Articolo metodologico

Protocollo per l'isolamento dell'RNA da diverse specie di tardigradi

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DOI:

10.3791/72120

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1 settembre 2026

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1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure di isolamento dell'RNA da diverse specie di tardigradi, utilizzando un kit di isolamento dell'RNA basato su colonne, progettato per isolare l'RNA da piccole quantità di tessuto e ottenere quantità sufficienti di RNA di alta qualità per applicazioni successive, come il sequenziamento dell'RNA e la sintesi del DNA complementare.

Abstract

I tardigradi sono animali microscopici noti per la loro eccezionale tolleranza allo stress ambientale. Questi animali possono sopravvivere alla disidratazione, a pressioni estreme, a basse temperature e a elevati livelli di radiazioni ionizzanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di queste capacità estremofile non sono ancora completamente compresi. Gli approcci molecolari utilizzati per indagare tali meccanismi, tra cui il sequenziamento dell'RNA, l'interferenza dell'RNA (RNAi) e l'espressione eterologa di geni di tardigradi in sistemi come i batteri, richiedono l'isolamento di RNA messaggero (mRNA) di alta qualità da un materiale biologico limitato. In questo studio, descriviamo un protocollo riproducibile per l'isolamento di RNA totale da tardigradi che (1) è efficace su molteplici specie, inclusa una specie di eterotardigrado, (2) richiede soltanto da 25 a 200 animali, a seconda delle dimensioni corporee, e (3) produce RNA in quantità e qualità sufficienti per applicazioni successive. Il presente protocollo consente un recupero efficiente dell'RNA a partire da un numero ragionevole di tardigradi e supporta indagini molecolari sulla tolleranza allo stress in diverse specie di tardigradi.

Introduzione

I tardigradi sono noti per la loro capacità di sopravvivere a stress estremi che altri animali non tollererebbero, inclusa la disidratazione, pressioni estreme, temperature estreme e agenti che danneggiano il DNA come farmaci chemioterapici e radiazioni ionizzanti1,2,3,4,5,6,7,8. Negli ultimi anni, gli scienziati hanno indagato i meccanismi alla base della straordinaria resistenza dei tardigradi utilizzando approcci molecolari come il sequenziamento dell'RNA, l'interferenza dell'RNA (RNAi) e l'espressione eterologa di geni di tardigradi in altri sistemi, inclusi cellule umane e batteri8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Quando applicati, questi approcci si sono rivelati strumenti potenti per comprendere esattamente come i tardigradi siano in grado di resistere a stress così estremi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tuttavia, tutti questi approcci molecolari per comprendere la tolleranza allo stress nei tardigradi dipendono dalla capacità di isolare RNA da questi piccoli animali in quantità sufficiente e con qualità adeguata per l'uso in processi successivi.

Un metodo precedente per l'isolamento dell'RNA da tardigradi si è rivelato efficace per ricercatori che lavorano con Hypsibius exemplaris23. Tuttavia, nel tentativo di replicare questo protocollo in H. exemplaris, abbiamo riscontrato che produceva concentrazioni e qualità dell'RNA non affidabili (dati non pubblicati). Un metodo alternativo per l'isolamento dell'RNA basato sul fenolo si è dimostrato efficace per H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus e una specie di eterotardigrado13,21,22,24,25,26. È stato dimostrato che questo protocollo fornisce RNA di qualità e quantità sufficienti per processi successivi, sia da singoli animali che da pool di animali (~50). Tuttavia, questo protocollo richiede che l'utilizzatore manipoli reagenti contenenti fenolo. Il fenolo è una sostanza chimica pericolosa che richiede un'accurata manipolazione e un'esecuzione impropria del protocollo può causare un residuo di fenolo che compromette la purezza dell'RNA e le applicazioni successive. Un altro protocollo precedentemente pubblicato per l'isolamento dell'RNA da tardigradi si concentra sulla capacità di isolare RNA da singoli animali27. Sebbene questo sia un protocollo utile per applicazioni come la PCR quantitativa (qPCR)27, è meno adatto per applicazioni successive come il sequenziamento dell'RNA, in cui l'obiettivo è ottenere una visione più completa del modo in cui gli animali rispondono a un determinato agente stressante o a una certa condizione.

Queste limitazioni nei protocolli disponibili per l'isolamento dell'RNA hanno portato a indagare metodi alternativi per isolare l'RNA dai tardigradi. Il kit per l'isolamento dell'RNA basato su colonne utilizzato in questo protocollo è commercializzato per isolare l'RNA da piccole quantità di tessuto. Questo kit è stato precedentemente utilizzato anche per isolare l'RNA da tessuti di insetti per analisi di sequenziamento dell'RNA a valle, suggerendo che potrebbe essere adatto per isolamenti da altri piccoli animali provvisti di cuticola, come i tardigradi28. Questo studio descrive passo dopo passo il protocollo per l'uso di questo kit di isolamento dell'RNA basato su colonne con i tardigradi, inclusa la spiegazione di specifiche precauzioni da adottare durante l'esecuzione del protocollo con questi organismi. Questo articolo riporta il successo del protocollo in sei specie di tardigradi (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti e l'eterotardigrado Viridiscus celatus). Lo studio ha dimostrato che è possibile ottenere RNA di qualità e quantità significative già da soli 25 esemplari. Sono inoltre forniti esempi di dati relativi alla concentrazione e alla qualità dell'RNA ottenuto, adeguati per applicazioni a valle come il sequenziamento dell'RNA (con minimo bias e amplificazione esponenziale della libreria) e la sintesi del DNA complementare (cDNA). Questo protocollo di isolamento dell'RNA si è già rivelato utile per scoprire i meccanismi alla base della tolleranza alle radiazioni in H. exemplaris8. Il successo del protocollo in diverse specie di tardigradi suggerisce che potrebbe essere applicato più ampiamente allo studio dei meccanismi di tolleranza allo stress, dei meccanismi dello sviluppo e dei processi evolutivi.

Protocollo

Il seguente protocollo non richiede l'approvazione etica istituzionale per animali, poiché gli animali invertebrati sono esenti da tale requisito. I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dell'attrezzatura e dell'area per l'isolamento dell'RNA

  1. Accendere un blocco riscaldante o un bagnomaria a 42 °C in preparazione per l'estrazione dell'RNA.
  2. Preparare un portaprovette per microcentrifuga, pipette (2 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL) e punte filtrate di dimensioni appropriate.
  3. Pulire la superficie del bancone, il portaprovette, le pipette e le confezioni delle punte con RNase Away, soluzione di candeggina diluita (10%) o etanolo al 70% per denaturare qualsiasi RNase residua.
    NOTA: La presenza eccessiva di RNase sugli strumenti o nell'area in cui si isola l'RNA può compromettere la qualità dell'RNA ottenuto a causa della degradazione. Ridurre questo rischio consentendo un tempo sufficiente affinché i prodotti denaturanti l'RNase agiscano efficacemente e assicurandosi che l'area e gli strumenti siano completamente asciutti prima di proseguire.
  4. Indossare guanti durante tutti i passaggi del protocollo e trattare frequentemente i guanti con una soluzione denaturante l'RNase nel corso del procedimento per prevenire la degradazione dell'RNA.

2. Raccolta degli animali per l'isolamento dell'RNA

  1. Utilizzando una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro (Figura 1A), un anello di Irwin o una micropipetta, trasferire da 25 a 200 animali (in base alle dimensioni della specie) dalle loro piastre di coltura a una piastra contenente acqua minerale pulita, per ridurre la quantità di materiale non appartenente ai tardigradi (alghe o altre fonti alimentari come nematodi o rotiferi, a seconda della specie).
  2. Prelevare una provetta da 1,5 mL priva di RNasi e un pestello.
  3. Utilizzando una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro o un anello di Irwin, trasferire gli animali nel fondo della provetta da 1,5 mL priva di RNasi, avendo particolare cura di trasferire con loro la minor quantità possibile di acqua.
  4. Centrifugare a 4.500 g per 3 minuti per formare un pellet di tardigradi sul fondo della provetta da microcentrifuga.
  5. Osservando la provetta con i tardigradi in pellet al microscopio stereoscopico, utilizzare una pipetta da 20 µL o una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro con un'apertura più piccola rispetto alle dimensioni dei tardigradi da cui si sta isolando l'RNA, per rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile di acqua senza disturbare il pellet di tardigradi. Vedere Figura 1B per un esempio della quantità accettabile di acqua residua.
    NOTA: Prestare attenzione a lasciare un sottile strato di acqua, in modo che gli animali non si disidratino nel breve intervallo tra la rimozione dell'acqua e l'aggiunta del Buffer di Estrazione (XB). Se gli animali si disidratano, ciò potrebbe compromettere la qualità dell'RNA dopo l'isolamento.
  6. Aggiungere 100 µL di Buffer di Estrazione (XB) alla provetta contenente i tardigradi.

3. Disgregamento meccanico dei tardigradi ed estrazione dell'RNA

  1. Utilizzando il pestello privo di RNasi, rompere gli tardigradi macinando delicatamente ma con fermezza il pestello sul fondo del tubo per circa 30 s. Un totale di 20–30 movimenti di macinazione dovrebbe essere sufficiente per rompere gli tardigradi.
  2. Rimuovere il pestello dal tubo, avendo cura di far sì che la maggior quantità possibile di liquido rimanga sul fondo del tubo.
  3. Controllare il contenuto del microcentrifuga al microscopio stereoscopico per accertarsi che non rimangano animali visibilmente integri.
  4. Incubare la miscela a 42 °C per 30 min su un blocco riscaldante agitato con agitazione delicata (300 giri/min).
    NOTA: Il buffer di estrazione (XB) stabilizza l'RNA prevenendone il degrado a questa temperatura.

4. Condizionamento della colonna per l'isolamento dell'RNA

  1. Negli ultimi 10 minuti dell'incubazione di estrazione, assemblare la colonna per la raccolta e la purificazione dell'RNA. Posizionare una colonna di purificazione in un tubo di raccolta e etichettare la colonna in modo appropriato.
  2. Aggiungere direttamente 250 µL di Condizionamento Buffer (CB) sulla colonna.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Centrifugare a 16,000 × g per 1 min e scartare il flusso passante. La colonna è ora pronta per ricevere il surnatante di RNA dal passaggio successivo.
  5. Togliere dal congelatore il 10x DNase I Reaction Buffer e l'acqua priva di nucleasi in modo che scongelino completamente in tempo per il passaggio 6 riportato di seguito.

5. Legame dell'RNA alla colonna

  1. Dopo l'incubazione di estrazione, centrifugare il tubo contenente i tardigradi disgregati meccanicamente e il Buffer di Estrazione (XB) a 3.000 × g per 2 minuti.
  2. Prendere un nuovo tubo privo di RNasi e etichettarlo in modo appropriato.
  3. Utilizzando una pipetta da 200 µL con punta filtrante, rimuovere con attenzione il sopranatante dal pellet di cuticole dei tardigradi. Prestare attenzione a non disturbare il pellet di cuticole e a rimuovere soltanto il sopranatante.
    NOTA: Il trasferimento di cuticole nei passaggi successivi comporterà una minore efficienza del rendimento di RNA in colonna a causa dell'ostruzione fisica della colonna. Per evitare questo errore potenziale, è possibile osservare la punta della pipetta con il sopranatante al microscopio per assicurarsi dell'assenza di cuticole. Se sono presenti cuticole, rimettere il sopranatante nel tubo e ripetere il passaggio di centrifugazione.
  4. Trasferire il sopranatante nel nuovo tubo etichettato, privo di RNasi.
  5. Aggiungere 100 µL di etanolo al 70% nel tubo contenente l'RNA e mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte. In questo passaggio, si dovrebbero osservare chiari filamenti viscosi dopo l'aggiunta dell'etanolo. Questo è un buon segno che nell'estratto è presente RNA.
  6. Pipettare l'intera miscela (200 µL) sulla colonna preparata al passaggio 4.
    NOTA: Quando si pipettano soluzioni sulla colonna in questo e nei passaggi successivi, prestare attenzione a dispensare il liquido al centro della colonna ed evitare di toccare fisicamente la colonna con la punta della pipetta. La perforazione meccanica della colonna provocherà problemi successivi riguardo alla qualità e alla quantità di RNA.
  7. Per legare l'RNA alla colonna, centrifugare per 2 minuti a 100 × g, seguito da una centrifugazione a 16.000 × g per 30 secondi per rimuovere il flusso passante.

6. Preparazione della soluzione di DNasi I

  1. Lasciare scongelare completamente il Buffer di Reazione 10x per DNase I e l'Acqua priva di nucleasi prima di preparare la soluzione.
  2. Per ogni isolamento di RNA, preparare una soluzione di 40 µL in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL separata, contenente 32 µL di Acqua priva di nucleasi, 4 µL di Buffer di Reazione 10x per DNase I e 4 µL di Enzima DNase I. Mantenere la soluzione sul ghiaccio fino al momento di applicarla alla colonna al Passaggio 7.3.

7. Lavaggio dell'RNA e trattamento con DNasi I

  1. Aggiungere 100 µL di Wash Buffer 1 (W1) direttamente sulla colonna di purificazione contenente l'RNA legato (proveniente dal passaggio 5.7).
  2. Centrifugare per 1 min a 8,000 × g ed eliminare il flusso passante.
  3. Aggiungere 40 µL di soluzione di DNase I del Passaggio 6 direttamente sulla colonna di purificazione e incubare a temperatura ambiente per 15 min per rimuovere la contaminazione da DNA.
  4. Aggiungere 40 µL di Wash Buffer 1 (W1) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 8,000 × g per 30 s.
  5. Aggiungere 100 µL di Wash Buffer 2 (W2) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 8,000 × g per 1 min.
  6. Aggiungere altri 100 µL di Wash Buffer 2 (W2) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 16,000 × g per 2 min. Scartare il flusso passante.
  7. Centrifugare la colonna a 16,000 × g per 1 min per asciugare la colonna.

8. Eluizione dell'RNA

  1. Prendere un tubo da 0,5 mL (incluso nel kit) per ogni isolamento di RNA ed etichettarlo in modo appropriato. Questo sarà il tubo che conterrà l'RNA dopo l'isolamento.
  2. Trasferire la colonna con l'RNA legato e lavato nel tubo da 0,5 mL precedentemente etichettato. La colonna deve inserirsi saldamente in questo tubo.
  3. Guardando il tubo di lato, posizionare la punta della pipetta direttamente sopra la membrana della colonna, espellere 11 µL di tampone di eluizione (EB) sulla colonna e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
    NOTA: se il tampone di eluizione (EB) non viene disperso direttamente sulla colonna, si otterranno rese di RNA ridotte. Se si osservano goccioline di liquido attorno al perimetro della colonna, ciò indica una dispersione inadeguata del tampone di eluizione (EB). In tal caso, si raccomanda di ripetere questo passaggio utilizzando il flusso passato del passo 8.5, assicurandosi che il tampone di eluizione (EB) venga espulso direttamente al centro della colonna.
  4. Posizionare il tubo da 0,5 mL contenente la colonna nel tubo di raccolta fornito con il kit, per garantire un corretto posizionamento durante la centrifugazione (Figura 2).
  5. Centrifugare la colonna a 1.000 × g per 1 min per distribuire il tampone di eluizione (EB), quindi centrifugare a 16.000 × g per 1 min per eluire l'RNA.
  6. Posizionare immediatamente il tubo da 0,5 mL contenente l'RNA sul ghiaccio.

9. Convalida della quantità e qualità dell'RNA mediante spettrofotometro a microvolume

NOTA: Possono essere utilizzati altri metodi per valutare quantità e qualità dell'RNA. Qui viene utilizzato un metodo con uno spettrofotometro a microvolume. È inoltre possibile utilizzare un fluorimetro o uno strumento per elettroforesi su gel a microfluidica29.

  1. Pulire il piatto dello spettrofotometro a microvolume con un panno senza lanugine per assicurarsi che sia privo di altri liquidi.
  2. Selezionare l'impostazione RNA sullo spettrofotometro per l'analisi.
  3. Eseguire la messa a zero dello spettrofotometro utilizzando 1 µL del tampone di eluizione (EB) usato al passaggio 8.3.
  4. Dopo la messa a zero, rimuovere il tampone di eluizione (EB) dal piatto con un panno senza lanugine.
  5. Mantenendo il tubo da 0,5 mL contenente l'RNA sul ghiaccio, pipettare 1 µL di RNA sul piatto dello spettrofotometro. Abbassare il braccio dello spettrofotometro per misurare l'assorbanza del campione al fine di quantificare e valutare la qualità dell'RNA isolato.
    NOTA: Per informazioni dettagliate sui valori accettabili di qualità e quantità per le applicazioni successive, consultare la sezione “Risultati” riportata di seguito.

Risultati

Un passaggio critico di questo protocollo, come menzionato in precedenza, consiste nel rimuovere una quantità appropriata di acqua dai tardigradi raccolti prima di aggiungere il buffer di estrazione (XB) per l'estrazione dell'RNA. Lasciare troppa acqua provocherà una diluizione del buffer di estrazione (XB) e un'estrazione di RNA scadente (ad esempio, RIN < 7, rapporto 260/280 <1,8, rapporto 260/230 <1,8 e/o concentrazione <5 ng/µL) dagli animali, con conseguente riduzione della concentrazione e della qualità dell'RNA dopo l'eluzione. Rimuovere troppa acqua disidraterebbe rapidamente gli animali, potenzialmente causandone la morte e una riduzione della qualità dell'RNA a causa dell'aumentata attività delle RNasi dopo il decesso. Viene fornita una rappresentazione visiva che mostra la quantità appropriata di acqua da lasciare nel tubo insieme ai tardigradi prima dell'aggiunta del buffer di estrazione (XB) (Figura 1B) per facilitare il corretto svolgimento di questo protocollo.

Ad oggi, questo protocollo è stato sperimentato in sei specie diverse di tardigradi, inclusi un eterotardigrado (V. celatus). Queste isolazioni hanno prodotto concentrazioni di RNA comprese tra 11 ng/µL a 106,6 ng/µL (confermato mediante spettrofotometro a microvolume, Tabella 1) e 9 ng/µL a 113 ng/µL (confermato mediante elettroforesi su gel in microfluidica, Tabella 2). Il numero di animali necessari per l'isolamento dell'RNA varia a seconda delle dimensioni della specie da cui si effettua l'isolamento. Tardigradi più grandi, come Paramacrobiotus specie e Milnesium sp., produce ampie concentrazioni di RNA già da soli 25 animali (Tabella 1). Per specie più piccole, come H. exemplaris e V. celatus, le isolazioni hanno maggior successo quando effettuate su 100 o più animali (Tabella 1). La maggior parte delle isolazioni presenta un rapporto 260/280 intorno a 2, indicativo di RNA puro30. Isolamenti da alcune specie (V. celatus e H. exemplaris, e il Paramacrobiotus specie) provocano occasionalmente un rapporto 260/230 basso, suggerendo una contaminazione da reagenti30. Ciò si verificava spesso quando si utilizzavano meno animali (100 per V. celatus e H. exemplaris, e 25 per Specie di Paramacrobiotus), suggerendo che un numero troppo ridotto di animali possa aumentare il rischio di contaminazione del reagente nell'RNA eluito finale. Attraverso la valutazione della qualità dell'RNA tramite elettroforesi su gel in microfluidica, può essere calcolato un numero di integrità dell'RNA (RIN). Un RIN compreso tra 9 e 10 indica un RNA di alta qualità con scarsa degradazione31 e in genere non si consiglia di procedere con analisi successive come il sequenziamento dell'RNA se il valore RIN è inferiore a 7. Vengono forniti alcuni esempi di risultati ottenuti mediante elettroforesi su gel in microfluidica (Figura 3) da campioni con valori di RIN elevati e bassi/non rilevabili. Alcuni di questi campioni sono stati esclusi da ulteriori analisi (Tabella 2, Figura 3A, D). Tuttavia, alcuni campioni con RIN basso/non rilevabile sono stati selezionati per la preparazione delle librerie per il sequenziamento dell'RNA e hanno comunque prodotto risultati di sequenziamento di qualitàTabella 2, Figura 3B,F, dati non pubblicati, si veda la sezione "Discussione" per ulteriori informazioni).

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Figura 1: Impostazione per l'isolamento dell'RNA. Immagini che mostrano una pompetta per pipetta collegata a una camera di aspirazione provvista di un capillare di vetro per il movimento degli animali e la rimozione dell'acqua (A) e una rappresentazione della quantità accettabile di acqua residua prima dell'aggiunta del Buffer di Estrazione (XB) ai tardigradi di Paramacrobiotus (B). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Configurazione del tubo di eluizione per l'eluizione finale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Risultati rappresentativi di elettroforesi su gel microfluidica per H. exemplaris e P. gadabouti. (A) Gel di RNA di H. exemplaris esposto a radiazioni ionizzanti. (B) Gel di RNA di P. gadabouti e H. exemplaris in condizioni di controllo. (C–F) Profili di picco rappresentativi ottenuti da un campione di RNA di H. exemplaris di alta qualità (C), da un campione di H. exemplaris di qualità discutibile (D), da un campione di P. gadabouti di buona qualità (E) e da un campione di H. exemplaris con evidente degradazione (picco a 147 bp) (F). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Concentrazioni di RNA rappresentative e informazioni sulla qualità da diverse specie di tardigradi raccolte con uno spettrofotometro a microvolume. *Concentrazioni inferiori a 20 ng/µL, rilevate con uno spettrofotometro a microvolume, possono causare rapporti di assorbanza inaccurati. **Basso rapporto 260/230 causato da una velocità di centrifugazione errata al Passaggio 5.7. Cliccare qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Concentrazioni di RNA rappresentative e informazioni sulla qualità da due specie di tardigradi raccolte mediante un sistema di elettroforesi su gel a microfluidica. Cliccare qui per scaricare questa tabella.

Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è facilitare l'isolamento di RNA da tardigradi in quantità e qualità sufficienti per applicazioni successive che permettano lo studio della tolleranza allo stress nei tardigradi. Il protocollo qui presentato evidenzia i punti in cui gli utenti potrebbero incontrare difficoltà, tra cui la rimozione di una quantità sufficiente di acqua prima dell'aggiunta del buffer di estrazione (XB) (Passaggio 2.5), la rottura delle strutture corporee dei tardigradi (Passaggi 3.1–3.3), il trasferimento del soprannatante sulla colonna per la purificazione (Passaggio 5.3) e l'eluzione dell'RNA (Passaggio 8.3). Errori in uno qualsiasi di questi passaggi possono portare a una riduzione della concentrazione o della qualità dell'RNA ottenuto. Se la concentrazione di RNA risultante è inferiore a 5 ng/µL (come verificato mediante spettrofotometro a microvolume), l'utente potrebbe prendere in considerazione di ripetere l'isolamento dell'RNA con (1) un numero maggiore di animali iniziali (>100 per specie di piccole dimensioni o >50 per specie più grandi), oppure (2) ripetendo il protocollo, prestando particolare attenzione ai passaggi di rimozione dell'acqua, rottura dei tardigradi ed eluzione.

Questo articolo fornisce esempi di valutazioni della qualità dell'RNA (RIN, rapporto 260/280, rapporto 260/230) ritenute appropriate o inadeguate per il sequenziamento dell'RNATabella 1, Tabella 2, Figura 3). Di tanto in tanto, basso (<1.0) In alcuni isolamenti di RNA effettuati con questo protocollo si osservano rapporti 260/230Tabella 1), suggerendo la presenza di composti organici residui. Di solito, ciò era associato a un basso numero di animali. Se non è possibile aumentare l'apporto di campione animale, o se si riscontra costantemente un basso rapporto 260/230, si raccomanda di includere un ulteriore passaggio di lavaggio con il Buffer di Lavaggio 2 (W2) (ripetere il Passaggio 7.6) e/o di prolungare il tempo di centrifugazione a secco nel Passaggio 7.7 per assicurare la rimozione di questi contaminanti. Inoltre, va notato che il singolo rappresentante H. exemplaris isolamento con un basso rapporto 260/230 (Tabella 1) è stato eseguito da un utente principiante, studente universitario, che in seguito ha realizzato di aver effettuato il passaggio 5.7 (centrifugazione per rimuovere l'etanolo dopo il legame dell'RNA alla colonna) a una velocità di centrifugazione errata (troppo bassa). Ciò ha probabilmente determinato la ritenzione di etanolo sulla colonna, con conseguente contaminazione nel corso del protocollo, causando un basso rapporto 260/230. Le successive isolazioni effettuate da questo utente hanno prodotto valori di 260/230 entro un intervallo ragionevole (non inferiori a 1,5). Pertanto, tutti gli utenti, in particolare i principianti, dovrebbero prestare particolare attenzione alle velocità di centrifugazione durante l'esecuzione del protocollo, al fine di evitare questi potenziali problemi. Nonostante occasionali rapporti 260/230 bassi o valori bassi di RIN in H. exemplaris, l'RNA con letture di qualità simili potrebbe comunque essere utilizzato per sequenziamento dell'RNA successivo allo scopo di esaminare l'espressione genica differenziale dopo esposizione a radiazioni ionizzanti o ad altri stressori8 (Tabella 1, Tabella 2e dati non pubblicati). Analogamente, l'RNA isolato da P. gadabouti con questo protocollo si è ottenuta una concentrazione e qualità elevate dell'RNA (verificate mediante RIN, Tabella 2, Figura 3) e ha prodotto dati significativi di sequenziamento dell'RNA (dati non pubblicati). In via aneddotica, questo studio ha utilizzato con successo RNA da H. exemplaris con basse concentrazioni (5–9 ng/)µL) per ottenere cDNA per un clonaggio a valle efficace di H. exemplaris geni8. Quando l'RNA da H. exemplaris ha determinato una concentrazione bassa/non rilevabile e un RIN basso (misurato mediante elettroforesi su gel a microfluidica), l'RNA è stato quindi reisolato per questo trattamento prima di procedere con la preparazione della libreria per il sequenziamento dell'RNA (Tabella 2, Figura 3A, D). La decisione di ripetere l'isolamento dell'RNA per questo campione (Figura 3A, D), piuttosto che procedere con il sequenziamento come è stato fatto per altri campioni da H. exemplaris con RIN non rilevabile (Figura 3B,F), è stato effettuato a causa dell'assenza di bande ben definite sul gel di microfluidica, che può indicare un errore di caricamento, un degrado dell'RNA o una concentrazione insufficiente di RNA. Al contrario, quando l'RNA isolato da H. exemplaris aveva una concentrazione relativamente bassa, un RIN non rilevabile e segni di una certa degradazione dell'RNA, come indicato dai livelli più elevati di RNA di piccole dimensioni, ma ha comunque prodotto dati di sequenziamento dell'RNA utilizzabili dopo la preparazione della libreria (dati non pubblicati, Tabella 2, Figura 3B,F). Pertanto, anche se vengono fornite alcune linee guida per determinare se i campioni di RNA sono adatti per applicazioni successive, l'utente deve usare il proprio giudizio e considerare l'applicazione specifica prevista per valutare se la qualità e la quantità dell'RNA siano sufficienti per proseguire.

Gli scienziati che desiderano isolare l'RNA dai tardigradi devono prendere in considerazione diversi aspetti per determinare quale protocollo sia più adatto al loro scopo. Tutti i metodi precedentemente descritti per l'isolamento dell'RNA (incluso il metodo qui riportato) hanno prodotto RNA in quantità e qualità sufficienti a supportare applicazioni successive come il sequenziamento dell'RNA, la sintesi di cDNA e la qPCR8,12,13,17,21,22,25,27. Il costo è spesso un fattore da considerare, specialmente per laboratori di ricerca con budget ridotti o laboratori didattici. Il protocollo qui descritto è più costoso rispetto ai protocolli precedentemente riportati per ogni reazione di isolamento. Tuttavia, sosteniamo che l'aumento del costo comporti vantaggi rispetto ai protocolli precedentemente descritti. Rispetto ad altri protocolli di isolamento dell'RNA basati su colonne23, il protocollo qui riportato può produrre una quantità abbondante di RNA di qualità sufficiente a partire da una minore quantità di materiale iniziale (un numero inferiore di animali). Inoltre, come menzionato nell'Introduzione, il protocollo precedentemente descritto per l'isolamento dell'RNA basato su colonne ha funzionato in modo non costante nelle nostre mani, portando spesso a rese di RNA estremamente basse, insufficienti per le applicazioni successive (dati non pubblicati). Il protocollo qui riportato è anche notevolmente più sicuro rispetto a un approccio di isolamento dell'RNA basato su fenolo, poiché non richiede agli utilizzatori di maneggiare sostanze chimiche pericolose che necessitano di una cappa aspirante. Un problema comune riscontrato con i protocolli di estrazione dell'RNA basati su fenolo è il carryover del fenolo, che compromette la purezza dell'RNA e può interferire con le applicazioni successive. Questi problemi rendono l'estrazione dell'RNA basata su fenolo meno accessibile agli studenti universitari (sia nei laboratori di ricerca che in aula). Tuttavia, il metodo basato su fenolo è il più economico. Il protocollo qui riportato non è adatto per isolare l'RNA da un singolo animale al fine di valutare le risposte trascrittomiche individuali (come pubblicato da Kirk et al), ma risulta invece utile per esaminare i cambiamenti condivisi tra individui in risposta a uno stressore, fornendo una visione più olistica delle risposte allo stress. Pertanto, gli utilizzatori dovrebbero valutare l'importanza del costo, della disponibilità degli animali e dell'accessibilità del protocollo per determinare quale metodo meglio soddisfi le loro esigenze.

Questo studio ha dimostrato che questo protocollo produce RNA di quantità e qualità sufficienti da sei diverse specie di tardigradi, inclusa una specie rappresentativa degli Eterotardigradi. Inoltre, questo metodo di isolamento dell'RNA consente di ottenere una quantità sufficiente di RNA da un numero ragionevole di organismi (da 25 a 200, a seconda delle dimensioni della specie). La validazione di questo protocollo di isolamento dell'RNA in più specie apre la strada alla comprensione di aspetti affascinanti della biologia dei tardigradi. Ciò non si limita all'indagine sulla tolleranza allo stress, ma si estende anche alla comprensione dell'evoluzione di questi animali, inclusa l'evoluzione dei meccanismi di resistenza e del loro sviluppo. Questo protocollo è particolarmente utile per specie di tardigradi non modello o raccolte in campo, in cui la biomassa disponibile è limitata e mancano metodi standardizzati di isolamento dell'RNA. Infine, il protocollo è accessibile ai ricercatori ed è riproducibile anche da studenti universitari, risultando quindi uno strumento prezioso per laboratori didattici o di ricerca in istituzioni con focus principale sulla formazione degli studenti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi iniziali dell'Università di Asheville (a CCH) e da una sovvenzione NSF 2225683 a Jason Pienaar (tutore postdottorale di PK). Ringraziamo la struttura di sequenziamento ad alto rendimento dell'Università della Carolina del Nord per l'assistenza tecnica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubo microcentrifuga graduato Seal-Rite da 1,5 mL, naturale, in polipropilene, 500/confezione
Etilene al 70%VWR71001-654Per la pulizia di banchi e attrezzature
Kit Arcturis PicoPure per l'isolamento dell'RNAFisherKIT0204Kit contenente i componenti per il protocollo di isolamento descritto in questo manoscritto
CentrifugaEppendorf5405000441Centrifuga 5425, con manopole rotative, non refrigerata, con rotore FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (USA)
Acqua minerale Deer ParkQualsiasi negozio di alimentariN/AQuesto è il mezzo per le colture di tardigradi e viene utilizzato per risciacquare i tardigradi prima dell'isolamento dell'RNA
Microscopio stereoscopicoZeissN/AZeiss Stemi 305, rapporto di zoom 5:1 e ingrandimento totale da 8x a 40x, con unità di trasilluminazione M LED
DNasi IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNasi I, priva di RNasi (1 U/µL)
Punte filtrate per pipetta da 10 µLVWR76322-528Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 1000 µLVWR76322-154Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 20 µLVWR76322-134Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 200 µLVWR76322-150Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Capillari di vetroFisher50-821-811Capillari di vetro standard World Precision Instrument - 1B120-6 (6 pollici, diametro esterno 1,2 mm, senza filamento). Questi vengono tirati in fiamma per formare due capillari con estremità ristrette e poi spezzati al diametro appropriato per pipettare a bocca la specie di tardigrado desiderata.
Blocco riscaldanteEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, dispositivo base senza blocco termico, 100-130 V/50-60 Hz (USA/Giappone/Sud America/Taiwan)
Scala per nastro RNA ad alta sensibilitàAgilent5067-5581Scala per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Nastro RNA ad alta sensibilità (High Sensitivity RNA ScreenTape)Agilent5067-5579Per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Tampone campione per nastro RNA ad alta sensibilitàAgilent5067-5580Tampone per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Elettroforesi su gel a microfluidicaAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
Spettrofotometro a volume ridottoFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, tipo di rivelatore: sensore d'immagine lineare CMOS a 2048 elementi, display: schermo a colori ad alta definizione da 10 pollici, lingue: cinese, inglese, francese, giapponese, tedesco, sorgente luminosa: flash allo xenon, larghezza di banda spettrale: minore o uguale a 1,8 nm (FWHM a Hg 254 nm), tensione: 12 VCC
Pipetta a boccaMillipore SigmaA5177Assemblaggi di tubi aspiratori per pipette microcapillari calibrate
Acqua priva di nucleasiFisherFERR0581Thermo Scientific Water, priva di nucleasi
Pipette (2,5 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, confezione da 4
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY, decontaminante per superfici
Tubo e pestello privi di RNasiFisher12-141-368Tubi e pestelli privi di RNasi per l'isolamento dell'RNA

Riferimenti

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