Stabilizzazione di proteine e proteine—Condensati di RNA in idrogel di agarosio a bassa fusione per misurazioni biofisiche quantitative

Sommario

Qui presentiamo un metodo robusto per immobilizzare fisicamente i condensati separati in fase liquido-liquido all'interno di una matrice porosa di idrogel di agarosio a bassa fusione senza disturbare la loro dinamica interna dei liquidi. L'approccio minimizza la sedimentazione delle gocce, la coalescenza e gli artefatti di bagnamento superficiale, consentendo immagini riproducibili e analisi biofisiche quantitative per periodi di ore.

Abstract

I condensati biomolecolari formati dalla separazione in fase liquido-liquido sono sempre più riconosciuti come unità organizzative fondamentali della cellula, con ruoli che vanno dall'elaborazione dell'RNA all'assemblaggio dei granuli di stress. La ricostituzione in vitro di tali condensati utilizzando proteine purificate e RNA fornisce sistemi modello, ma le gocce liquide si ingrossano, sedimentano e si diffondono sulle superfici nel tempo, introducendo una significativa variabilità nelle misurazioni quantitative nei periodi sperimentali. Incorporare questi condensati in un idrogel scarno, otticamente trasparente e chimicamente inerte—qui preparato da agarosio a bassa fusione (LMA) allo 0,3–1,0% w/v—stabilizza le gocce in tre dimensioni, permettendo l'uso di metodologie con tempi di misurazione più lunghi o di configurazioni sperimentali con misurazioni ripetute. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione delle scorte LMA, la formazione delle goccioline e l'incorporamento, fornendo esempi di specifiche letture biofisiche a valle. Mostriamo inoltre che proprietà specifiche delle gocce, come la diffusione molecolare, vengono preservate dopo l'inserimento LMA nei sistemi rappresentativi testati. Poiché il metodo è compatibile con microscopia confocale, a campo ampio o a super-risoluzione, recupero di fluorescenza dopo fotosbiancamento o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, tra gli altri, può supportare la caratterizzazione quantitativa di condensati biomolecolari rilevanti in ambito sanitario e malattia.

Introduzione

La separazione in fase liquido-liquido (LLPS) guida la formazione di organelli senza membrana e condensati biomolecolari nelle cellule, inclusi granuli di stress, corpi P e il nucleolo 1,2,3,4,5. Questi condensati concentrano proteine specifiche e acidi nucleici mantenendo uno scambio rapido con il citoplasma o nucleoplasma circostante – un segno distintivo del comportamento^liquido 1,2,3,4,5. La disregolazione della LLPS è stata collegata a varie malattie, come i disturbi^{neurodegenerativi 3,6,7}, ed è anche implicata nella replicazione di diversi virus, come il SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

La ricostituzione in vitro dei condensati utilizzando proteine purificate e RNA in condizioni di tampone definite è diventata un approccio fondamentale per studiare i meccanismi^{LLPS 3,4}. Tuttavia, le gocce in provetta o su una superficie di vetro sono suscettibili a tre artefatti principali: (i) sedimentazione gravitazionale, che causa l'accumulo di gocce sul fondo; (ii) coalescenza, in cui le gocce si fondono nel tempo in strutture più piccole e più grandi; e (iii) bagnamento superficiale, dove le gocce si diffondono e si adsorbono parzialmente sul copertore. Questi fenomeni riducono la riproducibilità delle misurazioni quantitative e rendono difficile tracciare le singole gocce nelle loro dimensioni fisiologicamente^{rilevanti 13}. Questi fenomeni limitano ulteriormente l'uso di metodi che richiedono tempi di misura estesi da minuti a ore (ad esempio, spettroscopia a risonanza magnetica nucleare [NMR] o tecniche di microscopia a super-risoluzione come STORM) e vietano misurazioni ripetute su scale temporali estese.

L'immobilizzazione fisica all'interno di una rete di idrogel affronta contemporaneamente tutti e tre gli artefatti. L'agarosio forma un gel fisicamente reticolato a temperature inferiori a 34–38 °C. A concentrazioni dello 0,3–1,0% w/v, la dimensione della rete dell'agarosio è abbastanza grande da racchiudere gocce intate su scala micrometrica, rimanendo però sufficientemente porosa da non ostacolare la dinamica molecolare intra-goccia¹³. Inoltre, la porosità della matrice di agarosio permette la diffusione di macromolecole e piccole molecole dentro e fuori dalle gocce incorporate. Per sistemi particolarmente sensibili alla temperatura che coinvolgono proteine con domini piegati o che seguono una separazione di fase di tipo UCST/LCST (temperatura di soluzione critica superiore/inferiore), si può invece utilizzare agarosio a bassa fusione (LMA) con un punto di gelificazione di 26–30 °C. Approcci alternativi anti-bagnati, come la passivazione superficiale, possono ridurre l'adesione del condensato e quindi l'umidificazione, ma spesso richiedono una preparazione specializzata e non impediscono la sedimentazione o la coalescenza delle gocce. Al contrario, l'incastramento dell'agarosio fornisce un metodo semplice e ampiamente accessibile per immobilizzare spazialmente i condensati. È importante sottolineare che l'agarosio è stato convalidato per non alterare lo stato conformazionale del fuso nel sarcoma (FUS) e in altre proteine leganti l'RNA alla formazione di gocce fino a concentrazioni di agarosio dell'1,0% w/^{v 13}. Questo protocollo standardizza l'approccio di embedding dell'agarosio per l'uso generale con molti sistemi proteina o proteina-RNA a separazione di fase di interesse, fornendo indicazioni passo dopo passo per la preparazione dei reagenti e la preparazione del campione.

Protocollo

1. Preparazione del ceppo di agarosio

IMPORTANTE: Preparare la pellicola di agarosio nello stesso buffer utilizzato per creare i campioni separati in fase (d'ora in poi chiamato "buffer a gocce") per evitare disadattamenti del^{buffer 14}. Esempio: Il campione di nucleocapsid viene preparato nel tampone A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), che dovrebbe essere utilizzato anche per preparare lo stock di agarosio.
NOTA: Le condizioni sperimentali finali, incluse ma non limitate a composizione tampon, concentrazione proteica, uso di additivi e volumi finali del campione, dipendono fortemente dal sistema biologico specifico oggetto di indagine e dall'applicazione specifica a valle. Allo stesso modo, i parametri di acquisizione, la configurazione degli strumenti e l'analisi dei dati dipendono fortemente dal campione e dall'esperimento specifico. Ad esempio, la preparazione del nucleocapside SARS-CoV-2 con poly(A) è descritta nella Figura 1A (microscopia a fluorescenza confocale).

1. Pesa la quantità appropriata di LMA o agarosio regolare in un tubo da 1,5 mL contenente tampone a gocce. Esempio: per una scorta al 2% in peso e in volta, sciogli 20 mg di agarosio in 1 mL di tampone A.
   NOTA: La concentrazione finale di agarosio dovrebbe essere dell'1–2% p/v, a seconda della concentrazione finale desiderata nel campione. Non si consiglia superare il 2% di peso e vapore poiché diventa sempre più difficile pipettare. Taglia l'estremità stretta della punta della pipetta per facilitare la pipettatura, soprattutto con percentuali di agarosio elevate. Consulta la sezione di discussione per determinare se è necessario LMA o agarosio regolare per i campioni.
2. Riscalda l'agarosio a 80–90 °C in un blocco riscaldante o in un bagno d'acqua e sciogli completamente l'agarosio tramite vortice (ci vogliono circa 10 minuti).
   ATTENZIONE: L'agarosio fuso è caldo. Maneggialo con attenzione.
3. Bilancia la scorta di agarosio a 37 °C (LMA) o 55 °C (agarosio normale) nel blocco riscaldante o nel bagno d'acqua. Verifica che la soluzione rimanga pulita e liquida a questa temperatura. Verifica la temperatura del calcio di agarosio con un termometro se necessario.
   PUNTO DI PAUSA: I CALCI DI AGAROSIO FUSO POSSONO ESSERE TENUTI CALDI PER 30–60 MINUTI.
   Si consiglia vivamente di riscaldare l'agarosio in un bagno d'acqua per garantire un riscaldamento più omogeneo e mantenere la temperatura obiettivo con sufficiente precisione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con LMA, poiché piccole deviazioni di temperatura possono causare gelificazione prematura.
4. Dopo la preparazione del campione (sezione 2), conservare le scorte avanzate di agarosio a +4 °C. Segui i passaggi 1.2 e 1.3 sopra per rifondere e riequilibrare il calcio di agarosio prima dell'uso.
   NOTA: Raccomandiamo di mantenere il calcio di agarosio per un massimo di 2 settimane a +4 °C e di sottoporlo a non più di 2–3 cicli di solidificazione/fusione. Utilizzare buone pratiche di produzione per prevenire la contaminazione. Scartare i calci prima se non riescono a rifondersi o a solidificarsi, o se si verifica una contaminazione visibile.

2. Preparazione del campione

1. Preriscaldare tutti i materiali che entrano in contatto diretto con l'agarosio (ad esempio, punte di pipetta, tubi, vetrini microscopici) a circa 37 °C posizionandoli sul blocco riscaldante o in un incubatore per 2–3 minuti.
2. Prepara il calcio di agarosio come indicato nella Sezione 1.
3. Prepara il tampone delle gocce, i componenti separanti di fase (ad esempio, scorte di proteine o RNA) e qualsiasi altro additivo (ad esempio, agenti di affollamento, coloranti) per i campioni secondo il protocollo standard. Equilibra alla temperatura ambiente (RT). Esempio: Buffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), stock proteico di nucleocapsid (60 μM, nel buffer A), stock di poly(A) (30 μM, nel buffer A).
   NOTA: Per il recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP), microscopia a fluorescenza confocale o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), aggiungere una piccola frazione di proteina o RNA marcati fluorescenti alle scorte di proteina o RNA (raccomandato: frazione marcata <5%).
4. Calcola i volumi di tampone a gocciole, stock di agarosio, i componenti separanti di fase (ad esempio, proteina o RNA di interesse) e eventuali additivi supplementari (ad esempio, agenti di affollamento) necessari per il campione. Esempio: 6 μL di buffer A, 5 μL di stock di agarosio al 2% (0,5% finale), 5 μL di proteina nucleocapside (15 μM finali), 4 μL di poly(A) (6 μM finali). Volume finale 20 μL.
   NOTA: Sebbene dipendono molto dal piatto, tubo, piastra o altro recipiente utilizzato per l'esperimento, i volumi comunemente utilizzati sono 150 μL per un tubo NMR da 3 mm, 20 μL per esperimenti di microscopia o FRAP in vetri a 6 canali e 20–30 μL per gli esperimenti STORM in vetri microscopici a 18 pozzi (vedi la Tabella dei Materiali).
   1. Come valori iniziali, si utilizza l'agarosio finale dello 0,3–0,5% w/v per i test biofisici standard e lo 0,8–1,0% w/v per la stabilizzazione a lungo termine (ad esempio, esperimenti di invecchiamento).
      NOTA: Per la stabilizzazione e lo stoccaggio a lungo termine dei campioni, devono essere adottate misure per prevenire la disidratazione del campione (ad esempio, sigillare il contenitore del campione, conservare in una camera umidificata e aggiungere una barriera all'evaporazione) e per garantire che la composizione del tampone e il pH rimangano stabili durante incubazioni prolungate.
   2. Per i campioni NMR, aggiungi il 5% finale di D2O v/v al campione per il bloccaggio.
      NOTA: La concentrazione di tutti gli altri componenti e il volume totale del campione dipendono fortemente dall'applicazione specifica e dalla configurazione sperimentale.
5. Aggiungi i volumi corrispondenti di tampon, componenti separanti di fase, calcio di agarosio e additivi in un tubo preriscaldato da 1,5 mL.
   NOTA: Consigliamo di aggiungere prima il tampone e l'agarosio, seguiti da eventuali additivi supplementari. Raccomandiamo inoltre di aggiungere per ultimo i componenti di separazione della fase per innescare la formazione di condensati. Tuttavia, l'ordine ottimale di miscelazione dipende dal sistema e deve essere determinato in anticipo. Questo è particolarmente rilevante per sistemi in cui la stechiometria e l'ordine di addizione possono influenzare fortemente la dimensione delle goccioline o la compartimentazione. Esempio: L'ordine di miscelazione per il campione di nucleocapside è prima il tampone A, il secondo stock di agarosio, il terzo nucleocapsid e l'ultimo poly(A), utilizzando i volumi indicati nello Passo 2.4. In questo esempio, LLPS viene attivato dall'aggiunta di poly(A). Per i sistemi in cui LLPS produce torbidità visibile, la torbidità può fungere da indicatore qualitativo della QC; tuttavia, il tempo di inizio e la visibilità dipendono dal sistema, e la mancanza di turbidità immediata non indica di per sé un fallimento del protocollo.
   1. Tieni il tubo nel blocco riscaldante o nel bagno d'acqua mentre piotti su e giù alcune volte. Evita di introdurre bolle d'aria.
      NOTA: Mentre l'agarosio è ancora liquido, le gocce possono fondersi. Pertanto, variare il tempo di pre-incubazione sul blocco riscaldante o in un bagno d'acqua prima di iniziare la gelificazione può essere uno strumento utile per indagare gocce di diverse dimensioni. Caratterizzare la cinetica della crescita delle gocce in assenza di agarosio prima di selezionare l'intervallo di tempo pre-incubazione permette ai ricercatori di individuare riproducibilmente un specifico intervallo di dimensioni delle gocce.
6. Per campioni di microscopia / FRAP:
   1. Usa una pipetta normale per trasferire rapidamente il campione dentro/sul vetrino di microscopia preferito (ad esempio, vetrino di microscopia a canale con fondo copertura).
   2. Lascia la gelificazione a RT per 5–10 minuti (vedi nota nella sezione discussione).
      NOTA: Non muovere il vetrino microscopico durante questo periodo. Proteggi i campioni fluorescenti dalla luce.
   3. Misura il campione secondo il protocollo standard. Esempio: microscopio confocale a disco rotante, obiettivo 100x 1,45 plan apo oil, lunghezza d'onda di eccitazione 561 nm per colorante Cy3, acquisizione 100 ms al 30% di potenza laser (Cy3) e 50 ms a intensità luminosa del 6% (campo chiaro). Per FRAP: regione di candeggina di 1/10^di diametro della goccia posta al centro della goccia, 25 fotogrammi di pre-candeggina (acquisizione senza ritardo), 60 fotogrammi post-candeggina (prelevati a intervalli di 1 secondo), impulso laser per sbiancare 15 ms al 70% della potenza laser. Analizzare il recupero FRAP tramite normalizzazione su larga scala in software open-access; Riporta i parametri di adattamento cinetico solo se l'adattamento viene eseguito.
7. Per i campioni di STORM:
   1. Usa una pipetta normale per trasferire rapidamente il campione nel vetrino STORM preferito (ad esempio, vetrina a camera a 18 pozzi con fondo copertura). Distribuisci il campione come goccia.
   2. Lascia la gelificazione a RT per 5–10 minuti (vedi nota nella sezione discussione).
      NOTA: Non muovere il vetrino microscopico durante questo periodo. Proteggi i campioni fluorescenti dalla luce.
   3. Riempi l'intero pozzo con il buffer STORM. Sigilla il pozzo secondo il protocollo standard.
   4. Bilanciare il campione per almeno 1–2 ore prima della misurazione per permettere al buffer STORM di diffondersi nell'idrogel di agarosio.
      NOTA: La diffusione riuscita del buffer STORM nel campione può essere facilmente verificata se i coloranti fluorescenti lampeggiano durante l'acquisizione STORM. A seconda delle specifiche del campione, potrebbero essere necessari tempi di equilibrio più lunghi.
   5. Misura il campione secondo il protocollo standard utilizzato. Esempio: microscopio invertito Ti2, SR apochromat TIRF 100x 1.49 obiettivo olio, illuminazione sottile altamente inclinata. Acquisizione di 20.000 fotogrammi per campione, campo visivo di 64 x 64 pixel, tempo di esposizione di 10 ms con un laser da 125 mW da 647 nm per il colorante Cy5, e utilizzo di un laser da 20 mW da 405 nm per facilitare la transizione dallo stato oscuro a lungo vita allo stato fondamentale. Le immagini sono state elaborate utilizzando la stima della massima verosimiglianza con il fitting multi-emitter. Fu applicata la correzione della deriva e nella visualizzazione finale furono inclusi solo i punti dati con precisione di localizzazione di 25 nm o superiore. Le immagini finali vengono prodotte utilizzando il metodo degli istogrammi media spostati a ingrandimento 20x (1 pixel = 8 nm nell'immagine finale).
8. Per i campioni NMR:
   1. Usa una lunga e sottile pipetta di vetro (preriscaldata) per trasferire rapidamente il campione nel tubo NMR. Distribuisci il campione sul fondo del tubo.
   2. Lascia la gelificazione a RT per 5–10 minuti (vedi nota nella sezione discussione).
      NOTA: Non scuotere il tubo NMR durante questo periodo.
   3. Misura il campione secondo il protocollo standard utilizzato. Esempio: intensità di campo della NMR 750 MHz con sonda a temperatura ambiente PATXI, tubo da 3 mm, acquisizione a 25 °C, sequenza di impulsi standard (stebpgp1s19) per esperimenti di diffusione (DOSY), parametri: 4.096 punti con 32 scansioni, intensità del gradiente 2–95%, tempo di diffusione 0,08 s, impulso gradiente 12 ms, ritardo di rilassamento (d1) 5 s.

Risultati

Il protocollo è stato applicato ai condensati formati dal dominio N-terminal del FUS (FUS NTD) o dalla proteina nucleocapside (N) del SARS-CoV-2 con RNA poli(A) o s2m come esempi rappresentativi sia di gocce solo proteiche che di proteina-RNA. Per valutare se l'agarosio influisca rilevabilmente sulla formazione del condensato nelle condizioni testate, abbiamo formato goccioline con proteina N e poly(A) in presenza e assenza di LMA w/v dello 0,5%. Poiché l'LMA si solidifica dopo circa 5 minuti a RT, abbiamo registrato immagini microscopiche a fluorescenza in questo momento e osservato che le gocce avevano dimensioni approssimativamente uguali in entrambi i casi (Figura 1A,B). Per dimostrare l'effetto preventivo dell'agarosio sull'umidimento e la fusione delle gocce, abbiamo registrato un altro set di immagini 60 minuti dopo la preparazione del campione. Sebbene le gocce incorporate nell'agarosio non abbiano cambiato dimensione, i condensati in assenza di LMA hanno mostrato un aumento drastico di dimensione dovuto alla fusione e all'umidimento superficiale (Figura 1A,B). Sebbene abbiamo inserito le goccioline relativamente presto dopo la nucleazione, goccioline di dimensioni diverse possono essere inserite variando il tempo di incubazione pre-inserimento. Nonostante le gocce siano state incorporate nell'agarosio idrogel, la dinamica misurata del condensato non è stata rilevata in modo rilevante. Il recupero FRAP e, quindi, la diffusione apparente delle gocce erano molto simili con e senza LMA nel campione (Figura 1C). Inoltre, precedenti esperimenti di spettroscopia NMR ordinata per diffusione (DOSY) con condensati FUS NTD hanno mostrato che i tassi di diffusione non sono stati rilevabilmente influenzati dalla concentrazione di agarosio, almeno nell'intervallo 0,25–1% w/v (Figura 1D) (adattato da Emmanouilidis et ^al.13). Questi risultati dimostrano che un idrogel di agarosio è adatto a intrappolare condensati separati in fase nello spazio e nel tempo, consentendo misurazioni ripetute su lunghi intervalli temporali.

Sebbene sia le misurazioni microscopiche che FRAP siano abbastanza rapide da registrare (secondi a minuti), alcuni esperimenti richiedono diversi minuti (ad esempio, STORM, 1D ¹H NMR) o addirittura ore (ad esempio, 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) per essere acquisiti. Per tali esperimenti, è fondamentale che le gocce rimangano ferme durante l'acquisizione e non si sedimentino nel tempo. Qui mostriamo che abbiamo stabilizzato le gocce di proteina N + RNA s2m in LMA abbastanza a lungo da acquisire immagini STORM (Figura 1E). Inoltre, gli spettri NMR delle gocce NTD di FUS in presenza e assenza di agarosio avevano larghezze di linea comparabili, suggerendo che non ci siano interazioni rilevabili tra idrogel di agarosio e la proteina in queste condizioni (Figura 1F) (adattato da Emmanouilidis et ^al.13). Al contrario, gli spettri di condensati incorporati nell'agarosio mostravano un'intensità del segnale più elevata, probabilmente perché gocce non stabilizzate si sedimentavano nel tubo NMR durante l'acquisizione e quindi non erano più disponibili per la misurazione (Figura 1F) (adattato da Emmanouilidis et ^al.13). In conclusione, la stabilizzazione dei condensati negli idrogel di agarosio non solo consente esperimenti sul corso temporale, ma consente anche l'uso di metodologie con tempi di acquisizione estesi, preservando al contempo le proprietà delle gocce misurate nei sistemi rappresentativi testati.

Figura 1: Stabilizzazione del condensato tramite embedding dell'agarosio senza disturbare rilevabilmente le proprietà delle gocce misurate. (A) Microscopia a fluorescenza della proteina nucleocapside di 15 μM con 6 μM Cy3-poly(A) (5% marcato) nel tampone A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) in presenza (+ agarosio) o assenza (nessun agarosio) dello 0,5% w/v LMA. Le immagini sono state acquisite 5 o 60 minuti dopo il mixaggio / l'embedding dell'agarosio. Le immagini sono rappresentative di 7 immagini acquisite in n = 2 esperimenti indipendenti. Barra di scala = 5 μm. (B) Quantificazione dei raggi delle gocce dei condensati mostrata in (A). I dati sono visualizzati come boxplot (box = intervallo interquartile, linea centrale = mediana, baffi = intervallo dei dati rimanenti, punto = valori anomali). Il raggio medio ± deviazione standard (SD) e il numero di gocce analizzate in ciascuna condizione sono mostrati direttamente sul grafico. I dati seguono una distribuzione normale. Le singole goccioline non sono state trattate come repliche biologiche indipendenti per inferenza statistica. Non è stato eseguito alcun test statistico; le distribuzioni sono mostrate descrittivamente. (C) FRAP delle gocce mostrato in (A) al minuto 5. Il fotosbiancamento è stato eseguito con il laser a 561 nm (Cy3). I dati mostrano l'intensità normalizzata (media ± sd di n = 3 repliche indipendenti per condizione), che si ottiene normalizzando il segnale sbiancato ai valori pre-candeggina, un'area non sbiancata dello stesso campione e la fluorescenza di fondo. (D) Segnale DOSY non attenuato della proteina Fus NTD da 200 μM nel tampone B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM urea, pH 7,3) in presenza di 0,25, 0,5 o 1,0% w/v agarosio regolare. N = 1. (E) Microscopia a fluorescenza confocale e immagini STORM della proteina Cy5-nucleocapside a 15 μM (marcata al 5%) con 6 μM di RNA virale S2M in buffer A contenente 0,5% w/v LMA. Rappresentativo di n = 3 esperimenti indipendenti. Barra di scala = 1 μm in entrambe le immagini. (F) spettri NMR ^{1D 1}H (a sinistra) e 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR (a destra) di 200 μM FUS NTD in buffer B in presenza o assenza dello 0,5% w/v di agarosio regolare. N = 1. I pannelli (D) e (F) sono riprodotti da Emmanouilidis et ^al.13 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il successo dell'inglobamento dell'agarosio dei condensati biomolecolari dipende da diversi fattori. Innanzitutto, l'agarosio deve essere mantenuto a temperature sufficientemente alte da prevenire una gelificazione prematura e allo stesso tempo abbastanza basse da non disturbare strutture o interazioni biomolecolari. L'agarosio a basso tempo di fusione ha un punto di gelificazione di 26–30 °C e un punto di fusione di 60–65 °C, mentre l'agarosio regolare ha un punto di gelificazione di 34–38 °C e un punto di fusione di 90–95 °C. In secondo luogo, la miscelazione rapida e il trasferimento nel recipiente di reazione finale (ad esempio, il tubo NMR) sono critici, poiché piccole deviazioni di tempismo o temperatura possono portare a un'immersione disomogenea e quindi a una riproducibilità compromessa.

Nonostante questi punti critici, il metodo può essere facilmente adattato a diverse esigenze sperimentali. Per sistemi a separazione di fase con proteine intrinsecamente disordinate o sistemi non soggetti a denaturazione termica, si può utilizzare agarosio regolare al posto dell'LMA per risparmiare sui costi. Quando si preparano campioni contenenti proteine con domini ripiegati, o qualsiasi altra (bio-)molecola sensibile alla temperatura soggetta alla denaturazione termica, si deve utilizzare la LMA per prevenire la denaturazione. Un campione di controllo solo calore/senza agarosio può essere preparato per separare gli effetti dell'embedding dell'agarosio dagli effetti del riscaldamento transitorio del campione. Per ridurre il rischio di questi effetti di denaturazione dipendenti dalla temperatura, l'agarosio a bassa fusione è particolarmente adatto per campioni sensibili alla temperatura, mentre la concentrazione di agarosio può essere regolata per modulare la dimensione della mesh e il grado di confinamento meccanico. Per misurazioni di diffusione ad alta sensibilità, come il metodo NMR recentemente sviluppato chiamato LLPS REDIFINE^15,16, la concentrazione di agarosio più bassa che previene la sedimentazione è solitamente preferibile, tipicamente 0,3–0,5% w/v. Per esperimenti di maturazione che richiedono settimane o mesi di stabilità, è preferibile lo 0,8–1% w/v. Questi parametri devono essere ottimizzati per garantire una stabilizzazione efficace senza alterare rilevabilmente la morfologia o la dinamica del condensato e devono sempre essere adattati al sistema specifico. Questa validazione richiede il confronto di campioni con e senza embedding di agarosio (e condizioni altrimenti identiche) o il confronto di diverse concentrazioni di agarosio (per escludere effetti di rete dipendenti dalla concentrazione), ad esempio utilizzando la microscopia per valutare la morfologia delle gocce, FRAP per valutare la diffusione o qualsiasi altro metodo adatto per valutare le proprietà delle gocce importanti per lo investigatore.

Il tempo di gelazione è un altro aspetto importante. Il tempo necessario per solidificare l'agarosio dipende da diversi fattori, come il tipo di tampon, il pH, la concentrazione finale di agarosio, la temperatura di partenza e se si utilizza agarosio a bassa fusione o regolare. Tipicamente, l'agarosio si solidifica entro 5–10 minuti. La gelificazione del calcio di agarosio può essere utilizzata come indicazione della gelificazione del campione. Analogamente, variare i tempi di pre-incubazione prima dell'inglobazione dell'agarosio permette la caratterizzazione riproducibile di diverse dimensioni delle gocce. La scelta del buffer è anche fondamentale¹⁴. È fondamentale che il materiale di agarosio sia preparato nello stesso buffer utilizzato per preparare i campioni per evitare disallineamenti tra i buffer. Il buffer dovrebbe essere uno in cui il sistema è noto per separarsi in fase.

La sensibilità alla temperatura dovrebbe essere considerata per ciascun sistema. Molti sistemi a separazione di fase mostrano un comportamento di fase termo-reversibile, noto come LLPS di tipo UCST/LCST. Pertanto, una breve esposizione a temperature leggermente elevate durante il mescolamento dell'agarosio dovrebbe essere validata per garantire che non perturbi il comportamento delle fasi o le proprietà delle gocce misurate. Se sorgono problemi, questi possono essere solitamente affrontati affinando le condizioni di temperatura, minimizzando i tempi di manipolazione o regolando la concentrazione di agarosio. Ad esempio, sebbene lo stock LMA sia idealmente riscaldato a 37 °C, le scorte LMA rimarranno comunque liquide a 33–35 °C.

La risoluzione dei problemi è importante perché possono sorgere diverse modalità di guasto a seconda del campione e della configurazione sperimentale. Se le gocce si dissolveno mescolando con l'agarosio, ciò può essere causato da LMA troppo caldo o da un disadattamento del tampon. In questo caso, lo stock LMA dovrebbe essere mantenuto esattamente a o qualche grado sotto la temperatura target e preparato in un tampone identico alla proteina/RNA di interesse. Se si verifica una gelificazione prematura nella punta della pipetta, può essere dovuta al fatto che l'LMA è troppo fredda o alle punte non sono preriscaldate. Per evitare ciò, punte e tubi devono essere preriscaldati a 37 °C, l'operatore deve lavorare rapidamente e il blocco riscaldante deve essere mantenuto alla temperatura desiderata. Se nel tempo si verifica bagnatura, coalescenza o sedimentazione, può essere dovuto a un gel troppo rado o a una gelificazione irregolare. In questo caso, la concentrazione di LMA può essere aumentata e dovrebbe essere garantita anche la gelificazione a temperatura ambiente. Se la soluzione di agarosio contiene particelle visibili, può essere dovuto a una dissoluzione incompleta dell'agarosio. In questo caso, l'agarosio deve essere riscaldato fino a essere completamente trasparente e miscelato accuratamente prima dell'uso (ad esempio, vortizzato). Se durante la miscelazione o la pipettazione vengono introdotte bolle d'aria, queste possono interferire con l'imaging e portare a una distribuzione disomogenea del condensato. Per minimizzare la formazione di bolle, le soluzioni vanno miscelate delicatamente pipettando lentamente su e giù. Se si osserva una gelificazione eterogenea o una distribuzione disomogenea del condensato, ciò può essere dovuto a una miscelazione insufficiente o a gradienti locali di temperatura durante la gelificazione. In questo caso, i campioni devono essere conservati sul blocco riscaldante (o nel bagno d'acqua) fino a quando tutti i componenti non vengono aggiunti, miscelati immediatamente ma delicatamente e lasciati solidificarsi in condizioni di temperatura uniforme. Si dovrebbero evitare gradienti di temperatura ripidi; Si raccomanda la solidificazione a temperatura ambiente (e la solidificazione in frigorifero dovrebbe essere evitata). Negli esperimenti a lungo termine, l'evaporazione del campione può alterare le concentrazioni di soluti e le proprietà del condensato. Per minimizzare l'evaporazione, i campioni devono essere sigillati correttamente e mantenuti in un ambiente a controllo dell'umidità ogni volta che è possibile.

A differenza di metodi come la fissazione del paraformaldeide, l'incastramento dell'agarosio non fissa chimicamente i campioni. Pertanto, i condensati rimangono dinamici, il che è vantaggioso per gli studi funzionali ma limita la conservazione a lungo termine. Per tempi sperimentali prolungati, devono essere adottate precauzioni per prevenire evaporazione e cambiamenti di tampon, come i cambiamenti di pH. Inoltre, sebbene l'agarosio sia generalmente a bassa interazione in questi sami, dovrebbero essere considerati potenziali effetti indiretti sulla diffusione o sull'ambiente locale. Se si sospettano interazioni agarosio–biomolecola, come il legame non specifico della proteina all'agarosio, si possono considerare matrici idrogel alternative come il foto-incrociato di polietilenglicole diacrilato (PEG-DA), con dimensioni e porosità di mesh corrispondenti. L'assenza di interazioni dovrebbe essere validata misurando FRAP nella presenza e nell'assenza della matrice.

Oltre alla fissazione chimica, strategie di passivazione superficiale come superfici rivestite di BSA, PEG o tensioattivo e due strati lipidici supportati sono comunemente utilizzate per ridurre l'adesione e l'umidificazione del condensato. Sebbene questi approcci minimizzino efficacemente le interazioni superficiali, non impediscono il movimento del condensato, la sedimentazione o la fusione. L'incorporamento dell'agarosio, quindi, integra questi metodi fornendo immobilizzazione fisica mantenendo la dinamica del condensato, rendendolo particolarmente utile per esperimenti prolungati, imaging tridimensionale e misurazioni quantitative che richiedono una posizione stabile del campione. La scelta del metodo dovrebbe quindi essere guidata dall'obiettivo sperimentale.

Nel complesso, gli idrogel di agarosio forniscono un mezzo semplice ma efficace per stabilizzare i condensati in tre dimensioni. Questo previene la bagnatura e la fusione delle gocce senza rilevare in modo rilevante le proprietà intrinseche misurate nei sistemi rappresentativi testati, permettendo esperimenti e tecniche di lunga capacità di acquisizione, come la spettroscopia^{NMR 15}. Sebbene questo metodo possa non essere adatto a tutti i sistemi di separazione di fase per diversi motivi, il metodo qui presentato è applicabile allo studio di diversi condensati biomolecolari e può essere particolarmente utile per indagare i processi di maturazione rilevanti per i meccanismi delle malattie^{neurodegenerative 17}.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL tubes	qualsiasi marca va bene	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	per STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	grado per biologia molecolare
agarose, ultra pura	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	per microscopia
microscopio confocale	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	per l'etichettatura delle proteine
D2O (ossido di deuterio)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	espresso ricombinantemente nel nostro laboratorio, come descritto nel riferimento 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
blocco di riscaldamento o bagno d'acqua	qualsiasi marca va bene	N/A	qualsiasi marca o modello va bene
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
software di analisi delle immagini	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
spettrometro NMR	Bruker	N/A	750 MHz, sonda a temperatura ambiente PATXI, vedere il riferimento 13 per maggiori dettagli (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
tubo NMR	Bruker	N/A	3 mm, vetro
pipette P10, P20, P200 e P1000	qualsiasi marca va bene	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	per l'etichettatura dell'RNA
RNA poli(A)	N/A	N/A	trascritto in vitro nel nostro laboratorio, lunghezza circa 50 nucleotidi, come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
RNA s2m	N/A	N/A	trascritto in vitro nel nostro laboratorio, lunghezza 45 nucleotidi, sequenza: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
proteina nucleocapside SARS-CoV-2	N/A	N/A	espresso ricombinantemente nel nostro laboratorio, come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software per la rappresentazione grafica (es. R)	R-Project	Versione 4.2.1	https://www.r-project.org/
microscopio STORM	Nikon N-STORM	N/A
plugin ThunderSTORM	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
punte per le pipette utilizzate	qualsiasi marca va bene	N/A
TopSpin	Bruker	Versione 3.2 e 4.1
urea	Sigma-Aldrich	U5128