Interazione farmaco-farmaco tra eugenolo e repaglinide nel diabete mellito di tipo 2 e il suo potenziale meccanismo

Sommario

Questo studio mirava a esplorare potenziali interazioni farmaco-farmaco tra eugenolo (EUG) e repaglinide (RPG) in pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM).

Abstract

Questo studio ha indagato la potenziale interazione farmaco-farmaco (DDI) tra eugenolo (EUG) e repaglinide (RPG) nel diabete mellito di tipo 2 (T2DM). È stato stabilito un modello di ratto T2DM utilizzando una dieta ricca di grassi e streptozocina (STZ). Il gruppo a dose singola ha ricevuto 0,4 mg/kg RPG, mentre i gruppi con cosomministrazione sono stati pre-trattati con EUG (50, 100, 150 mg/kg) per sette giorni prima di ricevere una singola dose di RPG (0,4 mg/kg). I parametri di glucosio nel sangue e farmacocinetici della RPG sono stati valutati nei campioni plasmici dei ratti. L'effetto dell'EUG sulla stabilità metabolica RPG e sull'attività del citocromo P3A (CYP3A) è stato valutato nei microsomi epatici (RLM) di ratto. Nei ratti T2DM, il trattamento con RPG ha mostrato un effetto ipoglicemico, ulteriormente promosso dalla co-somministrazione di EUG in modo dipendente dalla dose (p < 0,001). La co-somministrazione di EUG ha influenzato la farmacocinetica della RPG aumentando l'area sotto la curva (AUC, aumentato 88,64%, 164,59% e 244,72% rispetto a RPG singolo, p < 0,001), concentrazione massima plasmmatica (C_max, aumentata 18,61%, 53,58% e 77,63% rispetto a RPG singolo, p < 0,01), concentrazione massima (T_max, 1,0 h per la co-somministrazione EUG vs 0,5 h per RPG singolo), emivita (t_1/2, prolungata 33,86%, 49,61% e 88,19% rispetto a RPG singolo, p < 0,01), tempo medio di ritenzione (MRT, prolungato 17,62%, 26,42%, 44,04% rispetto a RPG singolo, p < 0,001) e riduzione del tasso di risoluzione (Clz/F, diminuzione 48,92%, 63,31% e 74,10% rispetto a RPG singolo, p < 0,001) in modo dipendente dalla dose. In vitro Lo studio RLM, EUG, ha migliorato la stabilità metabolica della RPG prolungando l'emivita (44,09 ± 3,25 min) e riducendo la clearance intrinseca (30,55 ± 3,69 μL/min/mg di proteina). L'EUG ha anche inibito l'attività del CYP3A con un IC₅₀ di 7,90 ± 1,79 μM. La co-somministrazione dell'EUG ha promosso l'effetto ipoglicemico del RPG aumentando l'esposizione sistemica al RPG nei ratti T2DM, potenzialmente migliorando la stabilità metabolica del RPG e iniibando l'attività del CYP3A.

Introduzione

Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è un disturbo metabolico cronico caratterizzato da resistenza all'insulina o riduzione dell'efficienza insulinica, che colpisce milioni di persone^{in tutto il mondo 1}. Interazioni complesse con suscettibilità genetica e fattori legati allo stile di vita sono coinvolte nel T2DM, con conseguente riducimento dell'assorbimento del glucosio, eccessivo gluconeogenesi epatica e infiammazione cronica di basso^{grado 2}. Il T2DM può portare a gravi complicazioni se trattato in modo inadeguato, tra cui malattie cardiovascolari, malattie renali, retinopatia e neuropatia, influenzando significativamente la qualità della vita dei pazienti e aumentando la^{mortalità 2}. I trattamenti farmacologici attuali per il T2DM includono metformina, farmaci sulfonilureici, agonisti del recettore GLP-1 e inibitori di DPP-4, ecc^{. 3}. Il repaglinide (RPG) è un tipo di meglitinide a breve durata che agisce stimolando la secrezione di insulina e ha la caratteristica di una flessibilità^{dosificante 4}. Rispetto alle sulfoniluree, le glinidi offrono un controllo superiore dell'iperglicemia postprandiale, riducono il rischio di alcuni effetti avversi come l'ipoglicemia e presentano un profilo di sicurezza più favorevole, in particolare nei pazienti con insufficienza^{renale 5,6}. La RPG viene rapidamente assorbita dopo la somministrazione orale, raggiungendo concentrazioni plasmatiche massime tipicamente entro 30–60 minuti, e la sua breve emivita provoca una breve stimolazione del rilascio di insulina. Clinicamente, la RPG viene utilizzata sia come monoterapia sia in combinazione con altri agenti antiipoglicemici orali per ottimizzare il controllo^{glicemico 7}. Tuttavia, la sua applicazione clinica è limitata da una bassa biodisponibilità orale (circa il 56%), un metabolismo epatico rapido e un potenziale rischio di ipoglicemia 8,9,10,11,12,13,14. Questi svantaggi evidenziano la necessità di una strategia di trattamento completa.

L'eugenolo (EUG), noto chimicamente come 4-allilo-2-metossifenolo, è un composto organico con la formula chimica C₁₀H_{12O 2}¹⁵. L'EUG è un liquido incolore o giallo pallido ed è un composto fenolico attivo presente principalmente nei chiodi di garofano (Eugenia caryophyllata Thunb.) e in altre piante^{aromatiche 16}. L'EUG ha attirato molta attenzione grazie alle sue varie proprietà farmacologiche, tra cui attività antiossidanti, antinfiammatorie, antibatteriche, analgesiche e^antitumorali 17,18,19. Studi recenti hanno dimostrato che l'EUG ha dimostrato il potenziale valore come terapia aggiuntiva per il T2DM, poiché sia le evidenze sperimentali in vitro che in vivo indicano che l'EUG migliora la sensibilità all'insulina, favorisce l'assorbimento del glucosio nei tessuti periferici, inibisce la gluconeogenesi epatica e protegge la funzione delle β cellule^{pancreatiche 20,21}. Queste misure multifaccettate, unite a una tossicità^{relativamente bassa 22}, posizionano l'EUG come un candidato farmaco naturale altamente promettente, capace di integrare le carenze dei farmaci clinici tradizionali e alleviare le complicazioni correlate al T2DM attraverso un meccanismo sinergico.

Gli enzimi citocromo P450 (P450) svolgono un ruolo cruciale nel processo di metabolismo dei farmaci e mediano le interazioni farmaco-farmaco (DDI) inducendo o inibendo specifici sottotipi, cosa di vitale importanza per un trattamento farmacologico^{sicuro ed efficace 23}. In particolare, la RPG viene metabolizzata principalmente nel fegato da CYP2C8 e CYP3A4^24,25. Quando somministrata insieme alla quercetina (QCT), la QCT migliora la biodisponibilità in vivo della RPG iniibendo il metabolismo epatico di primo passaggio e sistemico tramite CYP450s²⁶. È stato inoltre riportato che l'EUG sopprime l'attività dei CYP450, inclusi 1A2, 2C9, 2D6 e 3A4 in modo dipendente dalla concentrazione, indicando potenziali interazioni quando l'EUG viene co-somministrata con farmaci metabolizzati da questi^{enzimi 27}. Nonostante il potenziale promettente dell'EUG come terapia aggiuntiva per il T2DM e la noto suscettibilità della RPG alle DDI mediate da CYP, non è chiaro se l'EUG alteri l'esposizione sistemica, la stabilità metabolica o il metabolismo mediato da CYP3A della RPG. Dato che sia EUG che RPG sono probabilmente co-somministrati in pratica clinica o in contesti di integratori alimentari, la mancanza di dati DDI tra i due rappresenta un potenziale rischio di alterazioni indesiderate nelle concentrazioni plasmatiche di RPG. Tali alterazioni potrebbero portare a una riduzione dell'efficacia terapeutica o a un aumento del rischio di ipoglicemia. Pertanto, questa lacuna di evidenza rappresenta un ostacolo significativo alla combinazione razionale e sicura di prodotti naturali con farmaci antidiabetici convenzionali. Pertanto, è essenziale valutare sistematicamente l'effetto dell'EUG sulla farmacocinetica e la farmacodinamica della RPG e chiarire il meccanismo metabolico sottostante, con particolare attenzione all'attività del CYP3A. Date le prove sopra citate, si potrebbe ipotizzare che l'EUG possa influenzare il metabolismo del RPG alterando l'attività del CYP450. Questo è il primo studio che ha indagato l'interazione EUG–RPG in un contesto T2DM. I risultati dovrebbero colmare una lacuna critica di conoscenza e fornire una base meccanicistica per ottimizzare la co-amministrazione sicura di EUG e RPG nella gestione T2DM. Se si considera la co-somministrazione, si dovrebbe considerare il potenziale di maggiore esposizione al RPG e si dovrebbero monitorare i segni di ipoglicemia, in particolare quando l'EUG viene assunta a dosi elevate o come integratore concentrato. Inoltre, sebbene i ratti esprimano isoforme di CYP3A funzionalmente analoghe a quelle umane di CYP3A4, l'estrapolazione diretta dei risultati quantitativi all'uomo richiede cautela a causa delle differenze tra specie nell'espressione enzimatica e nell'attività catalitica.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Accademia Cinese delle Scienze Mediche del Jilin (Data: 2024.11.21/No.2024112) in conformità con le linee guida^{ARRIVE 28}. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Condizioni di alloggio degli animali

I maschi di ratti Sprague-Dawley (200–250 g) venivano ospitati in una stanza per animali da laboratorio nelle seguenti condizioni: temperatura: 22 °C ± 2 °C, umidità relativa: 40–60%, e un ciclo di 12 ore di luce e scurezza, con libero accesso a cibo e acqua per consentire una settimana di^{acclimatazione 29,30}.

2. Modellazione animale, trattamento e lavorazione dei campioni

La dimensione del campione è stata determinata in base a un'analisi di potenza utilizzando il test F (G*Power 3.1.9.7). L'analisi di potenza a priori è stata eseguita con una dimensione dell'effetto di 0,6, un livello α di 0,05 e una potenza desiderata di 0,8, che ha prodotto un campione totale di 55. Questo calcolo indicava che erano necessari almeno 9 ratti per gruppo. Pertanto, sono stati utilizzati dieci ratti per gruppo, raggiungendo una potenza effettiva di 0,86.

Prima che venisse stabilito il modello T2DM, tutti i ratti venivano digiunati per 12 ore. Successivamente furono divisi casualmente in due gruppi: il gruppo di controllo (n = 10) e il gruppo T2DM (n = 50). L'istituzione del modello T2DM del ratto è stata effettuata secondo il metodo^{precedentemente riportato 31}. In breve, i ratti del gruppo T2DM sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi (con un contenuto di grassi del 60%) per 4 settimane consecutive e poi hanno ricevuto un'unica iniezione intraperitoneale di 30 mg/kg di STZ disciolta in un tampone sterile di citrato (pH 4,4). Tre giorni dopo l'iniezione STZ, la glicemia nella vena caudal dei ratti è stata misurata utilizzando un misuratore di glucosio nel sangue, e i ratti con una concentrazione di glucosio superiore a 16,7 mmol/L sono stati considerati aver stabilito con successo il T2DM. Per il gruppo di controllo, i ratti hanno ricevuto una dieta normale e iniezioni intraperitoneali dello 0,9% di soluzione salina normale nello stesso periodo del gruppo T2DM.

I ratti T2DM sono stati ulteriormente suddivisi in quattro gruppi con 10 ratti in ciascun gruppo: il gruppo T2DM + RPG (singolo RPG), il gruppo T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) (co-RPG+EUG 50 mg/kg), il gruppo T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) (co-RPG+EUG 100 mg/kg) e il gruppo T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) (co-RPG+EUG 150 mg/kg). Dopo un digiuno di 12 ore, ai ratti del gruppo singolo RPG sono stati somministrati per via orale 0,4 mg/kg RPG (sospesi in soluzione salina normale) tramite un ago^{di gagea 26}. I ratti nei gruppi co-RPG+EUG hanno ricevuto rispettivamente per via orale 50, 100 e 150 mg/kg EUG, una volta al giorno per sette giorni consecutivi, e all'ottavo giorno, dopo un ulteriore periodo di digiuno di 12 ore, al gruppo di co-somministrazione è stato inoltre somministrato 0,4 mg/kg RPG tramite gavage intragastrico. Successivamente, i parametri della glicemia sono stati valutati utilizzando campioni di sangue raccolti dalla vena caudaria.

Per l'analisi farmacocinetica, il campione di sangue (0,2 mL) è stato raccolto dal plesso venoso orbitale posteriore dei ratti nei tubi della microcentrifuga eparinizzata in vari momenti temporali (0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h e 8 h dopo la dose). Dopo la raccolta, i campioni venivano centrifugati (1500 × g, 10 min, 4 °C) per separare il plasma (giallo pallido, traslucido), che veniva conservato a -80 °C fino all'analisi. I campioni di plasma sono stati successivamente analizzati per la concentrazione di RPG utilizzando il metodo HPLC descritto nel passo 4.

3. Studio del metabolismo nei microsomi epatici di ratto aggregati

Per indagare il meccanismo alla base dei cambiamenti farmacocinetici in vivo , è stato valutato l'effetto dell'EUG sulla stabilità metabolica del RPG e sull'attività CYP3A nella RLM. RPG (3 μM) è stato incubato con o senza EUG in un tampone PBS a 37 °C con un volume totale di 200 μL, inclusi RLM (0,5 mg/mL di proteina microsomica) e un sistema di rigenerazione NADPH (1,3 mM NADP, 3,54 mM glucosio 6-fosfato, 0,4 U/mL glucosio 6-fosfato deidrogenasi e 3,3 mM_{MgCl 2}). Dopo una pre-incubazione di 5 minuti a 37 °C senza NADPH, la reazione è stata avviata aggiungendo il sistema di rigenerazione del NADPH. La miscela veniva poi incubata a 37 °C in un bagno d'acqua scosso. In diversi momenti di incubazione (0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min), venivano raccolti campioni di 30 μL e trasferiti in un tubo microcentrifuga con acetonitrile gelato per terminare la reazione. I campioni sono stati centrifugati (12000 × g per 10 minuti a 4 °C) per ottenere il soprandanante (trasparente). I supernatanti risultanti sono stati poi analizzati per la concentrazione di RPG utilizzando lo stesso metodo HPLC descritto nel passo 4.

4. Analisi HPLC

La concentrazione di RPG nel plasma (dallo stadio 2) e nelle incubazioni microsomali (dal passaggio 3) è stata analizzata utilizzando il metodo HPLC riportato da Kim et ^al.26. I passaggi specifici dell'operazione sono i seguenti: campioni (120 μL) sono stati miscelati con 300 μL di acetonitrile contenente ketoconazolo (standard interno, 100 ng/mL) per ottenere la precipitazione proteica. Successivamente, la miscela veniva vortizzata e centrifugata a 15.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il sovrantantante veniva trasferito in un tubo centrifuga a microcolonna ed evaporava a 25 °C sotto un'atmosfera di azoto. Il residuo dopo l'essiccazione veniva nuovamente disciolto con una fase mobile da 50 μL, poi vortizato e centrifugato. Successivamente, 40 μL del sovrandante venivano iniettati nella colonna HPLC (250 mm × 4,6 mm, dimensione particella 5 μm). La colonna è stata eluita a 25 °C in modalità eluzione isocratica con 10 mM di tampone fosfato (pH 6,0) e acetonitrile (rapporto volumetrico 46,4: 53,6), con una portata di 1 mL/min. L'eluente veniva monitorato utilizzando un rivelatore di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 240 nm.

5. Analisi statistica

È stato utilizzato software di analisi farmacocinetica per calcolare i parametri farmacocinetici, inclusi AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT e clearance di autorizzazione. Per la generazione delle figure e l'analisi dei dati venivano utilizzati software di analisi statistica e grafica. Tutti i dati sono stati presentati come deviazione media ± standard. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale (per confronti dei livelli di glucosio) o ANOVA bidirezionale (per confronti dei parametri farmacocinetici), a seconda dei conti, seguite dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. L'effetto dell'EUG sull'attività CYP3A è stato valutato tramite analisi di regressione non lineare. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

L'emivita dell'EUG sulla stabilità metabolica RPG nella RLM è stata calcolata da:
t_1/2 (min) = 0,693/ln(C_t/_{C 0} × 100).

Tasso di eliminazione intrinseco (μL/min/mg proteina) = v × 0,693/_{t 1/2};
v (μL/mg) = volume di incubazione/concentrazione proteica.

Risultati

L'EUG ha promosso l'effetto ipoglicemico della RPG nei ratti T2DM
Il livello di glucosio nel sangue dei ratti nel gruppo T2DM è aumentato (p < 0,001, IC 95%: -13,90~-11,32) rispetto a quello del gruppo di controllo, indicando la conduzione efficace del modello T2DM (Figura 1A). La somministrazione di un singolo RPG ha soppresso il livello di glucosio nel sangue nei ratti T2DM (p < 0,001, IC 95%: 5,26~7,84). La co-sommini...

Discussione

Il T2DM è una malattia metabolica cronica che richiede un trattamento a lungo termine, e i pazienti spesso devono assumere più farmaci a causa di condizioni sottostanti come malattie cardiovascolari e malattie^{renali 32}. Il rischio di DDI aumenta significativamente con la co-somministrazione dei farmaci, poiché può influire sull'assorbimento, il metabolismo o l'efficacia dei farmaci ipoglicemici, il che può portare a rischi acuti come coma ipoglicemico e livelli di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acetonitrile	Merck, Germany	34851	≥99.9%
chromatographic column	Phenomenex, USA	00G-4041-E0	250 mm × 4.6 mm, particle size 5 μm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3.0
EUG	MUST Bio-technology, China	A0074	purity ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	-	9.0.0
High Performance Liquid Chromatography	Shimadzu Corporation, Japan	228-45147-42	RF-20A
ketoconazole	Merck, Germany	K1003	Purity 99.0-101.0%
Male Sprague-Dawley rats	Shanghai Animal Center, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Germany	10107824001	97% (dry weight)
OneTouch Ultra2 blood glucose meter	Life Scan Inc., USA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Germany	P4474	ph 7.4
RLM	Merck, Germany	M9066	-
RPG	Merck, Germany	R9028	purity ≥98%
STZ	Merck, Germany	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, eugenolo; RPG, repaglinide; RLM, microsomi epatici di ratto; NADPH, β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; STZ, streptozotocina; PBS, tampone fosfato tamponato.