Articolo metodologico

Imaging del trasporto del liquido cerebrospinale mediante risonanza magnetica con contrasto via infusione intraventricolare in roditori

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DOI:

10.3791/72175

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28 agosto 2026

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1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo di cannulazione intraventricolare e infusione di tracciante specifico per studi di risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto (DCE-MRI) in roditori. Il protocollo consente una somministrazione continua del tracciante durante l'acquisizione delle immagini, permettendo la mappatura dell'intero cervello per quanto riguarda il trasporto del tracciante e la sua eliminazione dal cervello all'interno di una singola sessione di imaging ininterrotta.

Abstract

La cannulazione intraventricolare (ICV) permette la somministrazione di traccianti esogeni o agenti terapeutici direttamente nel ventricolo laterale, origine del percorso di circolazione del liquido cerebrospinale (CSF). Le molecole infuse vengono trasportate dal flusso convettivo del CSF attraverso i compartimenti ventricolari fino allo spazio subaracnoideo ed entrano successivamente nel parenchima cerebrale attraverso lo spazio perivascolare. Tuttavia, i metodi convenzionali di cannulazione ICV utilizzano tipicamente cannule ferromagnetiche, incompatibili con gli studi di risonanza magnetica (MRI), che richiedono pertanto l'infusione al di fuori dello scanner e la rimozione della cannula prima dell’acquisizione delle immagini. Il tempo necessario per il trasporto dell’animale e la preparazione dell’imaging comporta spesso la perdita della fase iniziale, e probabilmente più critica, del trasporto del tracciante. Di seguito descriviamo un protocollo di cannulazione e infusione ICV compatibile con la MRI per roditori, che consente una somministrazione continua del tracciante direttamente all’interno dello scanner durante l’acquisizione dinamica delle immagini MRI. La linea di infusione è realizzata interamente con materiali non magnetici, consentendo un’acquisizione ininterrotta delle immagini all’interno di una singola sessione. Questo approccio è particolarmente adatto per studi di MRI dinamica con contrasto per l’analisi della dinamica del CSF, del trasporto glinfatico, della clearance dei soluti e della somministrazione intratecale di farmaci.

Introduzione

Il cervello è uno degli organi più metabolicamente attivi e dinamici del corpo, che genera continuamente prodotti di scarto che devono essere rimossi in modo efficiente per mantenere una normale funzione neuronale1. L'accumulo di rifiuti metabolici rappresenta una caratteristica distintiva della neurodegenerazione e dell'invecchiamento cerebrale2. Il sistema glinfatico svolge un ruolo centrale in questo processo di eliminazione, facilitando la rimozione dei sottoprodotti metabolici e dei rifiuti tossici attraverso il flusso di massa del liquido cerebrospinale (CSF) e lo scambio tra CSF e liquido interstiziale (ISF)3,4,5, un processo reso possibile dai canali per l'acqua aquaporina-4 (AQP4) localizzati sui piedini astrocitari6. Una comprensione significativa della dinamica del CSF è stata ottenuta studiando il trasporto di diversi traccianti per il CSF. La risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto (DCE-MRI) mediante agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCA) si presta particolarmente bene alla valutazione su scala cerebrale del trasporto dei traccianti7,8. La rilevanza clinica di questo approccio è stata dimostrata da studi traslazionali nell'uomo. L'amministrazione intratecale di GBCA seguita da risonanze magnetiche seriali è stata utilizzata per valutare la dinamica del CSF nel cervello umano9. Studi successivi hanno dimostrato il trasporto del tracciante su scala cerebrale seguito da una rimozione notturna10. Questo approccio è stato recentemente applicato per rivelare un alterato trasporto periarterioso del tracciante in soggetti con ridotta capacità di riserva pressione-volume intracranica, nonché in pazienti con idrocefalo normoteso idiopatico11. Questi studi stabiliscono la DCE-MRI del trasporto di traccianti nel CSF come un approccio clinicamente traslabile e forniscono un'ulteriore motivazione per lo sviluppo di metodi preclinici rigorosi e riproducibili per indagini meccanicistiche sulla regolazione della dinamica del CSF e sulla rimozione dei rifiuti.

La cannulazione della cisterna magna (ICM) è comunemente utilizzata negli studi sul sistema glinfatico per la somministrazione di traccianti12. Tuttavia, solo circa il 20% degli agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCA) somministrati via questo metodo viene trasportato nel parenchima cerebrale, mentre la maggior parte defluisce direttamente verso il midollo spinale o i linfatici8. Questo approccio comporta inoltre il rischio di danneggiare il cervelletto o il tronco encefalico, e il fissaggio della cannula per studi longitudinali rimane tecnicamente complesso. La cannulazione intraventricolare (ICV) si è affermata come un'alternativa più affidabile13,14,15. Uno studio recente ne ha dimostrato la riproducibilità e i principali vantaggi nella somministrazione di traccianti fluorescenti, inclusa una fissazione stabile della cannula che consente un libero movimento dell'animale e permette iniezioni ripetute di tracciante in studi longitudinali13.

Nonostante questi vantaggi, i protocolli esistenti di cannulazione ICV non sono direttamente compatibili con gli studi di risonanza magnetica16. Poiché la cannulazione ICV richiede la penetrazione del parenchima cerebrale, di solito utilizza cannule ferromagnetiche che generano severi artefatti di suscettibilità nelle immagini di risonanza magnetica. Di conseguenza, l'infusione del tracciante deve essere eseguita al di fuori dello scanner, con la rimozione della cannula prima del trasferimento dell'animale per l'acquisizione delle immagini. Un flusso di lavoro tipico prevede l'acquisizione di una scansione basale, la rimozione dell'animale per la cannulazione e l'infusione del tracciante, e successivamente il riposizionamento dell'animale per scansioni dinamiche successive. Questo flusso di lavoro interrotto esclude la possibilità di un'acquisizione continua e riferita al basale e introduce errori di allineamento dovuti al riposizionamento, che possono compromettere l'analisi cinetica voxel per voxel. Ancor più importante, poiché la fase iniziale di uptake è tipicamente la porzione più dinamica e transitoria della cinetica del tracciante, eseguire il trasferimento dell'animale e la configurazione dello scanner durante questo intervallo comporta la perdita dei dati più informativi.

In questo studio, presentiamo un protocollo che supera queste limitazioni integrando una linea di infusione ICV compatibile con la risonanza magnetica (MRI) e con capacità di somministrazione di un agente di contrasto all'interno dello scanner, consentendo acquisizioni dinamiche continue di MRI in roditori. Questo approccio permette una mappatura quantitativa dell'intero cervello relativa al trasporto del tracciante nel liquido cerebrospinale (CSF) in un'unica sessione di imaging ininterrotta. Il protocollo è particolarmente adatto per lo studio della dinamica del CSF a livello cerebrale, del trasporto glio-linfatico e della cinetica di eliminazione dei soluti. Sebbene qui descritto per ratti adulti, il protocollo può essere adattato per i topi mediante opportuni aggiustamenti delle coordinate di cannulazione e dei parametri di infusione15.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della Case Western Reserve University (A-3145-01-2023-0015), in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e con la Politica del Servizio Sanitario Pubblico sul Trattamento Umano degli Animali da Laboratorio. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della linea di infusione

  1. Tagliare un segmento di 30 mm di cannula di rame e un tratto di 2 m di tubo di polietilene (PE) utilizzando forbici seghettate.
  2. Sotto un microscopio, allargare delicatamente un'estremità del tubo di PE con un ago da 30 G, quindi inserire la cannula di rame nell'estremità allargata e fissare il giunto con colla cianoacrilica. Collegare l'estremità opposta del tubo di PE a un ago da 30 G.
    NOTA: Il rame è altamente duttile; prestare attenzione a non schiacciare il lume durante il taglio. Evitare di deformare la cannula o di forare il tubo durante il montaggio. La lunghezza del tubo di PE deve consentire di posizionare la pompa per siringa al di fuori del campo magnetico periferico dello scanner.
  3. Riempire l'insieme cannula-tubo con soluzione tracciante disgassata e collegarlo a una siringa Hamilton da 50 µL. Avvolgere la punta della siringa con nastro sigillante in politetrafluoroetilene (PTFE) per prevenire perdite. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante questa operazione.
  4. Montare la siringa Hamilton sulla pompa per siringa ed aspirare ulteriori 30 µL di soluzione tracciante nella siringa.

2. Procedura di cannullatura

  1. Pesare il ratto e anestetizzarlo mediante iniezione intraperitoneale di chetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Verificare la profondità adeguata dell’anestesia mediante il riflesso alla pressione sul dito del piede. Integrare con un terzo della dose iniziale se necessario e ricontrollare prima di proseguire.
  2. Rasare la testa e il collo, rimuovere i peli liberi e sterilizzare la cute esposta con tamponi di etanolo al 70%.
  3. Fissare il ratto su un supporto stereotassico e posizionare sotto l’animale un tappetino riscaldante ricoperto con carta assorbente. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l’essiccamento corneale.
  4. Regolare la pinza nasale per livellare il cranio. Praticare un’incisione mediana e retrarre la cute con quattro clip emostatiche per esporre il bregma e il lambda. Applicare perossido di idrogeno al 3% sul cranio per rimuovere il periostio residuo e migliorare la visibilità dei punti di riferimento.
    NOTA: Un livellamento accurato del cranio è fondamentale per un posizionamento riproducibile della cannula. Come misura pratica di controllo qualità, confrontare le coordinate mediolaterali (ML) e dorsoventrali (DV) in corrispondenza del bregma e del lambda: se il cranio è correttamente livellato, la differenza tra i due punti di riferimento non deve superare 0,2 mm in nessuno dei due assi ML o DV.
  5. Montare sul braccio stereotassico il trapano elettrico con una punta fine e assicurarsi che il braccio sia saldamente bloccato.
  6. Posizionare la punta del trapano sul bregma, quindi spostarla di 0,7 mm in posizione posteriore e di 1,4 mm in posizione laterale a destra. Abbassare la punta del trapano fino al contatto con la superficie cranica e registrare la coordinata DV.
  7. Sotto osservazione al microscopio, avanzare il trapano a incrementi di 0,1 mm. Fermarsi immediatamente al momento della perforazione del cranio (lo spessore cranico tipico nei ratti adulti è di 0,3–0,4 mm).
  8. Sostituire il trapano con la cannula precaricata sul braccio stereotassico. Attivare brevemente la pompa di infusione finché un liquido non appare appena all’estremità della cannula, confermando così un percorso libero per il fluido.
  9. Assicurarsi che la cannula sia montata perpendicolarmente alla superficie cranica, quindi allinearla sul foro praticato. Avanzare la cannula a una velocità di 0,1 mm/s fino a una profondità finale obiettivo di 3,5 mm al di sotto della superficie durale.
  10. Applicare una goccia di adesivo tissutale all’interfaccia tra cannula e cranio. Dopo la polimerizzazione, chiudere l’incisione del cuoio capelluto con punti di sutura e piegare delicatamente la cannula di rame parallelamente alla superficie cranica per evitare il contatto con la bobina della risonanza magnetica.

3. Configurazione della risonanza magnetica e acquisizione dinamica

  1. Posizionare la bobina trasmittente di volume all'isocentro dello scanner.
  2. Trasferire l'animale in una staffa compatibile con la risonanza magnetica (MRI) in posizione prona. Collegare il sistema di monitoraggio fisiologico, compreso il sensore respiratorio e la sonda per la temperatura rettale. Accendere il bagno di acqua calda circolante per mantenere la temperatura corporea a circa 37 °C.
  3. Mantenere un'adeguata anestesia per tutta la sessione di scansione utilizzando isoflurano supplementare somministrato via cono nasale. Regolare la concentrazione di isoflurano tra lo 0,25% e l'1,0% per mantenere una frequenza respiratoria di 50–70 atti/min.
    NOTA: L'anestesia con chetamina-xilazina somministrata prima dell'intervento chirurgico di cannulazione garantirà una sedazione residua durante il trasferimento iniziale alla staffa MRI. Introdurre l'isoflurano gradualmente e monitorare continuamente la frequenza respiratoria durante la scansione.
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente volatile che rappresenta un rischio per inalazione; utilizzare un sistema attivo di aspirazione e ridurre al minimo l'esposizione del personale.
  4. Posizionare la pompa di infusione al di fuori del campo magnetico periferico, impostare la velocità di infusione a 1 µL/min e la durata dell'infusione a 20 min, corrispondente a un volume totale di infusione di 20 µL. Disporre e fissare con cura il tubo di infusione lungo la staffa per evitare tensioni e spostamenti.
    ATTENZIONE: Gli oggetti ferromagnetici possono diventare proiettili pericolosi se posizionati vicino a uno scanner MRI. Mantenere tutti gli strumenti non compatibili con la MRI al di fuori del campo periferico.
  5. Montare la bobina a matrice superficiale direttamente sulla parte dorsale del cranio, centrata sul cervello. Posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente tra la bobina e la sede dell'incisione per assorbire eventuali fuoriuscite dalla ferita.
  6. Avanzare la staffa all'interno del magnete fino a quando il cervello si trova all'isocentro. Verificare che il tubo di infusione e i cavi del monitoraggio fisiologico rimangano liberi da ostruzioni.
  7. Eseguire l'impostazione iniziale dello scanner ed acquisire immagini anatomiche per confermare il corretto posizionamento della cannula.
  8. Dopo aver acquisito le immagini di base, avviare contemporaneamente la pompa di infusione e la scansione dinamica, continuando l'acquisizione per un totale di 3 h (vedere Tabella 1 per i dettagli dell'acquisizione).

Risultati

La postazione chirurgica è configurata per consentire un posizionamento preciso della trapano per raggiungere il ventricolo laterale (0,7 mm posteriormente e 1,4 mm lateralmente rispetto al bregma; Figura 1A,D). La linea di infusione è composta da una cannula in rame lunga 30 mm, un segmento di tubo PE lungo 2 m e un ago da 30 G collegato a una siringa Hamilton (Figura 1B). La lunghezza estesa del tubo consente di posizionare la pompa per siringa al di fuori del campo magnetico periferico dello scanner. Dopo la perforazione del foro a trapano, la linea di infusione precaricata viene montata sul braccio stereotassico e la cannula viene avanzata nel ventricolo laterale fino a una profondità di 3,5 mm al di sotto della superficie durale (Figura 1C). Una volta fissata, la cannula viene piegata in posizione parallela alla superficie del cranio per evitare il contatto con la bobina della risonanza magnetica (Figura 1E).

Il successo della cannulazione ICV può essere confermato mediante immagini anatomiche che risolvono chiaramente il sistema ventricolare e il percorso della cannula, consentendo la visualizzazione diretta della punta della cannula all'interno della cavità ventricolare sia in vista sagittale (Figura 2A) che assiale (Figura 2B). Queste immagini permettono anche di escludere animali con posizionamento fuori bersaglio della cannula dagli esami DCE-MRI, inclusi i casi di inserimento insufficiente, in cui la punta termina all'interno del corpo calloso, e di inserimento eccessivo, in cui la punta si estende nel talamo. La distribuzione spaziotemporale del tracciante negli esami DCE-MRI può fornire ulteriore conferma di un posizionamento corretto della cannula, poiché posizionamenti fuori bersaglio rilasciano il tracciante nel parenchima cerebrale, producendo cinetiche non compatibili con la propagazione ventricolare del tracciante.

Per le scansioni DCE-MRI, l'infusione endovenosa di agenti di contrasto viene avviata dopo l'acquisizione del valore basale, e l'acquisizione dinamica delle immagini può durare fino a 3 h o più (Figura 2C). Figura 2D mostra immagini rappresentative pesate in T1 3D acquisite a diversi punti temporali successivi all'infusione dell'agente di contrasto. Al termine dell'infusione di 20 minuti, il potenziamento è già evidente all'interno del ventricolo laterale infuso (controlaterale), nei ventricoli terzo e quarto e nella cisterna magna, indicando una rapida propagazione in massa del tracciante attraverso il percorso ventricolo-sostaracnoideo. Un aumento del segnale è inoltre osservato nel parenchima circostante il ventricolo laterale controlaterale, suggerendo il trasporto del tracciante nei tessuti periventricolari attraverso la membrana ependimale.

Un'analisi più quantitativa del trasporto dell'agente di contrasto può essere ottenuta utilizzando tecniche di mappatura parametrica, come la mappatura di T1 e T2 mediante magnetic resonance fingerprinting (MRF; Figura 3). All'interno dei compartimenti intratecali, T1 diminuisce rapidamente durante l'infusione, propagandosi dal ventricolo laterale controlaterale ai ventricoli terzo e quarto, con la cisterna magna che mostra un lieve ritardo nell'inizio dell'accorciamento di T1. Gli agenti di contrasto somministrati per via ICV mostrano inoltre una penetrazione estesa nel parenchima cerebrale, con le regioni periventricolari (prossimali) che presentano una riduzione di T1 più precoce e marcata, mentre le regioni più distali mostrano una riduzione di T1 ritardata e minore. Con un protocollo di scansione di 3 h, è possibile valutare anche l'eliminazione dell'agente di contrasto dal parenchima cerebrale, analizzando la cinetica del recupero di T1. Nel complesso, questo protocollo consente il monitoraggio dinamico delle fasi principali del trasporto del tracciante nel liquor, inclusa la rapida distribuzione ventricolare, la propagazione intratecale, l'assorbimento parenchimale e la successiva eliminazione, tutto all'interno di una singola sessione continua di risonanza magnetica.

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Figura 1: Impianto chirurgico e assemblaggio della linea di infusione per la cannullatura ICV compatibile con risonanza magnetica. (A) Postazione chirurgica. Un trapano elettrico è posizionato sopra il campo operatorio per la perforazione del foro cranico. (B) Linea di infusione assemblata, costituita da un ago da 30 G (freccia rossa), un segmento di tubo in polietilene da 2 m (freccia verde) e una cannula in rame da 30 mm (freccia blu). (C) Linea di infusione precaricata montata sul braccio stereotassico per l’impianto della cannula. (D) Coordinate per l’impianto della cannula. (E) Aspetto finale prima della chiusura; la cannula in rame è piegata parallelamente alla superficie del cranio per evitare contatti con la bobina della risonanza magnetica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Posizionamento della cannula e monitoraggio dinamico del trasporto dell'agente di contrasto dopo infusione ICV. (A,B) Visualizzazione del posizionamento della cannula (frecce rosse) in immagini anatomiche nelle viste sagittale e assiale, rispettivamente. (C) Schema del protocollo di imaging. (D) Immagini rappresentative pesate in T1 3D in punti temporali selezionati nelle viste sagittale (in alto), assiale (al centro) e coronale (in basso). Barre della scala, 5 mm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Valutazione quantitativa del trasporto del tracciante mediante fingerprinting a risonanza magnetica (MRF). (A) Mappe di T1 (in alto) e T2 (in basso) ricostruite a partire dai dati MRF 3D in determinati punti temporali successivi all'infusione ICV. Barra della scala, 5 mm. (B) Curve temporali medie di T1 nei compartimenti intratecali, inclusi il ventricolo laterale controlaterale (LV), il terzo ventricolo (V3), il quarto ventricolo (V4) e la cisterna magna (CM). La regione grigia ombreggiata indica il periodo di infusione di 20 minuti. (C) Curve temporali medie di T1 nel tessuto parenchimale prossimale e distale rispetto a V4 e al ventricolo laterale controlaterale (LV). Le posizioni delle ROI per le curve temporali sono mostrate in (A). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Schema del trasporto del tracciante nel liquor spinale dopo infusione ICV. (A) Vista sagittale che mostra l'infusione del tracciante tramite Cannula ICV e la sua successiva distribuzione tramite flusso di massa attraverso il sistema ventricolare fino allo spazio subaracnoideo (frecce rosse), nonché il suo trasporto attraverso la membrana ependimale nel parenchima cerebrale adiacente (frecce blu). LV: ventricolo laterale; V3: terzo ventricolo; V3v: terzo ventricolo ventrale; V4: quarto ventricolo; CM: cisterna magna. (B) Schema ingrandito dell'area delimitata dal riquadro in (A) che illustra il percorso di scambio tra LCR e LIE. Il LCR entra nel parenchima lungo lo spazio para-arterioso, favorito dai canali per l'acqua acuaporina-4 (AQP4) espressi sui piedini astrocitari, si sposta mediante flusso convettivo attraverso lo spazio interstiziale ed esce tramite lo spazio paravenoso nella vena di drenaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

ParametriDCE-MRI (3D FLASH)3D MRF
Tipo di sequenza3D FLASH pesato in T13D MRF (stack-of-spirals)
TR / TE (ms)20,0 / 2,710,0 / 2,0
Angolo di flip10°Variabile (programmazione ad angolo di flip variabile)
Preparazione della magnetizzazioneNessunaInversione o preparazione in T2 (6 su 8 segmenti)
Campo di vista36 × 24 × 24 mm³60 × 60 mm² (nel piano); 15 mm (attraverso il piano)
Dimensione della matrice144 × 96 × 96300 × 300 (nel piano); 30 (attraverso il piano)
Risoluzione spaziale0,25 mm isotropo0,2 × 0,2 mm² (nel piano); 0,5 mm (attraverso il piano)
Risoluzione temporale3 min/immagine7 min/immagine
Traiettoria nello spazio-kCartesianaTraiettorie stack-of-spirals; 48 interleaves per campionamento completo
AccelerazioneNessuna (singola media)48 volte (24× nel piano, 2× attraverso il piano)
NotaTutti gli esperimenti di imaging sono stati eseguiti su un sistema Bruker BioSpin 9,4 T operante sulla piattaforma ParaVision 360 v3.4. È stata utilizzata una bobina volumetrica quadratura da 86 mm come trasmettitore e una bobina a matrice superficiale a 4 canali come ricevitore. 

Tabella 1: Parametri di acquisizione della risonanza magnetica.

Discussione

Il protocollo qui descritto integra la cannulazione ICV con l'infusione durante la risonanza magnetica e l'acquisizione dinamica di immagini mediante MRI, consentendo una valutazione quantitativa dell'intero cervello relativa al trasporto del tracciante nel liquor entro una singola sessione di imaging. I vantaggi, così come i limiti, dell'infusione ICV vanno valutati meglio in confronto con l'infusione ICM. L'infusione ICM evita la cannulazione trans-parenchimatosa ed è pertanto meno invasiva. Tuttavia, poiché la cisterna magna si trova a metà del percorso della circolazione del liquor, l'infusione ICM, specialmente a flussi più elevati, può indurre una temporanea inversione del gradiente di pressione che guida la circolazione del liquor17. Ancor più importante, i traccianti somministrati mediante ICM si distribuiscono rapidamente nello spazio subaracnoideo a valle e successivamente nello spazio perivascolare. Sebbene i canali AQP4 ai piedini terminali degli astrociti facilitino lo scambio tra liquor e liquido interstiziale (ISF), questi canali non sono permeabili ai mezzi di contrasto a base di gadolinio (GBCA) a causa delle loro elevate dimensioni molecolari. Di conseguenza, i traccianti somministrati mediante ICM mostrano un potenziamento del contrasto significativamente ridotto nel parenchima rispetto all'infusione ICV15, rendendo l'infusione ICM meno adatta allo studio dell'eliminazione dei soluti dal cervello. L'infusione ICV supera questi limiti erogando i traccianti in prossimità dei siti endogeni di produzione del liquor13,14. Inoltre, i gradienti di pressione e di concentrazione durante l'infusione ICV favoriscono il trasporto diretto dei traccianti attraverso lo strato ependimale13,14,15, permettendo l'utilizzo di questi traccianti come marcatori per l'eliminazione dei rifiuti (Figura 4).

Diversi dettagli tecnici sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. Un livellamento accurato del cranio è essenziale per un posizionamento costante nel ventricolo laterale, poiché il margine di errore nel posizionamento della cannula è molto ridotto a causa delle piccole dimensioni del ventricolo. L'assemblaggio di una linea di infusione libera da ostruzioni e perdite è altrettanto importante. Bolle d'aria o occlusioni parziali possono alterare il profilo di infusione e compromettere l'interpretazione della cinetica iniziale; nel peggiore dei casi, una bolla di grandi dimensioni potrebbe ostruire completamente la linea, causando il fallimento dell'esperimento. I problemi più comuni durante l'allestimento della risonanza magnetica includono perdite all'interfaccia siringa-ago, che possono essere ridotte utilizzando nastro sigillante in PTFE, e tensione sulla linea di infusione durante l'inserimento del supporto, che può essere evitata fissando il tubo al supporto per prevenire trazioni o piegamenti.

Le coordinate target e la profondità di inserimento qui presentate sono state ottimizzate per ratti Wistar di 12 settimane e potrebbero richiedere aggiustamenti per altre età e ceppi. L'infusione ICV può essere eseguita sui topi con opportune modifiche per compensare il minore peso corporeo e le dimensioni ventricolari più ridotte15. La velocità di infusione e il volume totale possono essere regolati in base alle proprietà fisico-chimiche del tracciante, inclusi le dimensioni molecolari e la rilassività; tuttavia, considerando il piccolo volume dei compartimenti ventricolari, velocità di infusione elevate potrebbero aumentare significativamente la pressione ventricolare e pertanto devono essere utilizzate con cautela. Inoltre, la cannula di rame utilizzata nello studio attuale offre la resistenza meccanica necessaria per penetrare la dura madre e attraversare il parenchima in un unico passaggio lineare. Le sue proprietà duttili la rendono anche facile da piegare, un vantaggio nelle configurazioni di bobina con spazio limitato18. Il riscaldamento indotto dalle radiofrequenze è minimo grazie alla breve lunghezza di inserimento della cannula. Tuttavia, un eccessivo degrado del rame può rilasciare ioni di rame liberi che possono causare neurotossicità; pertanto, una cannula di rame è probabilmente inadatta per impianti cronici. Per configurazioni di bobina che possono ospitare una cannula sporgente, cateteri in silice o in PEEK offrono una resistenza meccanica adeguata per l'inserimento, evitando tali problemi di tossicità14,19,20.

L'agente di contrasto utilizzato in questo caso (Gd-DOTA) ha un peso molecolare di 558,65 Da, che è di diversi ordini di grandezza superiore a quello dei soluti metabolici endogeni come il lattato (90 Da) e il glucosio (180 Da), ma molto inferiore rispetto agli aggregati proteici di maggiore interesse nella neurodegenerazione, come i monomeri di amiloide-β (~4,5 kDa) o la proteina tau (~45–65 kDa). Ciò rende i GBCA indicatori ragionevoli per la cinetica di eliminazione dei soluti di piccole dimensioni, ma i risultati ottenuti non devono essere direttamente estesi all'eliminazione di soluti macromolecolari più grandi. Inoltre, poiché i canali per l'acqua AQP4 non sono permeabili ai GBCA, i risultati non possono essere direttamente estesi allo scambio CSF-ISF facilitato da AQP4.

Nello studio attuale, la procedura di cannulazione è stata immediatamente seguita da una sessione di imaging allo scopo di dimostrarne la fattibilità. È importante notare che l’impianto della cannula può indurre una risposta infiammatoria in grado di sopprimere la funzione glinfatica13, e un periodo di attesa di 24 ore permetterebbe il recupero della funzione glinfatica ai livelli basali21. I ricercatori dovrebbero tenere conto di questo fattore quando progettano studi volti a indagare la funzione glinfatica. Inoltre, uno studio precedente ha riportato che l’afflusso di liquido cerebrospinale è maggiore sotto anestesia con chetamina/xilazina rispetto a quella con isoflurano18. Di conseguenza, il presente protocollo utilizza la chetamina/xilazina per l’induzione iniziale. Tuttavia, una singola dose di chetamina/xilazina non è sufficiente a mantenere un’anestesia stabile per tutta la durata combinata del protocollo di cannulazione e imaging. Il regime anestetico qui utilizzato è stato adattato da uno studio precedente che impiegava dexmedetomidina insieme a basse dosi di isoflurano22. Esso rappresenta un compromesso tra il mantenimento della stabilità fisiologica durante un protocollo prolungato e la minimizzazione della soppressione della funzione glinfatica indotta dall’anestesia.

Nonostante i vantaggi, l'infusione ICV presenta alcune limitazioni. Considerando il piccolo volume di liquido cerebrospinale cranico (~300 µL)23, è possibile infondere solo un volume limitato di traccianti. Inoltre, la velocità di infusione (1 µL/min) è paragonabile alla velocità di produzione del liquido cerebrospinale (~1,6 µL/min)23,24; pertanto, è previsto un aumento transitorio della pressione ventricolare durante l'infusione. La riduzione del volume o della velocità di infusione potrebbe attenuare parzialmente questo problema; tuttavia, un volume minore di tracciante potrebbe compromettere la sensibilità di rilevamento, mentre una velocità di infusione più lenta prolungherebbe il tempo totale di infusione senza attenuare completamente l'aumento di pressione. Di conseguenza, è necessario prestare cautela nell'interpretare la dinamica del trasporto del tracciante durante il periodo di infusione, anche se questa limitazione non impedisce una caratterizzazione affidabile delle fasi successive di distribuzione ed eliminazione. Nel complesso, questo protocollo di infusione ICV compatibile con la risonanza magnetica offre una piattaforma pratica e adattabile per acquisire l'intero andamento temporale del trasporto del tracciante nel liquido cerebrospinale in vivo, aprendo nuove prospettive per lo studio della dinamica del liquido cerebrospinale, dell'eliminazione dei soluti e delle alterazioni associate alle malattie.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Nazionali di Sanità con i numeri di concessione R01NS124206 e RF1AG094791. Il contenuto è sotto l'esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. La Figura 4 è stata creata con BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago ipodermica 30 G x 1 pollice con attacco in plasticaExel26439
Siringa gastight da 50 µL, punta Luer (LT)Hamilton80901
Pinzetta anatomica strettaFine Science Tools11003-12
LCR artificialeTOCRIS3525
Attane Isoflurano 1000 mg/gScanVet55226
Tubicino capillare in rame 0,32 mm OD × 0,16 mm IDNippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
Clip in rameIEUYOFEBA 1801
Tampone di cotonePuritan868-WCS
Dotarem (gadoterato meglumina) iniettabile, 0,5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
TrapanoForedomModel SR
Punta del trapanoFine Science Tools19007-05
PortapuntaStoelting51630
Pinzette mediche DumontFine Science Tools11252-00, 11253-20
Unguento oculareRugbyNDC 0536
Sistema di anestesia E-Z Anesthesia EZ-7000 ClassicE-Z SystemsEZ-7000
Pinzette di GraefeFine Science Tools11052-10,11152-10
Pad riscaldanteBraintree Scientific5381
Kit di cauterizzazione ad alta temperaturaFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamina)Intervet International BV511519
Adesivo in silicone KWIK-SIL, a bassa tossicità, kitWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
Ago monouso da 5/8 di pollice, sterile, 26 GBD305115
Tubulino in polietilene 0,61 mm OD × 0,28 mm IDScandidactSKU252
Rompin Vet 20 mg/mL (xilazina)KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH148999
Lame di bisturiFine Science Tools10023-00
ForbiciFine Science Tools91460-11, 14007-14
SpátolaFine Science Tools10090-13
Strumento stereotassicoStoelting51600U
Pinza per ago chirurgicoAgnTho’s12502-12
Pompa per siringaNew era pump systemNE-4000
Xylocain 20 mg/mL (lidocaina)AstraZeneca158543

Riferimenti

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