Un pannello combinato di biomarcatori sierici per la valutazione diagnostica e prognostica nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago

Sommario

Questo studio presenta un flusso di lavoro ambispettivo multicentrico per la misurazione dell'antigene carcinoembrionario sierico, dell'antigene del carcinoma a cellule squamose e dell'antigene carboidrato 125 e per la validazione del loro valore diagnostico e prognostico combinato nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago.

Abstract

​Il carcinoma a cellule squamose dell'esofago rimane difficile da diagnosticare precocemente e da stratificare con precisione prima del trattamento. La stadiazione convenzionale tumore-nodo-metastasi fornisce informazioni anatomiche essenziali ma non riflette pienamente l'eterogeneità biologica circolante. Questo studio osservazionale ambispettivo condotto in due centri ha sviluppato e validato esternamente un pannello combinato di biomarcatori sierici, comprendente antigene carcinoembrionario, antigene del carcinoma a cellule squamose e antigene carboidratico 125, per la discriminazione diagnostica e la valutazione del rischio prognostico nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago. Un totale di 277 partecipanti è stato arruolato presso un ospedale terziario e un centro sanitario comunitario, inclusi 167 pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago, 55 pazienti con malattia esofagea benigna e 55 controlli sani. La coorte dell'ospedale terziario è stata utilizzata per lo sviluppo del modello e la validazione interna, mentre la coorte del centro comunitario è stata impiegata per la validazione esterna. I biomarcatori sierici pretrattamento sono stati misurati prima del trattamento iniziale, trasformati in forma logaritmica, standardizzati utilizzando i parametri della coorte di addestramento ed inseriti in modelli di regressione logistica diagnostica e di Cox proporzionale per il rischio prognostico. Il pannello combinato ha mostrato una maggiore capacità discriminante diagnostica rispetto a ciascun marcatore singolo, con un'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore di 0,869 nella coorte di addestramento e di 0,842 nella coorte di validazione esterna. Un carico biomolecolare combinato più elevato si è associato a una lunghezza del tumore di almeno 5 cm, malattia pT3–4, metastasi linfonodali e stadiazione tumore-nodo-metastasi III–IV. Nell'analisi della sopravvivenza, un elevato carico combinato di biomarcatori ha predetto in modo indipendente una minore sopravvivenza globale e una minore sopravvivenza libera da progressione, dopo aggiustamento per i principali fattori clinico-patologici. Il modello prognostico integrato, che combina il carico di biomarcatori con variabili clinico-patologiche, ha superato lo stadio tumore-nodo-metastasi da solo, con un indice C di 0,792 nella coorte di addestramento e di 0,761 nella validazione esterna. Questi risultati supportano l'utilizzo del pannello sierico composto da antigene carcinoembrionario, antigene del carcinoma a cellule squamose e antigene carboidratico 125 come strumento pratico e non invasivo complementare per la valutazione pretrattamento e la stratificazione individuale del rischio nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago.

Introduzione

Il carcinoma a cellule squamose dell'esofago è un importante sottotipo istologico del cancro dell'esofago e continua a rappresentare un notevole onere clinico nell'Asia orientale, in particolare in Cina¹. Sebbene la diagnosi endoscopica, la valutazione mediante imaging, l'intervento chirurgico, la chemioradioterapia e il trattamento sistemico abbiano migliorato la gestione clinica, la prognosi rimane insoddisfacente per molti pazienti². Un fattore importante è che la malattia viene spesso diagnosticata solo dopo che si è già verificata un'invasione locale o una diffusione linfonodale³. Un altro motivo è che pazienti con lo stesso stadio di classificazione tumore-nodo-metastasi possono comunque differire per risposta al trattamento, rischio di recidiva e outcome di sopravvivenza⁴. Queste differenze indicano che lo stadio anatomico da solo non riesce a descrivere completamente la variabilità biologica del carcinoma a cellule squamose dell'esofago.

La valutazione clinica attuale si basa principalmente sull'endoscopia con biopsia, lo staging radiologico e la valutazione patologica postoperatoria. Questi metodi sono indispensabili, ma presentano limitazioni quando utilizzati per un monitoraggio ripetuto, la stima del rischio pretrattamento o lo screening su larga scala. L'endoscopia è invasiva e meno adatta a controlli frequenti, mentre la tomografia computerizzata e l'ecografia endoscopica possono non rilevare invasioni minime o piccole lesioni metastatiche⁵. I modelli prognostici basati su imaging e approcci molecolari hanno migliorato la previsione del rischio nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago, ma molti richiedono piattaforme specializzate, post-elaborazione delle immagini, sequenziamento del tessuto o flussi di lavoro computazionali non disponibili routine in tutti i laboratori clinici^6,7. Un approccio basato sul sangue a basso costo e ripetibile potrebbe quindi fornire informazioni complementari utili, specialmente quando i clinici necessitano di una stratificazione del rischio pretrattamento prima della terapia definitiva.

I marcatori tumorali sierici sono attraenti in questo contesto perché sono di routine disponibili, minimamente invasivi e facili da ripetere. L'antigene carcinoembrionario riflette il carico tumorale e la differenziazione cellulare anomala, mentre l'antigene del carcinoma a cellule squamose è più strettamente associato alla trasformazione maligna dell'epitelio squamoso⁸. Si è riscontrato che l'antigene carboidrato 125 è collegato all'attività infiammatoria sistemica, al coinvolgimento sieroso e alla progressione della malattia in diverse neoplasie⁹. Questi marcatori non rappresentano lo stesso segnale biologico. Al contrario, potrebbero rilevare dimensioni sovrapposte ma distinte del carico tumorale, del fenotipo squamoso, della risposta sistemica e dell'interazione ospite-tumore. Per questo motivo, un panel combinato potrebbe fornire prestazioni migliori rispetto a un singolo marcatore quando l'obiettivo è identificare il carcinoma a cellule squamose dell'esofago e stimare il rischio clinico¹⁰.

Studi precedenti hanno valutato marcatori tumorali sierici, indicatori infiammatori, firme radiologiche, profili molecolari e modelli prognostici compositi nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago e in altri tumori gastrointestinali correlati^11,12. Tuttavia, molti modelli pubblicati si concentrano esclusivamente sulla diagnosi o sulla prognosi, utilizzano coorti monocentriche, mancano di una validazione esterna indipendente oppure forniscono informazioni limitate riguardo alla trasformazione dei marcatori, alla scelta delle soglie, alla calibrazione e alla riproducibilità del modello. L'elemento di novità del presente studio consiste nello sviluppo di un pratico pannello sierico a tre marcatori, che impiega l'antigene carcinoembrionario, l'antigene del carcinoma a cellule squamose e l'antigene carboidratico 125, misurati di routine, per supportare sia la discriminazione diagnostica sia la stratificazione del rischio prognostico all'interno di un unico flusso di lavoro bicentrico. Il modello è stato sviluppato in una coorte di ospedale terziario e successivamente testato, senza ulteriore ottimizzazione, in una coorte indipendente di un centro comunitario, consentendo così di valutarne la stabilità in diversi contesti clinici.

Questo studio ha sviluppato e validato un pannello combinato di biomarcatori sierici basato sull'antigene carcinoembrionario, sull'antigene del carcinoma a cellule squamose e sull'antigene carboidrato 125. L'analisi ha seguito due obiettivi correlati. Il primo era valutare se il pannello combinato migliorasse la discriminazione diagnostica tra carcinoma a cellule squamose dell'esofago e controlli non maligni rispetto ai singoli marcatori sierici. Il secondo era determinare se il carico combinato di biomarcatori prima del trattamento aggiungesse informazioni prognostiche oltre le variabili clinicopatologiche convenzionali e lo stadio tumor-nodo-metastasi. Questa struttura ha permesso allo studio di valutare se un pannello di biomarcatori sierici di routine potesse funzionare come un ausilio non invasivo alla diagnosi istopatologica, alla valutazione radiologica e allo stadio anatomico nella valutazione clinica pretrattamento.

Protocollo

Questo studio che coinvolge partecipanti umani, cartelle cliniche e campioni di siero è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e i requisiti istituzionali per la ricerca su soggetti umani¹³. Il protocollo dello studio è stato esaminato e approvato dall'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Jiangsu con il numero di approvazione CJ28J12-45. Per i dati clinici anonimi e i campioni di siero residui raccolti in forma retrospettiva, è stata esonerata la richiesta di un consenso informato scritto aggiuntivo, in conformità con le normative etiche istituzionali. Per i campioni raccolti in forma prospettica, è stato ottenuto il consenso informato scritto prima dell'arruolamento. Tutte le informazioni relative ai partecipanti e i campioni di siero sono stati resi anonimi prima dell'analisi. Sono stati utilizzati identificatori di studio per il collegamento dei dati, e nessuna informazione personalmente identificabile è stata inclusa nel set di dati analitici.

Progettazione dello studio e assegnazione del gruppo

Questo studio osservazionale ambispettivo condotto in due centri ha valutato il valore diagnostico e prognostico di un pannello combinato di biomarcatori sierici che include l'antigene carcinoembrionario (CEA), l'antigene del carcinoma a cellule squamose (SCC-Ag) e l'antigene carboidratico 125 (CA125) nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC). I dati retrospettivi sono stati ottenuti da cartelle cliniche idonee e da campioni sierici residui pretrattamento, mentre l'arruolamento prospettico è stato utilizzato per raccogliere ulteriori campioni sierici pretrattamento e completare il follow-up entro lo stesso disegno dello studio. I partecipanti sono stati reclutati da un ospedale terziario e da un centro sanitario comunitario tra gennaio 2021 e dicembre 2024, con il follow-up in corso fino al 31 dicembre 2025. Il centro A, ovvero l'ospedale terziario, ha costituito il gruppo di addestramento per lo sviluppo del modello, la stima dei coefficienti, la selezione delle soglie di cutoff e la validazione interna. Il centro B, ovvero il centro sanitario comunitario, ha funto da coorte di validazione esterna. Lo studio è stato riportato in conformità con le linee guida Transparent Reporting of a multivariable prediction model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD)¹⁴.

Sono stati inclusi complessivamente 277 partecipanti, di cui 194 del Centro A e 83 del Centro B. Il gruppo di addestramento comprendeva 114 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), 40 controlli con malattia esofagea benigna e 40 controlli sani. Il gruppo di validazione esterna comprendeva 53 pazienti con ESCC, 15 controlli con malattia esofagea benigna e 15 controlli sani. È stata utilizzata un'allocazione basata sui centri anziché una suddivisione casuale, al fine di ridurre la dispersione di informazioni e testare la stabilità del modello in un contesto clinico indipendente. L'analisi diagnostica ha confrontato i livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125 tra pazienti con ESCC, pazienti con malattia esofagea benigna e controlli sani. L'analisi prognostica si è limitata ai pazienti con ESCC e ha valutato se il carico combinato di biomarcatori potesse migliorare la stratificazione del rischio per la sopravvivenza globale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS). Il disegno dello studio, lo screening dei partecipanti, l'allocazione dei gruppi, il flusso di lavoro per i biomarcatori sierici, lo sviluppo del modello diagnostico, la validazione esterna e il confronto tra modelli prognostici sono riassunti in Figura 1.

Il flusso dei partecipanti ha incluso screening, esclusioni, raggruppamento diagnostico e assegnazione basata sul centro. Un totale di 326 individui è stato sottoposto a screening. Quarantanove individui sono stati esclusi, tra cui 12 con trattamento antitumorale prima del prelievo del sangue, 8 con un'altra neoplasia primaria, 9 con infezione grave, malattia autoimmune o comorbidità non controllate che potrebbero influenzare i marcatori tumorali sierici, 11 con emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente di siero o intervallo prolungato di lavorazione, e 9 con dati clinici, patologici o di follow-up chiave mancanti. La popolazione finale analitica comprendeva 277 partecipanti: 167 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), 55 controlli con malattia esofagea benigna e 55 controlli sani.

Giustificazione della dimensione del campione

La dimensione del campione è stata determinata dalla disponibilità consecutiva dei partecipanti idonei, dei campioni sierici pretrattamento e delle informazioni di follow-up durante il periodo di studio predeterminato. Il modello diagnostico ha utilizzato tre biomarcatori sierici continui come predittori candidati. Nel gruppo di addestramento, erano disponibili 114 casi di carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e 80 controlli non-ESCC, corrispondenti a 38,0 casi ESCC e 26,7 controlli non-ESCC per ogni predittore biomolecolare candidato. Questo ha permesso una regressione logistica a bassa dimensionalità e ridotto il rischio di overfitting. Il gruppo di convalida esterna comprendeva 53 casi di ESCC e 30 controlli non-ESCC ed è stato utilizzato esclusivamente per la convalida, senza rivalutazione dei coefficienti. La giustificazione della dimensione del campione si allineava ai principi attuali per i modelli predittivi, che enfatizzano la frequenza dell'esito, il numero di parametri predittori candidati, la prestazione attesa del modello e la convalida indipendente, piuttosto che la suddivisione casuale dei dati¹⁵.

Reclutamento dei partecipanti, criteri di idoneità e raccolta dei dati

I partecipanti sono stati arruolati in modo continuativo durante il periodo dello studio. Nel Centro A, i pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC) sono stati reclutati dai reparti di chirurgia toracica, gastroenterologia e oncologia. Nel Centro B, i pazienti con ESCC sono stati identificati tramite screening basato sulla comunità, cartelle di follow-up o percorsi di referral, e sono stati inclusi solo se disponibili conferma istopatologica e campioni sierici pre-trattamento. I controlli con patologie esofagee benigne sono stati reclutati tra soggetti sottoposti a gastroscopia per disfagia, sintomi da reflusso o sospetta anomalia esofagea, e con reperti patologici non maligni. I controlli sani sono stati selezionati tra coloro che si sono sottoposti a esami di routine nello stesso periodo e che non avevano storia di neoplasia, infezioni attive, disfunzione epatica o renale grave, né evidenze radiologiche o endoscopiche di lesioni occupanti spazio nell'esofago.

I pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) erano idonei se presentavano un ESCC primario confermato da biopsia gastroscopica o da esame istopatologico postoperatorio, non avevano ricevuto trattamenti antitumorali prima del prelievo del sangue e disponevano di dati clinici basali completi, referti patologici e campioni di siero pretrattamento. I partecipanti venivano esclusi in caso di altra neoplasia primaria, trattamento antitumorale precedente al prelievo del sangue, infezione acuta grave, malattia autoimmune attiva, comorbidità non controllate che potessero influenzare i livelli sierici dei marcatori tumorali, emolisi visibile, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente di siero, variabili cliniche chiave mancanti o dati di follow-up non disponibili. L’analisi prognostica era limitata ai pazienti con ESCC per i quali era disponibile lo stadio tumor-node-metastasis (TNM) e un esito misurabile di sopravvivenza o di progressione della malattia. I pazienti con un follow-up inferiore a 6 mesi venivano mantenuti nell’analisi se si era verificato decesso o progressione della malattia entro tale periodo.

Le variabili di base includevano età, sesso, storia del fumo, storia del consumo di alcol, indice di massa corporea, centro partecipante, gruppo diagnostico, tipo di lesione e livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125. Per i pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC), ulteriori variabili includevano sede del tumore, lunghezza del tumore, grado di differenziazione istologica, profondità di invasione, stato dei linfonodi, stadio TNM, invasione linfatica e vascolare, modalità di trattamento iniziale, recidiva, progressione, stato di sopravvivenza e data dell'ultimo controllo. La storia del fumo era definita come fumo attuale o precedente consumo regolare di almeno 100 sigarette durante la vita. La storia del consumo di alcol era definita come assunzione di alcol almeno una volta alla settimana per più di 6 mesi. Lo stadio TNM è stato determinato secondo l'ottava edizione del sistema di stadiazione del Comitato Americano Congiunto per il Cancro/Unione Internazionale per la Lotta contro il Cancro (AJCC/UICC) per il carcinoma dell'esofago¹⁶. I preparati istopatologici dei casi di ESCC e di lesioni benigne sono stati revisionati indipendentemente da due patologi esperti, e ogni disaccordo è stato risolto da un terzo patologo.

Due ricercatrici formate hanno estratto in modo indipendente informazioni cliniche dai record medici elettronici, dai referti di anatomia patologica, dai sistemi informativi di laboratorio, dai documenti relativi ai trattamenti, dai record di follow-up e dai registri delle morti, utilizzando un dizionario di dati predeterminato. Le discrepanze sono state risolte verificando i documenti originali, con una terza ricercatrice che ha preso la decisione finale quando necessario. La localizzazione del tumore è stata classificata come esofago toracico superiore, medio o inferiore. Il grado di differenziazione istologica è stato classificato come differenziato, moderatamente differenziato o scarsamente differenziato. Le unità delle variabili continue sono state standardizzate tra i due centri partecipanti prima dell'analisi.

Prelevamento del sangue, lavorazione del siero e misurazione dei biomarcatori

Tutti i campioni di sangue sono stati raccolti prima del trattamento iniziale, entro 7 giorni dalla conferma patologica e almeno 3 giorni prima dell'inizio del trattamento. Sono stati prelevati campioni di sangue venoso periferico di 5–8 mL tra le 7:00 e le 9:00 del mattino, dopo digiuno notturno, utilizzando provette con separatore di siero. Il prelievo è stato rinviato se il partecipante aveva ricevuto una trasfusione di sangue, un'infusione di albumina ad alto volume o un intervento invasivo nelle 72 ore precedenti il prelievo. I campioni sono stati lasciati coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugati a 1.500 × g per 10 minuti. Il siero è stato separato e suddiviso in aliquote in 3–5 provette contrassegnate con codice a barre, con un volume di 300–500 µL per ogni aliquota. Le aliquote sono state conservate a −80°C fino al momento dell'analisi, e nessuna aliquota è stata sottoposta a più di un ciclo di congelamento-scongelamento. Sono stati esclusi i campioni con evidente emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente o intervallo superiore a 2 ore tra il prelievo e il congelamento.

I livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125 sono stati misurati utilizzando sistemi automatizzati di immunodosaggio chemiluminescente, seguendo le istruzioni dei produttori. Gli aliquote sieriche sono state scongelate a 4°C prima dell'analisi, mescolate delicatamente e analizzate in un unico ciclo, ogni volta che possibile. Se era necessario effettuare un'analisi in lotti, l'ordine dei campioni è stato organizzato per evitare un raggruppamento sistematico in base allo stato della malattia, al centro, allo stadio patologico o all'esito del follow-up. I campioni con valori superiori all'intervallo di misurazione analitica sono stati diluiti e ripetuti secondo le istruzioni del reagente. Il personale di laboratorio era all'oscuro del gruppo di appartenenza dei partecipanti, dello stadio patologico, dello stato di trattamento e dell'esito del follow-up.

Le soglie cliniche erano di 5,0 ng/mL per il CEA, 1,5 ng/mL per il SCC-Ag e 35 U/mL per il CA125, in base agli standard del laboratorio locale e agli intervalli di riferimento dei produttori. Queste soglie sono state utilizzate per definire l'aumento dei marcatori e un elevato carico combinato di biomarcatori, al fine di effettuare analisi di associazione clinicopatologica e di stratificazione della sopravvivenza. Per la classificazione diagnostica, sono state selezionate soglie basate sui dati esclusivamente nel gruppo di addestramento utilizzando l'indice di Youden, e successivamente applicate invariati al gruppo di convalida esterna. Prima dell'esecuzione dei test, sono state effettuate la calibrazione dello strumento e il controllo interno della qualità. Ogni giorno di analisi sono stati inclusi controlli ad alto e basso livello, e i test sono proseguiti solo quando i risultati del controllo di qualità rientravano nell'intervallo accettato.

La riproducibilità tra saggi e tra centri è stata valutata prima dell'analisi finale del modello utilizzando aliquote di siero di collegamento analizzate in modo cieco e materiali di controllo di qualità di routine. Un insieme di collegamento costituito da 30 aliquote di siero cieche è stato testato attraverso i due flussi di lavoro di laboratorio. I coefficienti di variazione tra i centri sono stati del 4,8% per il CEA, del 5,6% per il SCC-Ag e del 5,1% per il CA125. I corrispondenti coefficienti di correlazione intraclasse sono stati 0,94 per il CEA, 0,92 per il SCC-Ag e 0,93 per il CA125. Nessuna ricalibrazione specifica del saggio per centro è stata effettuata poiché nessuna deviazione sistematica ha superato l'intervallo predefinito di controllo di qualità del laboratorio. I valori finali dei biomarcatori sono stati armonizzati mediante standardizzazione dell'unità e standardizzazione statistica basata sul gruppo di addestramento prima della costruzione del modello.

Definizione combinata del biomarcatore e costruzione del modello

Il pannello combinato di biomarcatori sierici era composto da CEA, SCC-Ag e CA125. Per l'analisi dell'associazione clinicopatologica e la stratificazione della sopravvivenza secondo Kaplan-Meier, ciascun marcatore è stato classificato come elevato o non elevato in base alla soglia clinica predefinita. Un elevato carico combinato di biomarcatori è stato definito come l'aumento di almeno due dei tre marcatori. Per la modellizzazione diagnostica e prognostica, i tre biomarcatori sono stati mantenuti come variabili continue, trasformati utilizzando il logaritmo naturale e standardizzati mediante la media e la deviazione standard del gruppo di addestramento. Gli stessi parametri di trasformazione sono stati applicati al gruppo di validazione esterna.

I biomarcatori standardizzati e trasformati in log sono stati calcolati utilizzando i seguenti parametri della coorte di addestramento:

zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71

zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0,28)/0,57

zlnCA125 = (lnCA125 - 3,05)/0,62

Il pannello diagnostico combinato è stato costruito utilizzando una regressione logistica multivariata nel gruppo di addestramento. Il predittore lineare diagnostico è stato calcolato come segue:

LPdiagnostic = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag+0.42 × zlnCA125

La probabilità predetta individuale di ESCC è stata calcolata come segue:

PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)

Il valore soglia diagnostico ottimale per il pannello combinato è stato 0,57, selezionato nella coorte di addestramento utilizzando l'indice di Youden e applicato invariato nella validazione esterna.

Il punteggio prognostico basato sui biomarcatori è stato costruito utilizzando un modello di rischio proporzionale di Cox. Il modello basato esclusivamente sullo stadio TNM è stato utilizzato come riferimento per lo staging anatomico. Il modello basato sui biomarcatori ha utilizzato il carico combinato di biomarcatori. Il modello clinicopatologico ha incluso età, lunghezza del tumore, grado di differenziazione istologica, stadio pT, stato dei linfonodi e modalità di trattamento iniziale. Il modello integrato ha aggiunto al modello clinicopatologico un elevato carico combinato di biomarcatori. Per la sopravvivenza globale (OS), il predittore lineare prognostico integrato è stato calcolato come segue:

LPOS = 0.33 × età ≥65 anni + 0,36 × lunghezza del tumore ≥5 cm + 0,25 × scarsa differenziazione + 0,31 × pT3

- 4stadio + 0,66 × metastasi linfonodale

-0,58 × intervento chirurgico radicale - trattamento basato

+0,81 × highcombinedbiomarkerburden

Per il PFS, il predittore lineare prognostico integrato è stato calcolato come segue:

LPPFS = 0.27 × età ≥ 65 anni + 0.31 × lunghezza del tumore ≥ 5 cm  + 0.24 × scarsa differenziazione + 0.25 × pT3

-4stadio + 0,55 × metastasi linfonodale

- 0,46 × trattamento basato su chirurgia radicale

+0,71 × highcombinedbiomarkerburden

Tutte le variabili binarie nelle equazioni prognostiche sono state codificate come 1 se presenti e 0 se assenti. Tutti i coefficienti, i parametri di standardizzazione e le soglie sono stati stimati nel gruppo di addestramento e applicati direttamente al gruppo di validazione esterna senza riottimizzazione.

Endpoint diagnostici e prognostici

La diagnosi patologica è stata utilizzata come standard di riferimento diagnostico. L'endpoint diagnostico primario era la discriminazione tra carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e controlli non ESCC, inclusi disturbi esofagei benigni e controlli sani. Gli endpoint diagnostici secondari includevano la discriminazione tra ESCC e malattia esofagea benigna, tra ESCC e controlli sani, e tra ESCC in stadio precoce e controlli non maligni. L'ESCC in stadio precoce è stato definito come malattia allo stadio I–II secondo la classificazione TNM. Le prestazioni diagnostiche sono state valutate mediante curve caratteristiche operative del ricevitore, area sotto la curva, sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo, accuratezza, punteggio F1, curve precisione-ricordo, curve di calibrazione, punteggi di Brier, intercette di calibrazione, pendenze di calibrazione e analisi delle curve decisionali.

L'analisi prognostica è stata condotta esclusivamente nei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC). L'endpoint prognostico primario era la sopravvivenza globale (OS), definita come l'intervallo tra la data del primo trattamento antitumorale definitivo e il decesso per qualsiasi causa. L'endpoint prognostico secondario era la sopravvivenza libera da progressione della malattia (PFS), definita come l'intervallo tra il primo trattamento e la progressione documentata della malattia, la ricaduta o il decesso. Nei pazienti sottoposti a chirurgia radicale, la ricaduta locale, la metastasi a distanza o il decesso correlato al tumore sono stati considerati eventi PFS qualora non fosse presente lesione residua dopo l'intervento. Nei pazienti sottoposti a chemioradioterapia definitiva o a trattamento palliativo, la progressione è stata determinata in base ai reperti di imaging, alla valutazione endoscopica e alla valutazione clinica.

I dati di follow-up sono stati ottenuti tramite visite ambulatoriali, cartelle di ricovero ospedaliero, cartelle di follow-up comunitario, referti di invio e contatti telefonici. I pazienti sono stati seguiti ogni 3 mesi durante i primi 2 anni dopo il trattamento, ogni 6 mesi dal terzo al quinto anno e annualmente successivamente. I pazienti senza decesso, recidiva o progressione alla data finale del follow-up sono stati censurati alla loro ultima data di contatto confermata. Gli eventi relativi all'esito sono stati revisionati indipendentemente da due ricercatori. Quando le date degli eventi differivano tra le fonti, sono stati verificati i referti di imaging, le cartelle di dimissione, i referti endoscopici, i documenti di invio e i registri anagrafici delle morti per determinare la data finale dell'evento. La data limite per il follow-up è stata il 31 dicembre 2025 per entrambi i centri partecipanti.

Analisi statistica

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando R 4.3.2 e SPSS 27.0. Le variabili continue sono state riassunte come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile), a seconda della distribuzione. Le variabili categoriche sono state riassunte come frequenze e percentuali. I confronti tra gruppi sono stati effettuati mediante il test t per campioni indipendenti, il test U di Mann-Whitney, l'analisi della varianza a un fattore, il test di Kruskal-Wallis, il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher, secondo le indicazioni. I dati mancanti sono stati valutati prima della costruzione del modello. I partecipanti con stato diagnostico chiave, valori dei biomarcatori pretrattamento, stadio TNM o dati sugli esiti di sopravvivenza/progressione mancanti sono stati esclusi in base ai criteri di idoneità predeterminati. Le covariate non chiave con dati mancanti inferiori al 5,0% sono state gestite mediante imputazione multipla tramite equazioni concatenate, con 20 set di dati imputati e 20 iterazioni¹⁷. I modelli di imputazione includevano gruppo diagnostico, centro, età, sesso, storia del fumo, consumo di alcol, valori dei biomarcatori, stadio TNM, modalità di trattamento, stato di OS, stato di PFS e tempo di follow-up. Sono state eseguite analisi su casi completi come analisi di sensibilità.

Il modello diagnostico è stato sviluppato nel gruppo di addestramento. Le curve caratteristiche operative del ricevitore sono state utilizzate per calcolare l'area sotto la curva, la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo, il valore predittivo negativo, l'accuratezza e il punteggio F1. Le aree sotto la curva sono state confrontate utilizzando il test di DeLong¹⁸. Le curve precisione-richiamo sono state utilizzate come valutazione diagnostica supplementare. La calibrazione è stata valutata mediante curve di calibrazione, punteggi di Brier, intercette di calibrazione e pendenze di calibrazione. L'utilità clinica è stata valutata mediante l'analisi della curva decisionale¹⁹. La validazione interna è stata effettuata utilizzando 1.000 ricampionamenti bootstrap per stimare la discriminazione e la calibrazione corrette per l'ottimismo. La validazione esterna è stata effettuata applicando direttamente al Centro B l'equazione del gruppo di addestramento, i parametri di standardizzazione e la soglia, senza ulteriore adattamento.

Per l'analisi prognostica, sono state generate curve di Kaplan-Meier per confrontare la sopravvivenza globale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS) tra i gruppi in base al carico di biomarcatori, e il test log-rank è stato utilizzato per valutare le differenze nella sopravvivenza. È stata impiegata la regressione di Cox per stimare i rapporti di rischio (hazard ratios) e gli intervalli di confidenza al 95%. Le variabili clinicamente rilevanti e quelle associate agli esiti nell'analisi univariata sono state considerate per i modelli multivariabili. Le prestazioni del modello sono state valutate mediante l'indice C di Harrell, curve ROC dipendenti dal tempo, curve di calibrazione, punteggi di Brier e analisi della curva decisionale²⁰. La calibrazione prognostica è stata valutata a 1, 3 e 5 anni. L'assunzione di proporzionalità dei rischi è stata verificata mediante i residui di Schoenfeld e i grafici di sopravvivenza log-minus-log²¹. I valori P globali del test di Schoenfeld erano pari a 0,42 per il modello OS e a 0,37 per il modello PFS. La multicollinearità è stata valutata mediante i fattori di inflazione della varianza prima dell'interpretazione finale del modello; tutte le variabili candidate nei modelli diagnostici e prognostici finali presentavano fattori di inflazione della varianza inferiori a 2,1. Il valore prognostico aggiuntivo rispetto allo stadio TNM e ai modelli clinicopatologici convenzionali è stato valutato mediante il miglioramento netto della classificazione (net reclassification improvement) e il miglioramento integrato della discriminazione (integrated discrimination improvement). I parametri del modello stimati nel gruppo di addestramento sono stati applicati al gruppo di validazione esterna senza ulteriore aggiustamento²². Tutti i test erano a due code e un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Flusso dei partecipanti e riproducibilità del saggio

Sono stati sottoposti a screening complessivamente 326 individui, dei quali 49 sono stati esclusi: 12 avevano ricevuto un trattamento antitumorale prima del prelievo del sangue, 8 presentavano un'altra neoplasia primaria, 9 avevano infezione grave, malattia autoimmune o comorbidità non controllate che potrebbero influenzare i marcatori tumorali sierici, 11 avevano emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente di siero o intervallo prolungato di lavorazione, e 9 presentavano dati clinici, patologici o di follow-up chiave mancanti. La popolazione analitica finale comprendeva 277 partecipanti: 167 pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC), 55 pazienti con malattia esofagea benigna e 55 controlli sani. Il Centro A ha contribuito con 194 partecipanti alla coorte di addestramento, mentre il Centro B ha contribuito con 83 partecipanti alla coorte di validazione esterna. Il flusso dei partecipanti, l'assegnazione delle coorti, il flusso operativo del test dei biomarcatori, lo sviluppo del modello diagnostico, la validazione esterna e il framework di modellizzazione prognostica sono illustrati in Figura 1, mentre i dettagli relativi allo screening e alle esclusioni sono riportati in Tabella Supplementare 1.

La riproducibilità tra test e tra centri è stata valutata utilizzando 30 aliquote sieriche di collegamento in cieco. I coefficienti di variazione tra centri sono stati del 4,8% per l'antigene carcinoembrionale (CEA), del 5,6% per l'antigene del carcinoma a cellule squamose (SCC-Ag) e del 5,1% per l'antigene carboidrato 125 (CA125). I corrispondenti coefficienti di correlazione intraclasse sono stati rispettivamente 0,94, 0,92 e 0,93. Nessuna ricalibrazione specifica per centro è stata necessaria prima della standardizzazione statistica e dello sviluppo del modello. I risultati sulla riproducibilità del test sono riportati nella Tabella Supplementare 2.

Caratteristiche basali della popolazione in studio

L'età mediana dell'intera popolazione era di 59 anni (IQR, 53–66 anni) e 198 partecipanti (71,5%) erano di sesso maschile. L'uso attuale o pregresso del fumo è stato riportato da 141 partecipanti (50,9%) e l'uso attuale o pregresso di alcol da 127 partecipanti (45,8%). La coorte comprendeva 167 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (CECS) (60,3%), 55 pazienti con malattia esofagea benigna (19,9%) e 55 controlli sani (19,9%). I livelli mediani sierici di CEA, SCC-Ag e CA125 erano rispettivamente di 3,9 ng/mL (IQR, 2,0–6,6 ng/mL), 1,4 ng/mL (IQR, 0,8–2,3 ng/mL) e 22,8 U/mL (IQR, 13,9–35,7 U/mL). Età, sesso, storia del fumo, consumo di alcol, gruppo diagnostico e livelli sierici basali dei biomarcatori erano comparabili tra le coorti di addestramento e di validazione esterna (Tabella 1).

Tra i 167 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), l'età mediana era di 61 anni (IQR, 55–68 anni) e 133 pazienti (79,6%) erano di sesso maschile. I tumori si localizzavano più frequentemente nell'esofago toracico medio (89/167, 53,3%), seguito dall'esofago toracico inferiore (56/167, 33,5%) e dall'esofago toracico superiore (22/167, 13,2%). I tumori moderatamente differenziati e scarsamente differenziati rappresentavano rispettivamente 81 casi (48,5%) e 66 casi (39,5%). La lunghezza del tumore era di almeno 5 cm in 68 pazienti (40,7%), la malattia pT3–4 era presente in 121 pazienti (72,5%), la metastasi linfonodale in 100 pazienti (59,9%) e la stadiazione III–IV secondo il sistema tumore-nodo-metastasi (TNM) era osservata in 111 pazienti (66,5%). L'invasione linfatica e vascolare era stata identificata in 65 pazienti (38,9%). Il trattamento primario consisteva in chirurgia radicale con o senza terapia adiuvante in 113 pazienti (67,7%), chemioradioterapia definitiva in 32 pazienti (19,2%) e trattamento sistemico palliativo o di supporto in 22 pazienti (13,2%). Le principali variabili clinicopatologiche erano comparabili tra i gruppi di addestramento e di validazione esterna per l'ESCC (Tabella 2).

Distribuzione multidimensionale dei biomarcatori sierici tra i gruppi di studio

Le distribuzioni del CEA, dell'SCC-Ag e del CA125 sierici differivano tra i pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), i controlli con malattia esofagea benigna e i controlli sani (Figura 2). Dopo trasformazione logaritmica, tutti e tre i biomarcatori mostravano livelli più elevati nel gruppo ESCC rispetto ai due gruppi non maligni. Il livello mediano di CEA era di 5,2 ng/mL nei pazienti con ESCC, rispetto a 2,4 ng/mL nei controlli con malattia esofagea benigna e 1,9 ng/mL nei controlli sani. Il livello mediano di SCC-Ag era di 1,9 ng/mL nei pazienti con ESCC, rispetto a 0,9 ng/mL e 0,7 ng/mL negli altri gruppi. Il livello mediano di CA125 era di 28,9 U/mL nei pazienti con ESCC, rispetto a 18,7 U/mL e 16,1 U/mL negli altri gruppi. Le distribuzioni dei biomarcatori sierici specifiche per gruppo sono riassunte nella Tabella Supplementare 3.

CEA e SCC-Ag hanno mostrato una separazione più chiara tra ESCC e controlli non maligni rispetto a CA125. Nella distribuzione bidimensionale di CEA e SCC-Ag trasformati in logaritmo, i campioni di ESCC erano più spesso concentrati nella regione a valori più elevati, mentre i controlli sani si raggruppavano più frequentemente nella regione a valori più bassi. Un elevato carico combinato di biomarcatori, definito come aumento di almeno due dei tre marcatori, è stato osservato in 61 dei 167 pazienti con ESCC (36,5%), in 8 dei 55 controlli con malattia esofagea benigna (14,5%) e in 4 dei 55 controlli sani (7,3%). La distribuzione del carico elevato di biomarcatori differiva in modo significativo tra i tre gruppi (P < 0,001), come riportato anche nella Tabella Supplementare 3.

Sviluppo della firma diagnostica combinata nella coorte di addestramento

La firma diagnostica combinata è stata sviluppata nel gruppo di addestramento utilizzando i valori di CEA, SCC-Ag e CA125 sottoposti a trasformazione logaritmica (Figura 3). L'analisi della correlazione a coppie ha mostrato correlazioni positive moderate tra i tre marcatori. La correlazione più forte è stata osservata tra CEA e SCC-Ag (r = 0.58), seguita da quella tra SCC-Ag e CA125 (r = 0.47) e tra CEA e CA125 (r = 0.41), risultati che supportano una modellizzazione congiunta senza considerare i marcatori come misurazioni intercambiabili.

Nella regressione logistica univariata, CEA, SCC-Ag e CA125 erano ciascuno associati allo stato di carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), con odds ratio rispettivamente di 2,81, 3,94 e 2,14. Nel modello diagnostico multivariato, SCC-Ag ha mostrato l'effetto aggiustato maggiore (OR, 2,87; IC 95%, 1,62–5,09; P < 0,001), seguito da CEA (OR, 1,80; IC 95%, 1,19–2,72; P = 0,006) e da CA125 (OR, 1,52; IC 95%, 1,03–2,25; P = 0,034). I coefficienti del modello diagnostico sono riassunti nella Tabella Supplementare 4. Il predittore lineare diagnostico finale era:

LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag + 0,42 × zlnCA125

La probabilità predetta individuale di ESCC è stata calcolata come:

PESCC = 1/1 + exp( -LPdiagnostic )

La distribuzione di probabilità prevista dal modello diagnostico combinato ha mostrato una separazione tra partecipanti con ESCC e non-ESCC. Il valore soglia ottimale era 0,57. A questo valore soglia, il modello combinato ha raggiunto un'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore (AUC) di 0,869 (IC 95%, 0,817–0,921), con un valore predittivo positivo del 85,8% e un valore predittivo negativo del 73,0% nella coorte di addestramento.

Prestazioni diagnostiche e validazione esterna del panello combinato di biomarcatori

Nel gruppo di addestramento, l'antigene SCC ha mostrato la performance diagnostica più elevata tra i tre biomarcatori singoli, con un AUC di 0,802 (IC 95%, 0,735–0,869). Gli AUC per CEA e CA125 sono stati rispettivamente di 0,711 (IC 95%, 0,635–0,786) e 0,668 (IC 95%, 0,591–0,744). Il panel combinato ha raggiunto la discriminazione complessiva più alta, con un AUC di 0,869 (IC 95%, 0,817–0,921), una sensibilità del 79,8%, una specificità dell'81,2%, un valore predittivo positivo dell'85,8%, un valore predittivo negativo del 73,0%, un'accuratezza dell'80,4% e un punteggio F1 del 82,7% (Tabella 3).

Le curve ROC hanno confermato una maggiore capacità diagnostica del pannello combinato rispetto ai singoli biomarcatori (Figura 4A). Al valore soglia ottimale di 0,57, il pannello combinato ha mostrato una sensibilità del 79,8% e una specificità dell'81,2%. L'AUC del pannello combinato era significativamente più alta rispetto a quella dell'SCC-Ag da solo (P = 0,032). La validazione interna mediante bootstrap con 1.000 ricampionamenti ha mostrato un'AUC corretta per l'ottimismo di 0,856, una pendenza di calibrazione corretta per l'ottimismo di 0,97 e un punteggio di Brier corretto per l'ottimismo di 0,154. Le stime della validazione interna sono riportate in Tabella supplementare 4.

Nel gruppo di validazione esterna, l'analisi precisione-richiamo ha mostrato la precisione media più elevata per distinguere l'ESCC dai controlli sani (AP = 0,912; Figura 4B). La precisione media era di 0,863 per ESCC rispetto a non-ESCC e di 0,841 per ESCC rispetto alle malattie esofagee benigne. La precisione media per l'ESCC in stadio precoce rispetto ai controlli non maligni era di 0,535. L'analisi di calibrazione ha mostrato un accordo tra le probabilità previste e gli esiti osservati in entrambi i gruppi (Figura 4C). Il punteggio di Brier era di 0,148, con una pendenza di calibrazione di 1,02 e un'intercetta di 0,01 nel gruppo di addestramento. Nel gruppo di validazione esterna, il punteggio di Brier era di 0,164 con una pendenza di calibrazione di 0,93 e un'intercetta di calibrazione di −0,04. L'analisi della curva decisionale ha mostrato un beneficio netto maggiore per il pannello combinato rispetto alle strategie "tratta-tutti" e "non-trattare-nessuno" per la maggior parte delle soglie di probabilità (Figura 4D).

I risultati della validazione esterna sono riassunti nella Tabella 4. Il pannello combinato ha ottenuto un AUC di 0,842 (IC 95%, 0,753–0,930) per ESCC rispetto a non-ESCC, con una sensibilità del 75,5%, una specificità del 76,7%, un'accuratezza del 75,9%, un punteggio di Brier di 0,164, una pendenza di calibrazione di 0,93 e un beneficio netto di 0,218 a una probabilità soglia di 0,30. Gli AUC sono stati rispettivamente di 0,801 (IC 95%, 0,686–0,916) per ESCC rispetto alle malattie esofagee benigne, di 0,889 (IC 95%, 0,800–0,979) per ESCC rispetto ai controlli sani e di 0,818 (IC 95%, 0,704–0,932) per l'ESCC in stadio precoce rispetto ai controlli non maligni. La specificità più alta è stata osservata per ESCC rispetto ai controlli sani (86,7%), mentre per l'ESCC in stadio precoce rispetto ai controlli non maligni si è registrata una sensibilità del 70,6% e una specificità del 78,3%.

Profilo di associazione clinicopatologica del pannello combinato di biomarcatori nell'ESCC

L'associazione tra l'aumento dei biomarcatori sierici e le caratteristiche clinicopatologiche è stata valutata nei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (Tabella 5). L'età e il sesso hanno mostrato una limitata associazione con l'aumento individuale dei biomarcatori. I pazienti di età pari o superiore a 65 anni presentavano una proporzione maggiore di elevato carico combinato di biomarcatori rispetto ai pazienti di età inferiore a 65 anni (47,6% contro 29,8%; P = 0,028), mentre il sesso non era associato all'aumento individuale dei biomarcatori né al carico combinato di biomarcatori.

Le variabili legate al tumore hanno mostrato associazioni più forti con l'aumento dei biomarcatori. Un elevato carico combinato di biomarcatori era presente nel 50,0% dei pazienti con lunghezza del tumore pari almeno a 5 cm, rispetto al 27,3% dei pazienti con lunghezza del tumore inferiore a 5 cm (P = 0,004). Un elevato carico combinato di biomarcatori era inoltre più frequente nei pazienti con scarsa differenziazione rispetto a quelli con differenziazione buona o moderata (50,0% contro 28,2%; P = 0,006), nei pazienti con malattia pT3–4 rispetto a quelli con malattia pT1–2 (42,1% contro 21,7%; P = 0,011), nei pazienti con metastasi linfonodali rispetto a quelli senza metastasi linfonodali (43,0% contro 26,9%; P = 0,038) e nei pazienti con stadio TNM III–IV rispetto a quelli con stadio TNM I–II (43,2% contro 23,2%; P = 0,009).

La visualizzazione a livello del paziente ha mostrato che punteggi di rischio combinati più elevati erano associati a caratteristiche clinicopatologiche più avanzate (Figura 5A). I pazienti con punteggi più alti venivano classificati più frequentemente come pT3–4, con linfonodi positivi, scarsamente differenziati o allo stadio TNM III–IV. L'analisi del boxplot ha mostrato una distribuzione verso l'alto dei biomarcatori nei pazienti con maggiore lunghezza del tumore, scarso differenziamento, malattia pT3–4, positività dei linfonodi e stadio TNM III–IV (Figura 5B). Il diagramma di Sankey ha mostrato che i pazienti con due o tre biomarcatori elevati venivano più spesso classificati allo stadio TNM III–IV, mentre i pazienti senza biomarcatori elevati venivano più spesso classificati allo stadio TNM I–II (Figura 5C). L'associazione tra il carico combinato di biomarcatori e la distribuzione dello stadio TNM era statisticamente significativa (P < 0,001).

Stratificazione prognostica basata sul panel combinato di biomarcatori sierici

Il tempo mediano di follow-up per i pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è stato di 34 mesi. Durante il follow-up, sono stati registrati 78 decessi e 96 eventi di sopravvivenza libera da progressione. I dettagli relativi al follow-up e agli eventi sono riassunti nella Tabella Supplementare 5. Un elevato carico combinato di biomarcatori è risultato associato a esiti di sopravvivenza peggiori. Nella regressione di Cox univariabile, un elevato carico combinato di biomarcatori è risultato associato a un aumentato rischio di morte (HR, 2,91; IC 95%, 1,89–4,46; P < 0,001) e di progressione o morte (HR, 2,63; IC 95%, 1,80–3,84; P < 0,001). Dopo aggiustamento per età, lunghezza del tumore, grado di differenziazione, stadio pT, metastasi linfonodali e modalità di trattamento, un elevato carico combinato di biomarcatori è rimasto indipendentemente associato alla sopravvivenza globale (OS; HR, 2,24; IC 95%, 1,41–3,54; P = 0,001) e alla sopravvivenza libera da progressione (PFS; HR, 2,03; IC 95%, 1,35–3,05; P = 0,001). Al contrario, livelli elevati di CEA, SCC-Ag e CA125 non sono risultati più statisticamente significativi quando inclusi singolarmente nei modelli multivariabili. I risultati della regressione di Cox sono riassunti nella Tabella 6.

L'analisi di Kaplan-Meier ha mostrato una chiara separazione tra i gruppi con carico elevato e ridotto di biomarcatori combinati (Figura 6A,B). La sopravvivenza mediana (OS) è stata di 38 mesi nel gruppo a basso carico e di 19 mesi nel gruppo ad alto carico (log-rank P < 0,001). La sopravvivenza libera da progressione mediana (PFS) è stata di 28 mesi nel gruppo a basso carico e di 13 mesi nel gruppo ad alto carico (log-rank P < 0,001). Il modello prognostico integrato ha mostrato una maggiore capacità discriminatoria dipendente dal tempo rispetto allo stadio TNM da solo (Figura 6C), con AUC di 0,829, 0,806 e 0,781 a 1, 3 e 5 anni, rispettivamente, rispetto a 0,701, 0,676 e 0,648 per lo stadio TNM da solo. Il miglioramento dell'indice C rispetto allo stadio TNM da solo è stato di 0,130 nella coorte di addestramento e di 0,120 nella coorte di validazione esterna. La mappa termica di riferimento del follow-up ha mostrato un aumento della mortalità cumulativa tra i diversi strati di rischio (Figura 6D). Nel terzile a basso rischio, le probabilità di mortalità cumulativa erano del 6%, 12%, 24%, 37% e 52% a 6, 12, 24, 36 e 60 mesi, rispettivamente. Le probabilità corrispondenti erano del 14%, 26%, 44%, 59% e 74% nel terzile a rischio intermedio e del 28%, 47%, 68%, 82% e 91% nel terzile ad alto rischio.

Convalida esterna e utilità prognostica incrementale del modello integrato

Il modello integrato ha mostrato la maggiore capacità prognostica di discriminazione tra i modelli valutati in entrambe le coorti. Nella coorte di addestramento, l'indice C era 0,792 per il modello integrato, rispetto a 0,736 per il modello clinicopatologico, 0,703 per il pannello di biomarcatori da solo e 0,662 per lo stadio TNM da solo. Nella coorte di convalida esterna, l'indice C per il modello integrato era 0,761, rispetto a 0,708, 0,681 e 0,641 per gli altri modelli. Anche le AUC dipendenti dal tempo hanno favorito il modello integrato. Nella coorte di addestramento, il modello integrato ha raggiunto valori di AUC pari a 0,829, 0,806 e 0,781 a 1, 3 e 5 anni, rispettivamente. Nella coorte di convalida esterna, le corrispondenti AUC erano 0,801, 0,774 e 0,748. Rispetto allo stadio TNM da solo, il modello integrato ha mostrato un NRI di +0,274 e un IDI di +0,102. La convalida interna con metodo bootstrap ha mostrato un indice C corretto per l'ottimismo pari a 0,779 per il modello integrato. Le metriche di prestazione del modello sono presentate nella Tabella 7, e ulteriori risultati di convalida prognostica sono forniti nella Tabella Supplementare 5.

Il grafico di confronto tra modelli ha mostrato il valore più alto dell'indice C di Harrell per il modello integrato in entrambi i cohorti (Figura 7A). Il nomogramma includeva età, lunghezza del tumore, grado di differenziazione istologica, stadio pT, stato dei linfonodi, modalità di trattamento iniziale e alto carico combinato di biomarcatori per stimare le probabilità di sopravvivenza globale (OS) a 1, 3 e 5 anni (Figura 7B). Nel cohort di validazione esterna, le curve di calibrazione per la sopravvivenza globale a 1, 3 e 5 anni si sono avvicinate alla linea di riferimento ideale (Figura 7C). I punteggi di Brier sono stati rispettivamente 0.141, 0.164 e 0.178, con pendenze di calibrazione pari a 0.97, 0.93 e 0.91. L'analisi della curva decisionale ha mostrato che il modello integrato presentava un beneficio netto maggiore rispetto allo stadio TNM da solo, al modello clinicopatologico e alle strategie di trattare tutti o nessuno nell'intervallo principale di probabilità soglia (Figura 7D). A una probabilità soglia di 0,30, il beneficio netto era di 0,181 per il modello integrato, rispetto a 0,139 per il modello clinicopatologico e 0,117 per lo stadio TNM da solo. Questi risultati relativi alla calibrazione e alla curva decisionale sono riassunti nella Tabella Supplementare 5.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I set di dati generati e analizzati durante questo studio sono disponibili pubblicamente nel repository Figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33154580.v1.

Figura 1: Progettazione dello studio e flusso analitico. Schema riassuntivo dello screening dei partecipanti, dell'assegnazione alla coorte, della misurazione dei biomarcatori sierici, dello sviluppo del modello diagnostico, della validazione esterna e della costruzione del modello prognostico. Il Centro A ha funto da coorte di addestramento, mentre il Centro B ha funto da coorte di validazione esterna. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Distribuzione dei biomarcatori sierici CEA, SCC-Ag e CA125 nei diversi gruppi dello studio. (A) Grafici a violino e a scatola con baffi che mostrano i livelli logaritmicamente trasformati dei biomarcatori sierici nei pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC), nei controlli con malattie esofagee benigne e nei controlli sani. (B) Distribuzione bivariata dei valori logaritmicamente trasformati di CEA e SCC-Ag. (C) Grafico a ragnatela che riassume il profilo combinato dei biomarcatori nei diversi gruppi diagnostici. (D) Distribuzione del carico di biomarcatori elevati nei diversi gruppi diagnostici. CEA = antigene carcinoembrionario; SCC-Ag = antigene del carcinoma a cellule squamose; CA125 = antigene carboidrato 125; ESCC = carcinoma a cellule squamose dell'esofago. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Sviluppo della firma diagnostica combinata nella coorte di addestramento. (A) Mappa termica di correlazione dei valori di CEA, SCC-Ag e CA125 trasformati in logaritmo. (B) Risultati della regressione logistica univariata e multivariata per i singoli biomarcatori e per il modello diagnostico combinato. (C) Distribuzione delle probabilità predette per i partecipanti con ESCC e non-ESCC basata sul modello diagnostico combinato. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Prestazioni diagnostiche e validazione esterna del pannello combinato di biomarcatori. (A) Curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che confrontano singoli biomarcatori e il pannello combinato nella coorte di addestramento. (B) Curve precisione-richiamo nei diversi scenari di validazione esterna. (C) Grafici di calibrazione per le coorti di addestramento e di validazione esterna. (D) Analisi della curva decisionale che mostra il beneficio netto in funzione delle probabilità soglia. ROC = curva caratteristica operativa del ricevitore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Profilo di associazione clinicopatologica del pannello combinato di biomarcatori nel carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC). (A) Panoramica a livello individuale dei punteggi di rischio combinati, dei livelli sierici dei biomarcatori e delle caratteristiche clinicopatologiche. (B) Diagrammi a scatola che mostrano la distribuzione dei biomarcatori tra i principali sottogruppi clinicopatologici. (C) Diagramma di Sankey che illustra la relazione tra l'elevato carico di biomarcatori e lo stadio TNM. TNM = tumore-nodo-metastasi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Stratificazione prognostica basata sul carico combinato di biomarcatori. (A) Curve di Kaplan-Meier per la sopravvivenza globale in base al carico combinato di biomarcatori. (B) Curve di Kaplan-Meier per la sopravvivenza libera da progressione in base al carico combinato di biomarcatori. (C) Curve caratteristiche operative del ricevitore dipendenti dal tempo, che confrontano il modello integrato con lo stadio TNM da solo. (D) Mappa termica che mostra le probabilità cumulative di mortalità attraverso i terzili di rischio e i punti temporali di follow-up. OS = sopravvivenza globale; PFS = sopravvivenza libera da progressione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Convalida esterna e traduzione clinica del modello prognostico integrato. (A) Confronto dell'indice C di Harrell tra i modelli prognostici nei cohort di addestramento e di convalida esterna. (B) Nomogramma che incorpora età, lunghezza del tumore, differenziazione istologica, stadio pT, stato dei linfonodi, modalità di trattamento iniziale e alto carico combinato di biomarcatori per stimare la sopravvivenza globale a 1, 3 e 5 anni. (C) Grafici di calibrazione per la convalida esterna della sopravvivenza globale a 1, 3 e 5 anni. (D) Analisi della curva decisionale per confrontare il modello integrato con lo stadio TNM da solo, il modello clinicopatologico e le strategie di trattare tutti o nessuno. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Variabile	Totale (n = 277)	Cohorte di addestramento, Centro A (n = 194)	Cohorte di validazione esterna, Centro B (n = 83)	Valore P
Età, anni, mediana (IQR)	59 (53–66)	59 (52–65)	60 (54–67)	0.284
Sesso maschile, n (%)	198 (71,5)	137 (70,6)	61 (73,5)	0,622
Fumatore attuale o ex fumatore, n (%)	141 (50,9)	95 (49,0)	46 (55,4)	0,321
Consumo attuale o pregresso di alcol, n (%)	127 (45,8)	87 (44,8)	40 (48,2)	0,603
Gruppo diagnostico, n (%)				0,701
CSEEC	167 (60,3)	114 (58,8)	53 (63,9)
Malattia esofagea benigna	55 (19,9)	40 (20,6)	15 (18,1)
Controlli sani	55 (19,9)	40 (20,6)	15 (18,1)
CEA sierica, ng/mL, mediana (IQR)	3,9 (2,0–6,6)	3,8 (1,9–6,4)	4,1 (2,1–6,8)	0,367
SCC-Ag sierico, ng/mL, mediana (IQR)	1,4 (0,8–2,3)	1,4 (0,8–2,2)	1,5 (0,9–2,4)	0,418
CA125 sierico, U/mL, mediana (IQR)	22,8 (13,9–35,7)	22,4 (13,5–34,9)	23,6 (14,6–36,8)	0,447

Tabella 1: Caratteristiche basali dei partecipanti nei cohort di addestramento e di validazione esterna. Sono riassunte le caratteristiche demografiche, la composizione dei cohort e i livelli sierici basali di CEA, SCC-Ag e CA125 per l'intera popolazione, il cohort di addestramento e il cohort di validazione esterna.

Variabile	ESCC complessivo (n = 167)	Cohorte di addestramento (n = 114)	Cohorte esterna di validazione (n = 53)	Valore P
Età, anni, mediana (IQR)	61 (55–68)	61 (55–67)	62 (56–68)	0.386
Sesso maschile, n (%)	133 (79,6)	91 (79,8)	42 (79,2)	0.931
Fumatore attuale o ex fumatore, n (%)	110 (65,9)	74 (64,9)	36 (67,9)	0.701
Consumo attuale o pregresso di alcol, n (%)	95 (56,9)	66 (57,9)	29 (54,7)	0.688
Localizzazione del tumore, n (%)				0.879
Toracico superiore	22 (13,2)	15 (13,2)	7 (13,2)
Toracico medio	89 (53,3)	60 (52,6)	29 (54,7)
Toracico inferiore	56 (33,5)	39 (34,2)	17 (32,1)
Differenziazione istologica, n (%)				0.944
Bene differenziato	20 (12,0)	14 (12,3)	6 (11,3)
Moderatamente differenziato	81 (48,5)	56 (49,1)	25 (47,2)
Scarso differenziamento	66 (39,5)	44 (38,6)	22 (41,5)
Lunghezza del tumore ≥5 cm, n (%)	68 (40,7)	45 (39,5)	23 (43,4)	0.621
Stadio pT3–4, n (%)	121 (72,5)	82 (71,9)	39 (73,6)	0.821
Metastasi linfonodale, n (%)	100 (59,9)	68 (59,6)	32 (60,4)	0.924
Stadio TNM III–IV, n (%)	111 (66,5)	75 (65,8)	36 (67,9)	0.785
Invasione linfatica e vascolare, n (%)	65 (38,9)	42 (36,8)	23 (43,4)	0.404
Modalità di trattamento primario, n (%)				0.753
Chirurgia radicale ± terapia adiuvante	113 (67,7)	79 (69,3)	34 (64,2)
Chemioradioterapia definitiva	32 (19,2)	21 (18,4)	11 (20,8)
Trattamento sistemico/supportivo palliativo	22 (13,2)	14 (12,3)	8 (15,1)

Tabella 2: Caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) nei cohorti di addestramento e di validazione esterna. Sono riportati il confronto per sede del tumore, differenziazione istologica, lunghezza del tumore, stadio pT, stato linfonodale, stadio TNM, invasione linfatica e vascolare e modalità di trattamento primario tra i pazienti con ESCC nei cohorti di addestramento e di validazione esterna.

Modello	Valore soglia ottimale	AUC (IC 95%)	Sensibilità (%)	Specificità (%)	Valore predittivo positivo (%)	Valore predittivo negativo (%)	Precisione (%)	Punteggio F1 (%)
CEA	4.85 ng/mL	0.711 (0.635–0.786)	58.8	76.2	77.9	56.6	66.2	67.1
SCC-Ag	1.52 ng/mL	0.802 (0.735–0.869)	70.2	78.8	82.5	65.6	73.8	76.1
CA125	31.8 U/mL	0.668 (0.591–0.744)	44.7	82.5	78.5	52.4	60.3	57
Pannello combinato	0.57	0.869 (0.817–0.921)	79.8	81.2	85.8	73	80.4	82.7

Tabella 3: Accuratezza diagnostica dei singoli biomarcatori e del pannello combinato di biomarcatori sierici nella coorte di addestramento. Le prestazioni diagnostiche sono riportate utilizzando il cutoff ottimale, l'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore, la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo, il valore predittivo negativo, l'accuratezza e il punteggio F1.

Confronto	AUC (IC 95%)	Sensibilità, %	Specificità, %	Accuratezza, %	Punteggio di Brier	Pendenza di calibrazione	Beneficio netto alla probabilità soglia 0,30
ESCC vs non-ESCC	0.842 (0.753–0.930)	75.5	76.7	75.9	0.164	0.93	0.218
ESCC vs malattia esofagea benigna	0.801 (0.686–0.916)	73.6	73.3	73.5	0.171	0.9	0.196
ESCC vs controlli sani	0.889 (0.800–0.979)	77.4	86.7	79.5	0.122	0.97	0.252
ESCC in stadio precoce vs controlli non maligni	0.818 (0.704–0.932)	70.6	78.3	76.3	0.153	0.89	0.173

Tabella 4: Validazione esterna delle prestazioni diagnostiche del pannello combinato di biomarcatori sierici. Le prestazioni del modello sono riassunte in quattro scenari diagnostici: ESCC rispetto a non-ESCC, ESCC rispetto a malattie esofagee benigne, ESCC rispetto a controlli sani e ESCC in fase precoce rispetto a controlli non maligni.

Caratteristica	Categoria	CEA elevato (n %)	SCC-Ag elevato (n %)	CA125 elevato (n %)	Alto carico combinato (n %)	P per CEA	P per SCC-Ag	P per CA125	P per carico combinato
Età	<65 anni (n = 104)	40 (38,5)	54 (51,9)	29 (27,9)	31 (29,8)	0,129	0,108	0,151	0,028
	≥65 anni (n = 63)	32 (50,8)	41 (65,1)	25 (39,7)	30 (47,6)
Sesso	Femmina (n=34)	13 (38,2)	17 (50,0)	13 (38,2)	12 (35,3)	0,513	0,367	0,402	0,871
	Maschio (n = 133)	59 (44,4)	78 (58,6)	41 (30,8)	49 (36,8)
Lunghezza del tumore	<5 cm (n = 99)	35 (35,4)	49 (49,5)	24 (24,2)	27 (27,3)	0,015	0,021	0,009	0,004
	≥5 cm (n = 68)	37 (54,4)	46 (67,6)	30 (44,1)	34 (50,0)
Differenziazione	Buona/moderata (n = 103)	38 (36,9)	52 (50,5)	27 (26,2)	29 (28,2)	0,018	0,032	0,027	0,006
	Scarso (n=64)	34 (53,1)	43 (67,2)	27 (42,2)	32 (50,0)
Stadio pT	pT1–2 (n = 46)	13 (28,3)	20 (43,5)	9 (19,6)	10 (21,7)	0,016	0,028	0,036	0,011
	pT3–4(n = 121)	59 (48,8)	75 (62,0)	45 (37,2)	51 (42,1)
Stato linfonodale	Negativo (n = 67)	21 (31,3)	31 (46,3)	15 (22,4)	18 (26,9)	0,012	0,025	0,021	0,038
	Positivo (n = 100)	51 (51,0)	64 (64,0)	39 (39,0)	43 (43,0)
Stadio TNM	I–II (n = 56)	16 (28,6)	25 (44,6)	11 (19,6)	13 (23,2)	0,008	0,021	0,014	0,009
	III–IV (n= 111)	56 (50,5)	70 (63,1)	43 (38,7)	48 (43,2)

Tabella 5: Associazioni tra l'aumento dei biomarcatori sierici e le caratteristiche clinicopatologiche nei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC). Le proporzioni di CEA elevato, SCC-Ag elevato, CA125 elevato e alto carico combinato di biomarcatori sono confrontate tra sottogruppi demografici e legati al tumore.

Variabile	HR univariata per OS (IC 95%)	Valore P	HR multivariata per OS (IC 95%)	Valore P	HR univariata per PFS (IC 95%)	Valore P	HR multivariata per PFS (IC 95%)	Valore P
Età ≥65 anni	1.52 (1.01–2.31)	0.046	1.39 (0.90–2.14)	0.138	1.41 (0.97–2.06)	0.074	1.31 (0.88–1.95)	0.186
Sesso maschile	1.18 (0.67–2.08)	0.566	—	—	1.13 (0.69–1.84)	0.632	—	—
Lunghezza del tumore ≥5 cm	1.89 (1.25–2.86)	0.003	1.44 (0.93–2.23)	0.103	1.76 (1.22–2.55)	0.003	1.36 (0.92–2.01)	0.122
Scarso grado di differenziazione	1.63 (1.07–2.47)	0.024	1.29 (0.84–1.99)	0.245	1.58 (1.09–2.28)	0.016	1.27 (0.86–1.87)	0.228
Stadio pT3–4	2.04 (1.19–3.49)	0.009	1.36 (0.76–2.44)	0.304	1.92 (1.18–3.11)	0.009	1.29 (0.77–2.18)	0.335
Metastasi linfonodale	2.46 (1.50–4.03)	<0.001	1.94 (1.15–3.28)	0.013	2.12 (1.37–3.28)	0.001	1.73 (1.08–2.79)	0.023
Trattamento basato su chirurgia radicale	0.43 (0.28–0.65)	<0.001	0.56 (0.36–0.88)	0.012	0.51 (0.35–0.74)	<0.001	0.63 (0.43–0.94)	0.024
CEA elevata	1.88 (1.24–2.85)	0.003	1.34 (0.86–2.10)	0.199	1.71 (1.18–2.49)	0.005	1.26 (0.84–1.88)	0.267
SCC-Ag elevato	1.95 (1.25–3.03)	0.003	1.29 (0.80–2.08)	0.302	1.82 (1.22–2.72)	0.004	1.25 (0.81–1.93)	0.315
CA125 elevato	1.79 (1.16–2.78)	0.009	1.21 (0.76–1.93)	0.421	1.68 (1.13–2.50)	0.011	1.18 (0.77–1.82)	0.446
Elevato carico combinato di biomarcatori	2.91 (1.89–4.46)	<0.001	2.24 (1.41–3.54)	0.001	2.63 (1.80–3.84)	<0.001	2.03 (1.35–3.05)	0.001

Tabella 6: Analisi di regressione Cox univariata e multivariata per la sopravvivenza complessiva e la sopravvivenza libera da progressione. Sono riportati i rapporti di rischio (hazard ratios) e gli intervalli di confidenza al 95% per le variabili clinicopatologiche, l'aumento individuale dei biomarcatori e l'elevato carico combinato di biomarcatori.

Modello	C-index del gruppo di addestramento	AUC a 1 anno del gruppo di addestramento	AUC a 3 anni del gruppo di addestramento	AUC a 5 anni del gruppo di addestramento	C-index della validazione esterna	AUC a 1 anno della validazione esterna	AUC a 3 anni della validazione esterna	AUC a 5 anni della validazione esterna	NRI rispetto a TNM	IDI rispetto a TNM
Solo stadio TNM	0.662	0.701	0.676	0.648	0.641	0.672	0.651	0.628	—	—
Solo pannello di biomarcatori	0.703	0.744	0.713	0.689	0.681	0.709	0.687	0.666	0.118	0.049
Modello clinicopatologico	0.736	0.772	0.748	0.721	0.708	0.741	0.719	0.694	0.153	0.061
Modello integrato	0.792	0.829	0.806	0.781	0.761	0.801	0.774	0.748	0.274	0.102

Tabella 7: Prestazioni predittive di diversi modelli prognostici nelle coorti di addestramento e di validazione esterna. L'indice C di Harrell, l'area sotto la curva dipendente dal tempo, il miglioramento netto della riclassificazione e il miglioramento integrato della discriminazione sono confrontati tra lo stadio TNM da solo, il pannello di biomarcatori da solo, il modello clinicopatologico e il modello integrato.

Tabella supplementare 1: Selezione, esclusione dei partecipanti e assegnazione finale del gruppo di studio. Vengono riassunti i numeri relativi alla selezione, le motivazioni delle esclusioni, la popolazione finale analizzata, la distribuzione per gruppo diagnostico e l'assegnazione dei gruppi per centro. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Riproducibilità tra saggi e tra centri nella misurazione dei biomarcatori sierici. I risultati dei test su aliquote sieriche analizzate in cieco sono riassunti mediante coefficienti di variazione tra centri e coefficienti di correlazione intraclasse per CEA, SCC-Ag e CA125.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 3: Distribuzione dei biomarcatori sierici e carico combinato di biomarcatori nei gruppi diagnostici. Vengono riassunte le distribuzioni specifiche per gruppo dei biomarcatori sierici CEA, SCC-Ag e CA125, nonché la proporzione di soggetti con elevato carico combinato di biomarcatori, nei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), nei controlli con malattie esofagee benigne e nei controlli sani.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 4: Coefficienti del modello diagnostico e validazione interna con metodo bootstrap. Sono riassunti l'intercetta del modello diagnostico, i coefficienti dei biomarcatori, le stime di regressione logistica univariata e multivariata, la soglia stabilita sul gruppo di addestramento, il numero di ricampionamenti bootstrap, l'area sotto la curva corretta per l'ottimismo, la pendenza della curva di calibrazione e il punteggio di Brier.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella Supplementare 5: Risultati del follow-up, mortalità in punti temporali prefissati, calibrazione e analisi delle curve decisionali per la validazione prognostica. Sono riassunti la durata del follow-up, gli eventi di sopravvivenza, la sopravvivenza globale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS) mediana per gruppo di carico biomolecolare; il miglioramento dell'indice C; l'indice C corretto per l'ottimismo; le probabilità cumulative di mortalità in punti temporali prefissati; i punteggi Brier della validazione esterna; le pendenze di calibrazione; e le stime del beneficio netto delle curve decisionali.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Questo studio multicentrico ha sviluppato e validato esternamente un pannello combinato di biomarcatori sierici che integra CEA, SCC-Ag e CA125 per la valutazione diagnostica e prognostica nell'ESCC. Il pannello combinato ha superato ciascun singolo biomarcatore nella capacità di distinguere l'ESCC dai controlli non maligni e ha mantenuto una discriminazione accettabile nella coorte di validazione esterna. Questo risultato è in linea con studi precedenti sull'ESCC che hanno dimostrato come i marcatori tumorali sierici possano fornire informazioni diagnostiche e prognostiche clinicamente rilevanti, anche se le prestazioni di un singolo marcatore sono spesso limitate dall'overlap biologico tra condizioni maligne e non maligne^23,24. Il principale contributo di questo studio consiste quindi nello sviluppo di un flusso di lavoro riproducibile basato su tre marcatori, che integra diagnosi pretrattamento, correlazione clinico-patologica e stratificazione della sopravvivenza in un unico schema analitico.

Il miglioramento delle prestazioni del pannello combinato è biologicamente plausibile perché CEA, SCC-Ag e CA125 riflettono processi legati al tumore in modo parzialmente diverso. SCC-Ag è strettamente associato alla malignità dell'epitelio squamoso e ha mostrato le migliori prestazioni diagnostiche singole in questa coorte. CEA potrebbe riflettere il carico tumorale, il fenotipo invasivo e l'attività maligna sistemica, mentre CA125 potrebbe cogliere segnali infiammatori più ampi, sierosali o legati a malattia avanzata, piuttosto che aspetti specifici della biologia del carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC)^25,26. Le correlazioni moderate tra i tre biomarcatori suggeriscono che i marcatori fossero correlati ma non ridondanti, a sostegno di un modellamento congiunto piuttosto che del ricorso a una singola misurazione circolante.

Un elevato carico combinato di biomarcatori era associato a tumori di maggiori dimensioni, malattia pT3–4, metastasi linfonodali e stadio TNM III–IV, indicando che il panello rilevava un segnale più complesso rispetto a un semplice risultato diagnostico binario. Questo schema è clinicamente rilevante poiché lo stadio anatomico rimane centrale nella gestione del carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), ma i pazienti appartenenti allo stesso stadio possono comunque differire per aggressività tumorale, carico sistemico e outcome di sopravvivenza²⁷. Un profilo sierico di biomarcatori potrebbe quindi contribuire a perfezionare la valutazione del rischio pretrattamento, in particolare quando i clinici necessitano di informazioni aggiuntive prima di interventi chirurgici, chemioradioterapia definitiva, trattamenti sistemici o un follow-up più intensivo. Nell’analisi della sopravvivenza, un elevato carico combinato di biomarcatori è rimasto indipendentemente associato a una peggiore sopravvivenza globale (OS) e sopravvivenza libera da progressione (PFS) dopo aggiustamento per le principali variabili clinico-patologiche, e il modello integrato ha mostrato un indice C e AUC dipendenti dal tempo superiori rispetto allo stadio TNM considerato isolatamente²⁸.

Rispetto ai modelli basati su imaging, radiomica, espressione genica o modelli multi-omici, il presente pannello presenta vantaggi pratici ma un ambito biologico più ristretto. I modelli di radiomica e trascrittomica possono catturare l'eterogeneità spaziale, le caratteristiche del microambiente tumorale e i sottotipi molecolari, e alcuni di essi hanno mostrato prestazioni prognostiche promettenti nel carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC)^29,30. Tuttavia, questi approcci spesso richiedono protocolli di imaging standardizzati, pipeline computazionali avanzate, campioni tissutali di alta qualità, piattaforme di sequenziamento o un supporto bioinformatico specializzato. Al contrario, CEA, SCC-Ag e CA125 vengono misurati regolarmente in molti laboratori clinici, sono relativamente economici e possono essere ripetuti durante il follow-up. Il valore clinico del presente pannello risiede quindi nella sua accessibilità e nella compatibilità con i flussi di lavoro esistenti, piuttosto che nella capacità di sostituire l'imaging, la patologia, il profilo molecolare o la stadiazione TNM.

Le analisi di calibrazione e della curva decisionale supportano una traduzione clinica cauta. Il modello diagnostico combinato ha mostrato una calibrazione accettabile sia nel gruppo di addestramento che in quello di validazione esterna, e l'analisi della curva decisionale ha indicato un beneficio netto positivo in intervalli di soglia clinicamente rilevanti. Anche il modello prognostico integrato ha mostrato un miglioramento nella discriminazione e una calibrazione accettabile nella validazione esterna. Questi risultati sono importanti perché modelli con elevata discriminazione potrebbero comunque essere mal calibrati o clinicamente non utili³¹. Riportando AUC, indice C, calibrazione, punteggi di Brier e risultati della curva decisionale, questo studio fornisce una valutazione più completa delle prestazioni del modello rispetto a studi basati esclusivamente su metriche di discriminazione o rapporti di rischio.

Vanno riconosciuti diversi limiti. Sebbene lo studio abbia incluso una validazione esterna, quest'ultima si è limitata a due centri e il gruppo di validazione era più piccolo rispetto al gruppo di addestramento. I valori dei biomarcatori sono stati misurati soltanto al basale pretrattamento, pertanto non sono state valutate le variazioni longitudinali durante la terapia neoadiuvante, la chemioradioterapia, il monitoraggio postoperatorio o il controllo delle recidive, anche se le tendenze seriali dei marcatori tumorali potrebbero fornire ulteriori informazioni prognostiche³². Il pannello sierico non è stato confrontato direttamente con la radiomica, l'espressione genica, il DNA tumorale circolante o altri modelli di biopsia liquida nella stessa popolazione di pazienti, e possono verificarsi falsi positivi in caso di condizioni infiammatorie, benigne o con comorbilità. In sintesi, il pannello sierico combinato di CEA, SCC-Ag e CA125 ha mostrato un migliore potere discriminatorio diagnostico rispetto ai singoli biomarcatori, si è associato a caratteristiche clinico-patologiche sfavorevoli e ha migliorato la stratificazione prognostica quando aggiunto alle variabili cliniche convenzionali. Sono necessarie ulteriori validazioni multicentriche, valutazioni seriali dei biomarcatori e confronti diretti con modelli basati su imaging e modelli molecolari prima di un'implementazione clinica routinaria.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Calibratori Access CEA	Beckman Coulter	33205	Calibrazione per il saggio del CEA sierico
Controllo qualità Access CEA	Beckman Coulter	33029	Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del CEA sierico
Pacchetto reagenti Access CEA	Beckman Coulter	33200	Misurazione del CEA sierico sul sistema di immunodosaggio UniCel DxI 800 Access
Pipetta microlitrica regolabile, 100–1000 µL	Eppendorf	3123000063	Aliquotatura del siero dopo centrifugazione
Calibratori ARCHITECT CA 125 II	Abbott Diagnostics	02K4502	Calibrazione per il saggio del CA125 sierico
Controlli ARCHITECT CA 125 II	Abbott Diagnostics	02K4511	Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del CA125 sierico
Kit reagenti ARCHITECT CA 125 II	Abbott Diagnostics	02K4529	Misurazione del CA125 sierico sull'analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR
Analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR	Abbott Diagnostics	i2000SR	Piattaforma automatizzata per immunodosaggio chemiluminescente con microparticelle per test SCC-Ag e CA125
Calibratore ARCHITECT SCC	Abbott Diagnostics	8D1801	Calibrazione per il saggio del SCC-Ag sierico
Controlli ARCHITECT SCC	Abbott Diagnostics	8D1810	Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del SCC-Ag sierico
Kit reagenti ARCHITECT SCC	Abbott Diagnostics	8D1828	Misurazione del SCC-Ag sierico sull'analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR
Stampante etichette a codice a barre	Brady	BMP51	Etichettatura a codice a barre di aliquote di siero e provette criogeniche
Ago per prelievo del sangue	BD Biosciences	367286	Prelievo di sangue venoso periferico
Contenitore criogenico per stoccaggio	Corning	431131	Stoccaggio organizzato di aliquote di siero congelate
Provetta criogenica, 2,0 mL, filettatura esterna, autoportante	Corning	430659	Stoccaggio di aliquote di siero etichettate a codice a barre a −80 °C
Modulo per l'estrazione dei dati e dizionario dati predefinito	Gruppo dello studio	Non applicabile	Estrazione standardizzata di variabili cliniche, patologiche, di laboratorio e di follow-up
Pacchetto dcurves	Pacchetto R	Versione 0.4.0	Analisi della curva decisionale e stima del beneficio clinico netto
Sistema cartelle cliniche elettroniche	Ospedali partecipanti	Non applicabile	Estrazione di dati demografici, clinici, terapeutici e di follow-up
Punte filtrate per pipetta, 100–1000 µL	Eppendorf	30073594	Aliquotatura del siero controllata per contaminazione
Pacchetto ggplot2	Pacchetto R	Versione 3.5.1	Visualizzazione statistica e preparazione di figure
IBM SPSS Statistics	IBM	Versione 27.0	Confronti alla baseline e verifica statistica supplementare
Sistema di gestione delle informazioni di laboratorio	Laboratorio dell'ospedale partecipante	Non applicabile	Recupero e collegamento dei referti dei test sui biomarcatori sierici
Pacchetto mice	Pacchetto R	Versione 3.16.0	Imputazione multipla mediante equazioni concatenate
Pacchetto nricens	Pacchetto R	Versione 1.6	Analisi del miglioramento della riclassificazione netta
Sistema di refertazione anatomopatologica	Ospedali partecipanti	Non applicabile	Conferma della diagnosi di carcinoma esofageo a cellule squamose, patologia benigna, caratteristiche del tumore e variabili relative allo stadio
Pacchetto pROC	Pacchetto R	Versione 1.18.5	Analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) e confronto di DeLong
Software statistico R	Fondazione R per il Calcolo Statistico	Versione 4.3.2	Analisi statistica, costruzione e validazione del modello, generazione di figure
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5810 R	Separazione del siero mediante centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti
Pacchetto rms	Pacchetto R	Versione 6.8-1	Analisi di calibrazione, costruzione di nomogrammi e supporto al modello di regressione
Tubo per prelievo del sangue con separazione del siero, 5 mL	BD Biosciences	367955	Prelievo di sangue venoso periferico a digiuno per il test dei biomarcatori sierici
Pacchetto survival	Pacchetto R	Versione 3.5-7	Regressione di Cox a rischi proporzionali e analisi della sopravvivenza
Pacchetto survminer	Pacchetto R	Versione 0.4.9	Visualizzazione della curva di Kaplan–Meier
Modulo per registrazione del follow-up telefonico	Gruppo dello studio	Non applicabile	Raccolta e verifica delle informazioni su sopravvivenza, recidiva, progressione e ultima data di contatto
Pacchetto timeROC	Pacchetto R	Versione 0.4	Analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) dipendente dal tempo
Freezer a temperatura ultra-bassa	Thermo Fisher Scientific	TSX60086A	Stoccaggio di aliquote di siero a −80 °C
Sistema di immunodosaggio UniCel DxI 800 Access	Beckman Coulter	DxI 800	Piattaforma automatizzata per immunodosaggio chemiluminescente per il test del CEA sierico