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Articolo metodologico

Protocollo per l'isolamento dell'RNA da diverse specie di tardigradi

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DOI:

10.3791/72120

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1 settembre 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure di isolamento dell'RNA da diverse specie di tardigradi, utilizzando un kit di isolamento dell'RNA basato su colonne, progettato per isolare l'RNA da piccole quantità di tessuto e ottenere quantità sufficienti di RNA di alta qualità per applicazioni successive, come il sequenziamento dell'RNA e la sintesi del DNA complementare.

Abstract

I tardigradi sono animali microscopici noti per la loro eccezionale tolleranza allo stress ambientale. Questi animali possono sopravvivere alla disidratazione, a pressioni estreme, a basse temperature e a elevati livelli di radiazioni ionizzanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di queste capacità estremofile non sono ancora completamente compresi. Gli approcci molecolari utilizzati per indagare tali meccanismi, tra cui il sequenziamento dell'RNA, l'interferenza dell'RNA (RNAi) e l'espressione eterologa di geni di tardigradi in sistemi come i batteri, richiedono l'isolamento di RNA messaggero (mRNA) di alta qualità da un materiale biologico limitato. In questo studio, descriviamo un protocollo riproducibile per l'isolamento di RNA totale da tardigradi che (1) è efficace su molteplici specie, inclusa una specie di eterotardigrado, (2) richiede soltanto da 25 a 200 animali, a seconda delle dimensioni corporee, e (3) produce RNA in quantità e qualità sufficienti per applicazioni successive. Il presente protocollo consente un recupero efficiente dell'RNA a partire da un numero ragionevole di tardigradi e supporta indagini molecolari sulla tolleranza allo stress in diverse specie di tardigradi.

Introduzione

I tardigradi sono noti per la loro capacità di sopravvivere a stress estremi che altri animali non tollererebbero, inclusa la disidratazione, pressioni estreme, temperature estreme e agenti che danneggiano il DNA come farmaci chemioterapici e radiazioni ionizzanti1,2,3,4,5,6,7,8. Negli ultimi anni, gli scienziati hanno indagato i meccanismi alla base della straordinaria resistenza dei tardigradi utilizzando approcci molecolari come il sequenziamento dell'RNA, l'interferenza dell'RNA (RNAi) e l'espressione eterologa di geni di tardigradi in altri sistemi, inclusi cellule umane e batteri8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Quando applicati, questi approcci si sono rivelati strumenti potenti per comprendere esattamente come i tardigradi siano in grado di resistere a stress così estremi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tuttavia, tutti questi approcci molecolari per comprendere la tolleranza allo stress nei tardigradi dipendono dalla capacità di isolare RNA da questi piccoli animali in quantità sufficiente e con qualità adeguata per l'uso in processi successivi.

Un metodo precedente per l'isolamento dell'RNA da tardigradi si è rivelato efficace per ricercatori che lavorano con Hypsibius exemplaris23. Tuttavia, nel tentativo di replicare questo protocollo in H. exemplaris, abbiamo riscontrato che produceva concentrazioni e qualità dell'RNA non affidabili (dati non pubblicati). Un metodo alternativo per l'isolamento dell'RNA basato sul fenolo si è dimostrato efficace per H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus e una specie di eterotardigrado13,21,22,24,25,26. È stato dimostrato che questo protocollo fornisce RNA di qualità e quantità sufficienti per processi successivi, sia da singoli animali che da pool di animali (~50). Tuttavia, questo protocollo richiede che l'utilizzatore manipoli reagenti contenenti fenolo. Il fenolo è una sostanza chimica pericolosa che richiede un'accurata manipolazione e un'esecuzione impropria del protocollo può causare un residuo di fenolo che compromette la purezza dell'RNA e le applicazioni successive. Un altro protocollo precedentemente pubblicato per l'isolamento dell'RNA da tardigradi si concentra sulla capacità di isolare RNA da singoli animali27. Sebbene questo sia un protocollo utile per applicazioni come la PCR quantitativa (qPCR)27, è meno adatto per applicazioni successive come il sequenziamento dell'RNA, in cui l'obiettivo è ottenere una visione più completa del modo in cui gli animali rispondono a un determinato agente stressante o a una certa condizione.

Queste limitazioni nei protocolli disponibili per l'isolamento dell'RNA hanno portato a indagare metodi alternativi per isolare l'RNA dai tardigradi. Il kit per l'isolamento dell'RNA basato su colonne utilizzato in questo protocollo è commercializzato per isolare l'RNA da piccole quantità di tessuto. Questo kit è stato precedentemente utilizzato anche per isolare l'RNA da tessuti di insetti per analisi di sequenziamento dell'RNA a valle, suggerendo che potrebbe essere adatto per isolamenti da altri piccoli animali provvisti di cuticola, come i tardigradi28. Questo studio descrive passo dopo passo il protocollo per l'uso di questo kit di isolamento dell'RNA basato su colonne con i tardigradi, inclusa la spiegazione di specifiche precauzioni da adottare durante l'esecuzione del protocollo con questi organismi. Questo articolo riporta il successo del protocollo in sei specie di tardigradi (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti e l'eterotardigrado Viridiscus celatus). Lo studio ha dimostrato che è possibile ottenere RNA di qualità e quantità significative già da soli 25 esemplari. Sono inoltre forniti esempi di dati relativi alla concentrazione e alla qualità dell'RNA ottenuto, adeguati per applicazioni a valle come il sequenziamento dell'RNA (con minimo bias e amplificazione esponenziale della libreria) e la sintesi del DNA complementare (cDNA). Questo protocollo di isolamento dell'RNA si è già rivelato utile per scoprire i meccanismi alla base della tolleranza alle radiazioni in H. exemplaris8. Il successo del protocollo in diverse specie di tardigradi suggerisce che potrebbe essere applicato più ampiamente allo studio dei meccanismi di tolleranza allo stress, dei meccanismi dello sviluppo e dei processi evolutivi.

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Protocollo

Il seguente protocollo non richiede l'approvazione etica istituzionale per animali, poiché gli animali invertebrati sono esenti da tale requisito. I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dell'attrezzatura e dell'area per l'isolamento dell'RNA

  1. Accendere un blocco riscaldante o un bagnomaria a 42 °C in preparazione per l'estrazione dell'RNA.
  2. Preparare un portaprovette per microcentrifuga, pipette (2 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL) e punte filtrate di dimensioni appropriate.
  3. Pulire la superficie del bancone, il portaprovette, le pipette e le confezioni delle punte con RNase Away, soluzione di candeggina diluita (10%) o etanolo al 70% per denaturare qualsiasi RNase residua.
    NOTA: La presenza eccessiva di RNase sugli strumenti o nell'area in cui si isola l'RNA può compromettere la qualità dell'RNA ottenuto a causa della degradazione. Ridurre questo rischio consentendo un tempo sufficiente affinché i prodotti denaturanti l'RNase agiscano efficacemente e assicurandosi che l'area e gli strumenti siano completamente asciutti prima di proseguire.
  4. Indossare guanti durante tutti i passaggi del protocollo e trattare frequentemente i guanti con una soluzione denaturante l'RNase nel corso del procedimento per prevenire la degradazione dell'RNA.

2. Raccolta degli animali per l'isolamento dell'RNA

  1. Utilizzando una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro (Figura 1A), un anello di Irwin o una micropipetta, trasferire da 25 a 200 animali (in base alle dimensioni della specie) dalle loro piastre di coltura a una piastra contenente acqua minerale pulita, per ridurre la quantità di materiale non appartenente ai tardigradi (alghe o altre fonti alimentari come nematodi o rotiferi, a seconda della specie).
  2. Prelevare una provetta da 1,5 mL priva di RNasi e un pestello.
  3. Utilizzando una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro o un anello di Irwin, trasferire gli animali nel fondo della provetta da 1,5 mL priva di RNasi, avendo particolare cura di trasferire con loro la minor quantità possibile di acqua.
  4. Centrifugare a 4.500 g per 3 minuti per formare un pellet di tardigradi sul fondo della provetta da microcentrifuga.
  5. Osservando la provetta con i tardigradi in pellet al microscopio stereoscopico, utilizzare una pipetta da 20 µL o una pompetta collegata a una camera di aspirazione dotata di una capillare di vetro con un'apertura più piccola rispetto alle dimensioni dei tardigradi da cui si sta isolando l'RNA, per rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile di acqua senza disturbare il pellet di tardigradi. Vedere Figura 1B per un esempio della quantità accettabile di acqua residua.
    NOTA: Prestare attenzione a lasciare un sottile strato di acqua, in modo che gli animali non si disidratino nel breve intervallo tra la rimozione dell'acqua e l'aggiunta del Buffer di Estrazione (XB). Se gli animali si disidratano, ciò potrebbe compromettere la qualità dell'RNA dopo l'isolamento.
  6. Aggiungere 100 µL di Buffer di Estrazione (XB) alla provetta contenente i tardigradi.

3. Disgregamento meccanico dei tardigradi ed estrazione dell'RNA

  1. Utilizzando il pestello privo di RNasi, rompere gli tardigradi macinando delicatamente ma con fermezza il pestello sul fondo del tubo per circa 30 s. Un totale di 20–30 movimenti di macinazione dovrebbe essere sufficiente per rompere gli tardigradi.
  2. Rimuovere il pestello dal tubo, avendo cura di far sì che la maggior quantità possibile di liquido rimanga sul fondo del tubo.
  3. Controllare il contenuto del microcentrifuga al microscopio stereoscopico per accertarsi che non rimangano animali visibilmente integri.
  4. Incubare la miscela a 42 °C per 30 min su un blocco riscaldante agitato con agitazione delicata (300 giri/min).
    NOTA: Il buffer di estrazione (XB) stabilizza l'RNA prevenendone il degrado a questa temperatura.

4. Condizionamento della colonna per l'isolamento dell'RNA

  1. Negli ultimi 10 minuti dell'incubazione di estrazione, assemblare la colonna per la raccolta e la purificazione dell'RNA. Posizionare una colonna di purificazione in un tubo di raccolta e etichettare la colonna in modo appropriato.
  2. Aggiungere direttamente 250 µL di Condizionamento Buffer (CB) sulla colonna.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Centrifugare a 16,000 × g per 1 min e scartare il flusso passante. La colonna è ora pronta per ricevere il surnatante di RNA dal passaggio successivo.
  5. Togliere dal congelatore il 10x DNase I Reaction Buffer e l'acqua priva di nucleasi in modo che scongelino completamente in tempo per il passaggio 6 riportato di seguito.

5. Legame dell'RNA alla colonna

  1. Dopo l'incubazione di estrazione, centrifugare il tubo contenente i tardigradi disgregati meccanicamente e il Buffer di Estrazione (XB) a 3.000 × g per 2 minuti.
  2. Prendere un nuovo tubo privo di RNasi e etichettarlo in modo appropriato.
  3. Utilizzando una pipetta da 200 µL con punta filtrante, rimuovere con attenzione il sopranatante dal pellet di cuticole dei tardigradi. Prestare attenzione a non disturbare il pellet di cuticole e a rimuovere soltanto il sopranatante.
    NOTA: Il trasferimento di cuticole nei passaggi successivi comporterà una minore efficienza del rendimento di RNA in colonna a causa dell'ostruzione fisica della colonna. Per evitare questo errore potenziale, è possibile osservare la punta della pipetta con il sopranatante al microscopio per assicurarsi dell'assenza di cuticole. Se sono presenti cuticole, rimettere il sopranatante nel tubo e ripetere il passaggio di centrifugazione.
  4. Trasferire il sopranatante nel nuovo tubo etichettato, privo di RNasi.
  5. Aggiungere 100 µL di etanolo al 70% nel tubo contenente l'RNA e mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte. In questo passaggio, si dovrebbero osservare chiari filamenti viscosi dopo l'aggiunta dell'etanolo. Questo è un buon segno che nell'estratto è presente RNA.
  6. Pipettare l'intera miscela (200 µL) sulla colonna preparata al passaggio 4.
    NOTA: Quando si pipettano soluzioni sulla colonna in questo e nei passaggi successivi, prestare attenzione a dispensare il liquido al centro della colonna ed evitare di toccare fisicamente la colonna con la punta della pipetta. La perforazione meccanica della colonna provocherà problemi successivi riguardo alla qualità e alla quantità di RNA.
  7. Per legare l'RNA alla colonna, centrifugare per 2 minuti a 100 × g, seguito da una centrifugazione a 16.000 × g per 30 secondi per rimuovere il flusso passante.

6. Preparazione della soluzione di DNasi I

  1. Lasciare scongelare completamente il Buffer di Reazione 10x per DNase I e l'Acqua priva di nucleasi prima di preparare la soluzione.
  2. Per ogni isolamento di RNA, preparare una soluzione di 40 µL in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL separata, contenente 32 µL di Acqua priva di nucleasi, 4 µL di Buffer di Reazione 10x per DNase I e 4 µL di Enzima DNase I. Mantenere la soluzione sul ghiaccio fino al momento di applicarla alla colonna al Passaggio 7.3.

7. Lavaggio dell'RNA e trattamento con DNasi I

  1. Aggiungere 100 µL di Wash Buffer 1 (W1) direttamente sulla colonna di purificazione contenente l'RNA legato (proveniente dal passaggio 5.7).
  2. Centrifugare per 1 min a 8,000 × g ed eliminare il flusso passante.
  3. Aggiungere 40 µL di soluzione di DNase I del Passaggio 6 direttamente sulla colonna di purificazione e incubare a temperatura ambiente per 15 min per rimuovere la contaminazione da DNA.
  4. Aggiungere 40 µL di Wash Buffer 1 (W1) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 8,000 × g per 30 s.
  5. Aggiungere 100 µL di Wash Buffer 2 (W2) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 8,000 × g per 1 min.
  6. Aggiungere altri 100 µL di Wash Buffer 2 (W2) sulla colonna di purificazione e centrifugare a 16,000 × g per 2 min. Scartare il flusso passante.
  7. Centrifugare la colonna a 16,000 × g per 1 min per asciugare la colonna.

8. Eluizione dell'RNA

  1. Prendere un tubo da 0,5 mL (incluso nel kit) per ogni isolamento di RNA ed etichettarlo in modo appropriato. Questo sarà il tubo che conterrà l'RNA dopo l'isolamento.
  2. Trasferire la colonna con l'RNA legato e lavato nel tubo da 0,5 mL precedentemente etichettato. La colonna deve inserirsi saldamente in questo tubo.
  3. Guardando il tubo di lato, posizionare la punta della pipetta direttamente sopra la membrana della colonna, espellere 11 µL di tampone di eluizione (EB) sulla colonna e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
    NOTA: se il tampone di eluizione (EB) non viene disperso direttamente sulla colonna, si otterranno rese di RNA ridotte. Se si osservano goccioline di liquido attorno al perimetro della colonna, ciò indica una dispersione inadeguata del tampone di eluizione (EB). In tal caso, si raccomanda di ripetere questo passaggio utilizzando il flusso passato del passo 8.5, assicurandosi che il tampone di eluizione (EB) venga espulso direttamente al centro della colonna.
  4. Posizionare il tubo da 0,5 mL contenente la colonna nel tubo di raccolta fornito con il kit, per garantire un corretto posizionamento durante la centrifugazione (Figura 2).
  5. Centrifugare la colonna a 1.000 × g per 1 min per distribuire il tampone di eluizione (EB), quindi centrifugare a 16.000 × g per 1 min per eluire l'RNA.
  6. Posizionare immediatamente il tubo da 0,5 mL contenente l'RNA sul ghiaccio.

9. Convalida della quantità e qualità dell'RNA mediante spettrofotometro a microvolume

NOTA: Possono essere utilizzati altri metodi per valutare quantità e qualità dell'RNA. Qui viene utilizzato un metodo con uno spettrofotometro a microvolume. È inoltre possibile utilizzare un fluorimetro o uno strumento per elettroforesi su gel a microfluidica29.

  1. Pulire il piatto dello spettrofotometro a microvolume con un panno senza lanugine per assicurarsi che sia privo di altri liquidi.
  2. Selezionare l'impostazione RNA sullo spettrofotometro per l'analisi.
  3. Eseguire la messa a zero dello spettrofotometro utilizzando 1 µL del tampone di eluizione (EB) usato al passaggio 8.3.
  4. Dopo la messa a zero, rimuovere il tampone di eluizione (EB) dal piatto con un panno senza lanugine.
  5. Mantenendo il tubo da 0,5 mL contenente l'RNA sul ghiaccio, pipettare 1 µL di RNA sul piatto dello spettrofotometro. Abbassare il braccio dello spettrofotometro per misurare l'assorbanza del campione al fine di quantificare e valutare la qualità dell'RNA isolato.
    NOTA: Per informazioni dettagliate sui valori accettabili di qualità e quantità per le applicazioni successive, consultare la sezione “Risultati” riportata di seguito.

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Risultati

Un passaggio critico di questo protocollo, come menzionato in precedenza, consiste nel rimuovere una quantità appropriata di acqua dai tardigradi raccolti prima di aggiungere il buffer di estrazione (XB) per l'estrazione dell'RNA. Lasciare troppa acqua provocherà una diluizione del buffer di estrazione (XB) e un'estrazione di RNA scadente (ad esempio, RIN < 7, rapporto 260/280 <1,8, rapporto 260/230 <1,8 e/o concentrazione <5 ng/µL) dagli animali, con conseguente riduzione della concentrazione e della qualità...

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Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è facilitare l'isolamento di RNA da tardigradi in quantità e qualità sufficienti per applicazioni successive che permettano lo studio della tolleranza allo stress nei tardigradi. Il protocollo qui presentato evidenzia i punti in cui gli utenti potrebbero incontrare difficoltà, tra cui la rimozione di una quantità sufficiente di acqua prima dell'aggiunta del buffer di estrazione (XB) (Passaggio 2.5), la rottura delle strutture corporee dei tardigradi (Passaggi 3.1–3.3), il trasferimento de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi iniziali dell'Università di Asheville (a CCH) e da una sovvenzione NSF 2225683 a Jason Pienaar (tutore postdottorale di PK). Ringraziamo la struttura di sequenziamento ad alto rendimento dell'Università della Carolina del Nord per l'assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubo microcentrifuga graduato Seal-Rite da 1,5 mL, naturale, in polipropilene, 500/confezione
Etilene al 70%VWR71001-654Per la pulizia di banchi e attrezzature
Kit Arcturis PicoPure per l'isolamento dell'RNAFisherKIT0204Kit contenente i componenti per il protocollo di isolamento descritto in questo manoscritto
CentrifugaEppendorf5405000441Centrifuga 5425, con manopole rotative, non refrigerata, con rotore FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (USA)
Acqua minerale Deer ParkQualsiasi negozio di alimentariN/AQuesto è il mezzo per le colture di tardigradi e viene utilizzato per risciacquare i tardigradi prima dell'isolamento dell'RNA
Microscopio stereoscopicoZeissN/AZeiss Stemi 305, rapporto di zoom 5:1 e ingrandimento totale da 8x a 40x, con unità di trasilluminazione M LED
DNasi IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNasi I, priva di RNasi (1 U/µL)
Punte filtrate per pipetta da 10 µLVWR76322-528Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 1000 µLVWR76322-154Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 20 µLVWR76322-134Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Punte filtrate per pipetta da 200 µLVWR76322-150Qualsiasi punta filtrata per pipetta va bene
Capillari di vetroFisher50-821-811Capillari di vetro standard World Precision Instrument - 1B120-6 (6 pollici, diametro esterno 1,2 mm, senza filamento). Questi vengono tirati in fiamma per formare due capillari con estremità ristrette e poi spezzati al diametro appropriato per pipettare a bocca la specie di tardigrado desiderata.
Blocco riscaldanteEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, dispositivo base senza blocco termico, 100-130 V/50-60 Hz (USA/Giappone/Sud America/Taiwan)
Scala per nastro RNA ad alta sensibilitàAgilent5067-5581Scala per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Nastro RNA ad alta sensibilità (High Sensitivity RNA ScreenTape)Agilent5067-5579Per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Tampone campione per nastro RNA ad alta sensibilitàAgilent5067-5580Tampone per l'analisi ad alta sensibilità di RNA totale su sistemi TapeStation
Elettroforesi su gel a microfluidicaAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
Spettrofotometro a volume ridottoFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, tipo di rivelatore: sensore d'immagine lineare CMOS a 2048 elementi, display: schermo a colori ad alta definizione da 10 pollici, lingue: cinese, inglese, francese, giapponese, tedesco, sorgente luminosa: flash allo xenon, larghezza di banda spettrale: minore o uguale a 1,8 nm (FWHM a Hg 254 nm), tensione: 12 VCC
Pipetta a boccaMillipore SigmaA5177Assemblaggi di tubi aspiratori per pipette microcapillari calibrate
Acqua priva di nucleasiFisherFERR0581Thermo Scientific Water, priva di nucleasi
Pipette (2,5 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, confezione da 4
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY, decontaminante per superfici
Tubo e pestello privi di RNasiFisher12-141-368Tubi e pestelli privi di RNasi per l'isolamento dell'RNA

Riferimenti

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