Questo studio indaga gli effetti terapeutici della formula Bushen-Jianpi-Qingchang e delle sue sottoporzioni sulla colite nel ratto, rivelando i relativi meccanismi regolatori che mirano all'asse metabolico microbiota intestinale–acidi biliari mediante analisi multi-omiche.
Articolo di ricerca
La formula Bushen Jianpi Qingchang migliora la colite nei ratti regolando il metabolismo degli acidi biliari e il microbiota intestinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La medicina tradizionale cinese (TCM) è ampiamente utilizzata per la gestione della colite ulcerosa (UC) grazie alla sua efficacia dimostrata e al profilo di sicurezza favorevole. La patogenesi centrale della UC cronica refrattaria coinvolge una carenza di milza e rene accompagnata da un accumulo intestinale di umidità-calore, e la formula Bushen-Jianpi-Qingchang (BJQF) è una prescrizione composta clinicamente validata per questa condizione. Questo studio ha mirato a indagare gli effetti terapeutici della BJQF e delle sue tre sottoprescrizioni scomposte (formula Bushen, BSF; formula Jianpi, JPF; formula Qingchang, QCF) sulla colite indotta da sodio dextran solfato (DSS) in ratti, e a caratterizzare i loro effetti regolatori sui profili fecali di acidi biliari (BA) e sulle comunità microbiche intestinali. La composizione batterica fecale e le concentrazioni di BA nei ratti con UC indotta da DSS sono state quantificate mediante sequenziamento del gene 16S rRNA e cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS), e l'associazione potenziale tra microbiota intestinale e metabolismo degli acidi biliari è stata analizzata. La BJQF ha significativamente migliorato l'infiammazione e l'ulcerazione colica nel modello di UC. Sono state identificate alterazioni distinte nella diversità e composizione batterica tra ratti con colite e controlli sani. L'associazione tra batteri differenziali e acidi biliari era centrata sull'acido 23-deossicolico (23-DCA) come nodo metabolico chiave. In particolare, l'acido taurolitocolico-3-solfato (TLCA-3S) e l'acido litocolico-3-solfato (LCA-3S) potrebbero fungere da biomarcatori di efficacia potenziali. La sottoprescrizione JPF ha mostrato un'efficacia più simile a quella della BJQF completa. L'amministrazione della BJQF e delle sue formule scomposte ha efficacemente attenuato i danni istopatologici, l'infiammazione, la disbiosi microbica intestinale e il disturbo metabolico degli acidi biliari nei ratti con UC, fornendo una base meccanicistica per la terapia composta della medicina tradizionale cinese.
Introduzione
La colite ulcerosa (CU), una delle principali forme di malattia infiammatoria intestinale (IBD), è caratterizzata da un'infiammazione cronica, continua e non specifica limitata alla mucosa colorettale. I pazienti affetti da CU presentano sintomi clinici come diarrea, dolore addominale, perdita di peso involontaria e feci ematiche o purulente, che compromettono gravemente la qualità della vita. La patogenesi della CU coinvolge fattori ambientali, genetici, microbici e immunologici. La CU si sviluppa tipicamente a seguito di uno squilibrio della microbiota intestinale, e questa disbiosi può notevolmente accelerare il decorso della malattia1. Numerose evidenze hanno identificato l'asse metabolico microbiota intestinale–acidi biliari (AB) come un modulo regolatorio centrale nella patogenesi della CU. Il cattivo metabolismo degli acidi biliari è un tratto distintivo ben riconosciuto del danno della mucosa intestinale nell'IBD. Gli acidi biliari secondari sono biosintetizzati esclusivamente dai microbiota intestinale a partire dagli acidi biliari primari di origine ospite, grazie all'espressione di enzimi chiave come la 7α-deidrossilasi necessaria per questa biotrasformazione. Pertanto, il pool fecale di acidi biliari costituisce un indicatore funzionale ideale per riflettere la riorganizzazione del microbioma indotta dal trattamento con medicina tradizionale cinese (TCM).
Questi acidi biliari secondari agiscono come molecole di segnalazione fondamentali per mantenere l'omeostasi immunitaria intestinale, l'integrità della barriera mucosale e la sopravvivenza delle cellule epiteliali2. Anomalie in questo asse, inclusa la carenza di acidi biliari secondari indotta da disbiosi microbica e una segnalazione alterata degli acidi biliari, innescano direttamente risposte pro-infiammatorie intestinali e un malfunzionamento della barriera, rendendo questo asse un potenziale bersaglio terapeutico per l'intervento nella colite ulcerosa (UC). La microflora intestinale svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della UC e influenza l'organismo ospite attraverso prodotti metabolici, come gli acidi biliari generati da reazioni fermentative. Alterazioni anomale della microflora intestinale e del metabolismo degli acidi biliari sono strettamente associate alla UC3. Poiché la microflora intestinale media la produzione di acidi biliari secondari, variazioni nella composizione e nell'abbondanza microbica possono alterare il metabolismo degli acidi biliari e contribuire allo sviluppo delle malattie infiammatorie intestinali (IBD)4.
La medicina tradizionale cinese (TCM) è stata ampiamente adottata per la gestione della colite ulcerosa (UC) grazie alla sua efficacia e sicurezza nel trattamento a lungo termine, come alternativa o terapia aggiuntiva agli agenti anti-infiammatori o immunosoppressori5. Riscaldare e tonificare il milza e i reni, pulire l'intestino ed eliminare l'umidità costituiscono i principi terapeutici fondamentali per la UC6. Secondo la teoria della medicina tradizionale cinese, la patogenesi centrale della UC cronica è la carenza di milza e reni (Fu-Zheng, rafforzamento del qi vitale) associata all'accumulo intestinale di calore-umidità (Qu-Xie, eliminazione dei fattori patogeni), e l'applicazione sinergica di queste due strategie è essenziale per un trattamento efficace della UC.
Studi sperimentali precedenti hanno confermato che JPF e QCF, due sottoporzioni fondamentali di BJQF, esercitano effetti terapeutici contro la colite ulcerosa (UC). JPF migliora l'infiammazione della mucosa e la disfunzione della barriera epiteliale intestinale attraverso il percorso di segnalazione NF-κB/HIF-1α7, mentre QCF ripristina l'omeostasi tra microbiota intestinale e metabolismo, protegge la barriera epiteliale intestinale e regola il percorso NLRP3/IL-1β8. Per analizzare i contributi biologici specifici dei moduli funzionali Fu-Zheng e Qu-Xie all'asse microbiota intestinale–acidi biliari (BA), questo studio è stato progettato per includere la formula completa BJQF e tre sottoporzioni scomposte: BSF (formula Bushen, tonificazione di milza e rene, Fu-Zheng puro), JPF (formula Jianpi, tonificazione della milza, Fu-Zheng fondamentale) e QCF (formula Qingchang, eliminazione del calore e dell'umidità intestinale, Qu-Xie puro). Questo disegno sperimentale consente di distinguere gli effetti sinergici e indipendenti di ciascun modulo funzionale nel trattamento della UC, un aspetto fondamentale per la traduzione delle prescrizioni composte della medicina tradizionale cinese (TCM) in terapie basate su evidenze.
L'ipotesi di lavoro è che il BJQF migliori la colite indotta da DSS rimodellando la composizione microbica intestinale e normalizzando il metabolismo degli acidi biliari, e che il modulo Jianpi funga da componente funzionale centrale responsabile degli effetti regolatori sull'asse microbiota intestinale–acidi biliari. Questo studio è stato progettato per analizzare sistematicamente il meccanismo "composto-a-modulo" del BJQF. Valutando la formula completa e i relativi sottomoduli fisiologici mirati, lo studio intende decifrare la sinergia biologica di questo composto di medicina tradizionale cinese (TCM) e fornire una base farmacologica moderna per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale (IBD) mediante la regolazione dell'asse microbiota intestinale–metabolismo degli acidi biliari. In questo contesto, viene effettuato un confronto sistematico dell'efficacia terapeutica della formula completa di BJQF e delle sue tre formule funzionali scomposte contro la colite ulcerosa (UC) indotta da DSS. Data l'importanza cruciale dell'asse microbiota intestinale–metabolismo degli acidi biliari nella patogenesi dell'UC, questo lavoro analizza il meccanismo sinergico composto-a-modulo del BJQF, chiarisce i contributi regolatori specifici dei moduli Bushen, Jianpi e Qingchang, e caratterizza gli effetti di rimodellamento di ciascun modulo sulla composizione microbica intestinale e sui profili fecali degli acidi biliari. Gli obiettivi principali sono rivelare la base biologica moderna del BJQF nel缓解dell'UC, identificare i principali target microbici–metabolici per l'intervento della TCM e fornire un riferimento meccanicistico per l'applicazione razionale e la ricerca traslazionale delle prescrizioni composte di TCM nella IBD.
Protocollo
Sono stati ottenuti quarantaquattro ratti maschi Sprague-Dawley sani del peso di 200 ± 20 g per lo studio. Tutti gli animali sono stati allevati in condizioni libere da patogeni specifici con libero accesso a una dieta standard in pellet e acqua, e sono stati adattati per 1 settimana prima dell'esperimento. Il benessere animale e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le indicazioni riportate nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" emessa dal Ministero della Scienza e Tecnologia della Cina. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino con il numero di approvazione 2023DW-029-01. Tutti i dettagli completi sulla provenienza degli animali e sulle forniture per l'allevamento sono riportati nella Tabella dei Materiali.
Preparazione della formula di MTC
La formula completa Bushen-Jianpi-Qingchang (BJQF) è stata formulata con nove ingredienti vegetali in dosaggi predeterminati: 15 g di Astragali Radix, 10 g di Atractylodis Macrocephalae Rhizoma tostato, 10 g di Scutellariae Radix, 4 g di Coptidis Rhizoma, 10 g di Sanguisorbae Radix, 6 g di Aucklandiae Radix, 5 g di Glycyrrhizae Radix, 15 g di Psoraleae Fructus e 15 g di Alpiniae Oxyphyllae Fructus. Tutti i materiali vegetali grezzi sono stati ammollati in soluzione salina fisiologica per 1 h, seguiti da 1 h di decottura per ottenere un volume finale di 1500 mL. Sono state preparate tre sottoclassi decomposte utilizzando un protocollo di decottura identico. La formula Bushen (BSF) conteneva 15 g di Psoraleae Fructus e 15 g di Alpiniae Oxyphyllae Fructus, decotta fino a un volume finale di 500 mL. La formula Jianpi (JPF) era composta da 15 g di Astragali Radix, 10 g di Atractylodis Macrocephalae Rhizoma tostato e 5 g di Glycyrrhizae Radix, con un volume finale di decotto di 500 mL. La formula Qingchang (QCF) comprendeva 10 g di Scutellariae Radix, 4 g di Coptidis Rhizoma, 10 g di Sanguisorbae Radix e 6 g di Aucklandiae Radix, anch’essa aggiustata a un volume finale di 500 mL. Le specifiche complete del produttore e i numeri di lotto di tutti i materiali vegetali sono riportati nella Tabella dei Materiali. Nella parte principale del testo si utilizza una nomenclatura vegetale generica, mentre i dettagli specifici del produttore sono indicati esclusivamente nella Tabella dei Materiali.
Induzione della colite e suddivisione sperimentale in gruppi
I ratti sono stati suddivisi casualmente in sei gruppi sperimentali: Gruppo di controllo (n = 6): acqua potabile normale + soluzione salina fisiologica per via intragastrica. Gruppo modello di colite ulcerosa (n = 6): acqua potabile con DSS al 3,5% (p/v) + soluzione salina fisiologica per via intragastrica. Gruppo trattato con BJQF (n = 8): acqua potabile con DSS al 3,5% + BJQF per via intragastrica (0,6 g/kg di peso corporeo). Gruppo trattato con BSF (n = 8): acqua potabile con DSS al 3,5% + BSF per via intragastrica (0,6 g/kg di peso corporeo). Gruppo trattato con JPF (n = 8): acqua potabile con DSS al 3,5% + JPF per via intragastrica (0,6 g/kg di peso corporeo). Gruppo trattato con QCF (n = 8): acqua potabile con DSS al 3,5% + QCF per via intragastrica (0,6 g/kg di peso corporeo).
La colite sperimentale è stata indotta con DSS al 3,5% nell'acqua da bere per 10 giorni consecutivi; il gruppo di controllo ha ricevuto acqua distillata senza DSS. La dose di ciascuna formula di MTC (0,6 g/kg) è stata calcolata convertendo la dose efficace nell'uomo alla dose equivalente nel ratto mediante il metodo di normalizzazione per area della superficie corporea (formula di Meeh-Rubner). Trattandosi di uno studio in fase di scoperta volto al confronto tra formule, è stata adottata una singola dose clinicamente equivalente. A partire dal giorno 1, ciascuna formula di MTC è stata somministrata per via intragastrica una volta al giorno. I gruppi di controllo e modello hanno ricevuto lo stesso volume di soluzione salina fisiologica (10 mL/kg). Al giorno 11, i ratti sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale. Sono stati raccolti siero, campioni fecali e tessuti del colon per le analisi. Il peso corporeo è stato misurato giornalmente. Inizialmente, ogni gruppo era composto da n = 8 animali. Durante l'induzione con DSS, 2 ratti nei gruppi di controllo e modello sono deceduti a causa di colite grave, portando a un valore finale di n = 6 per questi due gruppi. Un'analisi post-hoc della potenza statistica ha confermato che la dimensione finale del campione garantisce una potenza statistica ≥ 0,8 per tutti gli esiti primari (punteggio istologico, citochine chiave, peso corporeo), soddisfacendo così i requisiti statistici standard.
Misurazione delle concentrazioni delle citochine infiammatorie
I livelli sierici di IL-1β, IL-10 e TNF-α sono stati quantificati utilizzando kit ELISA commerciali, seguendo rigorosamente i protocolli del produttore. I valori di densità ottica sono stati rilevati mediante un lettore automatico di micropiastre. Analisi statistica: ANOVA a un fattore per valutare le differenze complessive tra i gruppi, seguita dalla correzione FDR di Benjamini-Hochberg per confronti a coppie post hoc, in linea con l'analisi dei dati omici.
Valutazione istopatologica
Campioni di tessuto del colon sono stati fissati in formalina al 10%, disidratati, inclusi in paraffina, sezionati e colorati con ematossilina ed eosina (HE). Il punteggio istologico è stato determinato utilizzando il sistema di valutazione della colite di Cooper modificato, una griglia semiquantitativa validata per la colite sperimentale9. La valutazione comprende quattro parametri: infiltrato infiammatorio, danno strutturale ai cripti, edema della mucosa ed estensione delle ulcere (punteggio totale 0–12). Dichiarazione sulla cecità: tutti i vetrini sono stati identificati con codici numerici prima della valutazione. Due patologi indipendenti, ignari dell'assegnazione ai gruppi, hanno valutato ciascun vetrino separatamente. Il punteggio finale corrisponde alla media dei due punteggi; le discrepanze pari o superiori a 2 punti sono state risolte da un terzo patologo senior. Analisi della varianza ad un fattore (one-way ANOVA) con correzione FDR di Benjamini-Hochberg per i confronti a coppie, in linea con gli altri dati fenotipici.
Raccolta del campione ed estrazione del DNA
Campioni freschi di feci di ratto sono stati raccolti in provette centrifughe sterili da 1 mL e immediatamente congelati a −80 °C, e trasportati su ghiaccio secco. Il DNA genomico batterico fecale è stato estratto da 250 mg di feci utilizzando il DNA Isolation Kit seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione del DNA è stata quantificata mediante spettrofotometro e l'integrità è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Durante l'estrazione e la quantificazione è stato incluso un controllo negativo con tampone. Gli estratti sono stati conservati a -20 °C prima dell'uso.
Sequenziamento del gene 16S rRNA e analisi bioinformatica
L'amplificazione mediante PCR ha targettizzato le regioni ipervariabili V3–V4 (338F–806R) del gene 16S rRNA. I prodotti di PCR sono stati purificati e sequenziati sulla piattaforma Illumina MiSeq con lettura accoppiata di 2 × 300 bp. Dopo il filtraggio della qualità, è stata ottenuta una media di 68.450 ± 28.297 letture pulite di alta qualità per campione (massimo 158.361, minimo 28.294). Le sequenze sono state raggruppate in OTU con una soglia di similarità del 97%. Sono state calcolate curve di rarefazione, indici di ricchezza e indici di diversità. L'annotazione tassonomica è stata effettuata utilizzando il classificatore RDP. L'analisi PCoA basata sulle distanze UniFrac e il clustering gerarchico sono stati eseguiti in R per valutare la similarità delle comunità. L'analisi LEfSe è stata eseguita sulla piattaforma Galaxy per identificare i taxa differenzialmente abbondanti (soglie: LDA > 3, Kruskal-Wallis p < 0,05, Wilcoxon post-hoc p < 0,05). Per i confronti multipli delle abbondanze microbiche, è stata applicata la correzione FDR di Benjamini-Hochberg; si è considerato significativo p(FDR) < 0,05.
Analisi con LC-MS/MS degli acidi biliari fecali
Un campione fecale da 20 mg è stato omogeneizzato con 200 µL di metanolo. Dopo centrifugazione, il soprannatante è stato concentrato, ricostituito in 100 µL di metanolo al 50% in acqua e analizzato mediante LC-MS/MS. Il sistema di rilevamento comprendeva un sistema UPLC Shimadzu e un sistema MS/MS QTRAP 6500 di Applied Biosystems. Le analisi qualitative e quantitative sono state eseguite utilizzando curve di calibrazione ottenute con standard di acidi biliari. L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata utilizzata per valutare la separazione del profilo metabolico. Gli acidi biliari differenziali sono stati definiti come quelli con un valore VIP ≥ 1 e un fold change ≥ 2 o ≤ 0,5. I grafici a violino sono stati utilizzati per visualizzare le distribuzioni degli acidi biliari differenziali. Per i confronti multipli, è stata applicata la correzione FDR di Benjamini-Hochberg, in accordo con l'analisi dei dati microbici.
Analisi statistica
La correlazione di Spearman è stata calcolata utilizzando la funzione cor in R. La significatività della correlazione è stata valutata mediante la funzione corPvalueStudent del pacchetto R WGCNA. I dati fenotipici sono espressi come media ± deviazione standard (Media ± DS). Per tutti i confronti tra più gruppi (fenotipici, microbici, metabolici), è stata applicata l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con correzione FDR di Benjamini-Hochberg per i test post-hoc. Un valore di p corretto < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi sono state eseguite con GraphPad Prism 7.00 e R 4.2.0. Il calcolo post-hoc della potenza del campione è stato effettuato utilizzando G*Power 3.1.
Risultati
Le formule di MTC migliorano l'infiammazione e i danni colici nella colite indotta da DSS
L'efficacia protettiva delle formule di MTC è stata innanzitutto valutata attraverso le variazioni di peso corporeo. Rispetto ai controlli, il gruppo modello di colite ulcerosa ha mostrato una perdita di peso sostenuta. BJQF, BSF, JPF e QCF hanno attenuato in modo significativo la perdita di peso indotta da DSS (Figura 1A). La colorazione con ematossilina-eosina ha rivelato una mucosa colonica integra e l'assenza di infiammazione nei controlli. Al contrario, nei tessuti colici del gruppo modello si sono osservate gravi alterazioni epiteliali, distruzione delle cripte e ampia infiltrazione di cellule infiammatorie nella mucosa e nella sottomucosa. Tutti i trattamenti con MTC hanno favorito il recupero del tessuto e ridotto l'infiammazione, con BJQF che ha mostrato il miglioramento più pronunciato (Figura 1B–C). Il punteggio istologico quantitativo ha confermato che la MTC ha migliorato significativamente i danni istopatologici (p < 0,05).
BJQF, BSF, JPF e QCF hanno ridotto in misura variabile il livello sierico di IL-1β (Figura 1D) e di TNF-α (Figura 1F). I livelli di IL-10 nei gruppi trattati non hanno raggiunto quelli del gruppo di controllo, ma sono risultati significativamente più elevati rispetto al gruppo modello (Figura 1E). Questi risultati indicano che le formulazioni di medicina tradizionale cinese inibiscono l'infiammazione intestinale indotta da DSS.
Figura 1Effetti terapeutici di BJQF e delle sue formule subordinarie scomposte sulla colite indotta da DSS in ratti. (A) Variazioni dinamiche del rapporto tra il peso corporeo e il valore basale in ciascun gruppo durante il periodo sperimentale di 10 giorni; (B) Punteggi istologici quantitativi dei tessuti colici in tutti i gruppi sperimentali; (C) Sezioni representative di tessuto colonnare colorate con ematossilina-eosina (HE) di ciascun gruppo (barra della scala = 200 µm); (D–F) Concentrazioni sieriche di citochine infiammatorie in ciascun gruppo: (D) IL-1β, (E) IL-10, (F) TNF-α. I dati sono espressi come media ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il trattamento con MTC rimodella la struttura della comunità microbica intestinale nei ratti con CU
Dopo il filtraggio della qualità, è stata ottenuta una media di 68.450 ± 28.297 letture pulite di alta qualità per campione. Il trattamento con MTC ha modificato la diversità batterica α (indice Chao1, Figura 2A). BJQF ha ridotto significativamente l’elevata diversità α nei ratti con CU (p(FDR) < 0,05). Tra le sottoformule, JPF ha ridotto significativamente la diversità (p(FDR) < 0,05), mentre BSF e QCF non hanno mostrato effetti significativi. Per quanto riguarda la diversità β, l’analisi PCoA non ponderata delle distanze UniFrac ha mostrato una chiara separazione tra i gruppi, indicando che il trattamento MTC ha rimodellato la composizione microbica complessiva (Figura 2B). L’analisi gerarchica di clustering ha ulteriormente dimostrato un clustering distinto tra gruppo modello e gruppi trattati (Figura 2C).
Sono stati rilevati un totale di 13 phyla, 22 classi, 36 ordini, 65 famiglie e 158 generi. A livello di phylum, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia e Proteobacteria hanno dominato (>99% di abbondanza totale, Figura 2D). Firmicutes era predominante nei controlli (86,98%), risultava significativamente ridotto nella colite ulcerosa (UC) (p(FDR) < 0,05), e veniva ripristinato dai trattamenti con medicina tradizionale cinese (TCM) (p(FDR) < 0,05), con BJQF che mostrava l'effetto più marcato. Bacteroidetes e Proteobacteria risultavano significativamente aumentati nell'UC e venivano invertiti da tutte le formulazioni di TCM. A livello di genere (abbondanza >1%, Figura 2E), Lactobacillus era predominante nei controlli (59,77%), risultava notevolmente ridotto nell'UC (3,57%, p(FDR) < 0,05) e veniva ripristinato dalla TCM (p(FDR) < 0,05). BJQF e JPF mostravano effetti più forti sul ripristino di Lactobacillus. L'UC aumentava anche Bacteroides, Ruminococcus_2, Bifidobacterium e Blautia, e riduceva Enterorhabdus e Corynebacterium_1 — modificazioni per la maggior parte invertite dalla TCM. Nel complesso, tutte le formulazioni hanno migliorato la disbiosi microbica associata all'UC, con BJQF e JPF che mostravano gli effetti più pronunciati.
Figura 2: Composizione della microbiota intestinale nei gruppi. (A) Indice di diversità batterica α valutato mediante Chao 1 (p(FDR) < 0,05 rispetto al Modello); (B) Analisi PCoA delle distanze UniFrac basata sulla composizione e abbondanza di OTU in diversi gruppi; (C) Analisi gerarchica di clustering basata sulla matrice delle distanze; (D) Abbondanza relativa a livello di phylum (p(FDR) < 0,05 rispetto al Modello); e (E) Abbondanza relativa a livello di genere (p(FDR) < 0,05 rispetto al Modello). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
LEfSe identifica taxa differenziali associati alla colite ulcerosa e alla medicina tradizionale cinese
L'analisi LEfSe è stata eseguita per identificare i taxa differenzialmente arricchiti tra i gruppi (LDA > 3, p < 0.05, Figura 3). I taxa arricchiti in UC includevano Bacteroidaceae, Bacteroides, Clostridiales, Clostridia, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidetes, Faecalibaculum e Ruminococcaceae, principalmente da Bacteroidetes e Firmicutes. Dopo il trattamento con MTC, la maggior parte dei taxa arricchiti da BJQF apparteneva a Firmicutes, con soltanto Bifidobatteriacee, Bifidobatteriali, e Bifidobacterium da Actinobacteria. I taxa arricchiti in BSF erano anch'essi principalmente Firmicutes. Taxa arricchiti in JPF come Turicibacter e Dorea appartenevano a Firmicutes. QCF ha mostrato l'arricchimento più forte di Verrucomicrobia (compresi Akkermansia), indicando un'elevata sensibilità di questo phylum all'intervento con QCF. In generale, Firmicutes è stato il phylum più reattivo a BJQF, BSF e JPF.
Figura 3: LEfSe ha identificato le OTU con abbondanza più differenziale nei diversi gruppi. Sono state osservate differenze significative nei punteggi LDA (p < 0,05) tra le classi (test di Kruskal-Wallis) e tra le sottoclassi (test di Wilcoxon). I taxa differenziali sono stati determinati sulla base di un punteggio soglia LDA > 3 e un livello di significatività statistica di 0,05. (p: phylum c: classe o: ordine f: famiglia g: genere). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'intervento con MTC normalizza i profili delle acidi biliari fecali nei ratti con colite ulcerosa
Data la malassorbimento degli acidi biliari (BA) nella malattia infiammatoria intestinale (IBD), gli autori hanno utilizzato la spettrometria di massa con cromatografia liquida (LC-MS/MS) per quantificare gli acidi biliari fecali. L'analisi delle componenti principali (PCA) ha mostrato una chiara separazione tra i gruppi di controllo e modello, mentre tutti i gruppi trattati si sono raggruppati più vicino ai controlli, indicando una parziale normalizzazione del metabolismo degli acidi biliari (Figura 4A). Gli acidi biliari più alterati nel gruppo modello erano LCA-3S aumentato e GDCA ridotto (Figura 4B). Dopo il trattamento, gli acidi biliari maggiormente upregolati sono stati ILCA (BJQF), GCDCA (BSF), DLCA (JPF) e GCDCA (QCF); gli acidi biliari maggiormente downregolati sono stati TLCA-3S (BJQF), LCA-3S (BSF), LCA-3S (JPF) e TLCA-3S (QCF) (Figura 4C–F). I grafici a violino hanno visualizzato gli acidi biliari differenzialmente espressi comuni tra i gruppi (Figura 5). In particolare, tutte le formulazioni di medicina tradizionale cinese (TCM) hanno aumentato i livelli di 23-DCA, 3-oxo-DCA e DLCA, e ridotto quelli di HCA, LCA-3S, TCA e TLCA-3S.
Figura 4: Le formulazioni di MTC hanno regolato il disturbo degli acidi biliari indotto da DSS nel modello di RC. (A) Grafico PCA degli acidi biliari nei gruppi Controllo, Modello, BJQF, BSF, JPF e QCF. (B) Diagramma a barre del rapporto di variazione nel gruppo Modello rispetto al Controllo. (C) Diagramma a barre del rapporto di variazione nel gruppo BJQF rispetto al Modello. (D) Diagramma a barre del rapporto di variazione nel gruppo BSF rispetto al Modello. (E) Diagramma a barre del rapporto di variazione nel gruppo JPF rispetto al Modello e (F) Diagramma a barre del rapporto di variazione nel gruppo QCF rispetto al Modello. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Diagramma a violino delle BA differenziali in ciascun gruppo di confronto. (A) BA differenziali in BJQF rispetto al Modello. (B) BA differenziali in BSF rispetto al Modello. (C) BA differenziali in JPF rispetto al Modello e (D) BA differenziali in QCF rispetto al Modello. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Correlazione tra acidi biliari fecali e abbondanza microbica intestinale
È stata eseguita un’analisi di correlazione di Spearman tra i phyla differenziali e gli acidi biliari (AB) differenziali (Figura 6A–F, Figura 7A–D). I grafici a corde mostrano le correlazioni con |r| ≥ 0,8 (Figura 6B, 6D, 6F). Nel confronto modello vs. controllo, il 23-DCA era correlato positivamente con Saccharibacteria e Firmicutes, e negativamente con Proteobacteria e Bacteroidetes (Figura 6B). Nel confronto BJQF vs. modello, Proteobacteria era associato a TLCA-3S, LCA-3S, TCA, α-MCA, 6,7-DKLCA, HCA, CDCA e THCA (Figura 6D). Nel confronto BSF vs. modello, Proteobacteria mostrava correlazione positiva con TDCA, 6,7-DKLCA e LCA-3S; Saccharibacteria era correlato positivamente con GUDCA e 23-DCA (Figura 6F).
Figura 6: Correlazioni tra acidi biliari differenziali nelle feci (AB) e l'abbondanza di batteri differenziali a livello di phylum. (A, C, E) Analisi di correlazione di Spearman per i gruppi Controllo vs. Modello, BJQF vs. Modello e BSF vs. Modello, rispettivamente. (B, D, F) Diagrammi a corde corrispondenti che illustrano le correlazioni forti (|r| ≥ 0,8) per i gruppi Controllo vs. Modello, BJQF vs. Modello e BSF vs. Modello, rispettivamente. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I grafici a corde mostrano correlazioni con |r| ≥ 0,8 (Figura 7B, 7D). Nel confronto tra modello JPF e modello vs., Saccharibacteria era negativamente associato a TLCA-3S, LCA-3S e HCA, e positivamente correlato a 23-DCAFigura 7B). Nel confronto tra QCF e modello, Saccharibacteria era correlata negativamente con HCA, CA, LCA-3S, THCA e TLCA-3S, e correlata positivamente con 23-DCA (Figura 7D). Questi risultati indicano che diverse formulazioni della medicina tradizionale cinese modulano la rete di interazione batteri–acidi biliari attraverso schemi distinti.
Figura 7: Correlazioni tra acidi biliari differenziali nelle feci (AB) e l'abbondanza di batteri differenziali. (A, C) Analisi di correlazione di Spearman per i gruppi JPF vs. Modello e QCF vs. Modello, rispettivamente. (B, D) Rispettive rappresentazioni a diagramma a corde che illustrano le correlazioni forti (|r| ≥ 0,8) per i gruppi JPF vs. Modello e QCF vs. Modello. Il rosso indica correlazioni positive, mentre il blu indica correlazioni negative. p < 0,05, p < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati grezzi sono stati caricati nel database NCBI Sequence Reads Archive (SRA) (Numero di accessione: PRJNA749732). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA749732
Discussione
Questo studio indaga il meccanismo terapeutico di BJQF e delle sue formule sub-componenti nel ridurre la colite ulcerosa (UC) indotta da DSS attraverso l'asse metabolico microbiota intestinale–acidi biliari. Questa analisi multi-omiche suggerisce che BJQF esercita effetti anti-colite ripristinando la disbiosi microbica associata all'UC e normalizzando il pool fecale di acidi biliari. Le sue formule sub-componenti mostrano distinti effetti regolatori specifici per modulo, con JPF che presenta un'efficacia più simile a quella della formula completa, rivelando il ruolo centrale della strategia Jianpi. Gli autori identificano inoltre 23-DCA come un nodo chiave di acidi biliari che collega il rimodellamento microbico e il miglioramento dell'UC, e TLCA-3S/LCA-3S come possibili biomarcatori di efficacia.
Il ripristino della disbiosi microbica mediato da BJQF è potenzialmente associato alla normalizzazione della concentrazione di acidi biliari e alla riduzione dell'infiammazione. L'UC è determinata da una disregolazione della rete immunitaria-microbiota-metabolismo, e uno squilibrio nei phyla principali è una caratteristica tipica sia nei pazienti che nei modelli animali10. Questi risultati confermano che i ratti con UC indotta da DSS mostrano una riduzione di Firmicutes e Lactobacillus, e un aumento di Bacteroidetes e Proteobacteria — coerente con i profili clinici dell'UC11. BJQF e JPF hanno invertito in modo più efficace queste anomalie, mentre BSF e QCF hanno mostrato effetti moderati. Considerando che taxon appartenenti a Firmicutes come Lactobacillus e Clostridium sono noti per possedere il corredo enzimatico fondamentale per la biosintesi degli acidi biliari secondari12, ciò suggerisce un possibile legame associativo: BJQF, in particolare il suo modulo Jianpi, ripristina Firmicutes con capacità di biosintesi degli acidi biliari, il che potrebbe potenziare la biotrasformazione degli acidi biliari secondari e correggere il disturbo metabolico. A livello di genere, BJQF e JPF hanno inoltre invertito le alterazioni indotte dall'UC in Bacteroides, Ruminococcus_2, Enterorhabdus e Corynebacterium_1, contribuendo ulteriormente a riparare la disbiosi e le funzioni correlate alla sintesi degli acidi biliari.
Il ripristino della disbiosi microbica può contribuire alla normalizzazione della piscina di acidi biliari (BA), un meccanismo metabolico chiave degli effetti anti-colitici. Il metabolismo degli acidi biliari dipende fortemente dall'attività microbica, e gli acidi biliari secondari sono fondamentali per l'omeostasi immunitaria e l'integrità della barriera13. I dati ottenuti con LC-MS/MS mostrano che i ratti con colite ulcerosa (UC) presentano una riduzione degli acidi biliari secondari protettivi (23-DCA, 3-oxo-DCA, DLCA) e un accumulo di acidi biliari solfati (TLCA-3S, LCA-3S), in accordo con precedenti osservazioni relative al disturbo del metabolismo degli acidi biliari associato all'UC14. Gli acidi biliari solfati hanno una scarsa assorbibilità intestinale e non possono entrare nella circolazione enteropatica15; il loro accumulo riflette un alterato metabolismo degli acidi biliari ed è associato all'attivazione di vie pro-infiammatorie16. Tutte le formulazioni hanno invertito questo squilibrio, con BJQF e JPF che hanno mostrato gli effetti più marcati.
L'analisi di correlazione conferma che il 23-DCA è il nodo chiave di BA associato ai cambiamenti nei phyla principali: correlato positivamente con Firmicutes e negativamente con Proteobacteria. In quanto BA secondario con effetti antinfiammatori e protettivi sulla barriera17, l'aumento del 23-DCA indotto da BJQF/JPF potrebbe essere attribuito all'arricchimento di Firmicutes e alla biosintesi potenziata, e si associa a una riduzione delle citochine e a un miglioramento dell'istologia. Sulla base di questi risultati correlazionali, gli autori propongono un modello meccanicistico ipotetico: BJQF ripristina l'abbondanza di Firmicutes > potenzia la biosintesi microbica di BA secondari > aumenta il 23-DCA protettivo > inibisce l'infiammazione intestinale. Questo modello deve ancora essere confermato da esperimenti funzionali.
Questo studio stabilisce un collegamento tra la teoria della MTC e la biologia molecolare moderna, mappando i moduli funzionali di BJQF su specifici cambiamenti microbici e metabolici. Il concetto di Jianpi rappresenta il collegamento centrale. In linea con la teoria della MTC del "reciproco rafforzamento tra milza e rene"18, BSF ha mostrato un moderato arricchimento di Firmicutes e un'upregolazione di 23-DCA. QCF ha principalmente arricchito Verrucomicrobia (Akkermansia) e regolato il metabolismo degli xenobiotici, riflettendo l'effetto di "eliminazione del calore-umidità". La formula completa esercita effetti sinergici superiori rispetto a qualsiasi singolo modulo, confermando la razionalità della progettazione dei composti della MTC basata sulla differenziazione dei sindromi.
L'analisi della correlazione rivela inoltre distinti reti di interazione batteri–acidi biliari modellate da ciascuna formula. Queste differenze riflettono caratteristiche regolatorie specifiche dei moduli e forniscono una base per applicazioni cliniche individualizzate: JPF per la colite ulcerosa (UC) dominata da carenza di milza con disbiosi centrata sui Firmicutes, QCF per l'UC dominata da umidità-calore con danno alla barriera mucosale, e BJQF completo per la classica sindrome combinata. In linea con questi risultati, studi recenti supportano anche l'asse microbiota intestinale–acidi biliari come bersaglio terapeutico centrale per l'UC e l'intervento della medicina tradizionale cinese19,20,21,22. La carenza di acidi biliari secondari indotta dalla disbiosi microbica è una caratteristica fondamentale dell'UC attiva, e il ripristino dell'omeostasi degli acidi biliari può alleviare efficacemente l'infiammazione e il danno alla mucosa23.
Questo studio presenta diversi limiti. In primo luogo, tutte le associazioni tra rimodellamento microbico e normalizzazione degli acidi biliari si basano su un'analisi multi-omica di tipo correlazionale; le relazioni causali non sono state validate mediante esperimenti funzionali come il trapianto di microbiota fecale. In secondo luogo, la dimensione del campione è relativamente moderata, il che potrebbe limitare la potenza statistica e la generalizzabilità dei risultati. In terzo luogo, sono stati quantificati soltanto gli acidi biliari fecali; i profili di acidi biliari nel siero e nella mucosa, che riflettono la circolazione enteropatica, non sono stati misurati. In quarto luogo, non sono stati identificati i fitochimici specifici attivi responsabili della regolazione del microbiota e degli acidi biliari. I futuri studi verificheranno le relazioni causali mediante esperimenti di trapianto di microbiota fecale e modelli animali germ-free, identificheranno i componenti attivi chiave del BJQF e condurranno studi pilota clinici per verificarne il valore traslazionale.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
CONTRIBUTO DEGLI AUTORI:
Hongyu Chen ha contribuito alla concettualizzazione, metodologia, validazione, analisi formale, indagine, visualizzazione e stesura della bozza originale del manoscritto. Song Zhao ha contribuito alla metodologia, amministrazione del progetto, indagine, visualizzazione, acquisizione dei fondi e stesura della bozza originale. Luzhou Xu ha contribuito alla concettualizzazione, fornitura delle risorse, revisione e modifica del manoscritto, amministrazione del progetto e supervisione generale dello studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (81774243).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi PCR da 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | Per reazioni di amplificazione genica del gene 16S rRNA |
| Tubi centrifuga sterili da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | Contenitori sterili per raccolta, conservazione e centrifugazione dei campioni |
| Formalina neutra tamponata al 10% | Solarbio Science & Technology | 1008128 | Per la fissazione di campioni di tessuto colonico |
| Sistema 6500 QTRAP MS/MS | Sciex | 5009065 | Per il profilo quantitativo basato su MRM degli acidi biliari fecali |
| Freezer a ultra-bassa temperatura a -80 ºC | Thermo Fisher Scientific | 702-UR | Per la criopreservazione di campioni fecali e di specimini biologici |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539 | Per la rilevazione dell'integrità del DNA mediante elettroforesi su gel |
| Fructus Alpiniae Oxyphyllae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230321 | Materiale vegetale grezzo, 15 g per dose, utilizzato in BJQF e BSF |
| Radix Astragali | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230312 | Materiale vegetale grezzo, 15 g per dose, utilizzato in BJQF e JPF |
| Radix Aucklandiae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230217 | Materiale vegetale grezzo, 6 g per dose, utilizzato in BJQF e QCF |
| Miscela standard di acidi biliari | Sigma-Aldrich | B4893 | Per la calibrazione qualitativa e quantitativa degli acidi biliari fecali |
| Rhizoma Coptidis | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230118 | Materiale vegetale grezzo, 4 g per dose, utilizzato in BJQF e QCF |
| Solfato di dextrano sodico (DSS, 36–50 kDa) | MP Biomedicals | 160110 | Per l'induzione di UC nei ratti, preparato come soluzione da bere al 3,5% (p/v) per 10 giorni consecutivi |
| Radix Glycyrrhizae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230411 | Materiale vegetale grezzo, 5 g per dose, utilizzato in BJQF e JPF |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v7.00 | Per l'analisi statistica, i test di significatività e la creazione di grafici scientifici |
| Kit di colorazione Ematossilina-Eosina (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | Per la colorazione di sezioni di tessuto colonico, osservazione istopatologica e valutazione dell'infiammazione |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità | Eppendorf | 5810R | Per la centrifugazione dei campioni durante l'estrazione di acidi nucleici e la preparazione per metabolomica |
| Metanolo HPLC grado | Merck KGaA | 1.06007.4008 | Per la preparazione dei campioni LC-MS/MS e della fase mobile |
| Piattaforma di sequenziamento Illumina MiSeq | Illumina Inc. | SY-410-1003 | Per il sequenziamento ad alto rendimento del gene 16S rRNA e il profilo della microbiota intestinale |
| Database KEGG | Kanehisa Laboratories | Release 107.0 | Per l'annotazione dei percorsi funzionali microbici |
| Ratti SD maschi di grado SPF | Shanghai Xipu-Bikai Experimental Animal Co., Ltd. | / | 44 ratti del peso di 200 ± 20 g, per la costruzione del modello di UC e esperimenti successivi |
| Lettore di micropiastre Multiskan™ GO | Thermo Fisher Scientific Oy | 51119080 | Per la lettura dell'assorbanza ELISA e la quantificazione delle citochine |
| Spettrofotometro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Per la quantificazione e la valutazione della purezza del DNA genomico batterico fecale |
| Cassette per inclusione in paraffina | Leica Biosystems | 3801520 | Per la disidratazione del tessuto colonico e l'inclusione in paraffina |
| Kit PowerFecal® per l'isolamento del DNA | MoBio (Qiagen) | 12830-50 | Per l'estrazione e la purificazione del DNA genomico batterico fecale |
| Fructus Psoraleae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230129 | Materiale vegetale grezzo, 15 g per dose, utilizzato in BJQF e BSF |
| Ambiente statistico R | R Foundation for Statistical Computing | v4.2.0 | Per l'analisi bioinformatica e il calcolo statistico |
| Kit ELISA per IL-10 nei ratti | Lun Chang Shuo Biotech | YD-30194 | Per il rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di IL-10 |
| Kit ELISA per IL-1β nei ratti | Lun Chang Shuo Biotech | YD-30206 | Per il rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di IL-1β |
| Kit ELISA per TNF-α nei ratti | Lun Chang Shuo Biotech | YD-31063 | Per il rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di TNF-α |
| Radix Sanguisorbae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230309 | Materiale vegetale grezzo, 10 g per dose, utilizzato in BJQF e QCF |
| Radix Scutellariae | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230407 | Materiale vegetale grezzo, 10 g per dose, utilizzato in BJQF e QCF |
| Sistema UPLC Shim-pack UFLC | Shimadzu Corporation | CBM-20A | Per la separazione cromatografica dei campioni di acidi biliari fecali |
| Rhizoma Atractylodis Macrocephalae tostato | Nanjing TCM Co., Ltd. | Batch 20230225 | Materiale vegetale grezzo, 10 g per dose, utilizzato in BJQF e JPF |
Riferimenti
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