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Articolo di ricerca
Lo studio attuale mira a chiarire la relazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla rinite allergica (AR). Livelli plasmatici più bassi di miR-146a e il genotipo GG del rs2910164 sono associati a un aumentato rischio di AR, a risposte infiammatorie potenziate e a manifestazioni cliniche più gravi nei pazienti con AR.
La rinite allergica (AR) non rappresenta una minaccia per la vita dei pazienti, ma compromette gravemente la loro qualità di vita. Il microRNA-146a (miR-146a) svolge un ruolo fondamentale nella regolazione immunitaria e nelle risposte infiammatorie; tuttavia, la relazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla AR non è ancora completamente compresa. Questo studio caso-controllo è stato progettato per indagare l'influenza del polimorfismo miR-146a rs2910164 sulla suscettibilità alla AR. Lo studio ha incluso complessivamente 180 volontari senza AR e 211 pazienti con AR. L'espressione del miR-146a plasmatico è stata misurata mediante RT-qPCR; il genotipo rs2910164 è stato determinato utilizzando il metodo TaqMan-qPCR. L'ELISA è stata impiegata per rilevare i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10. L'analisi di correlazione di Pearson ha valutato le correlazioni lineari tra l'espressione del miR-146a e il punteggio TNSS, il punteggio RQLQ e la concentrazione dei fattori sierici. I fattori di rischio per la AR sono stati identificati mediante regressione logistica. Il genotipo GG e l'allele G del polimorfismo miR-146a rs2910164 erano significativamente più frequenti nei pazienti con AR rispetto ai controlli sani. Il livello plasmatico di miR-146a era ridotto nei pazienti con AR. Il livello plasmatico di miR-146a era più basso nei pazienti con AR portatori del genotipo GG, che mostravano risposte allergiche e infiammatorie più attive. L'espressione del miR-146a era strettamente correlata ai sintomi allergici e alla gravità delle manifestazioni cliniche. La regressione logistica indica che i livelli sierici di IgE e IL-4 rappresentano fattori di rischio indipendenti per la AR, mentre l'espressione di IL-10 e miR-146a costituisce fattori protettivi indipendenti. Bassi livelli plasmatici di miR-146a sono osservati nei pazienti con AR, e il genotipo GG del polimorfismo miR-146a rs2910164 aumenta la suscettibilità alla AR.
La rinite allergica (AR) è un disturbo infiammatorio non infettivo della mucosa nasale mediato da allergeni. I sintomi clinici tipici dell'AR comprendono prurito nasale, congestione nasale, secrezione nasale chiara e starnuti frequenti1. Nei casi più gravi, i pazienti possono anche manifestare una riduzione del senso dell'olfatto e persino un peggioramento della qualità del sonno. Dati epidemiologici indicano che la prevalenza globale dell'AR aumenta anno dopo anno, raggiungendo il 10%-25%2. Sebbene l'AR non metta a rischio la vita dei pazienti, essa interrompe gravemente il sonno, l'apprendimento e il lavoro, riduce in modo significativo la qualità della vita e comporta un pesante onere economico per gli individui e per la società3. Lo studio ha confermato che l'AR rappresenta un fattore di rischio per l'asma e, con il progredire della malattia, i pazienti hanno maggiori probabilità di sviluppare sinusite o polipi nasali, aumentando ulteriormente il carico della malattia4,5. Pertanto, la prevenzione e il controllo dell'AR diventano un compito fondamentale nel campo delle malattie respiratorie. Tuttavia, la patogenesi dell'AR non è ancora stata completamente chiarita. Un'approfondita esplorazione del meccanismo fisiopatologico dell'AR e lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate rivestono un'importanza cruciale ed è anche una questione scientifica attualmente urgente da affrontare.
L'insorgenza della Rinite Allergica (AR) è legata a fattori ambientali e genetici6. Le attuali ricerche ritengono generalmente che l'effetto sinergico della suscettibilità genetica individuale e dell'esposizione all'ambiente allergenico rappresenti il fattore trainante principale per l'insorgenza della AR. Il team di Brozek ha ulteriormente confermato che l'interazione tra la suscettibilità genetica dell'organismo e l'esposizione ambientale costituisce la causa fondamentale della AR2. Nel campo della ricerca sui meccanismi genetici della AR, il polimorfismo genetico è progressivamente diventato l'oggetto di attenzione degli studiosi. I polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), in quanto forma prevalente di polimorfismo genetico, sono la causa principale della variazione dell'informazione genetica negli organismi7. Sempre più evidenze indicano che il genotipo TT nel sito IL-33 rs7044343 potrebbe rappresentare un possibile bersaglio per la prevenzione e il trattamento della AR8. Inoltre, il genotipo TT nel sito C-159T del promotore di CD14 agisce come marcatore predittivo del rischio di AR9. Ciò indica che gli SNP dei geni chiave possono fungere da importanti bersagli molecolari per la valutazione del rischio di AR, per fornire avvisi precoci e per raggiungere una prevenzione e un trattamento mirati. Questo fornisce indizi cruciali per una comprensione più approfondita del meccanismo di suscettibilità genetica alla AR.
Numerosi studi hanno dimostrato che un'espressione anomala dei microRNA (miRNA) rappresenta uno dei principali fattori alla base dell'insorgenza e dello sviluppo di un'ampia gamma di malattie10. I miRNA presentano la caratteristica di esistere in modo stabile nei fluidi corporei, il che li rende marcatori molecolari altamente sensibili per la diagnosi delle malattie. Il miR-146a è una molecola di RNA non codificante dotata di ampie funzioni biologiche11. Il polimorfismo rs2910164 si trova nella regione stem-loop della sequenza precursora del miR-146a. Una variazione in questo sito può influenzare l'efficienza di elaborazione e maturazione del pre-miR-146a, alterando così il livello di espressione del miR-146a maturo e influenzando le risposte immunitarie e infiammatorie a valle. Studi precedenti hanno confermato che un'eccessiva espressione del miR-146a può ridurre in modo significativo l'iperreattività delle vie aeree nei modelli murini di asma e inibire l'attivazione dei linfociti sensibilizzati12. Inibendo l'attività del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il miR-146a può alleviare efficacemente il danno infiammatorio nella sinusite13. Inoltre, l'iperespressione del miR-146a può anche attenuare i sintomi patologici nel modello murino di rinite allergica (AR) bloccando la via di segnalazione del recettore Toll-simile 4 (TLR4)14. Queste osservazioni evidenziano il ruolo fondamentale del miR-146a nella modulazione delle malattie del sistema respiratorio.
Le evidenze esistenti derivanti da studi su polimorfismi genetici indicano che la frequenza dell'allele G nel locus miR-146a rs2910164 è strettamente correlata all'iperreattività delle vie aeree15. Questo SNP è inoltre considerato un possibile biomarcatore del rischio di asma nella popolazione coreana15. In aggiunta, il gruppo di Jimenez-Morales ha ulteriormente dimostrato che il genotipo CC nel locus miR-146a rs2910164 conferisce protezione contro l'asma16. Tuttavia, non sono stati condotti studi pertinenti sull'associazione tra il polimorfismo miR-146a rs2910164 e la suscettibilità alla rinite allergica (AR). Pertanto, lo scopo di questo studio è verificare l'influenza del polimorfismo di miR-146a rs2910164 sulla AR, fornendo una nuova base teorica per la patogenesi, la diagnosi clinica e il trattamento della AR.
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Dichiarazione etica:
Tutti i partecipanti sono stati informati pienamente sugli obiettivi del nostro esperimento e hanno firmato il modulo di consenso informato. La ricerca è stata approvata dal comitato etico dell'Ospedale Affiliato di Longyan dell'Università Medica del Fujian (Numero di approvazione: LYREC2023-k007-01). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida, i regolamenti pertinenti e la Dichiarazione di Helsinki.
Reclutamento dei partecipanti, criteri di idoneità e raccolta dei campioni
Un totale di 211 individui diagnosticati con rinite allergica (AR) e 180 partecipanti sani (non-AR) sono stati reclutati presso il reparto di otorinolaringoiatria ambulatoriale del Longyan First Affiliated Hospital dell'Università Medica di Fujian tra gennaio 2023 e maggio 2025. I criteri diagnostici per la rinite allergica sono stati adottati dalle linee guida della Chinese Society of Allergy per la diagnosi e il trattamento della rinite allergica17. I pazienti dovevano presentare almeno due sintomi clinici di AR, tra cui prurito nasale, starnuti, congestione nasale o rinite. Inoltre, l'esame della mucosa nasale doveva evidenziare pallore ed edema, e il risultato del test cutaneo (Skin Prick Test, SPT) o del test sierico per le IgE doveva risultare positivo. Il test SPT è stato eseguito da personale specializzato nella stanza ambulatoriale per i test agli allergeni, al fine di garantire accuratezza e risultati costanti. Tutti i pazienti con rinite allergica hanno compilato il questionario sulla qualità della vita nella rinocongiuntivite (Rhino conjunctivitis Quality of Life Questionnaire, RQLQ) e sono stati valutati secondo il punteggio totale dei sintomi nasali (Total Nasal Symptom Score, TNSS) con l'assistenza del personale medico, e i punteggi sono stati registrati per successive analisi.
Volontari sani sottoposti a esami fisici di routine in ospedale sono stati reclutati come gruppo senza rinite allergica. I partecipanti idonei non presentavano anamnesi personale o familiare di rinite allergica, non avevano storia di asma o altre malattie allergiche, non soffrivano di sinusite cronica o altre malattie infiammatorie della cavità nasale e non avevano avuto infezioni delle vie respiratorie nel mese precedente. Inoltre, sono stati esclusi dallo studio individui con anamnesi di gravi malattie cardiache, epatiche, polmonari o renali, o di qualsiasi tumore maligno.
Sono stati prelevati campioni di sangue venoso periferico dai due gruppi di volontari. Una parte del sangue venoso anticoagulato è stata utilizzata per l'estrazione del DNA e dell'RNA plasmatico. Un'altra porzione del sangue venoso è stata separata per ottenere il siero, che è stato impiegato per la rilevazione di fattori sierici (immunoglobulina E (IgE), interleuchina-4 (IL-4), IL-6 e IL-10).
Estrazione del DNA:
200 µL di campioni di sangue venoso periferico sono stati utilizzati per l'estrazione del DNA mediante il kit per l'estrazione del DNA genomico da sangue intero (vedere la Tabella dei materiali). I campioni di sangue sono stati raccolti in provette con litio eparina come anticoagulante, quindi aliquotati e congelati a -20 °C per la conservazione. Le procedure operative specifiche devono seguire rigorosamente le istruzioni del kit. Alla fine, 100 µL di tampone di eluizione sono stati utilizzati per eluire il DNA. La purezza del campione di DNA estratto è stata determinata mediante analizzatore di acidi nucleici/proteine (spettrofotometro) (il rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀ era compreso tra 1,8 e 2,0). I campioni di DNA, dopo l'analisi, sono stati conservati a -20 °C per utilizzi futuri nei successivi esperimenti di genotipizzazione.
Rilevamento del Genotipo
È stato utilizzato un kit di genotipizzazione SNP TaqMan per rilevare la distribuzione dei genotipi di miR-146a rs2910164. Le informazioni sul kit sono state inserite nell'elenco dei materiali di consumo. Il volume totale della reazione PCR era di 10 µL, contenente 5 µL di Master Mix, 0,5 µL di miscela di primer e sonda per tipizzazione, 10 ng di DNA stampo e acqua priva di RNasi. L'amplificazione del DNA è stata eseguita utilizzando lo strumento PCR in tempo reale con rilevazione fluorescente Roche LightCycler 480 II. Condizioni di reazione: pre-denaturazione a 95 °C per 10 minuti; 40 cicli (95 °C per 15 secondi, 60 °C per 1 minuto), con lettura della fluorescenza FAM/VIC a 60 °C. Al termine dell'amplificazione, i segnali di doppia fluorescenza FAM/VIC raccolti sono stati analizzati mediante il software LightCycler 480 e i dati sui genotipi sono stati sottoposti a elaborazione statistica. Un segnale FAM singolo indica un genotipo omozigote, un segnale VIC singolo indica un altro genotipo omozigote, mentre la presenza di entrambi i segnali indica un genotipo eterozigote. I campioni con segnali anomali o risultati non concordanti alla ripetizione verranno sottoposti nuovamente a test. Ogni esperimento è stato eseguito includendo sia un controllo negativo senza stampo sia un controllo positivo, per il controllo di qualità. Tutti i campioni sono stati analizzati in tre ripliche tecniche.
RT-qPCR
L'estrazione totale di miRNA dal plasma è stata eseguita da 100 µL di plasma utilizzando un kit dedicato per l'estrazione di miRNA. Le informazioni sul kit sono state inserite nell'elenco dei materiali di consumo. La concentrazione di RNA è stata determinata mediante spettrofotometro. Il rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀ dei campioni di miRNA estratti e qualificati era compreso tra 1,8 e 2,0. Sono stati utilizzati 200 ng di RNA per la trascrizione inversa al fine di sintetizzare il cDNA, seguendo le istruzioni standard del kit. La trascrizione inversa è stata effettuata in un volume totale di 20 µL, comprendente un'incubazione a 42 °C per 60 min e un'inaltivazione a 85 °C per 5 min. La reazione di qPCR è stata preparata seguendo il protocollo stabilito, con un volume totale di 20 µL. La miscela di reazione è stata allestita come segue: 10 µL di pre-mix per qPCR, 0,4 µL di primer forward, 0,4 µL di primer reverse, 1 µL di template di cDNA e 8,2 µL di acqua priva di RNasi. Sono stati utilizzati primer specifici per miR-146a e per il gene di riferimento interno U6. L'amplificazione è stata completata utilizzando lo strumento per PCR quantitativa in tempo reale Roche LightCycler 480 II. Le condizioni termocicliche della qPCR erano: pre-denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 s e annealing ed estensione a 60 °C per 30 s. Tutti i campioni sono stati sottoposti a tre replicati tecnici. I dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando il software LightCycler 480. Utilizzando U6 come riferimento interno per correggere la variabilità tra i campioni, si calcola prima il ΔCt (valore Ct di miR-146a - valore Ct di U6), quindi il ΔΔCt (ΔCt del gruppo sperimentale - ΔCt del gruppo di controllo) e infine si ottiene il livello di espressione relativo di miR-146a tramite 2⁻ΔΔCt.
ELISA
I livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 sono stati rilevati mediante kit ELISA. Le procedure sperimentali sono state basate sul manuale delle istruzioni. I passaggi specifici erano i seguenti: innanzitutto, la soluzione concentrata per il lavaggio è stata diluita e gli standard sono stati diluiti in modo graduale per preparare le soluzioni di lavoro per la curva standard. In secondo luogo, 50 µL di diluente, soluzione standard e campione da analizzare sono stati aggiunti alle pozzette e incubati a 37 °C per 60 minuti. Dopo l'incubazione, le pozzette sono state lavate tre volte con la soluzione tampone per il lavaggio. Successivamente, sono stati aggiunti 50 µL di soluzione di lavoro dell'anticorpo coniugato con enzima e le piastre sono state incubate a 37 °C per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, il liquido è stato eliminato e le pozzette sono state nuovamente lavate, quindi è stata aggiunta la soluzione cromogenica e incubata per 15 minuti a 37 °C al buio. Dopo l'aggiunta della soluzione di arresto, l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Le concentrazioni dei campioni sono state calcolate in base alla curva standard. Ogni campione è stato analizzato tre volte. I dati con un coefficiente di variazione inferiore al 10% sono stati considerati validi. Durante l'esperimento sono state predisposte pozzette bianco e pozzette di controllo per il controllo di qualità. Il range di rilevamento e la sensibilità del kit erano conformi alle norme specificate nel manuale del produttore.
Statistica dei dati
I dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando i software SPSS e GraphPad Prism 9. I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (media ± DS). Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per valutare la normalità delle variabili continue, e il test di Levene è stato applicato per verificare l'omogeneità della varianza. Il confronto tra variabili continue nei due gruppi è stato analizzato mediante il test t per campioni indipendenti. Per i confronti tra più gruppi è stata eseguita un'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Tukey, mentre per valutare gli effetti principali di due fattori indipendenti e il loro effetto d'interazione è stata applicata l'analisi della varianza a due fattori (Two-way ANOVA). Gli outlier sono stati identificati ed esclusi in base alla regola delle 3 deviazioni standard. Nel presente studio non sono stati rilevati dati mancanti. La curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per analizzare l'efficacia diagnostica di miR-146a per AR. I parametri ROC pertinenti e gli intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati mediante algoritmi statistici integrati. L'analisi della correlazione di Pearson è stata impiegata per misurare la correlazione lineare tra l'espressione di miR-146a e i livelli di fattori sierici. Sono state effettuate analisi di regressione logistica univariata e multivariata per identificare i fattori di rischio per AR. Le variabili con p < 0,05 nell'analisi univariata sono state incluse nel modello di regressione logistica multivariata. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Caratteristiche dei Partecipanti e Distribuzione del Genotipo
I dati clinici basali dei due gruppi di soggetti sono stati analizzati statisticamente. I risultati hanno indicato che i livelli sierici di IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 presentavano differenze significative. Rispetto al gruppo di volontari senza rinite allergica (AR), la concentrazione sierica di IgE, IL-4 e IL-6 nel gruppo di pazienti con AR era aumentata, mentre il livello di IL-10 era ridotto (Tabella 1). La distribuzione de...
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La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria allergica cronica delle vie respiratorie. Il meccanismo fondamentale della AR è che, dopo l'esposizione dell'organismo ad allergeni, lesioni infiammatorie della mucosa nasale sono mediate da IgE17,18. I sintomi clinici comprendono principalmente prurito nasale, congestione nasale, starnuti e secrezione nasale chiara, che compromettono gravemente la qualità della vita dei pazienti. Studi epidemiologici e geneti...
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In questo articolo non vi è alcuna divulgazione.
Disponibilità dei dati:
Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi nell'articolo come file supplementare. Ulteriori richieste possono essere indirizzate all'autore corrispondente.
Contributo degli autori:
YMY ha fornito contributi sostanziali alla concezione e progettazione, all'acquisizione dei dati o all'analisi e interpretazione dei dati, ed è stato coinvolto nella stesura del manoscritto. YYH ha collaborato nell'acquisizione dei dati, nell'analisi dei dati e nell'analisi statistica. GML e JCW hanno contribuito all'interpretazione dei risultati e hanno revisionato criticamente il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
Non applicabile.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tubo da centrifuga da 15 mL | Corning | 430791 | Per la separazione del plasma, il confezionamento secondario del campione e l'estrazione degli acidi nucleici |
| Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4371355 | 2× miscela madre concentrata ottimizzata per la genotipizzazione di SNP, contenente polimerasi Taq a inizio caldo, dNTP, ioni magnesio, buffer di reazione e colorante di riferimento ROX. Non richiede preparazione manuale del sistema. Compatibile con il sopra menzionato TaqMan SNP Genotyping Assay, fornisce un sistema enzimatico stabile per l'amplificazione di SNP e la genotipizzazione fluorescente con buona riproducibilità e risultati di raggruppamento chiari. |
| Applied Biosystems TaqMan SNP Genotyping Assay (rs2910164, miR-146a) | Thermo Fisher Scientific | C__15946974_10 | Miscela pre-progettata di primer e sonde per la genotipizzazione di SNP del locus umano miR-146a rs2910164. Contiene primer specifici per PCR e due sonde fluorescenti MGB. L'allele C è marcato con VIC e l'allele G con FAM. È in grado di discriminare con precisione i tre genotipi (CC, CG, GG) in un singolo tubo di reazione, ed è adatto alla discriminazione allelica a punto finale su strumenti di qPCR. |
| Tubi per la raccolta di sangue anticoagulato con eparina litica BD | BD Vacutainer | 367884 | Biochimica clinica, test di emergenza e ricerca ematologica |
| Graphpad | USA | / | Grafici scientifici professionali & software statistico, standard in biologia/medicina, nessuna conoscenza di programmazione richiesta. Punti di forza principali: test t, ANOVA, analisi della sopravvivenza, regressione non lineare (ad esempio curve dose-risposta); genera grafici pronti per la pubblicazione (istogrammi, diagrammi a dispersione, curve di sopravvivenza) per qPCR, Western blot e saggi cellulari. |
| Kit ELISA per l'immunoglobulina E (IgE) | Jiancheng | H108-1-2 | Applicazione: ricerca sulla risposta immunitaria, malattie allergiche |
| Kit ELISA per l'interleuchina-10 (IL-10) | Jiancheng | H010-1-2 | Applicazione: Ricerca sull'infiammazione, regolazione immunitaria, biomarcatori clinici |
| Kit ELISA per l'interleuchina-4 (IL-4) | Jiancheng | H005-1-2 | Campo di ricerca: Infiammazione, risposta immunitaria Th2, reazione allergica |
| Kit ELISA per l'interleuchina-6 (IL-6) | Jiancheng | H007-1-2 | Applicazione: Ricerca sull'infiammazione, regolazione immunitaria, biomarcatori clinici |
| LightCycler 480 Software (v1.5 /v1.6) | Roche Diagnostics | / | Software ufficiale Roche che consente l'acquisizione dei dati qPCR con un solo clic, l'analisi quantitativa, l'analisi delle curve di denaturazione e il genotipaggio SNP (metodo endpoint TaqMan + HRM). |
| Kit miRcute per la Sintesi del Primo Filamento di cDNA per miRNA Potenziato | TIANGEN | KR211-02 | Adatto a tutti i protocolli di trascrizione inversa per miRNA maturi |
| miRcute Serum/Plasma miRNA Extraction and Isolation Kit | TIANGEN | DP503 | Campione applicabile: siero umano, plasma, supernatante cellulare |
| Roche LightCycler 480 Instrument II (Sistema di PCR in tempo reale) | Roche Diagnostics | 05015278001 | Quantificazione mediante qPCR + Genotipizzazione di SNP (inclusa TaqMan) + Analisi HRM mediante Curve di Denaturazione ad Alta Risoluzione |
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