione rappresentano i valori specifici di assorbanza RGB di ciascun colorante istologico, permettendo la separazione delle colorazioni sovrapposte durante la deconvoluzione del colore.
    NOTA: In questo protocollo, i vettori di colorazione sono stati definiti in QuPath, poiché vettori di colorazione predefiniti per la resorgina-fucisina non sono disponibili nelle Fiji.
    1. Apri l'immagine in QuPath e seleziona il tipo di immagine in campo chiaro.
      NOTA: Per minimizzare il bias, calcola i vettori di colorazione utilizzando immagini rappresentative dal dataset e applica gli stessi valori a tutte le immagini.
    2. Disegna una regione di interesse (ROI) che contiene prevalentemente fibre elastiche per definire la prima componente della colorazione.
    3. Nella scheda Immagine, naviga alle sezioni vettoriali Stain.
    4. Clicca su Stain 1, poi imposta il vettore di colorazione dal ROI per definire il vettore colore per le fibre elastiche (tipicamente viola-viola).
    5. Seleziona un ROI contenente tessuto non elastico (ad esempio, fondo o collagene) e clicca su colorazione 2, poi imposta il vettore di colorazione dal ROI per definire la componente di colore secondaria.
    6. QuPath calcola automaticamente la Tinta 3, corrispondente allo sfondo.
    7. Un esempio di vettori calcolati e applicati nelle Fiji: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Segnale non specifico R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Contesto R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      NOTA: Questi valori sono stati colorati solo per immagini colorate solo con resorcina-fucsina. Se è presente una controcolorazione, devono essere calcolati nuovi vettori di colorazione.
    8. Salvali come vettori di colorazione personalizzati e applicali per una deconvoluzione cromatica coerente su tutti i campioni.
      NOTA: Definire vettori di colorazione personalizzati da regioni rappresentative migliora la precisione della deconvoluzione del colore, in particolare per la colorazione con resorcina-fucsina, dove elastina e tonalità di sfondo possono variare tra i lotti.
  3. Deconvoluzione del colore dell'immagine in Fiji 13,14.
    1. Apri Fiji (ImageJ) e carica l'immagine del campo chiaro della sezione di tessuto colorato.
    2. Opzionale: Trasformare l'immagine in formato RGB (Immagine → Tipo → Colore RGB) solo se l'immagine non è già in RGB (ad esempio, immagini a 8 bit). Questo passaggio apre una nuova finestra dell'immagine; Salvali per preservare i dati grezzi originali.
    3. Esegui la deconvoluzione dei colori selezionando Image > Color > Color Deconvolution > User Values.
    4. Entra in scena il vettore di colorazione personalizzato precedentemente ottenuto da QuPath.
    5. Esegui il plugin per generare tre immagini in scala di grigi separate corrispondenti a fibre elastiche, tessuto escluso le fibre elastiche e sfondo.
    6. Usa le immagini direttamente per TWOMBLI senza preprocessing aggiuntivo. TWOMBLI richiede immagini nitide con sufficiente risoluzione; la levigatura (ad esempio, la sfocatura gaussiana) dovrebbe essere evitata per preservare i dettagli strutturali.
      NOTA: Assicurati che le regioni selezionate in QuPath per la stima vettoriale siano rappresentative della colorazione tipica, poiché questi vettori personalizzati saranno applicati uniformemente su tutte le immagini per un confronto coerente.
    7. Salva il canale elastico in fibra come file TIFF per la quantificazione e l'analisi a valle.
  4. Selezione del ROI per l'analisi delle fibre
    1. Per ogni sezione polmonare, si selezionano cinque ROI quadrati non biaisati nella regione alveolare e cinque ROI nella regione peribronchiolare (100 μm x 100 μm ciascuna).
    2. Duplica ogni ROI sull'immagine raw (Immagine > Duplicata) per preservare i dati originali.
    3. Duplica gli stessi ROI nell'analisi delle fibre elastiche deconvolute.
    4. Salva tutti i ROI duplicati come singoli file TIFF per l'analisi a valle.
      NOTA: Le regioni contenenti pieghe tissutali, artefatti sezionanti, lacerazioni, grandi vasi sanguigni o architettura alveolare mal conservata sono state escluse dall'analisi. Solo i ROI in fibra elastica deconvoluti venivano utilizzati come input per l'analisi TWOMBLI, mentre i duplicati di immagini grezze corrispondenti venivano mantenuti come file di riferimento per il controllo qualità e l'ispezione visiva. Le regioni di interesse (ROI) dovrebbero essere selezionate tramite campionamento casuale sistematico per garantire una rappresentazione imparziale del tessuto. Per minimizzare ulteriormente il bias dell'operatore, uno script automatico di selezione del ROI compatibile con QuPath è fornito nel File Supplementare 1 e nel File Supplementare 2, e la sua implementazione è descritta nella Sezione 3.5.
  5. Applicare la selezione automatica del ROI in QuPath utilizzando uno script di selezione ROI automatizzato.
    1. Apri l'immagine in QuPath e imposta il tipo di immagine su Brightfield.
    2. Dal menu Strumenti , seleziona lo strumento di annotazione desiderato per creare le annotazioni iniziali. Si raccomandano annotazioni quadrate.
    3. Disegna annotazioni quadrate all'interno del tessuto polmonare. Ogni annotazione dovrebbe comprendere una sola regione di interesse (ROI) per l'analisi, sia una regione alveolare che un'area peribronchiale.
    4. Una volta create le annotazioni, naviga su Annotazioni e seleziona Blocca annotazioni per prevenire movimenti o modifiche accidentali.
    5. Aggiungi le classi "alveoli" e "area peribronchiale" alla lista delle classi cliccando sul pulsante "+" accanto a Lista delle classi nel pannello di annotazione.
    6. Assegna ogni annotazione alla classe appropriata. Seleziona un'annotazione, scegli la classe corrispondente e clicca su Imposta selezionato. Il colore dell'annotazione cambierà e la classe assegnata ("alveoli" o "area peribronchiale") verrà visualizzata nel pannello delle proprietà dell'annotazione.
    7. Apri lo script corrispondente ed eseguilo. Al completamento, un messaggio indicherà che i ROI sono stati generati con successo. I ROI appena creati appariranno nella gerarchia delle annotazioni come annotazioni figlie dell'annotazione originale che definisce la classe.
    8. Per esportare i ROI, selezionali e naviga su File → Esporta Immagini → Pixel Originali. Salva i ROI esportati come file TIFF.
      NOTA: Gli script sono progettati per riconoscere solo i nomi delle classi "alveoli" e "area peribronchiale". Questi nomi devono essere inseriti esattamente come specificato. Per impostazione predefinita, gli script generano casualmente cinque ROI quadrati non sovrapposti che misurano 100 μm × 100 μm all'interno di ogni annotazione. I ROI dei candidati sono accettati solo se gli angoli e il centro sono completamente contenuti all'interno dei confini delle annotazioni, garantendo la completa inclusione nella regione selezionata. Sia il numero che le dimensioni dei ROI possono essere modificati all'interno dello script per soddisfare specifici requisiti sperimentali. Sono raccomandati almeno tre repliche biologiche e un minimo di cinque ROI per campione per le analisi.
  6. Analisi TWOMBLI
    1. Salva tutte le immagini ROI delle fibre elastiche in una cartella dedicata per l'analisi.
    2. Crea due sottocartelle all'interno della directory di lavoro: a. Folder di maschere – per maschere binarie generate da TWOMBLI. b. Cartella HDM – per immagini HDM (High-Density Matrix) generate da TWOMBLI.
    3. Esegui il plugin TWOMBLI: Open Fiji e avvia TWOMBLI (Plugin -> Macros -> Run).
    4. Seleziona il file di parametri di analisi appropriato. I seguenti parametri TWOMBLI sono stati utilizzati per l'analisi delle fibre elastiche, elencati nella Tabella 1.
      NOTA: Questi parametri possono variare a seconda dell'intensità della colorazione. I parametri sono stati ottimizzati empiricamente utilizzando molteplici immagini rappresentative di sezioni di tessuto polmonare colorate in condizioni standardizzate. L'ottimizzazione è stata effettuata confrontando le maschere generate con il pattern di colorazione originale e selezionando le impostazioni che offrono la migliore sovrapposizione tra la maschera segmentata e la rete elastica sottostante. Una volta stabiliti, gli stessi parametri venivano applicati a tutte le immagini all'interno del dataset.
    5. Scegli l'opzione "fibre scure su fondo chiaro".
    6. Genera e salva maschere binarie nella cartella Mask.
    7. Genera e salva immagini binarie nella cartella HDM.
    8. Estrarre parametri quantitativi della rete come lunghezza della fibra, punti di diramazione, curvatura, densità e allineamento.
      NOTA: L'analisi TWOMBLI richiede immagini nitide e ad alta risoluzione (>1 pixel/μm). Una scarsa deconvoluzione dei colori, regioni fuori fuoco o compressione dell'immagine possono compromettere l'accuratezza della quantificazione della rete in fibra.
  7. Quantificazione e analisi statistica
    1. Esporta i parametri di rete TWOMBLI come file CSV.
    2. Importa i dati CSV grezzi in GraphPad Prism per analisi statistiche e visualizzazioni.
      NOTA: Si raccomanda il seguente parametro: Maschera la lunghezza totale, che riflette la quantità totale di fibre elastiche all'interno del ROI, permettendo la quantificazione dell'abbondanza e della perdita di fibre. I punti finali della fibra indicano il grado di frammentazione della fibra; un numero aumentato di endpoint suggerisce fibre interrotte o rotte. I Punti di Ramo della Fibra misurano quanto sono interconnesse le fibre, riflettendo la complessità strutturale e l'integrità della rete ECM. Un numero maggiore di punti di diramazione indica una rete più complessa e intrecciata. La lacunarità quantifica l'omogeneità della distribuzione delle fibre attraverso il ROI. Una bassa lacunarità indica una rete uniforme con lacune di dimensioni simili, mentre un'alta lacunarità riflette una rete eterogenea con dimensioni variabili che descrivono una struttura più complessa. Il Conteggio delle Scatole - Dimensione Frattale cattura la complessità dell'architettura della fibra. Valori di dimensione frattale più alti indicano reti più complesse e dettagliate, mentre valori più bassi riflettono strutture più semplici o interrotte.
    3. Genera grafici a colonna che mostrino la media ± SEM per ogni parametro di rete quantificato (ad esempio, lunghezza della fibra, ramificazione, curvatura e densità).
    4. Normalità dei dati del test utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Per i dati parametrici, applica un test t di Student non accoppiato a due code. Per dati non parametrici, applicare un test Mann-Whitney U. Per confronti che coinvolgono più di due gruppi sperimentali, dovrebbe essere applicata un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita da un apposito test di confronto multiplo post hoc, oppure un test di Kruskal–Wallis per dati non parametrici.
      NOTA: Mantenere inalterati tutti i file CSV grezzi per garantire riproducibilità e tracciabilità dei dati. Riporta il numero di ROI e repliche biologiche analizzate per ciascuna condizione nelle legende delle figure.

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Risultati

Questo protocollo fornisce parametri quantitativi della rete di fibre elastiche attraverso diverse regioni polmonari e condizioni sperimentali. L'analisi TWOMBLI, come descritta in precedenza, fornisce parametri come lunghezza della fibra, densità di ramificazione, lacunarità e dimensione frattale per la valutazione della matriceextracellulare 10. Sulla base di questo quadro, il nostro approccio consente una caratterizzazione completa dell'organizzazione delle fib...

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Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro robusto e riproducibile per investigare l'architettura della matrice extracellulare polmonare (ECM) murina, con particolare attenzione al rimodellamento delle fibre elastiche guidate da fibroblasti. Le fibre elastiche sono essenziali per mantenere la compliance polmonare e il rinculo, e la loro alterazione è un segno distintivo di molteplici malattie polmonari, tra cui fibrosi, lesioni polmonari, invecchiamento e disturbime...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare la Struttura Centrale di Istologia della Facoltà di Medicina dell'Università di Bonn. Inoltre, riconosciamo il lavoro di supporto di Daniela Kraus e di tutto il team della struttura per animali iFET. V.L.K. è finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione Tedesca per la Ricerca) nell'ambito della Strategia di Eccellenza tedesca – EXC 2151 – 390873048.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Axio CS2 Slide Scanner Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jarSigma-AldrichS6016
DPX MountantSigma-Aldrich6522
Ethanol (100%) per istologiaCarl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/versione 1.54t
Soluzione di formalina, tamponata neutra 10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I Cassette per la lavorazione/inclusione dei tessutiSigma-AldrichH0542
MicrotomoThermo Fischer ScientificHM355S
Vetrini per microscopiVWR631-0108
Topo: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Numero di ceppo:000664 
Sistema di inclusione in paraffinaEpredia HistoStar embedding module
Prismhttps://www.graphpad.com versione 11
Qupathhttps://qupath.github.ioversione 0.7.0
Resorcina-FuchsinaWaldeck2.00E-30
Plugin TWOMBLIhttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
XileneApplichem GmBH14020172

Riferimenti

  1. Schmelzer CEH, Duca L. Elastic fibers: formation, function, and fate during aging and disease. FEBS J. 2022;289:3704-3730.
  2. Heinz A. Elastic fibers during aging and disease. Ageing Res Rev. 2021;66:101255.
  3. Rottmann S, et al. Global matrisome changes in obese lung are linked to fibroblastic stroma and premature aging. Cell Rep. 2025;44:116285.
  4. Naba A, et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 2012;11:M111 014647.
  5. Schiller HB, Fernandez IE, Burgstaller G, et al. Time- and compartment-resolved proteome profiling of the extracellular niche in lung injury and repair. Mol Syst Biol 2015;11:819.
  6. Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 2009;326:1216-9.
  7. Sutherland TE, Dyer DP, Allen JE. The extracellular matrix and the immune system: A mutually dependent relationship. Science. 2023;379:eabp8964.
  8. Kozel BA, Mecham RP. Elastic fiber ultrastructure and assembly. Matrix Biol. 2019;84:31-40.
  9. Schlatmann TJ, Becker AE. Histologic changes in the normal aging aorta: implications for dissecting aortic aneurysm. Am J Cardiol. 1977;39:13-20.
  10. Wershof E, et al. A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix. Life Sci Alliance. 2021;4.
  11. Fischer AH, et al. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008;2008:pdb prot4986.
  12. Bankhead P, et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 2017;7:16878.
  13. Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 2001;23:291-9.
  14. Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9:676-82.

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