Articolo metodologico

Targeting di Cas9 per l'esecuzione di esperimenti di rescue in cellule HEK293 knockout trasdotte stabilmente

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DOI:

10.3791/72172

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28 agosto 2026

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo elimina la proteina Cas9 dopo la modifica del genoma per facilitare esperimenti di recupero robusti in linee cellulari knockout stabilmente trasdotte.

Abstract

La tecnologia di editing genico CRISPR-Cas9 ha rivoluzionato la biologia molecolare. Spesso, questa tecnologia viene utilizzata per eliminare un gene che codifica per una proteina di interesse. Il fenotipo risultante fornisce informazioni preziose sulla funzione della proteina. L'importanza funzionale della proteina bersaglio può essere confermata reintroducendo la proteina per ripristinare la funzione perduta (recupero). Ciò viene generalmente ottenuto introducendo il cDNA codificante la proteina in trans mediante un vettore di espressione. Tuttavia, in linee cellulari knockout che esprimono stabilmente il sistema CRISPR-Cas9, il plasmide di espressione appena introdotto potrebbe essere anch'esso tagliato da Cas9. Il protocollo qui presentato fornisce una strategia per aggirare questo potenziale ostacolo negli esperimenti di recupero. Questo approccio viene dimostrato utilizzando cellule HEK293 in cui il gene che codifica per la proteina scaffold del ligasi dell'ubiquitina E3, CUL4B, è stato interrotto mediante CRISPR-Cas9. La trasduzione di queste cellule con un RNA guida (gRNA) mirato al transgene Cas9 integrato ha portato alla perdita della proteina Cas9 rilevabile. L'ablazione di Cas9 ha permesso il ripristino dell'espressione e della funzione di CUL4B dopo l'introduzione di un plasmide di espressione di CUL4B. Questi risultati forniscono la prova di concetto per un approccio ampiamente applicabile allo studio della funzione proteica attraverso esperimenti di recupero.

Introduzione

CRISPR-Cas9 è uno strumento potente per la modifica del genoma derivato da un sistema immunitario adattativo naturalmente presente nei procarioti, utilizzato per difendersi dall'infezione da batteriofagi. Grazie al basso costo, all'elevata percentuale di successo e alla facilità d'uso, la tecnologia CRISPR-Cas9 ha superato altri strumenti di editing genetico, come le nucleasi a dita di zinco (ZFNs) e le nucleasi effettore-like attivatore della trascrizione (TALENs), per effettuare modifiche genetiche precise, in particolare nelle colture cellulari. Il sistema a due componenti è composto da una nucleasi Cas9 e da un RNA guida (gRNA). Mediante appaiamento delle basi secondo Watson-Crick, il gRNA indirizza Cas9 verso una sequenza genomica bersaglio adiacente a un motivo protospacer-adiacente (PAM). La sequenza PAM funge da sito di riconoscimento essenziale che abilita l'attività della nucleasi. In corrispondenza di questo sito, Cas9 genera un'interruzione a doppio filamento (DSB). In assenza di un modello di riparazione omologo, la cellula ripara la DSB mediante il processo di giunzione non omologa delle estremità (NHEJ). Questo meccanismo di riparazione può introdurre inserzioni o delezioni (indel), causando mutazioni frameshift e l'eliminazione funzionale del gene bersaglio. L'interruzione del gene bersaglio viene quindi ottenuta introducendo Cas9 insieme a un gRNA ingegnerizzato. La sequenza del gRNA di 20 nucleotidi è complementare a una regione genomica immediatamente adiacente al PAM. La perdita funzionale risultante del gene bersaglio rivela il ruolo specifico di quel gene nei processi cellulari1.

Un esperimento di recupero, o saggio di complementazione, prevede il ripristino della proteina mancante per dimostrare l'inversione del fenotipo osservato. Questo approccio funge da controllo rigoroso per escludere effetti sperimentali non intenzionali, come quelli derivanti da delezioni 'fuori bersaglio' di CRISPR-Cas9. Il metodo più comune per reintroddurre una proteina di interesse è la trasfezione o la trasduzione di un vettore di espressione esogeno. Tuttavia, questo DNA introdotto è suscettibile allo stesso targeting da parte di CRISPR-Cas9 del locus endogeno. Questo rischio è particolarmente elevato nelle linee cellulari stably transdotte, in cui l'espressione costitutiva di Cas9 è abbinata alla selezione antibiotica per garantire una popolazione di knockout omogenea e costante; una strategia spesso necessaria in linee cellulari difficili da trasfettare o trasdurre, come quelle derivate da lineaggi immunitari, ematopoietici o neuronali.

Un metodo per aggirare il targeting del vettore consiste nell'introdurre mRNA esogeno che codifica per la proteina di interesse, evitando così il taglio mediato da Cas9 e la necessità di trascrizione nucleare. Tuttavia, rispetto al DNA plasmidico, l'mRNA sintetico è più costoso da produrre, intrinsecamente meno stabile e determina un'espressione altamente transitoria. Inoltre, richiede specifiche modificazioni chimiche per evitare l'attivazione delle risposte immunitarie innate citosoliche2.

Per evitare il targeting da parte del complesso Cas9/gRNA dei plasmidi di espressione, può essere impiegata l'ingegnerizzazione della base di wobble nella sequenza codificante. Sfruttando la degenerazione del codice genetico, possono essere introdotte mutazioni sinonime per eliminare la sequenza PAM richiesta e/o interrompere la complementarità con la gRNA, senza modificare la sequenza amminoacidica della proteina codificata. Tuttavia, l'uso di mutazioni sinonime non è privo di rischi. Queste alterazioni possono introdurre un uso subottimale dei codoni, il che potrebbe alterare la cinetica della traduzione e portare a un errato ripiegamento proteico, ridotta stabilità dell'mRNA o cambiamenti dannosi nella struttura secondaria dell'RNA3,4. Sebbene meno frequenti, altre conseguenze potenziali includono l'introduzione di segnali di poliadenilazione criptici, l'alterazione di motivi regolatori post-trascrizionali e un aumento della densità di CpG5,6. Inoltre, le sequenze ingegnerizzate potrebbero accidentalmente attivare risposte allo stress cellulare se la struttura dell'mRNA risultante interferisce con il progresso del ribosoma7,8.

Oltre alle sfide associate all'uso di mRNA sintetici o all'ingegnerizzazione delle basi del dondolio (wobble-base), l'espressione costitutiva di Cas9 dopo la modifica introduce diverse variabili confondenti nei saggi successivi. Poiché la specificità di Cas9 può essere imperfetta, un'espressione persistente aumenta la probabilità di tagli fuori bersaglio, portando all'acquisizione cumulativa di mutazioni non intenzionali nel tempo9,10,11. Inoltre, un costante monitoraggio del genoma e ripetute rotture a doppio filamento (DSBs) possono innescare una risposta persistente al danno del DNA, spingendo infine le cellule verso l'arresto del ciclo cellulare, la senescenza o l'apoptosi12,13. Questa produzione costitutiva impone anche un onere metabolico, potenziando così alla deriva clonale in cui cellule con bassa espressione superano quelle con alta espressione, determinando livelli incoerenti del transgene attraverso passaggi successivi. Infine, essendo una grande proteina procariotica, Cas9 può indurre stress attraverso segnalazioni immunitarie innate o sovraccaricare il sistema di proteostasi dell'ospite, innescando la risposta alle proteine mal ripiegate14,15,16.

Per mitigare queste complicazioni, sono state sviluppate diverse strategie di inibizione transitoria della Cas9, tra cui proteine fagiche Anti-CRISPR (Acrs)17,18, inibitori di piccole molecole o sistemi fusi a degroni come i PROTACs19,20 e meccanismi di controllo optogenetici19,21. Tuttavia, questi approcci introducono ostacoli pratici che ne limitano l'utilità negli assay di recupero. Le Acrs agiscono tramite mimetismo molecolare e richiedono pertanto un'ottimizzazione stechiometrica per garantire precisione. Le Acrs potrebbero inoltre aggravare gli stessi stress proteostatici e immunogenici associati alla sovraespressione della Cas9. La modulazione chimica introduce complessità farmacocinetiche, potenziale citotossicità e gli effetti "uncino" associati ai PROTAC, nei quali concentrazioni eccessive di ligando impediscono paradossalmente la formazione del complesso ternario produttivo22. Le piattaforme optogenetiche sono limitate dalla fototossicità cellulare e dalla necessità di hardware specializzato per garantire un'illuminazione costante19,21. In particolare, poiché questi metodi forniscono solo un'inibizione temporanea o reversibile, spesso risultano insufficienti per applicazioni in cui la Cas9 è espressa costitutivamente.

Al contrario, i sistemi CRISPR autoinattivanti offrono una soluzione permanente interrompendo autonomamente e in modo definitivo il transgene Cas9 immediatamente dopo la corretta modifica del gene bersaglio. Eliminando l'attività nucleasica residua, questo approccio protegge in modo permanente i vettori di recupero successivi dal taglio, riducendo al contempo lo stress proteostatico a lungo termine e la deriva genomica fuori bersaglio. Sebbene le gRNA autodirette possano essere consegnate mediante transfezioni transitorie di ribonucleoproteine o basate su lipidi23,24, questi metodi sono soggetti a diluzione e a variazioni stocastiche, generando una popolazione "mosaico" in cui alcune cellule sfuggono all'inattivazione25,26,27.

Per superare queste limitazioni, il protocollo descritto in questo articolo sfrutta un sistema di somministrazione lentivirale per l'inattivazione autonoma di Cas9, offrendo vantaggi pratici distinti nella modifica di linee cellulari stabili. La somministrazione lentivirale garantisce l'ereditarietà congiunta del transgene Cas9 e del suo regolatore autodiretto, prevenendo efficacemente l'"evasione per diluizione" tipica delle popolazioni che si dividono rapidamente. Inoltre, la capacità di carico ampliata dei vettori lentivirali permette la coespressione di marcatori di selezione per assicurare una popolazione omogenea priva di Cas9, mentre la loro ampia tropismo, conferita dalla pseudotipizzazione con VSV-G, facilita la somministrazione ad alta efficienza in tipi cellulari difficili da trasfettare25,28,29.

Come dimostrazione del concetto, questo protocollo descrive l'auto-inattivazione di Cas9 per facilitare il recupero fenotipico della proteina scafold ligasi dell'ubiquitina E3 CUL4B in cellule HEK293 con knockout di CUL4B30.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato linee cellulari umane immortalizzate consolidate (HEK293 e HEK293FT) e non ha coinvolto partecipanti umani, tessuti umani primari o esperimenti su animali. Pertanto, non era richiesta l'approvazione etica istituzionale.

1. Generazione di Cas9-costrutto lentivirale con gRNA specifico

  1. Inserire la sequenza di gRNA specifica per Cas9 (Tabella 1) nel vettore lentivirale pLentiGuide-Puro.
  2. Sostituire il gene di resistenza all'antibiotico con uno diverso da quello utilizzato per selezionare la linea cellulare CRISPR-Cas9 stably trasdotta.
  3. Verificare l'inserimento corretto e la fedeltà della sequenza sia della gRNA specifica per Cas9 che del gene di resistenza all'antibiotico sostituito mediante sequenziamento Sanger utilizzando primer specifici per il vettore.
    NOTA: in questo protocollo, il gene di resistenza alla puromicina (PuroR) è stato sostituito con il gene di resistenza all'hygromicina B (HygroR) per generare il vettore Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. Altri geni di resistenza all'antibiotico alternativi includono blasticidina S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR) e zeocina (ZeoR).

2. Produzione del lentivirus che codifica per la gRNA specifica per Cas9

  1. Sezionare 2,5 × 106  cellule HEK293FT in una piastra da 10 cm trattata per colture cellulari.
    NOTA: Mantenere le cellule in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; glucosio alto) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (di seguito indicato come cDMEM) e incubarle a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO2. Le cellule HEK293FT vengono utilizzate perché producono titoli di lentivirus più elevati rispetto ad altre linee cellulari derivate da HEK29331.
  2. Incubare le cellule per 12 ore fino a quando raggiungono almeno il 60% di confluenza prima della trasfezione.
    ATTENZIONE: Eseguire tutte le procedure che coinvolgono vettori lentivirali di terza generazione in condizioni di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2), utilizzando dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati e procedure di decontaminazione approvate (ad esempio, una cappa di sicurezza biologica di Classe II, contenimento secondario e alcol al 70%), come descritto da Pauwels et al32.
  3. Preparare una miscela standard di trasfezione con fosfato di calcio (CaPhos). Diluire 20 µg di DNA plasmidico totale in acqua sterile di grado molecolare fino a un volume finale di 450 µL. Aggiungere 50 µL di CaCl2 2,5 M, seguiti da 500 µL di soluzione salina tamponata con HEPES 2× (HBS; pH 7,05), ottenendo un volume finale di 1 mL in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Utilizzare DNA plasmidico verificato per sequenza, prevalentemente superavvolto, che soddisfi i seguenti criteri di qualità: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 ed endotossina <0,1 UE/µg. Preparare la miscela di trasfezione utilizzando un rapporto equimolare approssimativo composto da 5 µg di Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg di pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg di pLP2 (Rev) e 5,6 µg di pLP/VSVG (glicoproteina del virus della stomatite vescicolare).
  4. Mescolare accuratamente la soluzione di trasfezione con CaPhos mediante pipettaggio delicato.
  5. Aggiungere 1 mL della miscela di trasfezione con CaPhos goccia a goccia alla coltura di cellule HEK293FT.
  6. Agitare delicatamente la piastra per distribuire in modo uniforme i complessi di trasfezione.
  7. Incubare le cellule per 12 ore.
    NOTA: La trasfezione con fosfato di calcio generalmente non è influenzata dagli antibiotici di manutenzione standard33. Tuttavia, si raccomanda l'uso di un mezzo privo di antibiotici per metodi di trasfezione più sensibili, come la lipofezione, poiché gli antibiotici polianionici possono interferire con la formazione del complesso DNA-lipide34.
  8. Aspirare e scartare il mezzo di coltura.
  9. Lavare le cellule una volta con 10 mL di PBS sterile 1× a temperatura ambiente.
  10. Aspirare e scartare il PBS.
  11. Aggiungere 10 mL di cDMEM fresco a temperatura ambiente.
  12. Riposizionare le cellule nell'incubatore e lasciare che le particelle lentivirali si accumulino nel mezzo di coltura per 36 ore.
    NOTA: In queste condizioni, si stima che il surnatante lentivirale non concentrato produca circa 1,0 × 106 unità trasducenti (TU)/mL dopo 48 ore, anche se il titolo effettivo deve essere determinato sperimentalmente come descritto da Kutner et al.35 o Barde et al.36. Conservare il surnatante lentivirale a −80 °C fino a 2 anni. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento, poiché possono ridurre il titolo virale di circa il 55%37,38,39,40.

3. Raccolta del lentivirus che codifica per la gRNA specifica per Cas9 e trasduzione delle cellule bersaglio

  1. Sezionare 1,0 × 106 cellule bersaglio aderenti in una piastra da 10 cm trattata per coltura cellulare.
  2. Incubare le cellule bersaglio per 12 h prima della trasduzione lentivirale.
    NOTA: Le cellule bersaglio sono cellule HEK293 che esprimono stabilmente la Cas9 di Streptococcus pyogenes, un'RNA guida (gRNA) specifica per CUL4B (Tabella 1) e un gene di resistenza alla puromicina (PuroR). Mantenere le cellule in cDMEM contenente 10 µg/mL di puromicina e verificare l'interruzione di CUL4B mediante analisi di western blot prima dell'inattivazione autonoma della Cas9. Eseguire tutti i successivi esperimenti utilizzando cellule HEK293ΔCUL4B a basso passaggio.
  3. Raccogliere il mezzo contenente il lentivirus trasferendo con attenzione il sopranatante dalle cellule produttrici HEK293FT in un tubo conico sterile da 15 mL, avendo cura di non disturbare lo strato monocellulare.
    NOTA: Smaltire le cellule produttrici HEK293FT secondo le linee guida di sicurezza biologica stabilite32.
  4. Centrifugare il sopranatante raccolto a 1.000 × g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per formare un pellet delle eventuali cellule produttrici residue di HEK293FT.
  5. Aspirare e rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule HEK293ΔCUL4B precedentemente seminate.
  6. Trasferire 7 mL del sopranatante lentivirale chiarificato nella piastra da 10 cm contenente le cellule HEK293ΔCUL4B. Evitare di disturbare il pellet sul fondo del tubo da centrifuga e lasciare almeno 1 mL di sopranatante residuo per minimizzare il trasferimento delle cellule produttrici.
    NOTA: Se necessario, filtrare il sopranatante attraverso un filtro da 0,45 µm per eliminare ulteriormente le cellule produttrici residue. Smaltire il sopranatante rimanente in conformità alle linee guida di sicurezza biologica32. Con una titolazione stimata di 1,0 × 106 TU/mL, un inocolo di 7 mL dovrebbe produrre una molteplicità di infezione (MOI) compresa tra 3,5 e 5,541.
  7. Incubare le cellule HEK293ΔCUL4B trasdotte per 24 h per consentire la completa trasduzione e integrazione del lentivirus.
  8. Aspirare e rimuovere il sopranatante virale.
  9. Lavare le cellule una volta con 10 mL di PBS sterile 1× a temperatura ambiente.
  10. Aspirare e rimuovere il PBS.
  11. Aggiungere 10 mL di cDMEM fresco a temperatura ambiente.
  12. Rimettere le cellule nell'incubatore e coltivarle per quattro giorni per consentire l'espressione del transgene e l'interruzione della Cas9.
    NOTA: Se il vettore lentivirale contenente la gRNA per Cas9 non codifica per un reporter fluorescente, trasdurre una coltura sentinella parallela con un vettore lentivirale simile che esprime un reporter fluorescente. Utilizzare la coltura sentinella per stimare l'efficienza di trasduzione e il momento del depletamento del gene bersaglio mediante microscopia a fluorescenza qualitativa o citometria a flusso quantitativa. In questo studio, l'espressione di GFP è stata chiaramente rilevata mediante microscopia a fluorescenza quattro giorni dopo la trasduzione.

4. Selezione antibiotica di transduttanti con gRNA specifico per Cas9

NOTA: Quattro giorni dopo la trasduzione, le cellule bersaglio dovrebbero essere a confluenza o vicine alla confluenza e necessitano di essere trasferite in un contenitore di coltura più grande. Eseguire il trasferimento cellulare contemporaneamente all'inizio della selezione con antibiotico.

  1. Aspirare e scartare il mezzo di coltura dalle cellule HEK293ΔCUL4B .
  2. Lavare le cellule una volta con 10 mL di soluzione sterile di PBS 1× a temperatura ambiente.
  3. Aspirare e scartare il PBS.
  4. Aggiungere 2 mL di soluzione sterile di tripsina-EDTA a temperatura ambiente alla piastra di coltura.
  5. Incubare le cellule per 5 minuti per favorire il distacco.
  6. Aggiungere 8 mL di cDMEM a temperatura ambiente per neutralizzare la tripsina.
  7. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 mL.
  8. Pipettare su e giù la sospensione cellulare da 15 a 20 volte per dissociare completamente gli aggregati cellulari.
  9. Centrifugare le cellule a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  10. Durante la centrifugazione, preparare un fiasco T150 trattato per coltura tessutale contenente 20 mL di cDMEM integrato con 250 µg/mL di idromicina B.
    NOTA: La concentrazione di idromicina B necessaria per la selezione può variare a seconda del tipo cellulare. Eseguire una curva di morte utilizzando concentrazioni di idromicina B comprese tra 50 e 500 µg/mL per determinare la concentrazione minima necessaria per eliminare tutte le cellule non trasdotte entro 7–10 giorni. Se nel vettore Cas9-gRNA viene utilizzato un marcatore di resistenza antibiotica alternativo, eseguire una curva di morte utilizzando 2–10 µg/mL di blastidicina S, 400–800 µg/mL di G418/Geneticina o 50–400 µg/mL di zeocina.
  11. Aspirare e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
  12. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di cDMEM integrato con 250 µg/mL di idromicina B.
  13. Trasferire la sospensione cellulare di 10 mL nel fiasco T150 preparato contenente 20 mL di mezzo selettivo.
  14. Agitare delicatamente il fiasco per distribuire le cellule in modo uniforme.
  15. Incubare le cellule in condizioni selettive per tre giorni.
  16. Al terzo giorno di selezione, aspirare il mezzo selettivo e sostituirlo con 30 mL di cDMEM fresco integrato con 250 µg/mL di idromicina B.
    NOTA: La sostituzione del mezzo selettivo rimuove le cellule morte non aderenti, rifornisce i nutrienti e mantiene l'attività antibiotica.
  17. Continuare l'incubazione fino a quando il monostrato di cellule sopravvissute raggiunge una confluenza di circa il 90%, generalmente dopo ulteriori quattro giorni.

5. Convalida dell'eliminazione della Cas9 e in trans Recupero di CUL4B

NOTA: una volta che le cellule raggiungono circa il 90% di confluenza, confermare l'ablazione di Cas9 nei primi esperimenti e criopreservare immediatamente la popolazione cellulare rimanente42. Questo approccio minimizza lo sviluppo di meccanismi compensatori secondari.

  1. Seminare cellule HEK293 a basso passaggioΔCUL4B cellule stabilmente esprimenti una gRNA che targetizza Cas9 (di seguito indicate come HEK293ΔCUL4BΔcas9) in quattro pozzetti di una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti, a una densità di 2,5 × 105 cellule per pozzetto
  2. Seed HEK293ΔCUL4B cellule in quattro pozzetti di una piastra separata a 6 pozzetti. Seminare le cellule parental HEK293 in almeno un ulteriore pozzetto da utilizzare come controllo.
    NOTA: Utilizzare l'HEK293ΔCUL4B e colture parentali di HEK293 come controlli per l'espressione di Cas9 e di CUL4B, rispettivamente.
  3. Incubare tutte le colture per 12 h per consentire un completo attaccamento cellulare e una proliferazione attiva.
  4. Preparare miscele di trasfezione al fosfato di calcio (CaPhos) contenenti 0, 0,5, 1,0 o 2.0 µg di pCMV-FLAG-CUL4B. Regolare ogni miscela a un totale costante di 10 µg DNA plasmidico aggiungendo un vettore pCMV vuoto.
  5. Diluire ogni miscela di DNA in acqua sterile di grado per biologia molecolare fino a un volume finale di 180 µL, aggiungere 20 µL di 2,5 M di CaCl₂2, quindi aggiungere 200 µL di 2× soluzione salina tampone HEPES (HBS; pH 7,05) per ottenere un volume finale di 400 µL in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Quando si utilizzano plasmidi di espressione sotto il controllo di promotori forti (ad esempio, CMV), eseguire una titolazione del DNA per ottenere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli endogeni. Utilizzare DNA plasmidico prevalentemente superavvolto, con valori di A260/A280 compresi tra 1,8 e 2,0, valori di A260/A230 compresi tra 2,0 e 2,2, e un livello di endotossine di <0,1 UE/µg.
  6. Mescolare accuratamente ogni soluzione di trasfezione CaPhos mediante pipettaggio delicato.
  7. Aggiungere 200 µL di ciascuna miscela di transfezione in modo goccia a goccia nel pozzetto designato contenente HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellule. Cambiare le punte della pipetta tra un campione e l'altro per evitare contaminazioni incrociate.
  8. Aggiungere il rimanente 200 µL di ciascuna corrispondente miscela di transfezione, aggiunta goccia a goccia nel pozzetto designato contenente HEK293ΔCUL4B cellule
  9. Incubare le colture trasfettate per 12 h.
  10. Aspirare il mezzo di coltura da ogni pozzetto.
  11. Lavare le cellule una volta con 1 mL di soluzione salina fisiologica sterile a temperatura ambiente× PBS.
  12. Aspirare e scartare il PBS.
  13. Aggiungere 2 mL di cDMEM fresco a temperatura ambiente in ogni pozzetto.
  14. Incubare le colture per ulteriori 24 h per consentire l'espressione di CUL4B e le risposte funzionali a valle.
  15. Raccogliere le cellule utilizzando procedure standard di tripsinizzazione.
  16. Trasferire ogni sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL individuale.
  17. Lavare ogni sospensione cellulare una volta con 1× PBS.
  18. Pulsare brevemente i campioni a 14.000 × g a temperatura ambiente per formare il pellet delle cellule.
  19. Aspirare e scartare il soprannatante di PBS.
    ATTENZIONE: βIl 2-mercaptoetanolo è un irritante volatile per la pelle e le vie respiratorie, dotato di un odore intenso. Manipolare le soluzioni stock in una cappa chimica certificata indossando idonei dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti resistenti ai prodotti chimici, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Smaltire le punte, le provette e i rifiuti contaminati secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
  20. Lisare il pellet cellulare direttamente in 200 µL Tampone campione Laemmli integrato con il 5% (v/v) β-mercaptoetanolo.
  21. Denaturare le proteine riscaldando i campioni a 95 °C per 15 min.
  22. Risolvere 20–40 µg di proteine totali per corsia mediante elettroforesi standard su gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE).
  23. Trasferire le proteine risolte su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF).
  24. Incubare la membrana per 30 min a temperatura ambiente utilizzando il buffer di blocco.
    NOTA: Preparare il buffer di blocco utilizzando il 5% (p/v) di latte in polvere scremato o il 5% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) disciolti nel buffer di lavaggio standard (0,1% di Tween 20 in uno dei due)× Solu­zione salina tampone al Tris o 1× PBS).
  25. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna utilizzando il tampone di lavaggio standard.
  26. Incubare la membrana con anticorpi primari contro CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6, o α-TUBULINA per 12 h a 4 °C con agitazione delicata.
    NOTA: Diluire gli anticorpi primari 1:1.000 nel tampone di lavaggio standard.
  27. Rimuovere la soluzione dell'anticorpo primario e lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna utilizzando il tampone di lavaggio standard.
  28. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario anti-topo o anti-coniglio IgG coniugato con perossidasi di rafano (HRP) appropriato per 12 h a 4 °C con agitazione delicata.
    NOTA: Diluire gli anticorpi secondari 1:3.000 in buffer di blocco.
  29. Rimuovere la soluzione dell'anticorpo secondario e lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna utilizzando il tampone di lavaggio standard.
  30. Applicare in modo uniforme il substrato chemiluminescente potenziato (ECL) sulla membrana e incubare per 1 minuto.
  31. Acquisire i segnali chemiluminescenti mediante un sistema di imaging digitale.
    NOTA: Se lo si desidera, confermare l'effettiva interruzione genica mediante sequenziamento Sanger della regione genomica bersaglio, dopo l'amplificazione mediante PCR del DNA genomico isolato43.

Risultati

Per generare linee knockout con Cas9 abolita per la ricostituzione sperimentale, è stato prodotto in cellule HEK293FT un lentivirus codificante una gRNA mirata a Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) utilizzando plasmidi di impacchettamento standard (pLP1, pLP2 e pLP/VSVG). Il sopranatante virale risultante è stato raccolto e utilizzato per trasdurre le cellule bersaglio. La sopravvivenza durante la selezione con igromicina B ha confermato una trasduzione lentivirale riuscita, e un successivo analisi tramite western blot ha verificato l'abolizione di Cas9 (Figura 1).

La proteina CUL4B è stata facilmente rilevata nelle cellule HEK293 parentali, ma era assente nelle cellule HEK293 transfettate con vettore vuoto.ΔCUL4B e HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellule. In linea con la perdita di CUL4B, WDR5 e CDC6 hanno mostrato rispettivamente gli aumenti e le diminuzioni previsti nell'espressione a stato stazionario, confermando l'alterazione della funzione di CUL4B. La proteina Cas9 è stata rilevata in HEK293ΔCUL4B cellule, ma era non rilevabile nelle cellule parentali HEK293 e HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellule, confermando l'efficace ablazione di Cas9. Come previsto, la trasfezione del plasmide di espressione di CUL4B in cellule HEK293ΔCUL4B le cellule hanno mostrato solo una minima ripristinazione dell'espressione della proteina CUL4B. Al contrario, un'espressione robusta di CUL4B è stata osservata dopo la trasfezione delle cellule HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellule, accompagnata dal ripristino dell'espressione proteica a valle, come dimostrato dalla riduzione dei livelli di WDR5 e dall'aumento di quelli di CDC6. Nel complesso, questi risultati dimostrano che l'ablazione di Cas9 consente un efficiente ripristino dell'espressione e della funzione di CUL4B, prevenendo il taglio mediato da Cas9 del plasmide di salvataggio (Figura 2).

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Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale per l'ablazione mirata di Cas9 e la convalida del recupero di CUL4B. Questo flusso di lavoro descrive la generazione di cellule knockout CRISPR con ablazione di Cas9 mediante co-trasfezione delle cellule produttrici HEK293FT con pLP1, pLP2, pLP/VSVG e un costrutto Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro tramite trasfezione con fosfato di calcio. Il surnatante lentivirale risultante viene raccolto, centrifugato per eliminare le cellule produttrici residue e utilizzato per trasdurre le cellule bersaglio. Dopo la selezione, l'avvenuta ablazione di Cas9 viene confermata mediante analisi di western blot per ottenere una linea cellulare knockout pura, pronta per la ricostituzione sperimentale di CUL4B. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Recupero dell'espressione e della funzione di CUL4B in cellule HEK293 modificate con CRISPR-Cas9. (A) Schema sperimentale del protocollo di trasfezione. Le cellule HEK293ΔCUL4B   e HEK293ΔCUL4BΔcas9 sono state trasfettate con un vettore vuoto oppure con quantità crescenti di pCMV-FLAG-CUL4B. Le cellule sono state raccolte 36 h dopo la trasfezione e le proteine dei lisati sono state separate mediante SDS-PAGE. (B) Analisi mediante Western blot dell'efficienza di recupero e dei controlli funzionali a valle. Le proteine indicate sono state rilevate mediante Western blot. WDR5 e CDC6 sono state utilizzate come controlli della funzione di CUL4B. α-TUBULIN è stato utilizzato come controllo di caricamento. Le cellule HEK293 parentali sono state utilizzate come controllo per l'espressione basale. I risultati sono rappresentativi di esperimenti replicati (n = 2). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gene bersaglioSequenza gRNA (5′→3′)PAM (5′→3′)Posizione del bersaglioDescrizione del bersaglio
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Esone 3Regione N-terminale dell'ORF umano di CUL4B per un knockout con spostamento della cornice di lettura
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Regione interna conservata del transgene cas9 per indurre indel autoinattivanti

Tabella 1: Sequenze di RNA guida CRISPR-Cas9 e specifiche del bersaglio genomico.

Discussione

Questo protocollo ha permesso un ripristino robusto dell'espressione e della funzione della proteina bersaglio in linee cellulari knockout modificate con CRISPR-Cas9 in cui Cas9 era stata eliminata dopo la modifica. Un'osservazione rilevante emersa da questo studio è il grado sostanziale in cui l'espressione costitutiva di Cas9 sopprime l'espressione del transgene mediata da plasmide. Il punto di forza di questo protocollo risiede nella sua capacità di ripristinare sia la proteina perduta sia il fenotipo ad essa associato. Questo metodo stabilisce inoltre un quadro per l'esplorazione fenotipica di una vasta gamma di alterazioni proteiche. Ad esempio, l'introduzione di una variante mimetica della fosforilazione (ad esempio, sostituzione della serina con acido aspartico) può fornire informazioni preziose sul ruolo di quella specifica modificazione post-traduzionale, senza l'interferenza del background della proteina nativa.

Di conseguenza, questo protocollo è ampiamente applicabile a linee cellulari aderenti standard (ad esempio, HeLa, A549) e in sospensione (ad esempio, Jurkat, THP-1). Tuttavia, questo schema di selezione sequenziale potrebbe rivelarsi impraticabile per cellule primarie o non proliferanti (ad esempio, neuroni primari o macrofagi). In questi sistemi sensibili, l'eliminazione rapida delle cellule spettatrici non trasdotte rilascia detriti citotossici e segnali di stress pro-apoptotici nell'ambiente microscopico condiviso, inducendo una tossicità indiretta46,47. Potrebbe fallire in modo simile in linee tumorali altamente adattabili e aneuploidi (ad esempio, glioblastoma U87 o melanoma A375) che tendono a eludere i fenotipi mediati da CRISPR attraverso rapidi riarrangiamenti cromosomici o la rapida selezione di cloni pre-esistenti resistenti48,49. In definitiva, l'idoneità dipende dalla capacità della linea cellulare di tollerare il carico metabolico dell'espressione con vettori doppi, resistere a queste pressioni selettive indirette e mantenere cinetiche di crescita stabili per tutta la durata del protocollo, che si estende per diverse settimane.

Sebbene questo approccio rappresenti una prova di concetto versatile per la maggior parte delle linee cellulari, la sua implementazione richiede un attento equilibrio tra efficienza di consegna e integrità genomica. Come descritto, l'uso della consegna lentivirale per gRNA diretti contro il gene 'self' assicura una popolazione omogenea di cellule con Cas9 abolita, specialmente nelle cellule difficili da trasfettare. Tuttavia, il rischio di mutagenesi da integrazione semicasuale rimane una preoccupazione. Questi rischi possono essere gestiti ottimizzando il MOI. In linee permissive come HEK293, un MOI compreso tra 1 e 5 consente un'elevata saturazione riducendo al contempo la mutagenesi indotta dall'integrazione e la citotossicità41. Al contrario, cellule immunitarie o neuronali resistenti richiedono tipicamente MOI compresi tra 10 e 50, spesso necessitando l'uso di potenziatori come la polibrenina e/o la spinoculazione per raggiungere efficienze simili50,51,52,53,54,55.

Questo compromesso tecnico si estende alla scelta tra popolazioni policlonali e monoclonali. Le cellule HEK293ΔCUL4BΔcas9 generate in questo studio sono policlonali, una scelta che accelera i tempi sperimentali evitando l'espansione, che richiede settimane, necessaria per il sottoclonaggio da singola cellula. Inoltre, un pool policlonale rappresenta il fenotipo medio della coltura, attenuando efficacemente gli effetti dovuti ad artefatti clonali o a problemi legati all'integrazione in siti specifici. Sebbene le linee monoclonali siano più probabili a fornire risultati costanti grazie all'omogeneità genetica, i risultati presentati in questo lavoro suggeriscono che la selezione policlonale rappresenti un'alternativa valida e spesso preferibile quando si dà priorità alla velocità e alla rappresentatività della popolazione.

Anche la stabilità temporale del fenotipo risultante può rappresentare una variabile critica. Nel sistema qui presentato, l'impatto regolatorio di CUL4B su WDR5 e CDC6 si è ridotto nel corso di passaggi successivi delle linee cellulari knockout, in correlazione con un'upregolazione compensatoria del paralogo CUL4A (dati non mostrati). Questo rispecchia i risultati ottenuti da Nakagawa et al., che hanno dimostrato come CUL4A possa ripristinare parzialmente la funzione di CUL4B in cellule prive di CUL4B44. Tale compensazione omeostatica è comune nella biologia cellulare, in particolare quando si mira a una proteina con elevata omologia strutturale e ridondanza funzionale rispetto ad altre proteine cellulari.

Per affrontare questi meccanismi compensatori secondari, possono essere adottate due strategie distinte, a seconda degli obiettivi sperimentali e della linea cellulare utilizzata. Per i ricercatori che danno priorità all'efficienza o che lavorano con linee cellulari altamente adattabili, è essenziale un cronoprogramma sperimentale condensato. Questa strategia prevede la validazione immediata della perdita della proteina bersaglio, idealmente non appena la coltura raggiunge il 90% di confluenza dopo la selezione, seguita prontamente dal targeting con Cas9 autoinattivante e da saggi funzionali. Adottando questo flusso di lavoro accelerato, si ha maggiori probabilità di catturare le conseguenze biologiche primarie del knockout prima che i meccanismi cellulari di omeostasi abbiano tempo sufficiente per aumentare l'espressione di paraloghi ridondanti o altrimenti alterare il fenotipo risultante.

In alternativa, per studi che richiedono stabilità a lungo termine o esperimenti di recupero ad alta precisione, in particolare in modelli refrattari alla trasfezione come cellule immunitarie e neuronali, un sistema controllato dalla tetraciclina (Tet-On/Off) offre una soluzione praticabile56,57. Sebbene l'implementazione di questo sistema induttivo richieda ulteriori cicli di trasduzione lentivirale e l'uso di marcatori di resistenza antibiotica distinti, esso fornisce un meccanismo per il ripristino prolungato della proteina bersaglio al fine di stabilizzare l'ambiente cellulare prima di innescare eventi transitori di "perdita e recupero" mediati dalla doxiciclina57.

Dichiarazioni

Gli autori hanno utilizzato Google Gemini per assistere nel perfezionamento della terminologia tecnica e nella revisione del manoscritto. L'intelligenza artificiale è stata impiegata come strumento per il miglioramento linguistico e non ha contribuito alla sintesi originale dei dati, alla concettualizzazione dello studio o alla stesura primaria del testo. Gli autori hanno esaminato e modificato l'output e si assumono piena responsabilità per il contenuto del manoscritto finale. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi iniziali forniti dal Le Moyne College, dal Comitato per la Ricerca e lo Sviluppo del Le Moyne College, dal Comitato per la Ricerca Studentesca del Le Moyne College, dal Walter L. '66 e MaryAnne Poland Jesuit Center for Research and Teaching Innovation Fund e dal Dipartimento di Scienze Biologiche e Ambientali del Le Moyne College. Gli autori ringraziano per l'utilizzo di BioRender.com nella preparazione delle illustrazioni grafiche. La Figura 1 è stata creata con BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), e il pannello superiore della Figura 2 è stato creato con BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anticorpo anti-Cas9Cell Signaling65832Questo anticorpo monoclonale murino consente la rilevazione specifica di Cas9 di S. pyogenes in lisati umani, risultando ideale per verificare l'eliminazione di Cas9 mediata da gRNA autodiretto.
anticorpo anti-CDC6Cell Signaling3387Questo anticorpo monoclonale policlonale di coniglio consente la rilevazione specifica di CDC6 umano, risultando ideale per monitorare gli effetti funzionali a valle di CUL4B.
anticorpo anti-CUL4BSigma-AldrichC9995Questo anticorpo policlonale di coniglio purificato per affinità consente la rilevazione specifica di CUL4B umano senza reazioni incrociate con il suo paralogo strettamente correlato CUL4A.
anticorpo secondario anti-topo IgG coniugato a HRPCell Signaling7076Questo anticorpo IgG anti-topo equino è coniugato alla perossidasi del rafano (HRP) ed è ottimizzato per la rilevazione chemiluminescente di anticorpi primari monoclonali murini.
anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato a HRPCell Signaling7074Questo anticorpo IgG anti-coniglio caprino è coniugato alla perossidasi del rafano (HRP) ed è ottimizzato per la rilevazione chemiluminescente di anticorpi primari policlonali e monoclonali di coniglio.
anticorpo anti-WDR5Cell Signaling13105Questo anticorpo monoclonale di coniglio consente la rilevazione specifica di WDR5 umano, risultando ideale per monitorare gli effetti funzionali a valle di CUL4B.
anticorpo anti-α-TUBULINACell Signaling3873Questo anticorpo monoclonale murino riconosce l'alfa-tubulina umana ed è ideale come controllo uniforme di caricamento per la normalizzazione nell'analisi Western blot.
Kit di trasfezione con fosfato di calcioThermoFisher ScientificK278001Questo kit fornisce reagenti per trasfezione transitoria efficienti, ottimizzati per la produzione scalabile ed economicamente vantaggiosa di vettori lentivirali in cellule produttrici aderenti HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesissequenza gRNA per Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, sequenza PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesissequenza gRNA per Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, sequenza PAM: AGG
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle GibcoD5796Questo mezzo ad alto contenuto di glucosio, integrato con L-glutammina e piruvato di sodio, è ottimizzato per sostenere crescita, vitalità e stabilità metabolica in linee cellulari mammifere a rapida proliferazione (ad es. HEK293FT).
Serum bovino fetale, Premium (inattivato termicamente)Corning35-016-CVQuesto siero di grado premium, inattivato termicamente, fornisce fattori di crescita e ormoni essenziali riducendo al contempo la citotossicità mediata dal complemento nelle linee cellulari mammifere.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Questa linea cellulare ben caratterizzata di rene embrionale umano è altamente trasfettabile e costituisce un modello robusto e standard per lo studio dei fenotipi di knockout genico e dei framework di recupero proteico.
Cellule HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Questa variante a rapida crescita e altamente trasfettabile della linea di rene embrionale umano esprime stabilmente l'antigene T grande del virus SV40, risultando ottimizzata per massimizzare il titolo virale durante la produzione di vettori lentivirali.
Idromicina BsigmaaldrichH7772Questo antibiotico aminonucleosidico viene utilizzato come agente selettivo nella coltura cellulare mammifera per isolare transduttanti stabili che esprimono il marcatore di resistenza all'idromicina.
plasmide pCLIP-All-hCMV-Puro (gRNA per CUL4B)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bsequenza gRNA per CUL4B: ATCAAACCCTACAAACTCCA, sequenza PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/AQuesto plasmide di espressione mammifera utilizza un promotore del citomegalovirus (CMV) per indurre l'espressione costitutiva di una proteina Cullina 4B (CUL4B) marcata con FLAG ed è un dono di Jianping Jin.
Vettore di espressione mammifera pCMV-M1Addgene23007Controllo di vettore di espressione vuoto (un dono di Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Questo vettore di trasferimento lentivirale induce l'espressione di una gRNA personalizzabile tramite promotore U6 umano insieme a un marcatore di resistenza alla puromicina sotto il promotore EF-alfa, per targeting CRISPR in cellule che esprimono Cas9, ed è un dono di Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Vettore lentivirale codificante per GFP per valutare l'efficienza di transduzione (un dono di Kevin Janes)
PuromicinaSigma-AldrichP8833Questo antibiotico aminonucleosidico viene utilizzato come agente selettivo nella coltura cellulare mammifera per isolare transduttanti stabili che esprimono il marcatore di resistenza alla puromicina.
Soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS)Corning21-040-CVQuesta soluzione standard di sali equilibrati viene utilizzata per lavare monociti cellulari al fine di rimuovere efficacemente tracce di mezzo di coltura, proteine sieriche o enzimi senza alterare la pressione osmotica o la vitalità cellulare.
Tripsina EDTA 1XCorning25-051-CIQuesta soluzione enzimatica standard di dissociazione viene utilizzata per staccare le cellule mammifere aderenti dai contenitori di coltura scindendo i legami peptidici, mentre l'EDTA chela i cationi bivalenti per interrompere l'adesione intercellulare.
Miscela di confezionamento lentivirale ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Questa miscela ottimizzata di plasmidi di confezionamento (pLP1, pLP2 e pLP/VSVG) viene utilizzata per la co-trasfezione in cellule produttrici al fine di facilitare l'assemblaggio ad alto titolo e la produzione priva di replicazione di vettori di espressione lentivirali.

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