Lo studio attuale mira a chiarire la relazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla rinite allergica (AR). Livelli plasmatici più bassi di miR-146a e il genotipo GG del rs2910164 sono associati a un aumentato rischio di AR, a risposte infiammatorie potenziate e a manifestazioni cliniche più gravi nei pazienti con AR.
Articolo di ricerca
Studio di associazione del polimorfismo rs2910164 di miR-146a con la suscettibilità alla rinite allergica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rinite allergica (AR) non rappresenta una minaccia per la vita dei pazienti, ma compromette gravemente la loro qualità di vita. Il microRNA-146a (miR-146a) svolge un ruolo fondamentale nella regolazione immunitaria e nelle risposte infiammatorie; tuttavia, la relazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla AR non è ancora completamente compresa. Questo studio caso-controllo è stato progettato per indagare l'influenza del polimorfismo miR-146a rs2910164 sulla suscettibilità alla AR. Lo studio ha incluso complessivamente 180 volontari senza AR e 211 pazienti con AR. L'espressione del miR-146a plasmatico è stata misurata mediante RT-qPCR; il genotipo rs2910164 è stato determinato utilizzando il metodo TaqMan-qPCR. L'ELISA è stata impiegata per rilevare i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10. L'analisi di correlazione di Pearson ha valutato le correlazioni lineari tra l'espressione del miR-146a e il punteggio TNSS, il punteggio RQLQ e la concentrazione dei fattori sierici. I fattori di rischio per la AR sono stati identificati mediante regressione logistica. Il genotipo GG e l'allele G del polimorfismo miR-146a rs2910164 erano significativamente più frequenti nei pazienti con AR rispetto ai controlli sani. Il livello plasmatico di miR-146a era ridotto nei pazienti con AR. Il livello plasmatico di miR-146a era più basso nei pazienti con AR portatori del genotipo GG, che mostravano risposte allergiche e infiammatorie più attive. L'espressione del miR-146a era strettamente correlata ai sintomi allergici e alla gravità delle manifestazioni cliniche. La regressione logistica indica che i livelli sierici di IgE e IL-4 rappresentano fattori di rischio indipendenti per la AR, mentre l'espressione di IL-10 e miR-146a costituisce fattori protettivi indipendenti. Bassi livelli plasmatici di miR-146a sono osservati nei pazienti con AR, e il genotipo GG del polimorfismo miR-146a rs2910164 aumenta la suscettibilità alla AR.
Introduzione
La rinite allergica (AR) è un disturbo infiammatorio non infettivo della mucosa nasale mediato da allergeni. I sintomi clinici tipici dell'AR comprendono prurito nasale, congestione nasale, secrezione nasale chiara e starnuti frequenti1. Nei casi più gravi, i pazienti possono anche manifestare una riduzione del senso dell'olfatto e persino un peggioramento della qualità del sonno. Dati epidemiologici indicano che la prevalenza globale dell'AR aumenta anno dopo anno, raggiungendo il 10%-25%2. Sebbene l'AR non metta a rischio la vita dei pazienti, essa interrompe gravemente il sonno, l'apprendimento e il lavoro, riduce in modo significativo la qualità della vita e comporta un pesante onere economico per gli individui e per la società3. Lo studio ha confermato che l'AR rappresenta un fattore di rischio per l'asma e, con il progredire della malattia, i pazienti hanno maggiori probabilità di sviluppare sinusite o polipi nasali, aumentando ulteriormente il carico della malattia4,5. Pertanto, la prevenzione e il controllo dell'AR diventano un compito fondamentale nel campo delle malattie respiratorie. Tuttavia, la patogenesi dell'AR non è ancora stata completamente chiarita. Un'approfondita esplorazione del meccanismo fisiopatologico dell'AR e lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate rivestono un'importanza cruciale ed è anche una questione scientifica attualmente urgente da affrontare.
L'insorgenza della Rinite Allergica (AR) è legata a fattori ambientali e genetici6. Le attuali ricerche ritengono generalmente che l'effetto sinergico della suscettibilità genetica individuale e dell'esposizione all'ambiente allergenico rappresenti il fattore trainante principale per l'insorgenza della AR. Il team di Brozek ha ulteriormente confermato che l'interazione tra la suscettibilità genetica dell'organismo e l'esposizione ambientale costituisce la causa fondamentale della AR2. Nel campo della ricerca sui meccanismi genetici della AR, il polimorfismo genetico è progressivamente diventato l'oggetto di attenzione degli studiosi. I polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), in quanto forma prevalente di polimorfismo genetico, sono la causa principale della variazione dell'informazione genetica negli organismi7. Sempre più evidenze indicano che il genotipo TT nel sito IL-33 rs7044343 potrebbe rappresentare un possibile bersaglio per la prevenzione e il trattamento della AR8. Inoltre, il genotipo TT nel sito C-159T del promotore di CD14 agisce come marcatore predittivo del rischio di AR9. Ciò indica che gli SNP dei geni chiave possono fungere da importanti bersagli molecolari per la valutazione del rischio di AR, per fornire avvisi precoci e per raggiungere una prevenzione e un trattamento mirati. Questo fornisce indizi cruciali per una comprensione più approfondita del meccanismo di suscettibilità genetica alla AR.
Numerosi studi hanno dimostrato che un'espressione anomala dei microRNA (miRNA) rappresenta uno dei principali fattori alla base dell'insorgenza e dello sviluppo di un'ampia gamma di malattie10. I miRNA presentano la caratteristica di esistere in modo stabile nei fluidi corporei, il che li rende marcatori molecolari altamente sensibili per la diagnosi delle malattie. Il miR-146a è una molecola di RNA non codificante dotata di ampie funzioni biologiche11. Il polimorfismo rs2910164 si trova nella regione stem-loop della sequenza precursora del miR-146a. Una variazione in questo sito può influenzare l'efficienza di elaborazione e maturazione del pre-miR-146a, alterando così il livello di espressione del miR-146a maturo e influenzando le risposte immunitarie e infiammatorie a valle. Studi precedenti hanno confermato che un'eccessiva espressione del miR-146a può ridurre in modo significativo l'iperreattività delle vie aeree nei modelli murini di asma e inibire l'attivazione dei linfociti sensibilizzati12. Inibendo l'attività del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il miR-146a può alleviare efficacemente il danno infiammatorio nella sinusite13. Inoltre, l'iperespressione del miR-146a può anche attenuare i sintomi patologici nel modello murino di rinite allergica (AR) bloccando la via di segnalazione del recettore Toll-simile 4 (TLR4)14. Queste osservazioni evidenziano il ruolo fondamentale del miR-146a nella modulazione delle malattie del sistema respiratorio.
Le evidenze esistenti derivanti da studi su polimorfismi genetici indicano che la frequenza dell'allele G nel locus miR-146a rs2910164 è strettamente correlata all'iperreattività delle vie aeree15. Questo SNP è inoltre considerato un possibile biomarcatore del rischio di asma nella popolazione coreana15. In aggiunta, il gruppo di Jimenez-Morales ha ulteriormente dimostrato che il genotipo CC nel locus miR-146a rs2910164 conferisce protezione contro l'asma16. Tuttavia, non sono stati condotti studi pertinenti sull'associazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla rinite allergica (AR). Pertanto, lo scopo di questo studio è verificare l'influenza del polimorfismo di miR-146a rs2910164 sulla AR, fornendo una nuova base teorica per la patogenesi, la diagnosi clinica e il trattamento della AR.
Protocollo
Dichiarazione etica:
Tutti i partecipanti sono stati informati pienamente sugli obiettivi del nostro esperimento e hanno firmato il modulo di consenso informato. La ricerca è stata approvata dal comitato etico dell'Ospedale Affiliato di Longyan dell'Università Medica del Fujian (Numero di approvazione: LYREC2023-k007-01). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida, i regolamenti pertinenti e la Dichiarazione di Helsinki.
Reclutamento dei partecipanti, criteri di idoneità e raccolta dei campioni
Un totale di 211 individui diagnosticati con rinite allergica (AR) e 180 partecipanti sani (non-AR) sono stati reclutati presso il reparto di otorinolaringoiatria ambulatoriale del Longyan First Affiliated Hospital dell'Università Medica di Fujian tra gennaio 2023 e maggio 2025. I criteri diagnostici per la rinite allergica sono stati adottati dalle linee guida della Chinese Society of Allergy per la diagnosi e il trattamento della rinite allergica17. I pazienti dovevano presentare almeno due sintomi clinici di AR, tra cui prurito nasale, starnuti, congestione nasale o rinite. Inoltre, l'esame della mucosa nasale doveva evidenziare pallore ed edema, e il risultato del test cutaneo (Skin Prick Test, SPT) o del test sierico per le IgE doveva risultare positivo. Il test SPT è stato eseguito da personale specializzato nella stanza ambulatoriale per i test agli allergeni, al fine di garantire accuratezza e risultati costanti. Tutti i pazienti con rinite allergica hanno compilato il questionario sulla qualità della vita nella rinocongiuntivite (Rhino conjunctivitis Quality of Life Questionnaire, RQLQ) e sono stati valutati secondo il punteggio totale dei sintomi nasali (Total Nasal Symptom Score, TNSS) con l'assistenza del personale medico, e i punteggi sono stati registrati per successive analisi.
Volontari sani sottoposti a esami fisici di routine in ospedale sono stati reclutati come gruppo senza rinite allergica. I partecipanti idonei non presentavano anamnesi personale o familiare di rinite allergica, non avevano storia di asma o altre malattie allergiche, non soffrivano di sinusite cronica o altre malattie infiammatorie della cavità nasale e non avevano avuto infezioni delle vie respiratorie nel mese precedente. Inoltre, sono stati esclusi dallo studio individui con anamnesi di gravi malattie cardiache, epatiche, polmonari o renali, o di qualsiasi tumore maligno.
Sono stati prelevati campioni di sangue venoso periferico dai due gruppi di volontari. Una parte del sangue venoso anticoagulato è stata utilizzata per l'estrazione del DNA e dell'RNA plasmatico. Un'altra porzione del sangue venoso è stata separata per ottenere il siero, che è stato impiegato per la rilevazione di fattori sierici (immunoglobulina E (IgE), interleuchina-4 (IL-4), IL-6 e IL-10).
Estrazione del DNA:
200 µL di campioni di sangue venoso periferico sono stati utilizzati per l'estrazione del DNA mediante il kit per l'estrazione del DNA genomico da sangue intero (vedere la Tabella dei materiali). I campioni di sangue sono stati raccolti in provette con litio eparina come anticoagulante, quindi aliquotati e congelati a -20 °C per la conservazione. Le procedure operative specifiche devono seguire rigorosamente le istruzioni del kit. Alla fine, 100 µL di tampone di eluizione sono stati utilizzati per eluire il DNA. La purezza del campione di DNA estratto è stata determinata mediante analizzatore di acidi nucleici/proteine (spettrofotometro) (il rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀ era compreso tra 1,8 e 2,0). I campioni di DNA, dopo l'analisi, sono stati conservati a -20 °C per utilizzi futuri nei successivi esperimenti di genotipizzazione.
Rilevamento del Genotipo
È stato utilizzato un kit di genotipizzazione SNP TaqMan per rilevare la distribuzione dei genotipi di miR-146a rs2910164. Le informazioni sul kit sono state inserite nell'elenco dei materiali di consumo. Il volume totale della reazione PCR era di 10 µL, contenente 5 µL di Master Mix, 0,5 µL di miscela di primer e sonda per tipizzazione, 10 ng di DNA stampo e acqua priva di RNasi. L'amplificazione del DNA è stata eseguita utilizzando lo strumento PCR in tempo reale con rilevazione fluorescente Roche LightCycler 480 II. Condizioni di reazione: pre-denaturazione a 95 °C per 10 minuti; 40 cicli (95 °C per 15 secondi, 60 °C per 1 minuto), con lettura della fluorescenza FAM/VIC a 60 °C. Al termine dell'amplificazione, i segnali di doppia fluorescenza FAM/VIC raccolti sono stati analizzati mediante il software LightCycler 480 e i dati sui genotipi sono stati sottoposti a elaborazione statistica. Un segnale FAM singolo indica un genotipo omozigote, un segnale VIC singolo indica un altro genotipo omozigote, mentre la presenza di entrambi i segnali indica un genotipo eterozigote. I campioni con segnali anomali o risultati non concordanti alla ripetizione verranno sottoposti nuovamente a test. Ogni esperimento è stato eseguito includendo sia un controllo negativo senza stampo sia un controllo positivo, per il controllo di qualità. Tutti i campioni sono stati analizzati in tre ripliche tecniche.
RT-qPCR
L'estrazione totale di miRNA dal plasma è stata eseguita da 100 µL di plasma utilizzando un kit dedicato per l'estrazione di miRNA. Le informazioni sul kit sono state inserite nell'elenco dei materiali di consumo. La concentrazione di RNA è stata determinata mediante spettrofotometro. Il rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀ dei campioni di miRNA estratti e qualificati era compreso tra 1,8 e 2,0. Sono stati utilizzati 200 ng di RNA per la trascrizione inversa al fine di sintetizzare il cDNA, seguendo le istruzioni standard del kit. La trascrizione inversa è stata effettuata in un volume totale di 20 µL, comprendente un'incubazione a 42 °C per 60 min e un'inaltivazione a 85 °C per 5 min. La reazione di qPCR è stata preparata seguendo il protocollo stabilito, con un volume totale di 20 µL. La miscela di reazione è stata allestita come segue: 10 µL di pre-mix per qPCR, 0,4 µL di primer forward, 0,4 µL di primer reverse, 1 µL di template di cDNA e 8,2 µL di acqua priva di RNasi. Sono stati utilizzati primer specifici per miR-146a e per il gene di riferimento interno U6. L'amplificazione è stata completata utilizzando lo strumento per PCR quantitativa in tempo reale Roche LightCycler 480 II. Le condizioni termocicliche della qPCR erano: pre-denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 s e annealing ed estensione a 60 °C per 30 s. Tutti i campioni sono stati sottoposti a tre replicati tecnici. I dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando il software LightCycler 480. Utilizzando U6 come riferimento interno per correggere la variabilità tra i campioni, si calcola prima il ΔCt (valore Ct di miR-146a - valore Ct di U6), quindi il ΔΔCt (ΔCt del gruppo sperimentale - ΔCt del gruppo di controllo) e infine si ottiene il livello di espressione relativo di miR-146a tramite 2⁻ΔΔCt.
ELISA
I livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 sono stati rilevati mediante kit ELISA. Le procedure sperimentali sono state basate sul manuale delle istruzioni. I passaggi specifici erano i seguenti: innanzitutto, la soluzione concentrata per il lavaggio è stata diluita e gli standard sono stati diluiti in modo graduale per preparare le soluzioni di lavoro per la curva standard. In secondo luogo, 50 µL di diluente, soluzione standard e campione da analizzare sono stati aggiunti alle pozzette e incubati a 37 °C per 60 minuti. Dopo l'incubazione, le pozzette sono state lavate tre volte con la soluzione tampone per il lavaggio. Successivamente, sono stati aggiunti 50 µL di soluzione di lavoro dell'anticorpo coniugato con enzima e le piastre sono state incubate a 37 °C per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, il liquido è stato eliminato e le pozzette sono state nuovamente lavate, quindi è stata aggiunta la soluzione cromogenica e incubata per 15 minuti a 37 °C al buio. Dopo l'aggiunta della soluzione di arresto, l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Le concentrazioni dei campioni sono state calcolate in base alla curva standard. Ogni campione è stato analizzato tre volte. I dati con un coefficiente di variazione inferiore al 10% sono stati considerati validi. Durante l'esperimento sono state predisposte pozzette bianco e pozzette di controllo per il controllo di qualità. Il range di rilevamento e la sensibilità del kit erano conformi alle norme specificate nel manuale del produttore.
Statistica dei dati
I dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando i software SPSS e GraphPad Prism 9. I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (media ± DS). Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per valutare la normalità delle variabili continue, e il test di Levene è stato applicato per verificare l'omogeneità della varianza. Il confronto tra variabili continue nei due gruppi è stato analizzato mediante il test t per campioni indipendenti. Per i confronti tra più gruppi è stata eseguita un'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Tukey, mentre per valutare gli effetti principali di due fattori indipendenti e il loro effetto d'interazione è stata applicata l'analisi della varianza a due fattori (Two-way ANOVA). Gli outlier sono stati identificati ed esclusi in base alla regola delle 3 deviazioni standard. Nel presente studio non sono stati rilevati dati mancanti. La curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per analizzare l'efficacia diagnostica di miR-146a per AR. I parametri ROC pertinenti e gli intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati mediante algoritmi statistici integrati. L'analisi della correlazione di Pearson è stata impiegata per misurare la correlazione lineare tra l'espressione di miR-146a e i livelli di fattori sierici. Sono state effettuate analisi di regressione logistica univariata e multivariata per identificare i fattori di rischio per AR. Le variabili con p < 0,05 nell'analisi univariata sono state incluse nel modello di regressione logistica multivariata. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Caratteristiche dei partecipanti e distribuzione del genotipo
I dati clinici alla baseline dei due gruppi di soggetti sono stati analizzati statisticamente. I risultati hanno indicato che i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 presentavano differenze significative. Rispetto al gruppo di volontari senza rinite allergica (AR), la concentrazione sierica di IgE, IL-4 e IL-6 nel gruppo di pazienti con AR era aumentata, mentre il livello di IL-10 era ridotto (Tabella 1). La distribuzione del genotipo di miR-146a rs2910164 è stata determinata mediante metodo TaqMan-qPCR. I risultati dell'analisi hanno mostrato che il genotipo GG (χ2=7,018, OR (IC 95%) = 0,471 (0,269-0,825), p=0,008) e l'allele G (χ2=7,474, OR (IC 95%) = 0,637 (0,506-0,894), p=0,006) del rs2910164 erano più prevalenti nel gruppo di pazienti con AR rispetto al gruppo senza AR. La distribuzione del genotipo nel locus rs2910164 rispettava l'equilibrio di Hardy-Weinberg (pHWE = 0,191) (Tabella 2).
Analisi dell'espressione di miR-146a nel plasma
È stato misurato il livello di espressione di miR-146a nel plasma nei due cohorti dello studio. È stata osservata una marcata riduzione del livello di miR-146a nei pazienti con AR (Figura 1A). L'analisi della curva ROC ha dimostrato che miR-146a possiede una buona efficacia diagnostica per l'AR (Figura 1B). L'AUC era pari a 0,891. Al valore ottimale di cutoff di 0,785, la sensibilità era dell'83,89%, la specificità del 79,44% e l'indice di Youden era di 0,633. Sulla base del genotipo miR-146a rs2910164, i due gruppi di soggetti sono stati rispettivamente suddivisi in tre sottogruppi: GG, GC e CC. Sono state confrontate le differenze di espressione di miR-146a in ciascun sottogruppo. I risultati statistici hanno mostrato che nel gruppo senza AR, l'espressione di miR-146a non presentava differenze statisticamente significative tra i diversi sottogruppi di genotipo (Figura 1C); nel gruppo AR, il livello di espressione di miR-146a nel plasma nel sottogruppo con genotipo GG era significativamente inferiore rispetto a quello nei sottogruppi con genotipo GC e CC (Figura 1D). I dati sopra riportati indicano che l'espressione di miR-146a nel plasma nei pazienti con AR portatori del genotipo GG di rs2910164 è ridotta.
Analisi dei Citochine Sieriche e Correlazione con l'Espressione di miR-146a
Successivamente, i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 nei diversi sottogruppi di genotipo dei soggetti sono stati analizzati statisticamente. I risultati statistici non hanno rivelato differenze significative nei livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 tra i diversi sottogruppi di genotipo (Figura 2A-D); nel gruppo AR, i livelli di IgE, IL-4 e IL-6 sierici nei pazienti portatori del genotipo GG erano significativamente più elevati rispetto a quelli dei pazienti con genotipi GC e CC, mentre il livello di IL-10 sierica era inferiore (Figura 2A-D). È stata utilizzata un'analisi di correlazione di Pearson per indagare le correlazioni lineari tra l'espressione di miR-146a plasmatica e il punteggio TNSS, il punteggio RQLQ, nonché i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10. I risultati hanno indicato che l'espressione di miR-146a era significativamente correlata in modo negativo con il punteggio TNSS, il punteggio RQLQ e i livelli sierici di IgE, IL-4 e IL-6, mentre era correlata positivamente con il livello sierico di IL-10 (Tabella 3). Questi risultati suggeriscono che il livello di espressione di miR-146a è strettamente correlato alla gravità della AR, nonché ai livelli di reazioni allergiche e di infiammazione.
Analisi dei fattori di rischio per la rinite allergica
È stata utilizzata una regressione logistica univariata per analizzare i fattori di rischio della RA, e i risultati hanno indicato che IgE (OR = 1.719, 95% CI = 1.151-2.568, p = 0.008), IL-4 (OR = 1.602, 95% CI = 1.073-2.392, p = 0.021), IL-6 (OR = 1.566, 95% CI = 1.048-2.341, p = 0.029), IL-10 (OR = 0.649, 95% CI = 0.435-0.968, p = 0.034) e l'espressione di miR-146a (OR = 0.149, 95% CI = 0.096-0.233, p < 0.001) avevano un impatto sull'insorgenza della RA. Dopo aver controllato i fattori confondenti mediante analisi di regressione logistica multivariata, si è riscontrato statisticamente che IgE (OR=1.724, 95% CI = 1.092-2.722, p = 0.019), IL-4 (OR = 1.943, 95% CI = 1.206-3.131, p = 0.006), IL-10 (OR = 0.479, 95% CI = 0.296-0.773, p = 0.003) e l'espressione di miR-146a (OR = 0.148, 95% CI = 0.093-0.235, p < 0.001) erano fattori di rischio indipendenti per la RA (Tabella 4).
Figura 1: Diagramma schematizzato del flusso di lavoro. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Espressione plasmatica di miR-146a e prestazioni diagnostiche nella RA.
(A) Espressione plasmatica relativa di miR-146a in volontari sani e pazienti con RA. (B) Curva ROC per la valutazione delle prestazioni diagnostiche di miR-146a plasmatico nella RA. (C) Espressione plasmatica di miR-146a nei sottogruppi con genotipo GG, GC e CC nel gruppo senza RA. (D) Espressione plasmatica di miR-146a nei sottogruppi con genotipo GG, GC e CC nel gruppo con RA. I dati sono espressi come media ± DS. ***p < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Concentrazione sierica di citochine nei soggetti con diversi genotipi di miR-146a rs2910164 nei gruppi non-AR e AR.
Livelli sierici di (A) IgE, (B) IL-4, (C) IL-6 e (D) IL-10 nei sottogruppi con genotipo GG, GC e CC dei gruppi non-AR e AR. I dati sono espressi come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Informazioni | non-AR | AR | p-valore |
| Età (anni) | 42,37±12,43 | 41,81±11,86 | 0,316 |
| BMI (kg/m2) | 23,72±2,36 | 23,58±2,71 | 0,302 |
| Sesso (maschi, n) | 87 | 97 | 0,641 |
| Fumatori | 81 | 94 | 0,929 |
| IgE (IU/ml) | 36,17±10,44 | 116,52±24,38 | <0,001 |
| IL-4 (ng/L) | 1,76±0,61 | 18,74±4,62 | <0,001 |
| IL-6 (ng/L) | 1,29±0,57 | 9,63±3,79 | <0,001 |
| IL-10 (ng/L) | 3,26±0,68 | 1,74±0,73 | <0,001 |
| TNSS | / | 5,92±1,82 | |
| RQLQ | / | 2,43±1,16 | |
| Abbreviazioni: AR, Rinite allergica; BMI, Indice di massa corporea; IgE, Immunoglobulina E; IL, Interleuchina; TNSS, Punteggio totale dei sintomi nasali; RQLQ, Questionario sulla qualità della vita nella rinocongiuntivite; p<0,05 indica significatività statistica. | |||
Tabella 1: Caratteristiche cliniche dei partecipanti allo studio.
Confronto tra le caratteristiche demografiche, i livelli sierici di citochine e i punteggi di valutazione clinica nei gruppi non-AR e AR. Le abbreviazioni sono definite nella nota a piè di tabella.
| rs2910164 | non-AR (n=180) (%) | AR (n=211) (%) | Χ2 | p-valore | OR (IC 95%) |
| Modello codominante | |||||
| GG | 31 (17,22%) | 57 (27,01%) | 1 | ||
| GC | 82 (45,56%) | 96 (45,50%) | 2,832 | 0,092 | 0,637 (0,376-1,079) |
| CC | 67 (37,22%) | 58 (27,49%) | 7,018 | 0,008 | 0,471 (0,269-0,825) |
| Modello dominante | |||||
| GG+ GC | 113 (62,78%) | 153 (72,51%) | 1 | ||
| CC | 67 (38,22%) | 58 (27,49%) | 4,232 | 0,04 | 0,639 (0,417-0,980) |
| Modello recessivo | |||||
| GG | 31 (17,22%) | 57 (27,01%) | 1 | ||
| GC + CC | 149 (82,78%) | 154 (72,99%) | 5,34 | 0,021 | 0,562 (0,344-0,919) |
| Alleli | |||||
| G | 144 (40,00%) | 210 (49,76%) | 1 | ||
| C | 216 (60,00%) | 212 (50,24%) | 7,474 | 0,006 | 0,637 (0,506-0,894) |
| pHWE | 0,494 | 0,191 | |||
| Abbreviazione: AR, Rinite allergica. OR, Rapporto di odds; pHWE>0,05 indica che il gruppo è conforme all'equilibrio di Hardy-Weinberg. p < 0,05 indica significatività statistica. Nota: Il genotipo GG è stato scelto come gruppo di riferimento (OR = 1,000) per tutti i modelli genetici. | |||||
Tabella 2: Associazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la rinite allergica.
Distribuzione dei genotipi e degli alleli rs2910164 nei gruppi non-AR e AR analizzati utilizzando modelli genetici codominanti, dominanti, recessivi e allelici.
| Elementi | miR-146a | TNSS | RQLQ | IgE | IL-4 | IL-6 | IL-10 |
| Correlazione di Pearson | 1 | -0.742 | -0.736 | -0.806 | -0.756 | -0.727 | 0.757 |
| p-valore | / | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
| Abbreviazioni: TNSS, Punteggio Totale dei Sintomi Nasali; RQLQ, Questionario sulla Qualità della Vita nella Rinocongiuntivite; IgE, Immunoglobulina E; IL, Interleuchina; p<0.05 indica significatività statistica. | |||||||
Tabella 3: Correlazione tra l'espressione plasmatica di miR-146a e i parametri clinici e infiammatori.
Analisi di correlazione di Pearson tra l'espressione plasmatica di miR-146a e il punteggio TNSS, il punteggio RQLQ, il livello sierico di IgE e i livelli di citochine nei partecipanti allo studio.
| Elementi | Analisi di regressione univariata | Analisi di regressione multivariata | ||||
| OR | IC 95% | p-valore | OR | IC 95% | p-valore | |
| Età | 0.984 | 0.661-1.465 | 0.937 | |||
| BMI | 1.301 | 0.799-2.119 | 0.29 | |||
| Sesso | 1.099 | 0.738-1.638 | 0.641 | |||
| Fumatore | 1.018 | 0.683-1.519 | 0.929 | |||
| IgE | 1.719 | 1.151-2.568 | 0.008 | 1.724 | 1.092-2.722 | 0.019 |
| IL-4 | 1.602 | 1.073-2.392 | 0.021 | 1.943 | 1.206-3.131 | 0.006 |
| IL-6 | 1.566 | 1.048-2.341 | 0.029 | 1.489 | 0.924-2.353 | 0.088 |
| IL-10 | 0.649 | 0.435-0.968 | 0.034 | 0.479 | 0.296-0.773 | 0.003 |
| espressione di miR-146a | 0.149 | 0.096-0.233 | <0.001 | 0.148 | 0.093-0.235 | <0.001 |
| Abbreviazioni: AR, Rinite allergica; BMI, Indice di massa corporea; IgE, Immunoglobulina E; IL, Interleuchina. | ||||||
Tabella 4: Analisi di regressione logistica dei fattori associati alla rinite allergica.
Analisi di regressione logistica univariata e multivariata per valutare le variabili demografiche, le citochine sieriche e l'espressione di miR-146a plasmatico come fattori associati alla RA.
File Supplementare 1: Dati Grezzi Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria allergica cronica delle vie respiratorie. Il meccanismo fondamentale della AR è che, dopo l'esposizione dell'organismo ad allergeni, lesioni infiammatorie della mucosa nasale sono mediate da IgE17,18. I sintomi clinici comprendono principalmente prurito nasale, congestione nasale, starnuti e secrezione nasale chiara, che compromettono gravemente la qualità della vita dei pazienti. Studi epidemiologici e genetici hanno confermato che la suscettibilità genetica esercita un effetto vitale e indispensabile sull'insorgenza e sullo sviluppo della AR19. Questo studio ha ulteriormente rivelato che il polimorfismo miR-146a rs2910164 era strettamente associato alla suscettibilità alla AR e che il genotipo GG di rs2910164 potrebbe rappresentare un genotipo patogenetico. L'aumento della concentrazione sierica di IgE, IL-4 e IL-6, insieme alla riduzione del livello di IL-10 osservata nei pazienti con AR, indica un'intensificazione delle risposte allergiche e infiammatorie, coerente con le caratteristiche immunopatologiche della malattia.
Studi precedenti hanno dimostrato che il polimorfismo del SNP miR-146a contribuisce alla patogenesi di diverse malattie allergiche, come l'artrite reumatoide20, il lupus eritematoso sistemico21 e la malattia infiammatoria intestinale22. Rasha et al. hanno inoltre riportato che la distribuzione della frequenza del genotipo GG e dell'allele G nel locus rs2910164 era significativamente correlata alla suscettibilità alla malattia infiammatoria intestinale22. Il gruppo di Hai-Bo ha scoperto che il genotipo CC nel locus rs2910164 rappresenta un genotipo protettivo per la psoriasi. Gli individui portatori del genotipo GG presentano un rischio significativamente inferiore di sviluppare la psoriasi23. Diversi studi hanno riportato che il polimorfismo rs2910164 è strettamente associato alla suscettibilità all'asma e si è confermato che il genotipo GG aumenta significativamente il rischio di sviluppare l'asma15,16,24. Questo studio ha ulteriormente evidenziato che la frequenza di distribuzione del genotipo GG di miR-146a rs2910164 nei pazienti con rinite allergica (AR) era più elevata rispetto al gruppo di controllo sano, suggerendo che il genotipo GG possa aumentare la suscettibilità all'AR. L'arricchimento osservato del genotipo GG e dell'allele G nel gruppo AR supporta ulteriormente il possibile contributo della variazione genetica di miR-146a rs2910164 alla suscettibilità alla malattia. Nei pazienti con AR portatori del genotipo GG di rs2910164, le concentrazioni sieriche di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 erano aumentate. Il profilo alterato di citochine osservato negli individui portatori del genotipo GG suggerisce una risposta infiammatoria e allergica più intensa, che potrebbe contribuire a un aumento della suscettibilità alla malattia. Questo risultato indica che il genotipo GG potrebbe essere coinvolto nella patogenesi dell'AR potenziando la risposta allergica e infiammatoria.
In quanto regolatore fondamentale della risposta infiammatoria, miR-146a esercita un potente effetto antinfiammatorio. L'iperespressione di miR-146a regola i geni a valle e attenua significativamente diversi danni correlati all'infiammazione25,26,27. Studi precedenti hanno confermato che l'iperespressione di miR-146a può sopprimere efficacemente la risposta infiammatoria nella congiuntivite allergica attraverso l'upregolazione dell'espressione del fattore di trascrizione forkhead box protein 3 (FOXP3)28. Ulteriori esperimenti sugli animali hanno rivelato che il silenziamento di miR-146a nei topi mutanti comporta un rischio maggiore di sviluppare enfisema rispetto ai topi di tipo selvaggio, confermando ulteriormente il ruolo protettivo di miR-146a nelle malattie respiratorie29. Nel modello di sinusite, miR-146a inibisce l'attivazione di Mucin5AC (MUC5AC), riducendo l'infiammazione della mucosa e la secrezione eccessiva di muco13. I risultati di questo studio hanno mostrato che il livello di miR-146a nei pazienti con rinite allergica (AR) era ridotto e che l'espressione plasmatica di miR-146a nei pazienti portatori del genotipo rs2910164 GG era ancora più bassa. Questi risultati indicano che il genotipo rs2910164 GG potrebbe influenzare la suscettibilità all'AR attraverso la sua associazione con una ridotta espressione di miR-146a e una regolazione immunitaria alterata. Il genotipo GG potrebbe ridurre l'espressione di miR-146a, indebolendo la sua funzione regolatoria antinfiammatoria e aumentando la suscettibilità all'AR. L'analisi di correlazione di Pearson ha ulteriormente indicato l'associazione tra il livello di espressione di miR-146a e la gravità dell'AR, nonché lo stato infiammatorio. L'espressione di miR-146a era linearmente correlata negativamente con TNSS, RQLQ e i livelli sierici di IgE, IL-4 e IL-6, e linearmente correlata positivamente con il livello di IL-10. Ciò indica che nei pazienti con AR che presentano un'espressione più bassa di miR-146a, i sintomi clinici sono più gravi, la qualità della vita è maggiormente compromessa e le reazioni allergiche e le risposte infiammatorie sono più intense.
Questo studio era uno studio caso-controllo. L'analisi ha confermato un'associazione significativa tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla RA. Tuttavia, la ricerca presenta ancora alcune limitazioni. Da un lato, la dimensione relativamente ridotta del campione potrebbe limitare la generalizzabilità dei risultati ottenuti e non consente di caratterizzare con precisione le caratteristiche di distribuzione del genotipo rs2910164 nella popolazione. Dall'altro lato, questo studio dimostra soltanto l'associazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla RA, ma non riesce a chiarire la relazione causale tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la RA. Pertanto, in futuro verrà condotto uno studio prospettico di coorte per includere un numero maggiore di pazienti, al fine di chiarire il rapporto tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e l'insorgenza, l'evoluzione e la prognosi della RA, fornendo una base teorica più solida per la prevenzione e il trattamento della RA.
Complessivamente, l'espressione plasmatica di miR-146a era ridotta nei pazienti con AR, e il genotipo GG rs2910164 era associato a un aumentato rischio di malattia. Questo studio fornisce un possibile marcatore molecolare per identificare individui a rischio aumentato di AR e rappresenta una base per future indagini sui meccanismi genetici alla base dello sviluppo e della progressione della malattia.
Dichiarazioni
In questo articolo non vi è alcuna divulgazione.
Disponibilità dei dati:
Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi nell'articolo come file supplementare. Ulteriori richieste possono essere indirizzate all'autore corrispondente.
Contributo degli autori:
YMY ha fornito contributi sostanziali alla concezione e progettazione, all'acquisizione dei dati o all'analisi e interpretazione dei dati, ed è stato coinvolto nella stesura del manoscritto. YYH ha collaborato nell'acquisizione dei dati, nell'analisi dei dati e nell'analisi statistica. GML e JCW hanno contribuito all'interpretazione dei risultati e hanno revisionato criticamente il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
Ringraziamenti
Non applicabile.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tubo da centrifuga da 15 mL | Corning | 430791 | Per la separazione del plasma, il confezionamento secondario del campione e l'estrazione degli acidi nucleici |
| Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4371355 | 2× miscela madre concentrata ottimizzata per la genotipizzazione di SNP, contenente polimerasi Taq a inizio caldo, dNTP, ioni magnesio, buffer di reazione e colorante di riferimento ROX. Non richiede preparazione manuale del sistema. Compatibile con il sopra menzionato TaqMan SNP Genotyping Assay, fornisce un sistema enzimatico stabile per l'amplificazione di SNP e la genotipizzazione fluorescente con buona riproducibilità e risultati di raggruppamento chiari. |
| Applied Biosystems TaqMan SNP Genotyping Assay (rs2910164, miR-146a) | Thermo Fisher Scientific | C__15946974_10 | Miscela pre-progettata di primer e sonde per la genotipizzazione di SNP del locus umano miR-146a rs2910164. Contiene primer specifici per PCR e due sonde fluorescenti MGB. L'allele C è marcato con VIC e l'allele G con FAM. È in grado di discriminare con precisione i tre genotipi (CC, CG, GG) in un singolo tubo di reazione, ed è adatto alla discriminazione allelica a punto finale su strumenti di qPCR. |
| Tubi per la raccolta di sangue anticoagulato con eparina litica BD | BD Vacutainer | 367884 | Biochimica clinica, test di emergenza e ricerca ematologica |
| Graphpad | USA | / | Grafici scientifici professionali & software statistico, standard in biologia/medicina, nessuna conoscenza di programmazione richiesta. Punti di forza principali: test t, ANOVA, analisi della sopravvivenza, regressione non lineare (ad esempio curve dose-risposta); genera grafici pronti per la pubblicazione (istogrammi, diagrammi a dispersione, curve di sopravvivenza) per qPCR, Western blot e saggi cellulari. |
| Kit ELISA per l'immunoglobulina E (IgE) | Jiancheng | H108-1-2 | Applicazione: ricerca sulla risposta immunitaria, malattie allergiche |
| Kit ELISA per l'interleuchina-10 (IL-10) | Jiancheng | H010-1-2 | Applicazione: Ricerca sull'infiammazione, regolazione immunitaria, biomarcatori clinici |
| Kit ELISA per l'interleuchina-4 (IL-4) | Jiancheng | H005-1-2 | Campo di ricerca: Infiammazione, risposta immunitaria Th2, reazione allergica |
| Kit ELISA per l'interleuchina-6 (IL-6) | Jiancheng | H007-1-2 | Applicazione: Ricerca sull'infiammazione, regolazione immunitaria, biomarcatori clinici |
| LightCycler 480 Software (v1.5 /v1.6) | Roche Diagnostics | / | Software ufficiale Roche che consente l'acquisizione dei dati qPCR con un solo clic, l'analisi quantitativa, l'analisi delle curve di denaturazione e il genotipaggio SNP (metodo endpoint TaqMan + HRM). |
| Kit miRcute per la Sintesi del Primo Filamento di cDNA per miRNA Potenziato | TIANGEN | KR211-02 | Adatto a tutti i protocolli di trascrizione inversa per miRNA maturi |
| miRcute Serum/Plasma miRNA Extraction and Isolation Kit | TIANGEN | DP503 | Campione applicabile: siero umano, plasma, supernatante cellulare |
| Roche LightCycler 480 Instrument II (Sistema di PCR in tempo reale) | Roche Diagnostics | 05015278001 | Quantificazione mediante qPCR + Genotipizzazione di SNP (inclusa TaqMan) + Analisi HRM mediante Curve di Denaturazione ad Alta Risoluzione |
| SPSS 27.0 | USA | / | Software tutto-in-uno per statistiche in scienze sociali e medicina, basato su menù (senza codice), ideale per campioni di grandi dimensioni & progetti complessi. Funzionalità principali: statistiche descrittive, ANOVA, regressione, chi-quadrato, analisi della sopravvivenza, affidabilità, calcolo della dimensione del campione; supporta la pulizia dei dati & importazione multi-formato (Excel/CSV) per dati clinici, di indagine ed epidemiologici |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | TIANGEN | FP205-02 | Miscela madre potenziata ad alta specificità; tampone ottimizzato con fattore H-Bond che minimizza i dimeri di primer & non specifici; Taq hot-start + ROX per LightCycler 480 II; alta sensibilità & riproducibilità; ideale per geni a bassa abbondanza, campioni complessi, genotipizzazione ad alto rendimento. |
| Fotometro per micropiastre Thermo Scientific Multiskan FC | Thermo | 51119180 | Lettore multifunzione per piastre ad alte prestazioni; assorbanza (inclusa a 450 nm) + fluorescenza + luminescenza; linearità 0–4 Ab±2%) a 450 nm, deviazione standard della precisione&<0,001 Abs; compatibile con piastre a 96/384 pozzetti, intervallo dinamico automatico; ideale per ELISA, vitalità cellulare, immunodosaggi, interazioni molecolari. |
| Spettrofotometro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One | Thermo | / | Spettrofotometro UV-Vis microvolume standard oro; 1–2 μL campione, nessuna cuvetta necessaria; misura direttamente acidi nucleici (260 nm), proteine (280 nm), OD600 con concentrazione & rapporti di purezza (A260/A280, A260/A230); analisi spettrale completa 190–850 nm, calibrazione automatica, touchscreen; ideale per qPCR, NGS, controllo qualità della purificazione delle proteine |
| Kit per l'estrazione del DNA genomico da sangue intero | TIANGEN | DP304-03 | Campione applicabile: sangue intero periferico, cellule del sangue, campioni di tessuto |
Riferimenti
- Bernstein, J. A., Bernstein, J. S., Makol, R. & Ward, S. Allergic Rhinitis: A Review. JAMA. 331 (10), 866-877, (2024).
- Brozek, J. L. et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) guidelines-2016 revision. J Allergy Clin Immunol. 140 (4), 950-958, (2017).
- Pagel, J. M. L. & Mattos, J. L. Allergic Rhinitis and Its Effect on Sleep. Otolaryngol Clin North Am. 57 (2), 319-328, (2024).
- Nappi, E. et al. Comorbid allergic rhinitis and asthma: important clinical considerations. Expert Rev Clin Immunol. 18 (7), 747-758, (2022).
- Grimm, D., Hwang, P. H. & Lin, Y. T. The link between allergic rhinitis and chronic rhinosinusitis. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 31 (1), 3-10, (2023).
- Wise, S. K. et al. International consensus statement on allergy and rhinology: Allergic rhinitis - 2023. Int Forum Allergy Rhinol. 13 (4), 293-859, (2023).
- Vignal, A., Milan, D., SanCristobal, M. & Eggen, A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genet Sel Evol. 34 (3), 275-305, (2002).
- Falahi, S. et al. Association between IL-33 Gene Polymorphism (Rs7044343) and Risk of Allergic Rhinitis. Immunol Invest. 51 (1), 29-39, (2022).
- Kamel, M. A. et al. Association of serum CD14 level and functional polymorphism C-159T in the promoter region of CD14 gene with allergic rhinitis. Clin Exp Med. 23 (8), 4861-4869, (2023).
- Vishnoi, A. & Rani, S. miRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Updated Overview. Methods Mol Biol. 2595 1-12, (2023).
- Vijayakumar, S., Yesudhason, B. V., Anandharaj, J. L., Kalaivanan, L. & Selvan Christyraj, J. R. S. Exosomes and Their miRNA as a Potential Biomarker in the Diagnosis of Parkinson's Disease. ACS Chem Neurosci. 16 (15), 2756-2766, (2025).
- Han, S., Ma, C., Bao, L., Lv, L. & Huang, M. miR-146a Mimics Attenuate Allergic Airway Inflammation by Impacted Group 2 Innate Lymphoid Cells in an Ovalbumin-Induced Asthma Mouse Model. Int Arch Allergy Immunol. 177 (4), 302-310, (2018).
- Yan, D. et al. Human Neutrophil Elastase Induces MUC5AC Overexpression in Chronic Rhinosinusitis Through miR-146a. Am J Rhinol Allergy. 34 (1), 59-69, (2020).
- Wang, J. et al. MiR-146a mimic attenuates murine allergic rhinitis by downregulating TLR4/TRAF6/NF-kappaB pathway. Immunotherapy. 11 (13), 1095-1105, (2019).
- Trinh, H. K. T. et al. Association of the miR-196a2, miR-146a, and miR-499 Polymorphisms with Asthma Phenotypes in a Korean Population. Mol Diagn Ther. 21 (5), 547-554, (2017).
- Jimenez-Morales, S. et al. MiR-146a polymorphism is associated with asthma but not with systemic lupus erythematosus and juvenile rheumatoid arthritis in Mexican patients. Tissue Antigens. 80 (4), 317-321, (2012).
- Bayar Muluk, N., Bafaqeeh, S. A. & Cingi, C. Anti-IgE treatment in allergic rhinitis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 127 109674, (2019).
- Lv, R. et al. Research progress of anti-IGE treatment for allergic rhinitis. Am J Otolaryngol. 46 (3), 104646, (2025).
- Davila, I. et al. Genetic aspects of allergic rhinitis. J Investig Allergol Clin Immunol. 19 Suppl 1 25-31, (2009).
- Bogunia-Kubik, K. et al. Significance of Polymorphism and Expression of miR-146a and NFkB1 Genetic Variants in Patients with Rheumatoid Arthritis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 64 (Suppl 1), 131-136, (2016).
- El-Akhras, B. A. et al. mir-146a genetic polymorphisms in systemic lupus erythematosus patients: Correlation with disease manifestations. Noncoding RNA Res. 7 (3), 142-149, (2022).
- Ghorab, R. A. et al. MiR-146a (rs2910164) Gene Polymorphism and Its Impact on Circulating MiR-146a Levels in Patients with Inflammatory Bowel Diseases. Inflammation. 48 (3), 1193-1205, (2025).
- Gong, H. B., Zhang, S. L., Wu, X. J., Pu, X. M. & Kang, X. J. Association of rs2910164 polymorphism in MiR-146a gene with psoriasis susceptibility: A meta-analysis. Medicine (Baltimore). 98 (6), e14401, (2019).
- Dong, J., Sun, D. & Lu, F. Association of two polymorphisms of miRNA-146a rs2910164 (G > C) and miRNA-499 rs3746444 (T > C) with asthma: a meta-analysis. J Asthma. 58 (8), 995-1002, (2021).
- Zhou, Z., Zhu, Y., Gao, G. & Zhang, Y. Long noncoding RNA SNHG16 targets miR-146a-5p/CCL5 to regulate LPS-induced WI-38 cell apoptosis and inflammation in acute pneumonia. Life Sci. 228 189-197, (2019).
- Olivieri, F. et al. miR-21 and miR-146a: The microRNAs of inflammaging and age-related diseases. Ageing Res Rev. 70 101374, (2021).
- Xiong, J. R. et al. miR-146a Regulates Neuroinflammation and Immune Cell Function in Neurodegenerative Diseases. Curr Med Sci. 45 (4), 725-744, (2025).
- Guo, H. et al. MiR-146a upregulates FOXP3 and suppresses inflammation by targeting HIPK3/STAT3 in allergic conjunctivitis. Ann Transl Med. 10 (6), 344, (2022).
- Yoshikawa, H. et al. miR-146a regulates emphysema formation and abnormal inflammation in the lungs of two mouse models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 326 (1), L98-L110, (2024).