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Articolo metodologico

Imaging del trasporto del liquido cerebrospinale mediante risonanza magnetica con contrasto via infusione intraventricolare in roditori

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DOI:

10.3791/72175

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28 agosto 2026

 ,  , 
1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo di cannulazione intraventricolare e infusione di tracciante specifico per studi di risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto (DCE-MRI) in roditori. Il protocollo consente una somministrazione continua del tracciante durante l'acquisizione delle immagini, permettendo la mappatura dell'intero cervello per quanto riguarda il trasporto del tracciante e la sua eliminazione dal cervello all'interno di una singola sessione di imaging ininterrotta.

Abstract

La cannulazione intraventricolare (ICV) permette la somministrazione di traccianti esogeni o agenti terapeutici direttamente nel ventricolo laterale, origine del percorso di circolazione del liquido cerebrospinale (CSF). Le molecole infuse vengono trasportate dal flusso convettivo del CSF attraverso i compartimenti ventricolari fino allo spazio subaracnoideo ed entrano successivamente nel parenchima cerebrale attraverso lo spazio perivascolare. Tuttavia, i metodi convenzionali di cannulazione ICV utilizzano tipicamente cannule ferromagnetiche, incompatibili con gli studi di risonanza magnetica (MRI), che richiedono pertanto l'infusione al di fuori dello scanner e la rimozione della cannula prima dell’acquisizione delle immagini. Il tempo necessario per il trasporto dell’animale e la preparazione dell’imaging comporta spesso la perdita della fase iniziale, e probabilmente più critica, del trasporto del tracciante. Di seguito descriviamo un protocollo di cannulazione e infusione ICV compatibile con la MRI per roditori, che consente una somministrazione continua del tracciante direttamente all’interno dello scanner durante l’acquisizione dinamica delle immagini MRI. La linea di infusione è realizzata interamente con materiali non magnetici, consentendo un’acquisizione ininterrotta delle immagini all’interno di una singola sessione. Questo approccio è particolarmente adatto per studi di MRI dinamica con contrasto per l’analisi della dinamica del CSF, del trasporto glinfatico, della clearance dei soluti e della somministrazione intratecale di farmaci.

Introduzione

Il cervello è uno degli organi più metabolicamente attivi e dinamici del corpo, che genera continuamente prodotti di scarto che devono essere rimossi in modo efficiente per mantenere una normale funzione neuronale1. L'accumulo di rifiuti metabolici rappresenta una caratteristica distintiva della neurodegenerazione e dell'invecchiamento cerebrale2. Il sistema glinfatico svolge un ruolo centrale in questo processo di eliminazione, facilitando la rimozione dei sottoprodotti metabolici e dei rifiuti tossici attraverso il flusso di massa del liquido cerebrospinale (CSF) e lo scambio tra CSF e liquido interstiziale (ISF)3,4,5, un processo reso possibile dai canali per l'acqua aquaporina-4 (AQP4) localizzati sui piedini astrocitari6. Una comprensione significativa della dinamica del CSF è stata ottenuta studiando il trasporto di diversi traccianti per il CSF. La risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto (DCE-MRI) mediante agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCA) si presta particolarmente bene alla valutazione su scala cerebrale del trasporto dei traccianti7,8. La rilevanza clinica di questo approccio è stata dimostrata da studi traslazionali nell'uomo. L'amministrazione intratecale di GBCA seguita da risonanze magnetiche seriali è stata utilizzata per valutare la dinamica del CSF nel cervello umano9. Studi successivi hanno dimostrato il trasporto del tracciante su scala cerebrale seguito da una rimozione notturna10. Questo approccio è stato recentemente applicato per rivelare un alterato trasporto periarterioso del tracciante in soggetti con ridotta capacità di riserva pressione-volume intracranica, nonché in pazienti con idrocefalo normoteso idiopatico11. Questi studi stabiliscono la DCE-MRI del trasporto di traccianti nel CSF come un approccio clinicamente traslabile e forniscono un'ulteriore motivazione per lo sviluppo di metodi preclinici rigorosi e riproducibili per indagini meccanicistiche sulla regolazione della dinamica del CSF e sulla rimozione dei rifiuti.

La cannulazione della cisterna magna (ICM) è comunemente utilizzata negli studi sul sistema glinfatico per la somministrazione di traccianti12. Tuttavia, solo circa il 20% degli agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCA) somministrati via questo metodo viene trasportato nel parenchima cerebrale, mentre la maggior parte defluisce direttamente verso il midollo spinale o i linfatici8. Questo approccio comporta inoltre il rischio di danneggiare il cervelletto o il tronco encefalico, e il fissaggio della cannula per studi longitudinali rimane tecnicamente complesso. La cannulazione intraventricolare (ICV) si è affermata come un'alternativa più affidabile13,14,15. Uno studio recente ne ha dimostrato la riproducibilità e i principali vantaggi nella somministrazione di traccianti fluorescenti, inclusa una fissazione stabile della cannula che consente un libero movimento dell'animale e permette iniezioni ripetute di tracciante in studi longitudinali13.

Nonostante questi vantaggi, i protocolli esistenti di cannulazione ICV non sono direttamente compatibili con gli studi di risonanza magnetica16. Poiché la cannulazione ICV richiede la penetrazione del parenchima cerebrale, di solito utilizza cannule ferromagnetiche che generano severi artefatti di suscettibilità nelle immagini di risonanza magnetica. Di conseguenza, l'infusione del tracciante deve essere eseguita al di fuori dello scanner, con la rimozione della cannula prima del trasferimento dell'animale per l'acquisizione delle immagini. Un flusso di lavoro tipico prevede l'acquisizione di una scansione basale, la rimozione dell'animale per la cannulazione e l'infusione del tracciante, e successivamente il riposizionamento dell'animale per scansioni dinamiche successive. Questo flusso di lavoro interrotto esclude la possibilità di un'acquisizione continua e riferita al basale e introduce errori di allineamento dovuti al riposizionamento, che possono compromettere l'analisi cinetica voxel per voxel. Ancor più importante, poiché la fase iniziale di uptake è tipicamente la porzione più dinamica e transitoria della cinetica del tracciante, eseguire il trasferimento dell'animale e la configurazione dello scanner durante questo intervallo comporta la perdita dei dati più informativi.

In questo studio, presentiamo un protocollo che supera queste limitazioni integrando una linea di infusione ICV compatibile con la risonanza magnetica (MRI) e con capacità di somministrazione di un agente di contrasto all'interno dello scanner, consentendo acquisizioni dinamiche continue di MRI in roditori. Questo approccio permette una mappatura quantitativa dell'intero cervello relativa al trasporto del tracciante nel liquido cerebrospinale (CSF) in un'unica sessione di imaging ininterrotta. Il protocollo è particolarmente adatto per lo studio della dinamica del CSF a livello cerebrale, del trasporto glio-linfatico e della cinetica di eliminazione dei soluti. Sebbene qui descritto per ratti adulti, il protocollo può essere adattato per i topi mediante opportuni aggiustamenti delle coordinate di cannulazione e dei parametri di infusione15.

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Protocollo

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della Case Western Reserve University (A-3145-01-2023-0015), in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e con la Politica del Servizio Sanitario Pubblico sul Trattamento Umano degli Animali da Laboratorio. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della linea di infusione

  1. Tagliare un segmento di 30 mm di cannula di rame e un tratto di 2 m di tubo di polietilene (PE) utilizzando forbici seghettate.
  2. Sotto un microscopio, allargare delicatamente un'estremità del tubo di PE con un ago da 30 G, quindi inserire la cannula di rame nell'estremità allargata e fissare il giunto con colla cianoacrilica. Collegare l'estremità opposta del tubo di PE a un ago da 30 G.
    NOTA: Il rame è altamente duttile; prestare attenzione a non schiacciare il lume durante il taglio. Evitare di deformare la cannula o di forare il tubo durante il montaggio. La lunghezza del tubo di PE deve consentire di posizionare la pompa per siringa al di fuori del campo magnetico periferico dello scanner.
  3. Riempire l'insieme cannula-tubo con soluzione tracciante disgassata e collegarlo a una siringa Hamilton da 50 µL. Avvolgere la punta della siringa con nastro sigillante in politetrafluoroetilene (PTFE) per prevenire perdite. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante questa operazione.
  4. Montare la siringa Hamilton sulla pompa per siringa ed aspirare ulteriori 30 µL di soluzione tracciante nella siringa.

2. Procedura di cannullatura

  1. Pesare il ratto e anestetizzarlo mediante iniezione intraperitoneale di chetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Verificare la profondità adeguata dell’anestesia mediante il riflesso alla pressione sul dito del piede. Integrare con un terzo della dose iniziale se necessario e ricontrollare prima di proseguire.
  2. Rasare la testa e il collo, rimuovere i peli liberi e sterilizzare la cute esposta con tamponi di etanolo al 70%.
  3. Fissare il ratto su un supporto stereotassico e posizionare sotto l’animale un tappetino riscaldante ricoperto con carta assorbente. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l’essiccamento corneale.
  4. Regolare la pinza nasale per livellare il cranio. Praticare un’incisione mediana e retrarre la cute con quattro clip emostatiche per esporre il bregma e il lambda. Applicare perossido di idrogeno al 3% sul cranio per rimuovere il periostio residuo e migliorare la visibilità dei punti di riferimento.
    NOTA: Un livellamento accurato del cranio è fondamentale per un posizionamento riproducibile della cannula. Come misura pratica di controllo qualità, confrontare le coordinate mediolaterali (ML) e dorsoventrali (DV) in corrispondenza del bregma e del lambda: se il cranio è correttamente livellato, la differenza tra i due punti di riferimento non deve superare 0,2 mm in nessuno dei due assi ML o DV.
  5. Montare sul braccio stereotassico il trapano elettrico con una punta fine e assicurarsi che il braccio sia saldamente bloccato.
  6. Posizionare la punta del trapano sul bregma, quindi spostarla di 0,7 mm in posizione posteriore e di 1,4 mm in posizione laterale a destra. Abbassare la punta del trapano fino al contatto con la superficie cranica e registrare la coordinata DV.
  7. Sotto osservazione al microscopio, avanzare il trapano a incrementi di 0,1 mm. Fermarsi immediatamente al momento della perforazione del cranio (lo spessore cranico tipico nei ratti adulti è di 0,3–0,4 mm).
  8. Sostituire il trapano con la cannula precaricata sul braccio stereotassico. Attivare brevemente la pompa di infusione finché un liquido non appare appena all’estremità della cannula, confermando così un percorso libero per il fluido.
  9. Assicurarsi che la cannula sia montata perpendicolarmente alla superficie cranica, quindi allinearla sul foro praticato. Avanzare la cannula a una velocità di 0,1 mm/s fino a una profondità finale obiettivo di 3,5 mm al di sotto della superficie durale.
  10. Applicare una goccia di adesivo tissutale all’interfaccia tra cannula e cranio. Dopo la polimerizzazione, chiudere l’incisione del cuoio capelluto con punti di sutura e piegare delicatamente la cannula di rame parallelamente alla superficie cranica per evitare il contatto con la bobina della risonanza magnetica.

3. Configurazione della risonanza magnetica e acquisizione dinamica

  1. Posizionare la bobina trasmittente di volume all'isocentro dello scanner.
  2. Trasferire l'animale in una staffa compatibile con la risonanza magnetica (MRI) in posizione prona. Collegare il sistema di monitoraggio fisiologico, compreso il sensore respiratorio e la sonda per la temperatura rettale. Accendere il bagno di acqua calda circolante per mantenere la temperatura corporea a circa 37 °C.
  3. Mantenere un'adeguata anestesia per tutta la sessione di scansione utilizzando isoflurano supplementare somministrato via cono nasale. Regolare la concentrazione di isoflurano tra lo 0,25% e l'1,0% per mantenere una frequenza respiratoria di 50–70 atti/min.
    NOTA: L'anestesia con chetamina-xilazina somministrata prima dell'intervento chirurgico di cannulazione garantirà una sedazione residua durante il trasferimento iniziale alla staffa MRI. Introdurre l'isoflurano gradualmente e monitorare continuamente la frequenza respiratoria durante la scansione.
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente volatile che rappresenta un rischio per inalazione; utilizzare un sistema attivo di aspirazione e ridurre al minimo l'esposizione del personale.
  4. Posizionare la pompa di infusione al di fuori del campo magnetico periferico, impostare la velocità di infusione a 1 µL/min e la durata dell'infusione a 20 min, corrispondente a un volume totale di infusione di 20 µL. Disporre e fissare con cura il tubo di infusione lungo la staffa per evitare tensioni e spostamenti.
    ATTENZIONE: Gli oggetti ferromagnetici possono diventare proiettili pericolosi se posizionati vicino a uno scanner MRI. Mantenere tutti gli strumenti non compatibili con la MRI al di fuori del campo periferico.
  5. Montare la bobina a matrice superficiale direttamente sulla parte dorsale del cranio, centrata sul cervello. Posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente tra la bobina e la sede dell'incisione per assorbire eventuali fuoriuscite dalla ferita.
  6. Avanzare la staffa all'interno del magnete fino a quando il cervello si trova all'isocentro. Verificare che il tubo di infusione e i cavi del monitoraggio fisiologico rimangano liberi da ostruzioni.
  7. Eseguire l'impostazione iniziale dello scanner ed acquisire immagini anatomiche per confermare il corretto posizionamento della cannula.
  8. Dopo aver acquisito le immagini di base, avviare contemporaneamente la pompa di infusione e la scansione dinamica, continuando l'acquisizione per un totale di 3 h (vedere Tabella 1 per i dettagli dell'acquisizione).

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Risultati

La postazione chirurgica è configurata per consentire un posizionamento preciso della trapano per raggiungere il ventricolo laterale (0,7 mm posteriormente e 1,4 mm lateralmente rispetto al bregma; Figura 1A,D). La linea di infusione è composta da una cannula in rame lunga 30 mm, un segmento di tubo PE lungo 2 m e un ago da 30 G collegato a una siringa Hamilton (Figura 1B). La lunghezza estesa del tubo consente di posizionare la pompa per siring...

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Discussione

Il protocollo qui descritto integra la cannulazione ICV con l'infusione durante la risonanza magnetica e l'acquisizione dinamica di immagini mediante MRI, consentendo una valutazione quantitativa dell'intero cervello relativa al trasporto del tracciante nel liquor entro una singola sessione di imaging. I vantaggi, così come i limiti, dell'infusione ICV vanno valutati meglio in confronto con l'infusione ICM. L'infusione ICM evita la cannulazione trans-parenchimatosa ed è pertanto meno invasiva. Tuttavia, poiché la cistern...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Nazionali di Sanità con i numeri di concessione R01NS124206 e RF1AG094791. Il contenuto è sotto l'esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. La Figura 4 è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago ipodermica 30 G x 1 pollice con attacco in plasticaExel26439
Siringa gastight da 50 µL, punta Luer (LT)Hamilton80901
Pinzetta anatomica strettaFine Science Tools11003-12
LCR artificialeTOCRIS3525
Attane Isoflurano 1000 mg/gScanVet55226
Tubicino capillare in rame 0,32 mm OD × 0,16 mm IDNippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
Clip in rameIEUYOFEBA 1801
Tampone di cotonePuritan868-WCS
Dotarem (gadoterato meglumina) iniettabile, 0,5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
TrapanoForedomModel SR
Punta del trapanoFine Science Tools19007-05
PortapuntaStoelting51630
Pinzette mediche DumontFine Science Tools11252-00, 11253-20
Unguento oculareRugbyNDC 0536
Sistema di anestesia E-Z Anesthesia EZ-7000 ClassicE-Z SystemsEZ-7000
Pinzette di GraefeFine Science Tools11052-10,11152-10
Pad riscaldanteBraintree Scientific5381
Kit di cauterizzazione ad alta temperaturaFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamina)Intervet International BV511519
Adesivo in silicone KWIK-SIL, a bassa tossicità, kitWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
Ago monouso da 5/8 di pollice, sterile, 26 GBD305115
Tubulino in polietilene 0,61 mm OD × 0,28 mm IDScandidactSKU252
Rompin Vet 20 mg/mL (xilazina)KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH148999
Lame di bisturiFine Science Tools10023-00
ForbiciFine Science Tools91460-11, 14007-14
SpátolaFine Science Tools10090-13
Strumento stereotassicoStoelting51600U
Pinza per ago chirurgicoAgnTho’s12502-12
Pompa per siringaNew era pump systemNE-4000
Xylocain 20 mg/mL (lidocaina)AstraZeneca158543

Riferimenti

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