Articolo metodologico

Acupotomia per la spondilosi cervicale nei ratti: un protocollo visualizzato per l'istituzione del modello e l'intervento

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DOI:

10.3791/72132

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3 settembre 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Dermatology, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua Medicine, Tsinghua University, 3Acupuncture and Moxibustion Clinic, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive dettagliatamente un metodo di modellizzazione della spondilosi cervicale in ratti e una strategia di intervento con acupotomia, fornendo un protocollo operativo visualizzato per la ricerca inerente.

Abstract

La spondilosi cervicale (SC) è una malattia degenerativa cronica. I cambiamenti degenerativi nei dischi intervertebrali della colonna cervicale, insieme a successive alterazioni patologiche, interessano i tessuti e le strutture circostanti, provocando manifestazioni cliniche come dolore al collo, rigidità, limitata mobilità e, occasionalmente, formicolio e sintomi irradiati agli arti superiori. Tra questi, la compressione della radice nervosa è la più comune. Pertanto, questo studio ha sviluppato un modello murino di SC indotta da compressione della radice nervosa cervicale. La terapia con acupotomia ha mostrato potenzialità nel trattamento clinico della SC, poiché scioglie le aderenze dei tessuti molli locali e riduce la compressione nervosa. Tuttavia, al momento mancano protocolli procedurali visualizzati negli esperimenti sugli animali. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata di un metodo affidabile per la creazione di un modello murino di SC e del relativo protocollo di intervento con acupotomia. In questa procedura, vengono illustrati il processo di induzione del modello, i passaggi della manipolazione con acupotomia, il posizionamento terapeutico, le tecniche di immobilizzazione del ratto e le precauzioni fondamentali. Inoltre, lo studio ha utilizzato l'elettromiografia (EMG) per confermare il corretto insediamento del modello di SC e ha valutato l'intervento mediante soglie meccaniche di ritrazione, analisi della deambulazione e istopatologia della radice nervosa. Questa ricerca non solo offre un riferimento per la realizzazione del modello murino di SC e per l'intervento con acupotomia, ma fornisce anche un quadro sperimentale sistematico e fattibile per futuri studi volti a indagare i meccanismi d'azione.

Introduzione

La spondilosi cervicale (CS) è una comune malattia degenerativa della colonna vertebrale. Il processo patologico fondamentale ha origine dalla degenerazione dei dischi intervertebrali, che a sua volta innesta una serie di alterazioni patologiche secondarie, tra cui il restringimento dello spazio intervertebrale, la formazione di osteofiti e l'ipertrofia dei legamenti1,2. Queste modificazioni patologiche provocano una varietà di sintomi clinici, come dolore e rigidità a livello del collo e delle spalle, e intorpidimento irradiato agli arti superiori. Nei casi più gravi, possono manifestarsi deficit neurologici, tra cui disfunzioni motorie e persino tetraplegia2,3. In particolare, negli ultimi anni l'incidenza della spondilosi cervicale è progressivamente aumentata, con un'età di insorgenza sempre più precoce, comportando un notevole carico socioeconomico4. La degenerazione dei dischi intervertebrali cervicali e la proliferazione osteofitica possono coinvolgere le strutture ossee e molli adiacenti, causando un restringimento del canale spinale cervicale o dei forami intervertebrali e conseguente compressione di strutture vicine, tra cui le radici nervose cervicali, il midollo spinale e le arterie vertebrali1,2,3,4. Tra queste, la compressione delle radici nervose cervicali è la più frequente, rappresentando circa il 60%–70% di tutti i casi di CS5,6,7. Sebbene in ambito clinico siano disponibili diverse strategie terapeutiche, tra cui terapia fisica, trattamento farmacologico e intervento chirurgico, le terapie non chirurgiche sono diventate l'opzione preferita per la maggior parte dei pazienti a causa dei costi elevati, del notevole trauma e degli esiti postoperatori incerti associati agli interventi chirurgici4. Nella pratica medica attuale, vengono comunemente utilizzati farmaci antinfiammatori non steroidei e agenti neurotrofici. Sebbene questi farmaci possano alleviare il dolore e rallentare in una certa misura il decorso della malattia, sono associati a effetti avversi come lesioni del sistema digerente e danno renale8,9.

La terapia con acupotomia è una metodologia terapeutica caratteristica sviluppata sulla base delle teorie tradizionali della medicina cinese relative all'agopuntura, combinate con tecniche chirurgiche moderne mini-invasive. I suoi effetti si manifestano attraverso la dissezione e il rilascio delle aderenze dei tessuti molli, la regolazione dei fattori infiammatori locali e il miglioramento della microcircolazione regionale10,11,12. Negli ultimi anni, l'efficacia clinica dell'acupotomia nel trattamento della spondilosi cervicale è stata ampiamente riconosciuta, dimostrando un potenziale promettente nel ridurre la compressione nervosa, alleviare il dolore e migliorare la funzione motoria del rachide cervicale13,14. Tuttavia, quando applicata negli esperimenti sugli animali, l'intervento con acupotomia presenta sfide come una localizzazione imprecisa e difficoltà nel controllare la profondità della manipolazione. Allo stesso tempo, per trasformare queste osservazioni cliniche in conclusioni solide basate su evidenze, la creazione di modelli animali stabili e riproducibili rappresenta un prerequisito essenziale. Il metodo del filo di nylon intravertebrale induce una compressione meccanica diretta inserendo suture in nylon nel forame intervertebrale, riproducendo così in modo preciso il processo fisiopatologico della compressione clinica della radice nervosa15. Questo approccio modellistico presenta anche vantaggi come un ciclo di modellizzazione breve e segmenti di compressione controllabili15. Tuttavia, la sua procedura chirurgica si basa in larga misura sull'esperienza personale, e attualmente mancano descrizioni operative dettagliate e visualizzate.

Questo studio presenta un protocollo sperimentale completo, dettagliato e visualizzato che copre l'induzione di un modello rattno di spondilosi cervicale e l'intero procedimento di intervento con acupotomia. Poiché gli agenti anestetici possono influenzare la misurazione della soglia meccanica di ritrazione e, di conseguenza, alterare i risultati sperimentali16,17,18,19, in questo studio è stato utilizzato un apposito dispositivo di contenimento per ratto. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del processo di induzione del modello animale, delle manovre progressive di acupotomia, della localizzazione precisa dei siti di trattamento, dei metodi di immobilizzazione e fissazione del ratto e di altre precauzioni sperimentali fondamentali. Sono state adottate diverse dimensioni di valutazione, incluse la misurazione della soglia meccanica di ritrazione, registrazioni elettrofisiologiche, analisi della deambulazione e osservazione istopatologica delle radici nervose. Lo scopo di questo studio è fornire un protocollo visualizzato per l'induzione del modello e l'intervento di acupotomia in un modello rattno di spondilosi cervicale, offrendo così un supporto metodologico per indagini sui meccanismi d'azione e per la valutazione dell'efficacia della terapia con acupotomia nel trattamento della SC.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state esaminate, approvate e rigorosamente monitorate dal Comitato Etico per gli Animali da Laboratorio della Beijing MDKN Biotech Company (ID approvazione: MDKN-2025-096). Tutti i protocolli sono stati condotti in rigorosa conformità con le linee guida per la Cura e l'Utilizzo degli Animali da Laboratorio emesse dagli Istituti Nazionali di Sanità (NIH). I reagenti e l'attrezzatura utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali sperimentali e gruppi

  1. Selezionare ratti adulti maschi Sprague–Dawley (SD) del peso di 230,0 g ± 20 g da includere nell'esperimento.
  2. Sistemare gli animali in un'apposita struttura per animali da laboratorio.
  3. Mantenere la temperatura ambiente a 24 °C ± 2 °C e l'umidità relativa al 50%–60%, con un ciclo luce/buio di 12 h. Fornire accesso ad libitum a cibo standard e acqua per tutta la durata dello studio.
  4. Dopo un periodo di ambientamento di 7 giorni, assegnare casualmente 24 ratti a quattro gruppi (n = 6 per gruppo): il gruppo di controllo normale (Controllo), il gruppo finto-operato (Sham), il gruppo modello CS (Modello) e il gruppo sottoposto ad acupotomia. La tempistica del disegno sperimentale è illustrata in Figura 1.

2. Creazione del modello CS

NOTA: privare tutti i ratti di cibo e acqua per 12 h prima del modellamento. Pesare e registrare il peso corporeo. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mediante autoclave a vapore sotto pressione (Figura 2A).

  1. Preparare il filo di nylon 1 giorno prima dell'intervento chirurgico, tagliandolo in segmenti con un diametro di 0,5 mm e una lunghezza di circa 1 cm. Immergere i filamenti in etanolo al 75% per 4 h, asciugarli in condizioni sterili e quindi immergerli in soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% per 8 h per migliorare l'adesività ai tessuti.
  2. Posizionare il ratto in una camera di induzione. Indurre l'anestesia con isoflurano al 4%, quindi mantenere l'anestesia con isoflurano al 1,5%–2,0% tramite una maschera facciale. Fissare l'animale in posizione prona (seguendo protocolli approvati a livello istituzionale).
  3. Rasare la regione dorsale cervicale per esporre completamente il campo operatorio. Disinfettare l'area chirurgica tre volte con iodopovidone, procedendo dall'interno verso l'esterno, e ripetere la procedura di disinfezione con etanolo al 75%.
  4. Palpare e segnare il processo spinoso più alto (T2) sul dorso del ratto. Eseguire un'incisione cutanea dorsale mediana di circa 3 cm, estendendola in senso craniale a partire dall'apice del processo spinoso di T2. Dissecare in modo ottuso il tessuto sottocutaneo e la muscolatura cervicale posteriore (Figura 2B).
  5. Esponi completamente l'arco vertebrale sinistro da C5 a T1 e rimuovi accuratamente i tessuti muscolari e connettivi sovrastanti (Figura 2C).
  6. Dissezionare delicatamente il legamento giallo e i tessuti connettivi negli spazi intervertebrali C6–C7 e C7–T1 utilizzando pinzette microchirurgiche. Aprire l'arco vertebrale sinistro di C7 con pinzette emostatiche per esporre il midollo spinale.
  7. Ritirare delicatamente il midollo spinale verso il lato destro utilizzando un dissecatore nervoso oftalmico. Posizionare il filo in nylon sterilizzato al di sotto delle radici nervose C6–C7 e C7–T1 lungo l'asse longitudinale del midollo spinale con pinze microchirurgiche; evitare una compressione eccessiva per prevenire lesioni della vena vertebrale.
    NOTA: Esporre il midollo spinale nello stesso sito anatomico nel gruppo sham senza inserire il filamento di nylon.
  8. Chiudere e suturare l'incisione strato per strato al termine della procedura.
  9. Trasferire i ratti su un tappetino riscaldante a regolazione termostatica mantenuto a 37 °Ce monitorare i segni vitali fino al completo recupero della coscienza.
  10. Somministrare un'iniezione intramuscolare di 50.000 unità di soluzione di sodio penicillina nell'arto posteriore per la profilassi anti-infezione postoperatoria. Reintrodurre gli animali nelle loro gabbie di provenienza per il recupero postoperatorio.

3. Procedura di immobilizzazione

  1. Fissare il ratto in una manica di rete nera di contenimento.
  2. Fissare due fascette di nylon su una struttura di plastica. Posizionare la fascetta superiore nella regione ascellare e quella inferiore intorno alla regione pelvica (Figura 3B).
    NOTA: Utilizzare una piastra di plastica di dimensioni 200 mm × 300 mm × 5 mm, forata con fessure di 20 mm × 4 mm distanziate tra loro di 10 mm lungo i lati lunghi e di 3 mm lungo i lati corti, dotata di cinque piedini di sostegno posizionati al centro e ai quattro angoli (Figura 3A).
  3. Dopo l'induzione del modello, ripetere la procedura di contenimento descritta sopra per ciascun ratto di tutti i gruppi per tre giorni consecutivi al fine di garantire un'adeguata abituazione. Mantenere ogni sessione di contenimento per un minimo di 5 min al giorno.

Trattamento con acupotomia

  1. Iniziare l'intervento di acupotomia il 4o giorno successivo alla creazione del modello.
  2. Preparare aghi monouso sterili per acupotomia (diametro: 0,40 mm; lunghezza: 40 mm).
  3. Rimuovere il pelo sulla regione cervicale per esporre completamente il campo operatorio.
  4. Palpare i tessuti molli su entrambi i lati dei processi spinosi cervicali per identificare noduli induriti o strutture filamentose. Individuare un punto sul processo spinoso a C6 o C7, quindi localizzare altri due punti posti approssimativamente a 0,5 cm lateralmente rispetto a ciascun lato di questo processo spinoso.
  5. Designare questi tre punti come siti di inserzione per l'acupotomia e contrassegnarli (Figura 3C).
  6. Disinfettare i siti di inserzione segnati con povidone iodio medicale seguito da etanolo medicinale al 75%.
  7. Orientare il bordo tagliente dell'acupotomia parallelamente alla linea mediana posteriore e mantenere l'ago perpendicolare al piano coronale posteriore del collo durante l'inserzione.
  8. Esercitare una leggera compressione sul sito di inserzione con il pollice sinistro, tenendo al contempo l'acupotomia saldamente tra pollice e indice destro. Penetrare rapidamente attraverso il tessuto sottocutaneo in direzione perpendicolare, quindi avanzare lentamente l'ago fino a raggiungere la superficie ossea.
  9. Eseguire tre tagli longitudinali localizzati e due rilasci trasversali del tessuto molle all'interno dell'area lesa, limitando l'ampiezza dell'intervento entro 1 mm. Ritirare l'ago al termine della manovra (Figura 3D).
  10. Applicare una pressione decisa sul sito di inserzione per 3 minuti al fine di ottenere l'emostasi. Eseguire l'intervento di acupotomia una volta ogni 5 giorni, per un totale di tre sessioni.
    NOTA: A eccezione del gruppo sottoposto ad acupotomia, gli altri tre gruppi non ricevono alcun intervento terapeutico. Tuttavia, gli animali di questi gruppi vengono immobilizzati nello stesso modo e per la stessa durata di quelli del gruppo acupotomia.

5. Test della soglia meccanica al ritiro (MWT)

NOTA: Eseguire la misurazione il giorno prima dell'intervento chirurgico di induzione del modello, il 3rd giorno e il 14th giorno dopo l'intervento, utilizzando un stimolatore meccanico del dolore plantare per ratti e topi.

  1. Posizionare ogni ratto in una camera di prova trasparente posta su un pavimento in rete metallica, in un ambiente silenzioso mantenuto a 24 °C ± 2 °C.
  2. Lasciare che il ratto si ambienti all'interno della camera per almeno 5 minuti, oppure fino a quando i comportamenti esplorativi e di grooming si siano notevolmente ridotti.
  3. Posizionare la punta del filamento di von Frey perpendicolarmente alla superficie plantare della zampa anteriore sinistra, tra il terzo e il quarto metacarpo. Applicare lo stimolo dal basso attraverso la rete metallica finché non si osserva una rapida ritrazione della zampa, un comportamento di leccamento o scuotimento.
  4. Registrare il valore visualizzato al momento della ritrazione come soglia del dolore meccanico.
  5. Dopo aver testato ogni ratto, pulire accuratamente il pavimento in rete metallica e le pareti interne della camera con alcol medico al 75%, quindi asciugare con garza pulita per eliminare odori residui che potrebbero influenzare i test comportamentali successivi. Introdurre il ratto successivo solo dopo che l'apparecchiatura si sia completamente asciugata.
    ​NOTA: Testare tutti i ratti in ordine sequenziale per tre ripetizioni. Mantenere un intervallo di almeno 10 minuti tra due misurazioni consecutive del MWT nello stesso ratto. Utilizzare la media delle tre misurazioni come valore finale di MWT per ciascun ratto.

6. Registrazione dell'elettromiografia (EMG)

NOTA: Eseguire l'EMG a stato di riposo al Giorno 3 dopo la creazione del modello utilizzando un sistema di acquisizione e analisi di segnali biologici.

  1. Anestetizzare il ratto mediante inalazione di isoflurano (concentrazione di induzione 3%–4%, concentrazione di mantenimento 1,5%–2,0%). Fissare l'animale in posizione prona sulla piattaforma sperimentale ed esporre completamente l'arto anteriore sinistro.
  2. Collegare i cavi delle elettrodi di registrazione ai canali di acquisizione designati. Avviare il software di acquisizione, selezionare la modalità del segnale EMG e impostare la frequenza di campionamento a 20 kHz con un filtro passa-banda compreso tra 15 Hz e 5 kHz.
  3. Disinfettare i muscoli dell'arto anteriore sinistro (muscolo flessore radiale del carpo, muscolo flessore ulnare del carpo, bicipite brachiale e tricipite brachiale) utilizzando palline di cotone sgrassato imbevute di etanolo medico al 75%.
  4. Inserire l'elettrodo aghiforme di registrazione perpendicolarmente nel ventre muscolare, orientandolo ortogonalmente rispetto alla direzione delle fibre muscolari. Inserire un secondo elettrodo aghiforme a una distanza di 3–5 mm come elettrodo di riferimento, e inserire l'elettrodo di terra alla base della coda.
  5. Osservare l'attività di inserzione immediatamente dopo l'inserimento dell'ago. Una volta scomparse le potenziali di inserzione e quando il muscolo è completamente rilassato, registrare il segnale EMG a riposo per 1 minuto per ogni ratto.
    NOTA: Mantenere un ambiente silenzioso durante tutta la registrazione e ridurre al minimo le interferenze elettromagnetiche esterne. Le interferenze più comuni includono il rumore della frequenza di rete derivante dalla corrente alternata e il rumore ad alta frequenza proveniente da altre apparecchiature di laboratorio, che si manifesta come onde sinusoidali regolari sovrapposte agli elettromiogrammi. Tali interferenze possono essere ridotte mediante messa a terra, impostazioni dei filtri e gestione dell'ambiente.
  6. Estrarre con attenzione tutti gli elettrodi aghiformi e riportare il ratto nella sua gabbia, permettendogli di riprendersi spontaneamente dall'anestesia.
  7. Al termine della registrazione EMG per ogni ratto, pulire gli elettrodi aghiformi con etanolo medico al 75% utilizzando palline di cotone sgrassato e asciugarli accuratamente con garza sterile per prevenire contaminazioni incrociate.

7. Analisi della deambulazione nei ratti

NOTA: Eseguire l'analisi della deambulazione il primo giorno successivo al completamento dell'intervento di acupotomia (giorno postoperatorio 15 dopo la chirurgia del modello). Il sistema di analisi della deambulazione è composto da un tapis roulant dotato di una cinghia trasparente, una videocamera digitale ad alta velocità posizionata al di sotto della cinghia e una workstation informatica.

  1. Posizionare il ratto sul nastro del tapis roulant e lasciarlo ambientare liberamente per 3 min.
  2. Attivare il nastro del tapis roulant e aumentare gradualmente la velocità da 5,0 cm/s finché il ratto non mostra un'andatura stabile senza comportamento esplorativo.​
  3. Acquisire un video di 10 s dell'andatura ventrale (vista inferiore) del ratto utilizzando la telecamera ad alta velocità.
  4. Al termine del test per ciascun ratto, pulire accuratamente il nastro del tapis roulant e la camera di prova con etanolo al 75% per eliminare odori residui che potrebbero influenzare valutazioni comportamentali successive. Attendere che il nastro si asciughi completamente prima di introdurre il ratto successivo.
  5. Importare i video registrati nel software di analisi. Utilizzare il software per identificare la posizione degli artigli di ogni arto ed estrarre una serie di parametri dell'andatura.
  6. Al termine dell'analisi automatica, esportare i dati dei parametri dell'andatura per successive analisi statistiche.
  7. Includere nel presente studio i seguenti parametri dell'andatura: area stampata media della zampa anteriore sinistra (la media della dimensione dell'impronta del piede durante tutta la fase di appoggio), area massima di appoggio della zampa anteriore sinistra (la dimensione massima dell'impronta del piede durante tutta la fase di appoggio) e pressione di appoggio della zampa anteriore sinistra (che riflette l'intensità relativa della pressione della zampa durante la fase di appoggio, come registrata dal sistema di analisi dell'andatura).
    ​NOTA: Acquisire tre sequenze valide dell'andatura per ciascun ratto e utilizzare la media delle tre misurazioni per l'analisi.

8. Colorazione con ematossilina-eosina dei tessuti della radice nervosa

NOTA: Dopo i test comportamentali al Giorno 15 postoperatorio successivo all'intervento chirurgico del modello, raccogliere campioni di tessuto della radice nervosa per la colorazione con ematossilina-eosina.

  1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 2% (0,3 mL/100 g) ed eseguire una perfusione transcardiale con paraformaldeide.
  2. Dissezionare le radici nervose spinali C6–T1 e immergere il tessuto in paraformaldeide al 4% a 4 °C per la post-fissazione per 48 h.
    ATTENZIONE: Manipolare la paraformaldeide come sostanza irritante in un ambiente ben ventilato o sotto cappa chimica.
  3. Lavare il tessuto delle radici nervose fissato sotto acqua corrente per 1 h per rimuovere il fissativo residuo.
  4. Sottoporre il tessuto a disidratazione con etanolo in gradiente, chiarificare in xilene (I) e xilene (II) in sequenza, incorporare in paraffina e sezionare a uno spessore di 3–5 µm. Incubare i sezioni a 65 °C.
  5. Deparaffinare i sezioni in xilene (I) e xilene (II), 8 min ciascuno. Reidratare i sezioni attraverso una serie di etanoli in gradiente (100% per 15 min, 95% per 5 min, 80% per 5 min, 70% per 3 min), quindi immergere in acqua distillata per 2 min.
  6. Colorare i sezioni con soluzione di ematossilina per 5 s, quindi lavare in acqua corrente per 2 min per rimuovere l’eccesso di colorante.
  7. Differenziare i sezioni in acqua distillata per 30 s. Immergere i sezioni in etanolo al 70% per 10 s, seguito da etanolo all’80% per 10 s.
  8. Colorare i sezioni con soluzione di eosina per 4 min, quindi lavare sotto acqua corrente per rimuovere il colorante superficiale. Disidratare i sezioni attraverso una serie di etanoli in gradiente (70% per 10 s, 80% per 10 s, 95% per 10 s, 100% per 160 s), chiarificare in xilene per 4 min.
  9. Montare i vetrini con resina neutra.
  10. Esaminare le alterazioni patologiche e morfologiche del tessuto delle radici nervose spinali al microscopio ottico con un ingrandimento di 400× e acquisire immagini microscopiche da campi bersaglio rappresentativi.

9. Analisi statistica

  1. Eseguire le analisi statistiche utilizzando il software SPSS. Esprimere le variabili continue che seguono una distribuzione normale come media ± deviazione standard.
  2. Sotto le ipotesi di normalità e omogeneità della varianza, analizzare le soglie di ritrazione meccanica mediante analisi della varianza a misure ripetute, e analizzare i parametri della deambulazione mediante ANOVA ad un fattore. Effettuare confronti multipli post hoc tra i gruppi utilizzando il test della Differenza Minima Significativa (LSD).
  3. Applicare test non parametrici qualora non siano soddisfatte le ipotesi di distribuzione normale o di omogeneità della varianza.
  4. Considerare le differenze statisticamente significative per p < 0,05.

Risultati

Le valutazioni della soglia meccanica al ritiro (MWT) hanno mostrato valori basali comparabili in tutti i gruppi prima dell'induzione del modello. Al terzo giorno dopo la modellizzazione e l'operazione fittizia, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra il gruppo fittizio e il gruppo di controllo (p > 0,05). Al contrario, sia il gruppo modello che il gruppo acupotomia hanno mostrato una riduzione marcata della MWT rispetto al gruppo fittizio (p < 0,01, Figura 4). Al termine del trattamento, il gruppo acupotomia ha mostrato un aumento significativo della MWT rispetto al gruppo modello (p < 0,05, Figura 4).

Le registrazioni di elettromiografia (EMG) hanno rivelato che al 3o giorno dopo la modellizzazione e l'intervento fittizio, attività spontanee anomale come potenziali di fibrillazione e onde positive acute erano rilevabili a riposo nell'elettromiografia con ago sia nel gruppo modello sia in quello sottoposto ad acupotomia. Al contrario, nessuna scarica spontanea anomala è stata osservata nei tracciati di elettromiografia con ago a riposo dei gruppi di controllo o placebo (Figura 5). Se non sono presenti potenziali spontanei anomali nel lato interessato, ciò suggerisce che il modello potrebbe non aver danneggiato con successo la radice nervosa bersaglio e che la procedura chirurgica deve essere riesaminata.

L'analisi della deambulazione ha rivelato che, al termine del trattamento, l'area media dell'impronta, l'area massima dell'appoggio e la pressione durante l'appoggio nel gruppo sham non differivano in modo significativo rispetto al gruppo di controllo (p > 0,05). Al contrario, tutti i parametri della deambulazione erano notevolmente ridotti nel gruppo modello rispetto al gruppo sham (p < 0,001). Rispetto al gruppo modello, il gruppo sottoposto ad acupotomia ha mostrato un aumento significativo di ciascuno di questi indici di deambulazione (p < 0,05, Figura 6). L'area media dell'impronta corrisponde alla media della dimensione dell'impronta durante l'intera fase di appoggio. L'area massima dell'appoggio rappresenta la dimensione massima dell'impronta durante l'intera fase di appoggio. La pressione in stazione riflette l'intensità relativa della pressione della zampa durante la fase di appoggio, registrata dal sistema di analisi della deambulazione.

La colorazione ematosina-eosina del tessuto della radice nervosa cervicale ha dimostrato che, nei gruppi di controllo e falso trattamento, la morfologia del tessuto nervoso appariva sostanzialmente normale. Le fibre nervose e i corpi cellulari neuronali erano disposti in modo relativamente ordinato e compatto, con confini strutturali ben definiti e assenza di edema interstiziale evidente. In contrasto con il gruppo falso trattamento, il gruppo modello ha mostrato alterazioni patologiche pronunciate indicative di danno alla radice nervosa, caratterizzate da un'organizzazione disordinata e lassa delle fibre nervose e dei corpi cellulari, rottura e deformazione di un sottoinsieme di cellule neuronali, frammentazione parziale delle fibre e marcato edema interstiziale. Rispetto al gruppo modello, il trattamento con acupotomia ha notevolmente migliorato tali lesioni patologiche, come evidenziato da un allineamento più regolare delle fibre nervose e dei corpi cellulari, riduzione dell'edema interstiziale e ripristino parziale dell'integrità strutturale del tessuto nervoso (Figura 7).

Diagramma temporale del processo di trattamento con acupotomia con test MWT, registrazione di EMG e analisi della deambulazione
Figura 1: Diagramma dell'asse temporale del disegno sperimentale. Dopo un periodo di adattamento alimentare di 7 giorni, i modelli di CS sono stati realizzati sia nel gruppo modello che nel gruppo di acupotomia di ratti. Il gruppo falso è stato sottoposto alla stessa regione del midollo spinale del gruppo modello, ma senza l'inserimento del filo di pesce. L'intervento di acupotomia è iniziato il 4o giorno dopo il corretto completamento della modellizzazione nel gruppo di acupotomia. Le soglie del dolore meccanico nei ratti sono state misurate il giorno precedente alla modellizzazione, al terzo giorno postoperatorio e al termine dell'intervento, al quattordicesimo giorno postoperatorio. La valutazione elettromiografica è stata effettuata al terzo giorno postoperatorio per valutare la compressione della radice nervosa. L'analisi della deambulazione è stata eseguita al quindicesimo giorno postoperatorio, dopo l'intervento, per valutare la funzione di coordinamento motorio nei ratti. I campioni per le analisi sono stati raccolti dopo i test comportamentali al quindicesimo giorno postoperatorio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Configurazione degli strumenti chirurgici, procedura di dissezione del roditore, diagramma con marcatura dell'esposizione delle vertebre per lo studio anatomico.
Figura 2: Creazione del modello di ratto con CS. (A) Strumenti chirurgici utilizzati per l'induzione del modello. (B) Incisione dorsale cervicale e dissezione dei tessuti. (C) Lamine vertebrali cervicali sinistre da C5 a T1. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Preparazione della ricerca sugli animali, inclusa la figura sull'immobilizzazione del ratto, per l'allestimento della procedura medica.
Figura 3: Procedura dell'intervento di acupotomia. (A) Tavola di plastica utilizzata per immobilizzare il ratto. (B) Illustrazione schematica dell'immobilizzazione del ratto. (C) Punti di repère anatomici sulla superficie corrispondenti ai processi spinosi C6 e C7 nei ratti. (D) Rappresentazione schematica del trattamento di acupotomia nei ratti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Istogramma che mostra la soglia di ritrazione meccanica tra i gruppi: controllo, finto intervento, modello, acupotomia.
Figura 4: Confronto della soglia di ritrazione meccanica tra i quattro gruppi sperimentali di ratti (n = 6 per gruppo). **p < 0,01 rispetto al gruppo con intervento finto; #p < 0,05 rispetto al gruppo modello. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Confronto dell'ampiezza delle forme d'onda; A, B mostrano un rumore elevato; C, D mostrano un rumore ridotto; grafico di analisi del segnale audio.
Figura 5: Elettromiogrammi del membro anteriore a riposo nei quattro gruppi sperimentali dopo l'induzione del modello. (A) Elettromiogramma del membro anteriore nel gruppo modello. (B) Elettromiogramma del membro anteriore nel gruppo acupotomia. (C) Elettromiogramma del membro anteriore nel gruppo controllo. (D) Elettromiogramma del membro anteriore nel gruppo falso (sham). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Istogramma che confronta l'area media dell'impronta, l'area massima dell'appoggio e la pressione dell'appoggio tra quattro gruppi.
Figura 6: Confronto dei parametri della deambulazione tra i quattro gruppi sperimentali di ratti (n = 6 per gruppo). (A) Confronto dell'area media dell'impronta. (B) Confronto dell'area massima dell'appoggio. (C) Confronto della pressione dell'appoggio. ***p < 0,001 rispetto al gruppo con intervento fittizio; #p < 0,05 rispetto al gruppo modello. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Confronto istologico dei tessuti, quattro diapositive, immagine al microscopio, scala di 100μm per l'analisi cellulare.
Figura 7: Colorazione con ematossilina-eosina (HE) del tessuto della radice nervosa dei quattro gruppi di ratti sperimentali a un ingrandimento di 400×. (A) Colorazione HE del gruppo di controllo. (B) Colorazione HE del gruppo sham. (C) Colorazione HE del gruppo modello. (D) Colorazione HE del gruppo sottoposto ad acupotomia. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

La selezione di un modello animale appropriato è un prerequisito per chiarire la patogenesi della spondilosi cervicale (CS) e per valutare rigorosamente gli interventi terapeutici. Attualmente, il metodo del punto di sutura in nylon intravertebrale è ampiamente adottato grazie ai suoi vantaggi di relativa semplicità, breve ciclo di modellizzazione e alta riproducibilità e affidabilità15,20. In questo approccio, un materiale compressivo viene impiantato nel canale spinale del ratto per esercitare una compressione continua sulle radici nervose spinali cervicali, riproducendo così la condizione patologica di impingement radicolare causata da erniazione del disco intervertebrale o da iperplasia osteofitica in ambito clinico. Tra le lesioni secondarie associate alla spondilosi cervicale, la compressione della radice nervosa è la più comune e rappresenta una causa principale delle manifestazioni cliniche evidenti, che si presentano tipicamente come dolore al collo, rigidità e sintomi irradiati agli arti superiori5,7,21. Di conseguenza, questo studio ha adottato il metodo del punto di sutura in nylon intravertebrale per stabilire un modello di ratto della CS e ha fornito un protocollo operativo visualizzato per la creazione del modello e l'intervento di acupotomia nei ratti con CS.

Dopo la compressione della radice nervosa, ischemia locale, risposte infiammatorie e irritazione meccanica possono indurre sia una sensibilizzazione periferica che centrale, portando infine all'iperalgesia22,23,24,25,26. I risultati attuali hanno dimostrato una riduzione significativa della soglia del dolore meccanico nella zampa anteriore controlaterale nei ratti dopo l'induzione del modello, indicando che la procedura ha efficacemente provocato iperalgesia meccanica. Nei ratti sottoposti all'intervento di acupotomia, la soglia meccanica di ritrazione è stata significativamente ripristinata, suggerendo che il rilascio mediante acupotomia attenua efficacemente lo stato di sensibilizzazione al dolore. Il dolore non influenza soltanto le soglie sensoriali, ma altera anche i modelli di movimento spontaneo degli animali. I sistemi di analisi della deambulazione, acquisendo parametri spaziotemporali delle impronte delle zampe durante la locomozione, forniscono una quantificazione oggettiva delle alterazioni compensative della camminata indotte dal dolore, superando così la marcata soggettività insita nei metodi tradizionali di valutazione comportamentale27. In questo studio, i ratti del gruppo modello hanno mostrato una riduzione dell'area media dell'impronta, dell'area massima di appoggio e della pressione in appoggio della zampa anteriore controlaterale, riflettendo un comportamento di evitamento del carico e alterazioni della camminata di tipo protettivo secondarie al dolore. Al contrario, i ratti sottoposti all'intervento di acupotomia hanno mostrato una tendenza alla normalizzazione di questi parametri di deambulazione, indicando che il trattamento con acupotomia, oltre ad alleviare il dolore, migliora anche la coordinazione locomotoria. Osservazioni istomorfologiche hanno inoltre rivelato differenze intergruppo nell'organizzazione e nella morfologia delle fibre nervose e dei corpi cellulari neuronali all'interno della radice nervosa, nonché nel grado di edema interstiziale. Questi risultati suggeriscono che la terapia con acupotomia possa attenuare le alterazioni patologiche della radice nervosa.

La compressione della radice nervosa induce non solo disturbi nella conduzione sensitiva, ma può anche provocare denervazione o una ipereccitabilità anomala della muscolatura innervata. L'elettromiografia (EMG) a riposo, registrando l'attività elettrica spontanea (come i potenziali di fibrillazione e le onde positive acute) in un muscolo completamente rilassato, costituisce un indicatore sensibile dell'alterata eccitabilità sarcolemmica secondaria a un danno neurogeno, rappresentando così una metodica elettrofisiologica fondamentale per la valutazione delle radicolopatie sia in ambito clinico che sperimentale28,29,30. In condizioni fisiologiche, un muscolo completamente rilassato mostra silenzio elettrico, in assenza di scariche spontanee. In questo studio, sono state riscontrate marcate scariche spontanee nei muscoli a riposo dell'arto anteriore controlaterale nei ratti dopo l'induzione del modello. Tale attività EMG anomala a riposo rappresenta una manifestazione tipica di danno neurogeno e suggerisce che le radici nervose cervicali di questi ratti potrebbero essere sottoposte a una compressione protratta31. I reperti EMG anomali nei gruppi modello e acupotomia dopo la creazione del modello hanno ulteriormente confermato, dal punto di vista elettrofisiologico, il corretto sviluppo del modello di CS nel ratto.

Per evitare che le valutazioni comportamentali siano influenzate dagli effetti cumulativi di anestesie ripetute, l'intervento di acupotomia in questo studio è stato eseguito utilizzando un apparato di contenimento in animali svegli32. Studi precedenti hanno dimostrato che un adeguato training di abituazione e esposizioni ripetute possono attenuare in modo significativo le risposte allo stress indotto dal contenimento33,34,35,36. Ciò suggerisce che il training di abituazione prima dell'intervento in questo protocollo può ridurre efficacemente l'interferenza dello stress acuto da contenimento sugli indicatori sperimentali.

Questo studio non è privo di limitazioni. In primo luogo, il metodo della sutura in nylon intravertebrale riproduce principalmente una compressione meccanica acuta o subacuta, mentre la stenosi spinale umana si sviluppa tipicamente in seguito a un decorso degenerativo cronico. In secondo luogo, sebbene il protocollo di immobilizzazione attuale sia stato progettato per ridurre al minimo lo stress, studi futuri dovrebbero valutare biomarcatori correlati allo stress, come il cortisolo sierico, al fine di valutare in modo più completo l'impatto del dispositivo di immobilizzazione.

In conclusione, questo studio fornisce una procedura operativa dettagliata per la creazione di un modello ratto della sindrome da cauda equina (CS) e per il successivo trattamento mediante acupotomia. I risultati indicano che il rilascio mediante acupotomia aumenta significativamente la soglia del dolore meccanico, migliora i modelli di andatura evitante il dolore e attenua le alterazioni patologiche della radice nervosa. Questo lavoro fornisce quindi un quadro sperimentale sistematico e pratico per chiarire i meccanismi alla base della terapia con acupotomia nel trattamento della CS.

Dichiarazioni

Tutti gli autori hanno dichiarato di non avere potenziali conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal Programma Nazionale Chiave per la Ricerca e lo Sviluppo della Cina (Grant No. 2023YFC3502703) e dal Progetto Chiave del Fondo Congiunto per l'Innovazione e lo Sviluppo della Fondazione delle Scienze Naturali della Provincia di Hubei (Grant No. 2024AFD271).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 0,5 mLHebei Yunsheng Biotechnology Co., LtdSN-04442
Siringa da 1 mLShanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
Chirurgia filo 4-0 con ago, monofilamento (4×12)GLASSJZZSX193
Alcol al 75%Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD75-500ml
Ago per acupotomiaBeijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd.HY0440
Vetrino aderenteCITOTEST188105
Sistema di acquisizione e analisi del segnale biologicoTechmanBL-420N
Sistema di acquisizione e analisi del segnale biologico (Software)TechmanBL-420N Versione 3.0.0.237
CoprioggettoCitotest Labware Manufacturing Co.,Ltd10212432C
DeidratatoreDIAPATHDonatello
Bilancia elettronicaMettler-ToledoME203E/02
Forno elettrico di essiccazione termicaLaboteryGEL-70
Macchina per inclusioneWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Liquido trasparente ecologico per desparaffinazioneServicebioG1128-1L
Pinzette in acciaio inossidabile nere ESD-safe (punta curva)solomenESD-15
EtileneSCRC100092683
Pallina di cotone senza grassiCaoxian Hualu Sanitary Material Co. LTDTZMQ-500
Kit colorante costante ematossilina-eosina (HE) HD ServicebioG1076
Pinze emostatichesolomenB0557
IBM SPSS StatisticsIBM CorporationVersione 22.0
Sistema di imagingNikonNIKON DS-U3
IodoforoShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTDDF-500
IsofluranoRWD life scienceR510-22-10
Guanti in latticeBeijing Ruijing Latex Products Co. LTDRJJC-S
Dispositivo meccanico per test di stimolazione della zampaKew basisKW-CT-1
Pinze medicheAIZANCHENGAZN00008
Pinze emostatiche per zanzaraServicebioQX1310D
Gomma neutraSCRC10004160
Soluzione salina normaleSHIMENSLYS-500ml
Forbici oftalmichesolomenB0754
Liquido paraffinicoMacklin8012-95-1
Fissativo di paraformaldeide (neutro)ServicebioG1101
Tagliatore di patologiaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Penicillina G sodica per iniezioneJilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd.N. Approvazione Farmaco Veterinario 070011248
Soluzione di poli-L-lisinaShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R23126-50ml
Tosatrice per roditorisolomenB1564
Sistema di imaging e analisi della deambulazione nei roditoriCleverTreadScan; BCamCapture
Sistema di imaging e analisi della deambulazione nei roditori (Software)CleverTreadScan Versione 4.00; BCamCapture Versione 3.00
Ratti SDBeijing Sibefei Biotechnology Co., LtdA102
Macchina per anestesia per piccoli animali YuYAN ABM
Sterilizzatore a vapore (autoclave)YamatoSQ810C
Lama chirurgicasolomenB1177
Maschera chirurgicawinnerWJKZ-1
Pinza per ago chirurgicosolomenB0772
Forbici chirurgicheGLASSJZZSX-ZC544R
Spalmatore di tessutiZhejiang Kehua Instrument Co., Ltd KD-P
Sistema di lucidatura acqua ultrapuraAiken water ElAK-RO-C2
Fissativo universale per tessuti (neutro)ServicebioG1101-15ML
Microscopio ottico erettoNikonNIKON ECLIPSE E100
XileneSCRC10023418

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