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Articolo di ricerca

Effetti di Qi-fu-yin nel migliorare il deficit cognitivo e ridurre la senescenza cellulare nei cervelli di topi 5xFAD

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DOI:

10.3791/72118

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8 settembre 2026

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio valuta il trattamento con Qi-fu-yin (QFY) in topi 5xFAD. I risultati mostrano che l'amministrazione di QFY è associata a un miglioramento delle prestazioni di apprendimento e memoria, a una riduzione del deposito cerebrale di Aβ e della senescenza cellulare, e a un attenuato danno strutturale sinaptico nella corteccia cerebrale.

Abstract

Sebbene il meccanismo d'azione del Qi-fu-yin (QFY), una prescrizione della medicina tradizionale cinese, non sia ancora completamente compreso, esso ha mostrato un potenziale terapeutico nella malattia di Alzheimer (AD). Questo studio si è proposto di indagare l'associazione tra il trattamento con QFY e il deterioramento cognitivo nei topi 5xFAD. Abbiamo utilizzato la forza di prensione, andatura, nidificazione coloniale, scatola di trasferimento, test del labirinto acquatico di Morris e ELISA per valutare i livelli di Amiloide-β proteina 1-42 (Aβ1-42), Aβ1-40, la proteina associata alla crescita 43 (GAP-43), la sinaptofisina (SYN) e la proteina della densità postsinaptica 95 (PSD-95) nei cervelli di topi 5xFAD. L'analisi citochinica con tecnologia Luminex è stata utilizzata per quantificare i livelli del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) nella corteccia. La quantità del fenotipo secretorio associato alla senescenza β-galattosidasi (SA-β-Gal), Aβ deposizione e spine dendritiche nei cervelli degli animali sono state misurate mediante SA-βcolorazione con Gal, immunohistochimica e colorazione di Golgi-Cox, rispettivamente. Il trattamento con QFY ridusse in modo significativo l'A corticaleβ carico di placche e ridotta espressione di p21 nei topi 5xFAD, secondo i test di immunofluorescenza. Nei topi 5xFAD, la terapia con QFY ha notevolmente migliorato le prestazioni di apprendimento e memoria, alleviando invecchiamento, e aumentato i livelli delle proteine GAP-43, PSD-95 e SYN nella corteccia dei topi. Dopo il trattamento con QFY, si è osservata una diminuzione significativa di Aβ placca e SA-β-Attività di Gal nel cervello, così come Aβ1-42 e Aβ1-42/Aβ1-40 livelli nell'ippocampo. I livelli di IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A e IFN-γ erano notevolmente ridotte nella corteccia dei topi 5xFAD. Le analisi PCA e di correlazione di Pearson hanno dimostrato una forte associazione negativa tra le citochine SASP e i livelli delle proteine sinaptiche. Questi risultati suggeriscono un'associazione tra il trattamento con QFY e il miglioramento del declino cognitivo legato all'età e dei fenotipi di senescenza cellulare nei topi 5xFAD, insieme a un attenuato danno strutturale sinaptico. Tali risultati supportano ulteriori indagini sull'uso di QFY come potenziale candidato terapeutico per la malattia di Alzheimer.

Introduzione

Alzheimer's disease (AD)1 is the most prevalent form of dementia, characterized by amyloid-β protein (Aβ), hyperphosphorylated tau proteins (P-Tau), synaptic loss, and chronic inflammation. Currently available medications for AD have a number of side effects and are unable to stop the disease's progression2,3,4,5.

Senescence, which manifests as organism-wide disruptions across cellular and interstitial microenvironments rather than localized organ-specific alterations, is a key risk factor in AD pathogenesis. This systemic dysregulation distinguishes AD progression from single tissue-pathology models by fundamentally changing homeostatic mechanisms across biological systems6,7. Although cellular senescence initially serves as a homeostatic regulatory mechanism, the accumulation of senescent cells eventually causes progressive tissue degradation and persistent inflammatory cascades, fundamentally disrupting physiological homeostasis8. The ensuing inflammation may harm synapses and impair cognitive function9,10.

Cellular senescence is a complex cellular stress response characterized by telomere shortening, permanent cell-cycle arrest, and altered secretory activity11. Additional hallmarks include enlarged, flattened cell morphology, positive senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, lipofuscin accumulation, and secretion of SASP factors12. Memory formation is affected by the notable decline in the levels of proteins associated with synaptic plasticity of axons and dendrites, which occurs with cellular senescence13,14. Because synaptic plasticity is essential for learning and memory, disruptions in synaptic proteins contribute to cognitive impairment. These proteins include GAP-43, SYN, and PSD-95. Undoubtedly, synaptic function is affected by reductions in dendritic numbers and functional abnormalities in the brains of the elderly15.

QFY is a traditional Chinese medicine formula derived from Jing Yue Quan Shu. It is composed of Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae), Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey (Orobanchaceae), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Apiaceae), Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Fabaceae), Atractylodes macrocephala Koidz (Asteraceae), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). Research has demonstrated that QFY significantly ameliorates cognitive dysfunction in rats with diabetes-induced brain injury16. Our previous study found that QFY could improve cognitive learning and memory functions impairment in 5xFAD and APP/PS1 mice. In addition, QFY demonstrated high safety in non-clinical studies, and no obvious acute, subacute, or long-term toxic reactions were observed17,18,19. Analysis of the clinical therapeutic effect of QFY showed that AD patients experienced a significant increase in their capacity for activities of daily living and MMSE scores after QFY treatment20. Following three consecutive days of QFY administration in male Sprague-Dawley rats, ten prototype QFY-derived components, including butylidenephthalide, butylphthalide, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, and zingibroside R1, were detected in cerebrospinal fluid21,22. However, the therapeutic mechanism of QFY in AD is still unclear. In this study, we investigated the association between QFY treatment, cellular senescence, and AD-related pathological changes in 5xFAD mice.

Although previous studies have demonstrated the neuroprotective effects of QFY in AD models, the specific involvement of cellular senescence in mediating these effects remains unexplored. Moreover, whether QFY confers cognitive benefits through senescence‑associated synaptic preservation, rather than solely through amyloid‑β reduction, has not been addressed. The present study was therefore designed to investigate whether QFY treatment attenuates cellular senescence and whether this attenuation is associated with improved synaptic plasticity in 5xFAD mice.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shandong (SDUTCM20221101001).

Farmaci

La polvere secca in crema granulare QFY è stata preparata e testata presso il Centro di Ricerca e Sviluppo Farmaceutico Houpu di Lunan. Donepezil e Memantina sono stati acquistati da Shanghai Yuanye Technology. Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi 5xFAD con un peso corporeo iniziale compreso tra 19 e 27 g. La dose di QFY è stata ricavata dalla dose clinica umana di 43 g/giorno, corrispondente a 16,297 g/giorno dopo l'adeguamento alla polvere secca in crema granulare QFY. La dose media per il presente esperimento è stata calcolata sulla base della dose clinica umana (16,297 g/70 kg × 9,1 = 2,11861 g/kg/giorno). La dose alta è stata stabilita al doppio della dose media (4,24 g/kg/giorno), mentre la dose bassa è stata fissata alla metà della dose media (1,06 g/kg/giorno). Tutte le soluzioni farmacologiche sono state somministrate in un volume di 0,1 mL ogni 10 g di peso corporeo.

Come controllo positivo, è stata impiegata l'amministrazione combinata di donepezil e cloridrato di memantina. Le dosi sono state determinate in riferimento alle dosi attualmente utilizzate in ambito clinico (rispettivamente 10 mg/die e 20 mg/die) e ai dati precedenti del nostro gruppo di ricerca, ottenendo un regime di 1,0 mg/kg/die di donepezil più 2,8 mg/kg/die di memantina, per una dose combinata totale di 3,8 mg/kg/die. La concentrazione finale della miscela di donepezil–memantina è stata preparata a 0,38 mg/mL, calcolata come 3,8 mg/kg diviso per il volume di somministrazione di 0,1 mL ogni 10 g di peso corporeo.

Le soluzioni di QFY a dose bassa, media e alta sono state preparate come segue: 5,3 g, 10,6 g e 21,2 g di polvere secca di QFY sono stati posti ciascuno in becker separati da 100 mL, mescolati con 30 mL di acqua purificata mediante agitazione accurata, trasferiti in cilindri graduati e portati al volume finale di 50 mL con acqua purificata, ottenendo concentrazioni massiche finali rispettivamente di 0,106 g/mL, 0,212 g/mL e 0,424 g/mL. Per il controllo positivo, 5 mg di donepezil e 14 mg di memantina sono stati sciolti in acqua purificata e portati al volume finale di 50 mL. Gli animali di ciascun gruppo hanno ricevuto una volta al giorno la soluzione di farmaco corrispondente mediante somministrazione orale tramite sondino.

Animali

I topi transgenici 5xFAD [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] sono stati allevati in laboratorio. Gli animali sono stati mantenuti tutti in un ambiente SPF presso l'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shandong, con una temperatura di 22–24 oC, un'umidità del 50–60% e un ciclo luce-buio di 12 ore. Cibo e acqua sono stati forniti agli animali in ogni momento.

A 2,5 mesi di età, topi maschi 5xFAD sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi: 5xFAD non trattati, donepezil più memantina, QFY a basso dosaggio, QFY a dosaggio medio e QFY ad alto dosaggio. Coetanei maschi di tipo selvaggio (WT) servivano da gruppo di controllo WT. I trattamenti sono stati somministrati una volta al giorno per 220 giorni. (Figura 1).

Test comportamentali

Test della forza della presa

La forza muscolare scheletrica degli arti anteriori dei topi è stata misurata utilizzando un dinamometro per la forza di prensione23. Durante l'esperimento, il dispositivo di prova è stato posizionato in orizzontale, in modo che il topo rimanesse parallelo alla superficie del tavolo. Dopo aver acceso il dispositivo, il topo è stato posizionato delicatamente sulla piastra di prensione. Quando il topo aveva afferrato saldamente la piastra, la sua coda veniva tirata all'indietro con una forza costante fino a quando il topo non lasciava la presa. La forza massima di prensione è stata registrata. Questa misurazione è stata ripetuta tre volte e la media di questi valori è stata utilizzata per determinare la forza di prensione del topo.

Test della deambulazione

La regolarità dell'andatura dei topi è stata misurata utilizzando CatWalk XT. L'esperimento è stato suddiviso in un periodo di addestramento e un periodo di prova24. Un giorno prima, i topi sottoposti a esperimento sono stati trasferiti nella stanza sperimentale per permettere loro di adattarsi al nuovo ambiente. Durante il periodo di addestramento, i topi venivano posizionati nel punto di partenza e percorrevano autonomamente il canale fino al punto finale. Ogni topo veniva addestrato tre volte al giorno. Dopo 3 giorni di addestramento (fino a quando ciascun topo riusciva a percorrere rapidamente il canale), i topi venivano riportati nella gabbia. Il periodo di prova era identico al periodo di addestramento e il software del computer analizzava automaticamente ogni traiettoria di movimento. Punti verdi venivano visualizzati se la traiettoria era valida, punti arancioni se non lo era, e per ciascun topo dovevano essere presenti almeno tre punti verdi validi, che venivano analizzati mediante il software CatWalkXT 10.0.

Test della scatola di trasferimento

Il test della scatola di trasferimento è stato utilizzato per valutare la capacità di evitamento attivo condizionato nei topi25. L'apparato consisteva in una scatola di trasferimento (18 cm x 18 cm) collocata all'interno di una camera fonoassorbente.  L'esperimento comprendeva un periodo di apprendimento di 4 giorni seguito da un periodo di prova di 1 giorno.  Ogni giorno di apprendimento, ai topi veniva concesso un periodo di adattamento di 120 s nella scatola di trasferimento prima dell'inizio dell'addestramento. Ogni prova iniziava con uno stimolo condizionato di 6 s (tono a 70 dB, 1000 Hz abbinato a una luce da 500 lux), seguito da una scossa ai piedi di 3 s, 0,3 mA erogata attraverso il pavimento a griglia, e terminava con un intervallo interprova di 12 s. Se il topo passava al compartimento opposto durante lo stimolo condizionato, la scossa veniva omessa e la risposta veniva registrata come evitamento attivo. Se il topo non attraversava durante lo stimolo condizionato ma lo faceva durante la scossa ai piedi, la risposta veniva registrata come evitamento passivo.  Se il topo non attraversava per tutta la durata della prova, la risposta veniva registrata come fallimento dell'evasione.  L'addestramento è stato ripetuto per 4 giorni consecutivi con 30 prove al giorno. Durante il periodo di prova (giorno 5), la scossa ai piedi è stata omessa, mentre tutti gli altri parametri sono rimasti invariati rispetto al periodo di apprendimento. Il numero di risposte di evitamento attivo è stato registrato come misura principale di apprendimento e memoria.

Labirinto acquatico di Morris

Il test del labirinto acquatico di Morris è stato utilizzato per valutare le capacità di apprendimento spaziale e di memoria negli animali sperimentali26. L'esperimento è stato condotto in una vasca con un diametro di 120 cm e una profondità di 50 cm. La vasca è stata riempita con acqua bianca torbida, mantenuta alla temperatura di 21 °C. Una piattaforma con un diametro di 10 cm è stata posizionata a 1 cm sotto la superficie dell'acqua in uno dei quadranti. Intorno alla vasca sono stati disposti indizi visivi come punti di riferimento spaziali per i topi. La fase di apprendimento è stata svolta per quattro giorni consecutivi, con ciascuna sessione giornaliera che iniziava in uno di tre quadranti. Le posizioni di partenza variavano in modo pseudo-casuale tra i quattro punti cardinali. Ogni prova terminava quando l'animale raggiungeva con successo la piattaforma. È stato stabilito un tempo massimo di prova di 60 s; se l'animale non riusciva a individuare la piattaforma entro questo intervallo, veniva guidato con attenzione verso di essa. Dopo aver raggiunto la piattaforma, all'animale veniva concesso un breve riposo di 10 s prima di essere riportato nella sua gabbia di provenienza. Al termine del periodo di apprendimento, il periodo di prova inizia 24 h dopo. I topi vengono posizionati dal quadrante opposto rispetto a quello della piattaforma al giorno 5. Durante il periodo di prova vengono registrati la latenza di fuga, il tempo trascorso nel quadrante bersaglio e il numero di attraversamenti della zona originaria sott'acqua dove si trovava la piattaforma.

Test di nidificazione in colonia

Le attività quotidiane degli animali sperimentali sono state valutate utilizzando il test del nido coloniale27. L'esperimento è durato 24 h, con tre animali per gruppo. Dopo la somministrazione del farmaco nello stesso giorno, sono state preparate nuove gabbie foderate con 6 g di carta morbida per la costruzione del nido, e sono state scattate fotografie a 6 h, 12 h e 24 h. Alla fine dell'esperimento, la carta era dispersa in tutta la gabbia, senza alcun morso: 1 punto. I pezzi di carta erano raggruppati lateralmente nella gabbia, ma in modo allentato, senza formazione di nidi né evidente strappo o piegatura: 2 punti; i pezzi di carta raccolti e piegati in un nido formato ma relativamente piatto, senza evidente strappo: 3 punti; un nido profondo con carta ampiamente sminuzzata: 4 punti.  Alla fine dell'esperimento, il cartoncino intatto (definito come frammenti di carta con peso >0,1 g non sminuzzati né incorporati nel nido) è stato accuratamente raccolto, essiccato all'aria e pesato mediante una bilancia elettronica (precisione: 0,01 g). 

Campionamento e raccolta dei campioni

Sono stati raccolti campioni solo dai gruppi WT, 5xFAD e QFY (2,12 g/kg/giorno). Dopo l'asfissia con CO2, le teste sono state staccate, l'emisfero destro è stato rapidamente aperto per separare l'ippocampo e la corteccia, risciacquato con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) e posto in provette da 1,5 mL congelate in azoto liquido. I campioni sono stati conservati a -80 oC per analisi biochimiche. L'emisfero sinistro è stato fissato per immersione in paraformaldeide al 4% per 24 h, disidratato per immersione in etanolo assoluto, incluso in paraffina, sezionato a 5 µm e deparaffinizzato per la rilevazione immunohistochimica.

Saggio immunoenzimatico (ELISA)

Gli ELISA sono stati eseguiti per quantificare i livelli delle proteine bersaglio nei tessuti cerebrali. I contenuti di Aβ1–40 e Aβ1–42 negli omogenati dell'ippocampo sono stati misurati utilizzando kit commerciali, mentre i livelli corticali di GAP-43, PSD-95 e SYN sono stati determinati mediante kit provenienti da Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry. Tutte le procedure sono state eseguite rigorosamente secondo i protocolli dei produttori. Le serie standard sono state preparate mediante diluizione seriale seguendo le istruzioni del kit. Il layout della micropiastra includeva pozzetti vuoti, pozzetti per gli standard, pozzetti per campioni 5xFAD, pozzetti per campioni trattati con QFY (2,12 g/kg/giorno) e pozzetti per campioni di tipo selvaggio. Prima del caricamento, tutti i campioni sono stati diluiti di due volte con il diluente fornito. I reagenti sono stati aggiunti tenendo la punta della pipetta perpendicolare al fondo del pozzetto, quindi delicatamente agitati per assicurare un mescolamento completo.

Dopo la sigillatura della piastra, l'incubazione iniziale è stata eseguita a 37 °C per 30 min. Durante questo periodo, il buffer di lavaggio è stato preparato diluendo la soluzione concentrata con acqua ultrapura in rapporto 1:29 (1 mL di concentrato in 29 mL di acqua). Al termine dell'incubazione, la pellicola sigillante è stata rimossa, il liquido è stato eliminato e la piastra è stata asciugata tamponando delicatamente. Ciascun pozzetto è stato quindi riempito con 200 µL di buffer di lavaggio, lasciato in posa per 30 s e svuotato; il ciclo è stato ripetuto per 5 volte. Successivamente, il reagente marcato con enzima (50 µL) è stato aggiunto in tutti i pozzetti tranne i bianchi, e la piastra è stata nuovamente sigillata e incubata a 37 °C per 30 min, seguita da un identico passaggio di lavaggio ripetuto per cinque cicli.

Per lo sviluppo del colore, sono stati aggiunti 50 µL di soluzione cromogenica A in ogni pozzetto, seguiti da 50 µL di soluzione cromogenica B, con un'accurata miscelazione dopo ciascun aggiunta. La piastra è stata incubata a 37 °C al buio per 10 minuti. La reazione enzimatica è stata interrotta aggiungendo 50 µL di soluzione di arresto per ogni pozzetto, che ha trasformato immediatamente il colore blu in giallo. L'assorbanza (densità ottica) è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre, con i pozzetti vuoti come riferimento; tutte le letture sono state effettuate entro 15 minuti dall'arresto della reazione.

Luminex

I livelli corticali dei fattori SASP sono stati misurati utilizzando il kit Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay, seguendo tutte le procedure indicate dal produttore. I reagenti sono stati prelevati dallo stoccaggio a 4 °C e lasciati equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Le soluzioni madri degli standard sono state diluite in serie per generare una curva standard a sette punti, più un pozzetto bianco, secondo il protocollo del kit. Le perle magnetiche sono state pre-miscelate e diluite alla concentrazione operativa raccomandata; gli anticorpi di rilevamento sono stati preparati come soluzioni di lavoro; e il concentrato del buffer di lavaggio è stato diluito a 1x con acqua deionizzata. Il coniugato PE-streptavidina è stato anch'esso diluito a 1x utilizzando il buffer di diluizione fornito.

Per il saggio, 50 µL di sospensione di perline, standard, controlli di qualità e campioni di tessuto diluiti (5,6 µg/µL) sono stati aggiunti in sequenza alle pozzette designate secondo la disposizione della piastra. La piastra è stata quindi sigillata e incubata tutta la notte a 4 °C con agitazione orbitale a 800 rpm. Dopo l'incubazione, le perline sono state lavate tre volte con 200 µL di tampone di lavaggio per pozzetta. Successivamente, sono stati aggiunti 50 µL di anticorpo di rilevamento preparato in ciascuna pozzetta, e la piastra è stata incubata a temperatura ambiente per 1 h con agitazione a 800 rpm. Dopo altri tre cicli di lavaggio, sono stati aggiunti 50 µL di soluzione lavorativa di PE-streptavidina, e la piastra è stata incubata per ulteriori 30 min a temperatura ambiente nelle stesse condizioni di agitazione. È stato eseguito un ultimo lavaggio (tre volte con 200 µL di tampone di lavaggio), dopo di che sono stati aggiunti 150 µL di tampone di lavaggio in ciascuna pozzetta, e la piastra è stata agitata a temperatura ambiente per 2 min a 800 rpm prima della lettura sull'apparecchio Bio-Plex.

Colorazione per SA-β-Gal e immunohistochemia

La colorazione SA-β-Gal è stata eseguita secondo le istruzioni del kit Senescence β-Galactosidase Staining Kit. Dopo la colorazione SA-β-Gal, le sezioni sono state sottoposte a recupero dell'antigene mediante riscaldamento in tampone citrato (pH 6,0). L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata incubando le sezioni in una soluzione bloccante per la perossidasi per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni sono state incubate con un anticorpo monoclonale anti-Aβ₁-₄₂ di coniglio (1:400) a 4 °C durante la notte. Dopo il lavaggio, le sezioni sono state incubate con un anticorpo secondario IgG anti-coniglio/topo per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo ulteriori lavaggi, la reattività immunologica è stata rivelata con DAB per 2 minuti. Infine, le sezioni sono state disidratate, chiarificate e montate con resina neutra per l'esame microscopico.

Immunofluorescenza

Per la colorazione mediante immunofluorescenza, le sezioni in paraffina sono state disparaffinate nello xilene (3 × 15 min) e riidratate attraverso una serie di etanolo a concentrazione decrescente (100%, 95% e 75%; 2 × 5 min ciascuno). Il recupero dell'antigene è stato eseguito immergendo le sezioni in tampone di citrato sodico 1x a 95 °C per 30 min, quindi raffreddando gradualmente a temperatura ambiente. Dopo tre risciacqui con soluzione salina tamponata al fosfato contenente Tween 20 (PBST) (5 min ciascuno), le sezioni sono state permeabilizzate e bloccate con siero di capra normale al 10% contenente Triton X‑100 allo 0,3% per 90 min a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni sono state incubate con anticorpi primari contro p21/CIP1/CDKN1A (1:200) e Aβ₁‑₄₂ (1:400) a 37 °C per 2 h. Dopo quattro lavaggi con PBST (5 min ciascuno), le sezioni sono state incubate con anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor, specifici per la specie, (1:500) a 37 °C per 2 h al buio. Dopo un ulteriore lavaggio (4 × 5 min in PBST), le sezioni sono state montate con un mezzo di montaggio antifade contenente DAPI e analizzate mediante microscopio a fluorescenza.

Colorazione Golgi-Cox

La colorazione Golgi-Cox è stata eseguita utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Le Soluzioni A e B sono state miscelate 24 ore prima dell'esperimento. Dopo l'eutanasia dei topi, i tessuti cerebrali sono stati rapidamente rimossi, risciacquati con PBS e immersi nella miscela delle Soluzioni A e B. I tessuti sono stati conservati a temperatura ambiente al buio per 6 ore, dopo di che la soluzione di impregnazione è stata sostituita con soluzione fresca e l'incubazione è proseguita per ulteriori 2 settimane a temperatura ambiente al buio (almeno 2 mL di soluzione di impregnazione per ogni tessuto cerebrale). Successivamente, i tessuti sono stati trasferiti nella Soluzione C e incubati per 24 ore, quindi la soluzione è stata sostituita con Soluzione C fresca e l'incubazione è continuata per ulteriori 7 giorni a temperatura ambiente al buio. I tessuti cerebrali sono stati sezionati con uno spessore di 100 µm utilizzando un vibratomo. I tagli sono stati montati su vetrini rivestiti con gelatina e lasciati asciugare a temperatura ambiente per 3 giorni. I vetrini sono stati risciacquati due volte con acqua distillata (5 minuti ciascuno), quindi immersi in una miscela di Soluzione D, Soluzione E e acqua distillata (rapporto 1:1:2) per 15 minuti. Dopo altri due risciacqui con acqua distillata (5 minuti ciascuno), i tagli sono stati disidratati mediante soluzioni alcoliche graduali (50%, 75% e 95%; 5 minuti ciascuna), seguiti da quattro risciacqui in etanolo assoluto (4 minuti ciascuno) e tre risciacqui in xilene (5 minuti ciascuno). Infine, i preparati sono stati coperti con coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio. Le immagini sono state acquisite al microscopio e la densità delle spine dendritiche è stata quantificata utilizzando ImageJ.

Analisi statistica

Tutti i risultati sono stati riportati come media ± DS. I dati sono stati analizzati e rappresentati graficamente utilizzando GraphPad Prism 8.1.0. Per il confronto tra due gruppi è stato utilizzato il test t di Student. Per i confronti che coinvolgevano più gruppi è stata utilizzata un'ANOVA a un fattore, con confronti a coppie effettuati mediante il test di Dunnett. La significatività statistica è stata stabilita a p < 0,05.

Analisi multivariata e delle correlazioni

È stata eseguita un'analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando GraphPad Prism 8.0.1 per visualizzare il raggruppamento dei fattori SASP (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IFN-γ, CCL3, CCL4 e CCL5) tra i gruppi WT, 5xFAD e QFY (2,12 g/kg/giorno) (n = 8 per gruppo). Il grafico dei punteggi è stato generato in base alle prime due componenti principali. Nessuna trasformazione dei dati è stata applicata prima della PCA. È stata condotta un'analisi della correlazione di Pearson per valutare le relazioni lineari tra i fattori SASP e le proteine sinaptiche (PSD-95, GAP-43 e SYN), nonché tra Aβ₁₋₄₀, Aβ₁₋₄₂ e il rapporto Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀. L'analisi è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism, con una soglia di significatività a due code di p < 0,05. Sono state generate matrici di correlazione e una mappa termica per visualizzare l'intensità e la direzione delle associazioni.

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Risultati

Administration of QFY enhances learning and memory in 5xFAD mice

After QFY administration, a shuttle box test was conducted to assess the conditional active avoidance response of mice (Figure 2A–C). The results showed the number of active avoidances on days 1-4 (Figure 2A, p < 0.05) and the area under the curve (AUC) of active avoidance (Figure 2B, p ...

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Discussione

La plasticità sinaptica neurale svolge un ruolo chiave nella funzione cognitiva. Nei cervelli dei pazienti con AD, i depositi di Aβ si diffondono in diverse regioni, causando direttamente danni strutturali alle sinapsi, perdita di sinapsi eccitatorie e declino cognitivo28. GAP-43 (una proteina della membrana presinaptica)29, PSD-95 (una proteina di ancoraggio localizzata nella membrana postsinaptica)30 e SYN (una fosfoproteina associata alle vescicol...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (82205078, 82374062), della Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2026MS1293, ZR2021QH157), del Progetto di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Shandong (M20251730), dei Progetti di Scienza e Tecnologia della Regione Autonoma del Tibet, Cina (XZ202601ZY0167), e del Programma di Guida all'Innovazione Tecnologica della Provincia di Shandong (Fondo per lo Sviluppo Scientifico e Tecnologico Locale guidato dal Governo Centrale) (YDZX2023137), con il titolo del progetto 'Sviluppo e Ricerca sull'Industrializzazione delle Capsule Rivestite Enteriche Tongli come Medicina Tradizionale Cinese di Classe 1'.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Farmaci
DonepezilShanghai Yuanye Technologylot.J15HB188725
MemantinaShanghai Yuanye Technologylot. J21HB189391
Qi-fu-yinCentro di Ricerca e Sviluppo Houpu, Lunan Pharmaceuticallot. 2209001
Test comportamentali
CatWalk XTNoldusCatWalkXT 10.0 software
Dinamometro per la forza della presaBileadbiosciBLD-ZL-20
Labirinto acquatico di MorrisShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd120 cm
Scatola di trasferimentoShanghai Xinruan Information Technology Co., LtdXR-XC404
Anticorpi
Anti-Aβ1-42 anticorpoAbcamCat# ab201061
Anticorpo anti-p21/CIP1/CDKN1ANovus BiologicalsCat# NBP3-15661
Kit di saggio
Aβ1-40 kit ELISAThermo Fisher ScientificCat# KHB3482
Aβ1-42 kit ELISAThermo Fisher ScientificCat# KHB3442
Kit Bio-Plex Pro Cytokina Mouse 23-plexR&D SistemiCat# LXLBM23-1
kit ELISA per GAP-43Industria Jiangsu degli immunodosaggi enzimaticiCat# MM-47506M1
kit per colorazione di Golgi-CoxBeiJing Biolead Biology Sci & Tech CoCat# PK401
kit ELISA per PSD-95Industria Jiangsu per saggi immunoenzimaticiCat# MM-45953M1
Senescenza βKit per la colorazione della galattosidasiBeyotimeCat# C0602
Kit ELISA per la sinaptofisina (SYN)Industria Jiangsu degli immunodosaggi enzimaticiCat# MM-46504M1
Prodotti chimici & Reagenti
Anti-IgG coniglio e topo (anticorpo secondario)StarterCat# S0C1001
cromogeno DABAvviatoreCat# S0C1001
Software
CatWalk XTNoldus Information TechnologyVersione 10.0
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Riferimenti

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