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Articolo metodologico

Trapianto intracerebrale neonatale per la sostituzione della microglia e analisi della linea di discendenza in vivo

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DOI:

10.3791/72119

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28 luglio 2026

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1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo consente un trapianto intracerebrale neonatale efficiente di popolazioni microgliali definite, supportando un robusto ingertamento e l'analisi a lungo termine della linea di microglia e l'integrazione in vivo tra più fonti di donatori e modelli riceventi.

Abstract

La sostituzione della microglia tramite trapianto di cellule mieloidi si è affermata come un approccio sperimentale promettente per studiare i processi neurologici e le malattie. Tuttavia, le strategie di trapianto esistenti sono spesso limitate da ingertamento inefficiente, dipendenza dal condizionamento basato sull'irradiazione o flessibilità limitata tra i sistemi donatore e ricevente. Qui descriviamo un protocollo di trapianto intracerebrale neonatale per introdurre popolazioni di microglia purificate (microglie Hoxb8 e non-Hoxb8 ) nel cervello topino in via di sviluppo. Questo metodo consente un efficiente ingertamento e integrazione delle cellule donatrici nel parenchima cerebrale in condizioni fisiologicamente permissive. È importante sottolineare che il protocollo è compatibile con più fonti donatrici, inclusi progenitori ematopoietici embrionali e microglie cerebrali derivate dal postnatale, e può essere applicato su modelli riceventi distinti con microglie endogene ridotte o assenti, inclusi topi condizionati carenti di Csf1r e topi Csf1rΔFIRE . Le cellule donatrici vengono purificate tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e somministrate bilateralmente nei cervelli neonatali di topo utilizzando micropipette di vetro per un parto efficiente e minimamente invasivo. I topi riceventi vengono invecchiati per permettere alle cellule donatrici di espandersi e popolare la nicchia della microglia, e gli esiti vengono valutati tramite analisi istologica della distribuzione e dell'espressione dei marcatori delle cellule donatrici. Questo approccio fornisce una piattaforma robusta e scalabile per studiare l'ontogenesi della microglia e l'integrazione in vivo in contesti sperimentali diversi.

Introduzione

La sostituzione della microglia tramite trapianto di cellule mieloidi è emersa come una strategia potente per sondare la biologia della microglia e come potenziale paradigma terapeutico per le malattie neurologiche. Negli ultimi anni, il campo si è evoluto verso strategie capaci di sostituzione diffusa della microglia nel sistema nervosocentrale 1. Studi recenti hanno dimostrato che macrofagi e progenitori derivati dal donatore possono innestare il cervello, adottare programmi trascrizionali simili ai microglie e, in alcuni casi, migliorare i fenotipi associatialla malattia 2,3,4,5,6,7,8. Questi risultati supportano il concetto che la sostituzione dei macrofagi cerebrali possa essere sfruttata per studiare e potenzialmente modificare i processi neurologici della malattia.

Una sfida centrale nel trapianto di microglia è ottenere un ingertamento robusto minimizzando al contempo i confondimenti sperimentali. Molte strategie di sostituzione consolidate si basano su irradiazioni, chemioterapia o paradigmi di esaurimento della microglia per generare una nicchiainnestabile 6,9,10,11,12,13. Nonostante la loro efficacia, questi approcci possono indurre la senescenza della microglia, disturbare la barriera emato-encefalica e alterare la segnalazione infiammatoria, tutti elementi che possono complicare l'interpretazione del comportamento delle celluledonatrici 9,14. Lavori più recenti hanno iniziato a esplorare approcci indipendenti dal condizionamento o a tossicità ridotta per la sostituzione dellamicroglia 5,8,15.

Il tempismo dello sviluppo è un fattore importante per il successo del trapianto. Il cervello neonatale fornisce un ambiente permissivo che supporta l'espansione delle cellule donatrici e l'integrazione a lungo termine, probabilmente grazie alla riduzione delle barriere strutturali e all'insediamento continuo della nicchia endogena della microglia. Studi recenti di trapianto utilizzando il parto postnatale precoce (P0–P5) dimostrano un robusto innestamento parenchimante e l'acquisizione di un'identità simile a quella dei microglia, rafforzando l'importanza del contesto dello sviluppo per una sostituzioneefficiente 7,8,16,17.

Le microglie Hoxb8 forniscono un sistema particolarmente informativo per studiare i contributi specifici della linea di discendenza alla biologia della microglia. Queste cellule provengono da progenitori ematopoietici embrionali e rappresentano un sottoinsieme definito della microglia parenchimale con conseguenze comportamentali quandodisfunzionali 17,18,19,20,21. Lavori recenti che utilizzano progenitori primari Hoxb8 e sistemi progenitori del recettore microgliale e degli estrogeni (ER)-Hoxb8 dimostrano che queste cellule possono essere espanse, manipolate geneticamente e innestate con successo nel cervello, dove adottano profili trascrizionali simili a quelli delle microglie e caratteristiche funzionali 7,8,17. Questi progressi evidenziano ulteriormente l'utilità degli approcci di trapianto per dissezionare la linea di microglia e l'eterogeneità.

Qui descriviamo una piattaforma di trapianto intracerebrale neonatale ottimizzata per la versatilità tra sistemi di donatore e ricevente. A differenza degli approcci che dipendono da irradiazione o condizionamento sistemico, questo metodo utilizza la consegna bilaterale diretta intracerebrale nei topi neonatali, consentendo il posizionamento di cellule donatrici in un ambiente cerebrale permissivo dallo sviluppo minimizzando al contempo le perturbazioni sistemiche. La tecnica è compatibile con fonti di donatori multipli, inclusi progenitori ematopoietici embrionali e microglie cerebrali derivate dal postnatale, e può essere applicata su modelli riceventi distinti con microglie endogene ridotte o assenti. Un importante vantaggio pratico è che il cranio neonatale sottile permette un'iniezione manuale rapida con micropipette di vetro, eliminando la necessità di perforazioni o fissazioni stereotassiche e mantenendo comunque un ampio innestamento parenchimante.

Insieme, questo approccio fornisce un sistema robusto, flessibile e scalabile per studiare l'ontogenesi della microglia, l'eterogeneità e l'integrazione in vivo in contesti sperimentali diversi. Questo posiziona il trapianto intracerebrale neonatale come un'alternativa complementare e sperimentalmente controllata alle strategie sistemiche di sostituzione della microglia.

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Protocollo

Tutti i metodi e gli esperimenti di questo studio sono stati condotti su topi. Le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. Preparazione delle coppie riproduttive per cucciolate di donatore e ricevente

  1. Posiziona le coppie di riproduttori nella stessa gabbia la sera per iniziare gli accoppiamenti programmati.
  2. Ispezionare ogni mattina le femmine per la presenza di un tappo vaginale e confermare il successo dell'accoppiamento.
  3. Rimuovere le femmine tappate dai maschi e ospitarle individualmente fino al parto, che richiede circa 18–20 giorni.
  4. Maneggia delicatamente le madri incinte per 5 minuti al giorno, per 7–10 giorni prima della nascita, per ridurre lo stress associato alla gestione neonatale.
  5. Esponi le madri a un cotton fioc contenente odore di betadine durante le sessioni quotidiane di maneggiamento per ridurre lo stress materno quando i cuccioli vengono restituiti dopo l'intervento.
  6. Prepara gabbie pulite con materiale per il nido delle femmine in gravidanza prima del parto previsto.

2. Prelievo e lavorazione dei cervelli neonatali

  1. Eutanasiare i topi donatori neonatali (P0–P4) tramite overdose di isoflurano utilizzando un campanellino o una camera chiusa simile dotata di un falso pavimento per prevenire il contatto diretto con l'anestetico.
  2. Una volta che la respirazione cessa e si conferma l'assenza di riflessi, decapita immediatamente.
  3. Preleva tutto il cervello, compresi il cervelletto e i bulbi olfattivi. Mettere i cervelli in 3 mL di soluzione salina equilibrata fredda 1× Hanks (HBSS) in una piastra di Petri di plastica su ghiaccio.
  4. Utilizzando bisturi e pinze sterili, trita il cervello in pezzi di circa 1–2mm 3 .
  5. Trasferire il tessuto cerebrale tritato (1 cervello per tubo di dissociazione del tessuto) in tubi di dissociazione dei tessuti contenenti reagenti enzimatici per la digestione forniti dal sistema di dissociazione del tessuto neurale secondo il protocollo raccomandato dal produttore.
  6. Inserire i tubi in un dispositivo meccanico di dissociazione con capacità di riscaldamento e incubare a 37 °C per 30 minuti utilizzando il programma di dissociazione dei tessuti neurali consigliato dal produttore.
  7. Pre-ammollare filtri cellulari da 70 μm con 400 μL di 1× HBSS.
  8. Fai passare il tessuto dissociato attraverso i colini pre-ammollati che vengono posizionati su un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio.
  9. Lavare i tubi con 10 mL di 1× HBSS e passare attraverso filtri per garantire il massimo recupero cellulare.
  10. Scartare i filtri e centrifugare le celle a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspira il soprandante.
  11. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi di globuli rossi in acqua ultrapura sterile per campione e incubare per 10 minuti a 4 °C.
  12. Spegni la reazione di lisi con 10 mL di 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. Scartare i filtri e centrifugare le celle a 300 × g per 10 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
  14. Determina il numero cellulare usando un emocitometro. L'intervallo tipico di resa della cella è 3,2–4,0 × 106 prima della classificazione.
  15. Risospendere le cellule al 5% di FBS in 1× HBSS alla concentrazione desiderata per la colorazione a valle degli anticorpi.

3. Colorazione degli anticorpi cellulari per la selezione FACS delle popolazioni di microglia

  1. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di colorazione (5% FBS in 1× HBSS) contenente anticorpo bloccante del recettore Fc (CD16/32 purificato, 1:2000) e incubare le cellule per 10 minuti a 4 °C.
  2. Centrifuga le cellule a 240 × g per 3 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
  3. Incubare cellule con anticorpi coniugati fluorescenti (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) in 1 mL di tampone per colorazioni per 30 minuti su ghiaccio al buio.
  4. Centrifuga le cellule a 240 × g per 3 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
  5. Aggiungere un colorante di vitalità (ad esempio, 3 μM DAPI in 1× HBSS) per escludere cellule morte.
  6. Eseguire la selezione FACS utilizzando un classificatore di celle ad alta velocità dotato di laser appropriati per la rilevazione DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC e CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. Usa un ugello da 100 μm con bassa pressione di guaina quando possibile per massimizzare la vitalità della cella. Tieni i tubetti di raccolta dei campioni e le cellule selezionate sul ghiaccio per tutta la procedura.
  8. Usa celle non colorate, controlli di compensazione a singolo colore e controlli fluorescenti meno uno quando necessario per impostare tensioni, compensazione e gate.
  9. Prima le celle di gate per area di scattering frontale rispetto all'area di scattering laterale per escludere i detriti.
  10. I singoletti a porta utilizzano l'altezza di dispersione laterale rispetto alla larghezza di dispersione laterale.
  11. Escludere le cellule morte tramite il gating sulle celle DAPI⁻.
  12. Dalle singolette dal vivo, porta su CD45basso CD11b⁺ microglia.
  13. All'interno della microgliabassa CD45 CD11b⁺, si utilizza GFP e fluorescenza di tdTomato per separare le popolazioni microgliali dei donatori (microglie Hoxb8 : DAPI⁻ CD45basso CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, microglie non-Hoxb8 : DAPI⁻ CD45basso CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Classifica ogni popolazione in tubetti di raccolta sterili contenenti HBSS freddo 1x.
  15. Dopo lo smistamento, rianalizzare una piccola aliquota di cellule selezionate per confermare purezza e vitalità prima del trapianto.
  16. Raccogli le cellule selezionate in HBSS sterile 1× e mantienile sul ghiaccio al buio fino al trapianto.
    NOTA: Le rese tipiche per la microglia Hoxb8 variano da 3,70–4,60 x10 4 cellule e per le microglie non Hoxb8 da 1,10 a 1,14 x10 5 cellule per neonato (P0–P4), anche se le resa possono variare a seconda dell'età, del genotipo e dell'efficienza del processo tissutale. Trapianta le cellule vive purificate il prima possibile, idealmente entro 60 minuti dalla selezione delle cellule.

4. Prelievo e trattamento dei progenitori ematopoietici del fegato fetale

  1. Eutanasiare le madri incinte usando isoflurano al 5% somministrato in ossigeno tramite un vaporizzatore di precisione fino a quando la respirazione cessa e si conferma l'assenza di riflessi.
  2. Dopo un sovradosaggio di isoflurano, eseguire un metodo fisico secondario tramite lussazione cervicale per garantire la morte, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
  3. Rimuovere le corna uterine dai topi gravidi e metterle in freddo 3 mL di 1× HBSS in piastre di Petri di plastica (60 mm × 15 mm).
  4. Dissezionare gli embrioni di E12.5 dall'utero e inserirli in freddo fresco 3 mL di 1× HBSS in piastre di plastica di Petri.
  5. Dissezionare fegato fetale usando pinze fini e inserirli in 3 mL freschi di HBSS freddo 1× contenente il 5% di FBS in piastre di Petri.
  6. Dissociare meccanicamente il tessuto epatico fetale concentrato usando un ago da 26 g e una siringa da 3 mL.
  7. Centrifuga le cellule a 240 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
  8. Lava le celle con 1× HBSS.
  9. Fai passare la sospensione della cella attraverso un colone a 80 μm.
  10. Incubare le cellule in 20 μL di tampone di lisi dei globuli rossi (0,15 M cloruro di ammonio, 1 mM KHCO3) per 5 minuti, seguita dall'aggiunta di 13 mL di 1× HBSS per la tempratura.
  11. Continuare l'incubazione per 5 minuti per lisare i globuli rossi.
  12. Centrifuga le cellule a 200 × g per 5 minuti a 4 °C.

5. Colorazione degli anticorpi cellulari per la selezione FACS delle cellule progenitrici ematopoietiche

  1. Incubare cellule epatiche fetali con anticorpi coniugati fluorescenti (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) in 5% FBS/1% BSA in 1× HBSS per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
  2. Lava le celle con 1× HBSS e centrifuga a 240 × g per 5 minuti a 4 °C.
  3. Aggiungere un colorante di vitalità (ad esempio, 3 μM DAPI in 1× HBSS) per escludere cellule morte.
  4. Eseguire l'ordinamento FACS utilizzando un ordinatore di celle ad alta velocità dotato di laser e filtri appropriati per il rilevamento DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato e GFP.
  5. Usa un ugello da 100 μm con bassa pressione di guaina quando possibile per massimizzare la vitalità della cella. Tieni i tubetti di raccolta dei campioni e le cellule selezionate sul ghiaccio per tutta la procedura.
  6. Usa celle non colorate, controlli di compensazione a singolo colore e controlli fluorescenti meno uno quando necessario per impostare tensioni, compensazione e gate.
  7. Prima celle di gate usando area di scattering frontale rispetto ad area di dispersione laterale per escludere i detriti.
  8. I singoletti a porta utilizzano l'altezza di scatter in avanti rispetto alla larghezza di scatter in avanti, seguiti dall'altezza di scattering laterale rispetto alla larghezza di scatter laterale.
  9. Escludere le cellule morte tramite il gating sulle celle DAPI⁻.
  10. Dai singoletti vivi, escludono le cellule della linea eritroide tramite il gating su cellule Ter119⁻.
  11. All'interno della popolazione Ter119⁻, la porta su cellule progenitriciematopoietiche ad alto livello di Kit è presente.
  12. All'interno dellapopolazione ad alta popolazione DAPI⁻ Ter119⁻ Kit, isolare progenitori positivi alla linea Hoxb8 tramite gating su cellule tdTomato⁺.
  13. Se la linea donatrice contiene anche il reporter Cx3cr1-GFP, si utilizza la fluorescenza della GFP per confermare che la popolazione progenitrice epatica selezionata sia GFP⁻ obassa a questo stadio, distinguendo le cellule progenitrici dalle cellule mieloidi differenziate che esprimono Cx3cr1.
  14. Ordina la popolazione finale DAPI⁻ Ter119⁻Kit high tdTomato⁺ GFP in tubi di raccolta sterili contenenti 1× HBSS fredda.
  15. Dopo lo smistamento, rianalizzare una piccola aliquota di cellule selezionate per confermare purezza e vitalità prima del trapianto.
  16. Raccogli le cellule selezionate in HBSS sterile 1× e mantienile sul ghiaccio al buio fino al trapianto.
    NOTA: Le rese tipiche variano da circa 5,0–7,0 × 10progenitori ematopoietici di 4 Hoxb8 per preparazione epatica fetale E12.5, a seconda della dimensione dell'embrione e dell'efficienza di smistamento. Trapianta le cellule vive purificate il prima possibile, idealmente entro 60 minuti dallo smistamento.

6. Preparazione degli aghi di iniezione

  1. Caricare i capillari di vetro borosilicato (1,0 mm di diametro esterno, 0,58 mm di diametro interno, con filamento) in un estratore di micropipette.
  2. Stirare i capillari utilizzando un programma di trazione a due linee ottimizzato per generare aghi lunghi e conici, adatti al trapianto intracerebrale neonatale.
    1. Le impostazioni tipiche includono: Calore = 645, Tiraggio = 30, Velocità = 120, Ritardo = SPENNE e Pressione = 200. Ottimizza le impostazioni finali per il tipo specifico di vetro, le condizioni ambientali e la calibrazione del puller. Successivamente, si tagliano gli aghi risultanti e si bisellano per ottenere un diametro finale della punta esterna di circa 30 μm.
  3. Posiziona gli aghi estratti su due strisce di stucco all'interno di una grande piastra di Petri di plastica per proteggere le punte dai danni prima di rifilare e smussare.
  4. Posizionare l'ago estratto sotto un microscopio stereoscopico dissezionante con un ingrandimento approssimativo del 10× al 20× e sostenerlo con un tutore morbido.
    NOTA: Durante l'ispezione delle punte può essere utilizzata un ingrandimento più elevato (20×–40×) per verificare la corretta formazione del conico e identificare eventuali difetti prima del taglio e della bisellatura.
  5. Usa una lametta sterile per tagliare la punta dell'ago e ottenere un diametro esterno di circa 30 μm.
  6. Fissa l'ago tagliato in un portamafaffa.
  7. Regola l'angolo del conico a 30°–35°.
  8. Accendi il macinacaffè e l'illuminazione.
  9. Lascia che l'acqua distillata goccioli sulla pietra da macinare a un ritmo costante di circa una goccia ogni 4–5 secondi.
  10. Portate la punta dell'ago a contatto delicato con la pietra da mala rotante finché non si forma un bordo smussato.
  11. Misura il diametro esterno della punta smussata usando un dispositivo di misurazione della punta quando disponibile.
  12. Seleziona aghi con diametro esterno vicino a 30 μm per il trapianto.
  13. Riempi l'ago con un tampone sterile ed espelle delicatamente il liquido per assicurarti che la punta sia aperta e senza ostruzioni.

7. Preparazione dell'apparato di iniezione

  1. Assemblare una pipetta manuale a comando a bocca composta da tubi flessibili, un bocchino, un filtro in linea e un portacapillare.
    NOTA: Un filtro in linea è incorporato nell'apparato di pipetting controllato dalla bocca per prevenire la contaminazione.
  2. Segna l'ago ogni 2 mm (fino a 2 segni per ago). Ogni 2 mm corrisponde a ~2 μL.
  3. Inserire l'ago di iniezione di vetro preparato ~1,5 cm nel portacapillare e confermare che l'insieme sia sicuro e ermetico.
  4. Applica una dolce aspirazione attraverso il bocchino per verificare il flusso d'aria libero e la corretta resistenza.
  5. Conferma che il sistema consenta un controllo fluido di aspirazione e iniezione prima di caricare le cellule donatrici.
  6. Riempi l'ago di iniezione di vetro con la sospensione preparata per cellule donatrici (4,5 μL totali) utilizzando una punta fine per pipetta.
    NOTA: Assicurati che non rimangano bolle d'aria nell'ago prima di iniziare il trapianto. Usa un ago per mouse.

8. Anestetizzazione dei riceventi neonatali e preparazione del campo chirurgico

  1. Posizionare il topo neonatale in orientamento supino sul tavolo chirurgico e indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 2,0%–5,0% somministrato in ossigeno tramite un vaporizzatore di precisione.
  2. Posizionare il naso del topo all'interno di un cono nasale per mantenere una somministrazione continua di isoflurano e ossigeno durante tutta la procedura.
  3. Prevedi circa 1 minuto per l'induzione dell'anestesia mentre si monitora la respirazione.
  4. Tocca delicatamente gli arti e conferma l'assenza di riflesso di astinenza per verificare un'anestesia adeguata.
  5. Una volta raggiunto un piano anestetico adeguato, si riduce la concentrazione di isoflurano allo 0,5%–2,0% per il mantenimento e si prosegue l'anestesia fino a 10 minuti durante il trapianto.
  6. Mantieni il topo neonatale a circa 38 °C utilizzando un cuscinetto caldo posizionato sotto il tavolo chirurgico.
  7. Pulire l'area del sito di iniezione sulla testa utilizzando applicazioni alterne di betadine e etanolo al 70% con cotton cotton fiocs sterili.
  8. Applica un ultimo strato di betadine e lascia asciugare la pelle prima dell'iniezione.
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente anestetico pericoloso. Utilizzare sistemi adeguati di recupero anestetico e garantire una ventilazione adeguata della stanza, in conformità con le linee guida di sicurezza istituzionali.

9. Esecuzione di trapianto intracerebrale neonatale

  1. Stabilizza delicatamente la testa usando dita guantate o un supporto morbido per minimizzare i movimenti durante l'iniezione.
    NOTA: I topi riceventi vengono trapiantati tra P1 e P4.
  2. Identificare i siti di iniezione bilaterali nel telencefalo dorsale anteriore (futura regione della corteccia frontale), circa 1–2 mm laterali alla linea mediana sagittale e immediatamente caudali ai bulbi olfattivi. Posizionare i siti di iniezione simmetricamente in ciascun emisfero evitando i vasi sanguigni superficiali visibili.
    NOTA: A causa del cranio sottile e delle dimensioni ridotte dei topi neonatali, le iniezioni vengono eseguite utilizzando punti di riferimento anatomici visivi piuttosto che coordinate stereotassici.
  3. Ispeziona visivamente il cranio ed evita di inserire l'ago vicino ai vasi sanguigni visibili.
  4. Fai avanzare delicatamente la micropipetta in vetro smussato attraverso la pelle e il cranio in via di sviluppo.
  5. Guida l'ago circa 1–2 mm sotto la superficie del cranio nell'emisfero frontale.
  6. Somministrare cellule donatrici utilizzando una pressione manuale controllata tramite l'apparato della pipetta a controllo orale.
    NOTA: Quando si trapiantano progenitori ematopoietici purificati o microglie neonatali, iniettare 2–3 μL per emisfero, corrispondenti a circa 2,5 × 104 cellule per iniezione. Questo fornisce circa 5 × 104 cellule per ogni cervello di topo.
  7. Ritira lentamente la micropipetta dal cervello per minimizzare il reflusso delle cellule iniettate e ridurre i danni ai tessuti.
  8. Eseguire iniezioni controlaterali.
    NOTA: Usa un ago per topo per evitare contaminazioni incrociate tra topoli.

10. Recupero di neonati trapiantati

  1. Metti ogni cucciolo su un tappetino riscaldante subito dopo la procedura.
  2. Monitora i cuccioli finché il colore normale del corpo, i movimenti spontanei e l'attività generale non tornano a trovarsi.
    NOTA: Il tempo di recupero varia da 5 minuti a 10 minuti.
  3. Riporta i cuccioli alla diga.
  4. Strofina accuratamente ogni cucciolo con la lettiera e il materiale per il nido della gabbia domestica.
  5. Rimetti i cuccioli nella gabbia con la madre.
  6. Conferma che la madre recuperi e accetti i cuccioli restituiti.

11. Monitoraggio della salute postoperatoria

  1. Osserva i cuccioli ogni giorno per 10 minuti nei primi 3 giorni dopo il trapianto.
  2. Valuta i cuccioli per attività normale, comportamento di succhio e interazione con la madre.
    NOTA: Non disturbare le gabbie dei topi in questo periodo. Questo può aumentare lo stress sulla diga.
  3. Continua a monitorare i cuccioli a giorni alterni fino allo svezzamento dopo il periodo iniziale di 3 giorni.
  4. Valuta i cuccioli per lo sviluppo normale, il comportamento alimentare, il livello di attività e la cura materna.
  5. Misurare e registrare il peso corporeo ogni giorno durante il primo periodo postoperatorio.
  6. Valuta i cuccioli per segni di disagio, postura anomala, letargia o alimentazione compromessa.
  7. Eseguire l'eutanasia umana quando necessario secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
    1. Per i topi neonatali, si sopporta l'eutanasia con overdose di isoflurano utilizzando un campanellino o una camera simile chiusa dotata di un falso pavimento per prevenire il contatto diretto con l'anestetico. Una volta che la respirazione cessa e si conferma l'assenza di riflessi, decapita immediatamente.
    2. Per i topi adulti, si fa l'eutanasia utilizzando isoflurano al 5% somministrato in ossigeno tramite un vaporizzatore di precisione fino a quando la respirazione cessa e si conferma l'assenza di riflessi, seguita da una lussazione cervicale come metodo fisico secondario per garantire la morte.
      NOTA: Gli animali che mostravano mortalità postoperatoria o assenza di innestamento rilevabile di cellule donatrici al punto finale sperimentale sono stati esclusi dall'analisi. Non è stata somministrata analgesia postoperatoria perché il trapianto intracerebrale neonatale è stato considerato minimamente invasivo.

12. Raccolta di tessuti cerebrali per criosezionamento e colorazione da immunofluorescenza

  1. Rimuovi con cura il cervello e preparalo per l'analisi a sezione congelata.
  2. Elaborare il tessuto cerebrale postnatale per la criosezione e tagliare le sezioni coronali utilizzando un criostato secondo le procedure precedentemente descritte.
    NOTA: Per ogni topo, vengono analizzate 9–12 sezioni coronali che attraversano la corteccia somatosensoriale.
  3. Montare le sezioni su vetrine del microscopio e conservarle a -20 °C fino alla colorazione.
  4. Incubare brevemente le sezioni in un tampone di permeabilizzazione contenente 0,2% di Triton X-100 e 1% di desossicolato di sodio.
  5. Prepara anticorpi primari (anti-GFP di pollo, 1:500; Anticorpo anti-td del pomodoro per porcellini d'India, 1:250; coniglio anti-Iba1; 1:500) diluito nel tampone di diluizione degli anticorpi appropriato.
  6. Incubare le sezioni di tessuto con anticorpi primari durante la notte a 4 °C.
  7. Lavare le sezioni con soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere gli anticorpi primari non legati.
  8. Incubare sezioni con anticorpi secondari coniugati con fluorofori (anti-coniglio capra Alexa Fluor 647, 1:500; anti-cavia capra Alexa Fluor 555, 1:500; anti-gallina capra Alexa Fluor 488, 1:500) per 2 ore a temperatura ambiente al buio.
  9. Controcolorare le sezioni con DAPI per visualizzare i nuclei cellulari.
  10. Montare le sezioni utilizzando un mezzo antifade e applicare un copertino di vetro.

13. Acquisizione di immagini con microscopia confocale

  1. Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale dotato di obiettivi da 10× o 20×.
  2. Acquisire immagini a 512 × 512 o 1024 × 1024 pixel utilizzando velocità di scansione di 200–400 Hz.
  3. Raccogliere sezioni ottiche con intervalli z-step di 2–5 μm attraverso il tessuto.

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Risultati

Il trapianto intracerebrale neonatale di popolazioni di microglia purificate porta a una sopravvivenza a lungo termine e a un diffuso innesto di cellule derivate dal donatore all'interno del parenchima cerebrale ricevente. Popolazioni di microglia purificate da donatori sono state isolate tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza utilizzando reporter di linea fluorescente (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; microglie non-Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) prima del tra...

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Discussione

Il trapianto intracerebrale neonatale di progenitori microgliali purificati o sottopopolazioni microgliali definite fornisce un approccio robusto per ricostruire il compartimento microgliale in vivo e per esaminare le proprietà specifiche per linea dei macrofagi cerebrali. Questo metodo consente la ricostituzione selettiva utilizzando cellule donatrici definite geneticamente, consentendo una valutazione diretta dell'innestazione e della maturazione delle cellule donatrici nell'a...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), dalla Dauten Family Foundation e dalla University of Utah Flow Cytometry Facility. I topi Csf1rΔFIRE sono stati generati dal dottor Ben Xu presso l'Università dello Utah.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bell jarVariousN/AUsato per l'eutanasia
Capillari di vetro borosilicato con
filamento		Sutter InstrumentBF100-78-15Usato per gli aghi di iniezione
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma AldrichA8806Usato per preparare il buffer PB. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Cellule mieloidi
CD45 APCBioLegend103112Cellule ematopoietiche
Filtri per celle (70 µm)Falcon352350Usato per generare sospensioni di
cellule singole. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Anticorpo anti-GFP di polloAves LabsGFP-1020Colorazione immunofluorescente
Anticorpo c-Kit PE-Cy7BioLegend105814Progenitori ematopoietici
Microscopio confocaleLeicaTCS SP5Usato per l'imaging di fluorescenza
Tubi conici (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Elaborazione di tessuti/cellule. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Macchina criostatoLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Generazione di sezioni di tessuti congelati
. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Colorante nucleare DAPIThermo Fisher ScientificD1306Usato per la vitalità e
la colorazione nucleare
Microscopio dissecanteLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Usato per la preparazione e il taglio degli
aghi di iniezione. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria Purificazione cellulare
Blocco Fc (CD16/32 purificato)Biolegend101302Blocca il legame indesiderato degli anticorpi alle cellule di topo che esprimono recettori Fc
Siero fetale bovino (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUsato nei buffer di preparazione cellulare
. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Tubi flessibili per pipetta manualeVariousN/AComponente dell'apparato di iniezione manuale
Software di analisi per citometria a flussoFlowJov10.8.1Usato per l'analisi dei dati FACS
Citometro a flusso per la separazione cellulareBD BiosciencesFACSAriaUsato per la purificazione cellulare
gentleMACS Octo Dissociator con
riscaldatori		Miltenyi Biotec130-096-427Usato per la dissociazione del tessuto cerebrale
Anticorpo secondario Alexa Fluor 488
anti-pollo		Thermo Fisher ScientificA-11039Anticorpo secondario
Anticorpo secondario Alexa Fluor
555 anti-cavia anti-porcellino d'India		Thermo Fisher ScientificA-21428Anticorpo secondario
Anticorpo secondario Alexa Fluor 647
anti-cavia anti-coniglio		Thermo Fisher ScientificA-21245Anticorpo secondario
Anticorpo secondario Alexa Fluor 647
anti-cavia anti-ratto		Thermo Fisher ScientificA-48265Anticorpo secondario
Anticorpo anti-tdTomato di caviaFrontier InstituteAB_2631185Colorazione immunofluorescente
Soluzione salina bilanciata di Hanks’
(HBSS)		Gibco14175-079Usato durante la preparazione cellulare
EmatocimetroVariousN/AConteggio delle cellule
Filtro in linea per pipetta manualeVariousN/APreviene la contaminazione
MicrogrinderNarishigeEG-400Usato per smussare gli aghi di iniezione in vetro
Estensore di micropipetteSutter InstrumentP-1000Usato per generare aghi di iniezione fini
Boccaglio per pipetta manualeVariousN/AUsato per il controllo manuale dell'
iniezione
Kit di dissociazione del tessuto neurale (P)Miltenyi Biotec130-092-628Usato per la dissociazione enzimatica del tessuto cerebrale
Piatti di PetriThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Usato per conservare gli aghi tirati o il raccolto di tessuti. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Anticorpo anti-Iba1 di coniglioWako019-19741Marcatore di microglia
Anticorpo anti-TMEM119 di coniglioAbcam209064Marcatore specifico per microglia
Anticorpo anti-CD206 di rattoBioLegend141712Usato per identificare le popolazioni di macrofagi
Anticorpo anti-P2RY12 di rattoBioLegend848002Marcatore di microglia
Lame/scalpelVariousN/AUsato per rifilare le punte degli aghi o
il raccolto di tessuti
Buffer di lisi dei globuli rossiChemCruzsc-296258Usato per la rimozione dei globuli
rossi
Apparato stereotassicoKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Usato per l'impianto chirurgico. Sono disponibili varie marche. Quello elencato qui è solo un esempio.
Anticorpo Ter119 PerCP-Cy5.5BioLegend116228Cellule della linea eritroide

Riferimenti

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