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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Questo studio presenta un flusso di lavoro ambispettivo multicentrico per la misurazione dell'antigene carcinoembrionario sierico, dell'antigene del carcinoma a cellule squamose e dell'antigene carboidrato 125 e per la validazione del loro valore diagnostico e prognostico combinato nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago.
Il carcinoma a cellule squamose dell'esofago rimane difficile da diagnosticare precocemente e da stratificare con precisione prima del trattamento. La stadiazione convenzionale tumore-nodo-metastasi fornisce informazioni anatomiche essenziali ma non riflette pienamente l'eterogeneità biologica circolante. Questo studio osservazionale ambispettivo condotto in due centri ha sviluppato e validato esternamente un pannello combinato di biomarcatori sierici, comprendente antigene carcinoembrionario, antigene del carcinoma a cellule squamose e antigene carboidratico 125, per la discriminazione diagnostica e la valutazione del rischio prognostico nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago. Un totale di 277 partecipanti è stato arruolato presso un ospedale terziario e un centro sanitario comunitario, inclusi 167 pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago, 55 pazienti con malattia esofagea benigna e 55 controlli sani. La coorte dell'ospedale terziario è stata utilizzata per lo sviluppo del modello e la validazione interna, mentre la coorte del centro comunitario è stata impiegata per la validazione esterna. I biomarcatori sierici pretrattamento sono stati misurati prima del trattamento iniziale, trasformati in forma logaritmica, standardizzati utilizzando i parametri della coorte di addestramento ed inseriti in modelli di regressione logistica diagnostica e di Cox proporzionale per il rischio prognostico. Il pannello combinato ha mostrato una maggiore capacità discriminante diagnostica rispetto a ciascun marcatore singolo, con un'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore di 0,869 nella coorte di addestramento e di 0,842 nella coorte di validazione esterna. Un carico biomolecolare combinato più elevato si è associato a una lunghezza del tumore di almeno 5 cm, malattia pT3–4, metastasi linfonodali e stadiazione tumore-nodo-metastasi III–IV. Nell'analisi della sopravvivenza, un elevato carico combinato di biomarcatori ha predetto in modo indipendente una minore sopravvivenza globale e una minore sopravvivenza libera da progressione, dopo aggiustamento per i principali fattori clinico-patologici. Il modello prognostico integrato, che combina il carico di biomarcatori con variabili clinico-patologiche, ha superato lo stadio tumore-nodo-metastasi da solo, con un indice C di 0,792 nella coorte di addestramento e di 0,761 nella validazione esterna. Questi risultati supportano l'utilizzo del pannello sierico composto da antigene carcinoembrionario, antigene del carcinoma a cellule squamose e antigene carboidratico 125 come strumento pratico e non invasivo complementare per la valutazione pretrattamento e la stratificazione individuale del rischio nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago.
Il carcinoma a cellule squamose dell'esofago è un importante sottotipo istologico del cancro dell'esofago e continua a rappresentare un notevole onere clinico nell'Asia orientale, in particolare in Cina1. Sebbene la diagnosi endoscopica, la valutazione mediante imaging, l'intervento chirurgico, la chemioradioterapia e il trattamento sistemico abbiano migliorato la gestione clinica, la prognosi rimane insoddisfacente per molti pazienti2. Un fattore importante è che la malattia viene spesso diagnosticata solo dopo che si è già verificata un'invasione locale o una diffusione linfonodale3. Un altro motivo è che pazienti con lo stesso stadio di classificazione tumore-nodo-metastasi possono comunque differire per risposta al trattamento, rischio di recidiva e outcome di sopravvivenza4. Queste differenze indicano che lo stadio anatomico da solo non riesce a descrivere completamente la variabilità biologica del carcinoma a cellule squamose dell'esofago.
La valutazione clinica attuale si basa principalmente sull'endoscopia con biopsia, lo staging radiologico e la valutazione patologica postoperatoria. Questi metodi sono indispensabili, ma presentano limitazioni quando utilizzati per un monitoraggio ripetuto, la stima del rischio pretrattamento o lo screening su larga scala. L'endoscopia è invasiva e meno adatta a controlli frequenti, mentre la tomografia computerizzata e l'ecografia endoscopica possono non rilevare invasioni minime o piccole lesioni metastatiche5. I modelli prognostici basati su imaging e approcci molecolari hanno migliorato la previsione del rischio nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago, ma molti richiedono piattaforme specializzate, post-elaborazione delle immagini, sequenziamento del tessuto o flussi di lavoro computazionali non disponibili routine in tutti i laboratori clinici6,7. Un approccio basato sul sangue a basso costo e ripetibile potrebbe quindi fornire informazioni complementari utili, specialmente quando i clinici necessitano di una stratificazione del rischio pretrattamento prima della terapia definitiva.
I marcatori tumorali sierici sono attraenti in questo contesto perché sono di routine disponibili, minimamente invasivi e facili da ripetere. L'antigene carcinoembrionario riflette il carico tumorale e la differenziazione cellulare anomala, mentre l'antigene del carcinoma a cellule squamose è più strettamente associato alla trasformazione maligna dell'epitelio squamoso8. Si è riscontrato che l'antigene carboidrato 125 è collegato all'attività infiammatoria sistemica, al coinvolgimento sieroso e alla progressione della malattia in diverse neoplasie9. Questi marcatori non rappresentano lo stesso segnale biologico. Al contrario, potrebbero rilevare dimensioni sovrapposte ma distinte del carico tumorale, del fenotipo squamoso, della risposta sistemica e dell'interazione ospite-tumore. Per questo motivo, un panel combinato potrebbe fornire prestazioni migliori rispetto a un singolo marcatore quando l'obiettivo è identificare il carcinoma a cellule squamose dell'esofago e stimare il rischio clinico10.
Studi precedenti hanno valutato marcatori tumorali sierici, indicatori infiammatori, firme radiologiche, profili molecolari e modelli prognostici compositi nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago e in altri tumori gastrointestinali correlati11,12. Tuttavia, molti modelli pubblicati si concentrano esclusivamente sulla diagnosi o sulla prognosi, utilizzano coorti monocentriche, mancano di una validazione esterna indipendente oppure forniscono informazioni limitate riguardo alla trasformazione dei marcatori, alla scelta delle soglie, alla calibrazione e alla riproducibilità del modello. L'elemento di novità del presente studio consiste nello sviluppo di un pratico pannello sierico a tre marcatori, che impiega l'antigene carcinoembrionario, l'antigene del carcinoma a cellule squamose e l'antigene carboidratico 125, misurati di routine, per supportare sia la discriminazione diagnostica sia la stratificazione del rischio prognostico all'interno di un unico flusso di lavoro bicentrico. Il modello è stato sviluppato in una coorte di ospedale terziario e successivamente testato, senza ulteriore ottimizzazione, in una coorte indipendente di un centro comunitario, consentendo così di valutarne la stabilità in diversi contesti clinici.
Questo studio ha sviluppato e validato un pannello combinato di biomarcatori sierici basato sull'antigene carcinoembrionario, sull'antigene del carcinoma a cellule squamose e sull'antigene carboidrato 125. L'analisi ha seguito due obiettivi correlati. Il primo era valutare se il pannello combinato migliorasse la discriminazione diagnostica tra carcinoma a cellule squamose dell'esofago e controlli non maligni rispetto ai singoli marcatori sierici. Il secondo era determinare se il carico combinato di biomarcatori prima del trattamento aggiungesse informazioni prognostiche oltre le variabili clinicopatologiche convenzionali e lo stadio tumor-nodo-metastasi. Questa struttura ha permesso allo studio di valutare se un pannello di biomarcatori sierici di routine potesse funzionare come un ausilio non invasivo alla diagnosi istopatologica, alla valutazione radiologica e allo stadio anatomico nella valutazione clinica pretrattamento.
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Questo studio che coinvolge partecipanti umani, cartelle cliniche e campioni di siero è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e i requisiti istituzionali per la ricerca su soggetti umani13. Il protocollo dello studio è stato esaminato e approvato dall'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Jiangsu con il numero di approvazione CJ28J12-45. Per i dati clinici anonimi e i campioni di siero residui raccolti in forma retrospettiva, è stata esonerata la richiesta di un consenso informato scritto aggiuntivo, in conformità con le normative etiche istituzionali. Per i campioni raccolti in forma prospettica, è stato ottenuto il consenso informato scritto prima dell'arruolamento. Tutte le informazioni relative ai partecipanti e i campioni di siero sono stati resi anonimi prima dell'analisi. Sono stati utilizzati identificatori di studio per il collegamento dei dati, e nessuna informazione personalmente identificabile è stata inclusa nel set di dati analitici.
Progettazione dello studio e assegnazione del gruppo
Questo studio osservazionale ambispettivo condotto in due centri ha valutato il valore diagnostico e prognostico di un pannello combinato di biomarcatori sierici che include l'antigene carcinoembrionario (CEA), l'antigene del carcinoma a cellule squamose (SCC-Ag) e l'antigene carboidratico 125 (CA125) nel carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC). I dati retrospettivi sono stati ottenuti da cartelle cliniche idonee e da campioni sierici residui pretrattamento, mentre l'arruolamento prospettico è stato utilizzato per raccogliere ulteriori campioni sierici pretrattamento e completare il follow-up entro lo stesso disegno dello studio. I partecipanti sono stati reclutati da un ospedale terziario e da un centro sanitario comunitario tra gennaio 2021 e dicembre 2024, con il follow-up in corso fino al 31 dicembre 2025. Il centro A, ovvero l'ospedale terziario, ha costituito il gruppo di addestramento per lo sviluppo del modello, la stima dei coefficienti, la selezione delle soglie di cutoff e la validazione interna. Il centro B, ovvero il centro sanitario comunitario, ha funto da coorte di validazione esterna. Lo studio è stato riportato in conformità con le linee guida Transparent Reporting of a multivariable prediction model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD)14.
Sono stati inclusi complessivamente 277 partecipanti, di cui 194 del Centro A e 83 del Centro B. Il gruppo di addestramento comprendeva 114 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), 40 controlli con malattia esofagea benigna e 40 controlli sani. Il gruppo di validazione esterna comprendeva 53 pazienti con ESCC, 15 controlli con malattia esofagea benigna e 15 controlli sani. È stata utilizzata un'allocazione basata sui centri anziché una suddivisione casuale, al fine di ridurre la dispersione di informazioni e testare la stabilità del modello in un contesto clinico indipendente. L'analisi diagnostica ha confrontato i livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125 tra pazienti con ESCC, pazienti con malattia esofagea benigna e controlli sani. L'analisi prognostica si è limitata ai pazienti con ESCC e ha valutato se il carico combinato di biomarcatori potesse migliorare la stratificazione del rischio per la sopravvivenza globale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS). Il disegno dello studio, lo screening dei partecipanti, l'allocazione dei gruppi, il flusso di lavoro per i biomarcatori sierici, lo sviluppo del modello diagnostico, la validazione esterna e il confronto tra modelli prognostici sono riassunti in Figura 1.
Il flusso dei partecipanti ha incluso screening, esclusioni, raggruppamento diagnostico e assegnazione basata sul centro. Un totale di 326 individui è stato sottoposto a screening. Quarantanove individui sono stati esclusi, tra cui 12 con trattamento antitumorale prima del prelievo del sangue, 8 con un'altra neoplasia primaria, 9 con infezione grave, malattia autoimmune o comorbidità non controllate che potrebbero influenzare i marcatori tumorali sierici, 11 con emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente di siero o intervallo prolungato di lavorazione, e 9 con dati clinici, patologici o di follow-up chiave mancanti. La popolazione finale analitica comprendeva 277 partecipanti: 167 pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC), 55 controlli con malattia esofagea benigna e 55 controlli sani.
Giustificazione della dimensione del campione
La dimensione del campione è stata determinata dalla disponibilità consecutiva dei partecipanti idonei, dei campioni sierici pretrattamento e delle informazioni di follow-up durante il periodo di studio predeterminato. Il modello diagnostico ha utilizzato tre biomarcatori sierici continui come predittori candidati. Nel gruppo di addestramento, erano disponibili 114 casi di carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e 80 controlli non-ESCC, corrispondenti a 38,0 casi ESCC e 26,7 controlli non-ESCC per ogni predittore biomolecolare candidato. Questo ha permesso una regressione logistica a bassa dimensionalità e ridotto il rischio di overfitting. Il gruppo di convalida esterna comprendeva 53 casi di ESCC e 30 controlli non-ESCC ed è stato utilizzato esclusivamente per la convalida, senza rivalutazione dei coefficienti. La giustificazione della dimensione del campione si allineava ai principi attuali per i modelli predittivi, che enfatizzano la frequenza dell'esito, il numero di parametri predittori candidati, la prestazione attesa del modello e la convalida indipendente, piuttosto che la suddivisione casuale dei dati15.
Reclutamento dei partecipanti, criteri di idoneità e raccolta dei dati
I partecipanti sono stati arruolati in modo continuativo durante il periodo dello studio. Nel Centro A, i pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC) sono stati reclutati dai reparti di chirurgia toracica, gastroenterologia e oncologia. Nel Centro B, i pazienti con ESCC sono stati identificati tramite screening basato sulla comunità, cartelle di follow-up o percorsi di referral, e sono stati inclusi solo se disponibili conferma istopatologica e campioni sierici pre-trattamento. I controlli con patologie esofagee benigne sono stati reclutati tra soggetti sottoposti a gastroscopia per disfagia, sintomi da reflusso o sospetta anomalia esofagea, e con reperti patologici non maligni. I controlli sani sono stati selezionati tra coloro che si sono sottoposti a esami di routine nello stesso periodo e che non avevano storia di neoplasia, infezioni attive, disfunzione epatica o renale grave, né evidenze radiologiche o endoscopiche di lesioni occupanti spazio nell'esofago.
I pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) erano idonei se presentavano un ESCC primario confermato da biopsia gastroscopica o da esame istopatologico postoperatorio, non avevano ricevuto trattamenti antitumorali prima del prelievo del sangue e disponevano di dati clinici basali completi, referti patologici e campioni di siero pretrattamento. I partecipanti venivano esclusi in caso di altra neoplasia primaria, trattamento antitumorale precedente al prelievo del sangue, infezione acuta grave, malattia autoimmune attiva, comorbidità non controllate che potessero influenzare i livelli sierici dei marcatori tumorali, emolisi visibile, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente di siero, variabili cliniche chiave mancanti o dati di follow-up non disponibili. L’analisi prognostica era limitata ai pazienti con ESCC per i quali era disponibile lo stadio tumor-node-metastasis (TNM) e un esito misurabile di sopravvivenza o di progressione della malattia. I pazienti con un follow-up inferiore a 6 mesi venivano mantenuti nell’analisi se si era verificato decesso o progressione della malattia entro tale periodo.
Le variabili di base includevano età, sesso, storia del fumo, storia del consumo di alcol, indice di massa corporea, centro partecipante, gruppo diagnostico, tipo di lesione e livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125. Per i pazienti con carcinoma a cellule squamose dell'esofago (ESCC), ulteriori variabili includevano sede del tumore, lunghezza del tumore, grado di differenziazione istologica, profondità di invasione, stato dei linfonodi, stadio TNM, invasione linfatica e vascolare, modalità di trattamento iniziale, recidiva, progressione, stato di sopravvivenza e data dell'ultimo controllo. La storia del fumo era definita come fumo attuale o precedente consumo regolare di almeno 100 sigarette durante la vita. La storia del consumo di alcol era definita come assunzione di alcol almeno una volta alla settimana per più di 6 mesi. Lo stadio TNM è stato determinato secondo l'ottava edizione del sistema di stadiazione del Comitato Americano Congiunto per il Cancro/Unione Internazionale per la Lotta contro il Cancro (AJCC/UICC) per il carcinoma dell'esofago16. I preparati istopatologici dei casi di ESCC e di lesioni benigne sono stati revisionati indipendentemente da due patologi esperti, e ogni disaccordo è stato risolto da un terzo patologo.
Due ricercatrici formate hanno estratto in modo indipendente informazioni cliniche dai record medici elettronici, dai referti di anatomia patologica, dai sistemi informativi di laboratorio, dai documenti relativi ai trattamenti, dai record di follow-up e dai registri delle morti, utilizzando un dizionario di dati predeterminato. Le discrepanze sono state risolte verificando i documenti originali, con una terza ricercatrice che ha preso la decisione finale quando necessario. La localizzazione del tumore è stata classificata come esofago toracico superiore, medio o inferiore. Il grado di differenziazione istologica è stato classificato come differenziato, moderatamente differenziato o scarsamente differenziato. Le unità delle variabili continue sono state standardizzate tra i due centri partecipanti prima dell'analisi.
Prelevamento del sangue, lavorazione del siero e misurazione dei biomarcatori
Tutti i campioni di sangue sono stati raccolti prima del trattamento iniziale, entro 7 giorni dalla conferma patologica e almeno 3 giorni prima dell'inizio del trattamento. Sono stati prelevati campioni di sangue venoso periferico di 5–8 mL tra le 7:00 e le 9:00 del mattino, dopo digiuno notturno, utilizzando provette con separatore di siero. Il prelievo è stato rinviato se il partecipante aveva ricevuto una trasfusione di sangue, un'infusione di albumina ad alto volume o un intervento invasivo nelle 72 ore precedenti il prelievo. I campioni sono stati lasciati coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugati a 1.500 × g per 10 minuti. Il siero è stato separato e suddiviso in aliquote in 3–5 provette contrassegnate con codice a barre, con un volume di 300–500 µL per ogni aliquota. Le aliquote sono state conservate a −80°C fino al momento dell'analisi, e nessuna aliquota è stata sottoposta a più di un ciclo di congelamento-scongelamento. Sono stati esclusi i campioni con evidente emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficiente o intervallo superiore a 2 ore tra il prelievo e il congelamento.
I livelli sierici di CEA, SCC-Ag e CA125 sono stati misurati utilizzando sistemi automatizzati di immunodosaggio chemiluminescente, seguendo le istruzioni dei produttori. Gli aliquote sieriche sono state scongelate a 4°C prima dell'analisi, mescolate delicatamente e analizzate in un unico ciclo, ogni volta che possibile. Se era necessario effettuare un'analisi in lotti, l'ordine dei campioni è stato organizzato per evitare un raggruppamento sistematico in base allo stato della malattia, al centro, allo stadio patologico o all'esito del follow-up. I campioni con valori superiori all'intervallo di misurazione analitica sono stati diluiti e ripetuti secondo le istruzioni del reagente. Il personale di laboratorio era all'oscuro del gruppo di appartenenza dei partecipanti, dello stadio patologico, dello stato di trattamento e dell'esito del follow-up.
Le soglie cliniche erano di 5,0 ng/mL per il CEA, 1,5 ng/mL per il SCC-Ag e 35 U/mL per il CA125, in base agli standard del laboratorio locale e agli intervalli di riferimento dei produttori. Queste soglie sono state utilizzate per definire l'aumento dei marcatori e un elevato carico combinato di biomarcatori, al fine di effettuare analisi di associazione clinicopatologica e di stratificazione della sopravvivenza. Per la classificazione diagnostica, sono state selezionate soglie basate sui dati esclusivamente nel gruppo di addestramento utilizzando l'indice di Youden, e successivamente applicate invariati al gruppo di convalida esterna. Prima dell'esecuzione dei test, sono state effettuate la calibrazione dello strumento e il controllo interno della qualità. Ogni giorno di analisi sono stati inclusi controlli ad alto e basso livello, e i test sono proseguiti solo quando i risultati del controllo di qualità rientravano nell'intervallo accettato.
La riproducibilità tra saggi e tra centri è stata valutata prima dell'analisi finale del modello utilizzando aliquote di siero di collegamento analizzate in modo cieco e materiali di controllo di qualità di routine. Un insieme di collegamento costituito da 30 aliquote di siero cieche è stato testato attraverso i due flussi di lavoro di laboratorio. I coefficienti di variazione tra i centri sono stati del 4,8% per il CEA, del 5,6% per il SCC-Ag e del 5,1% per il CA125. I corrispondenti coefficienti di correlazione intraclasse sono stati 0,94 per il CEA, 0,92 per il SCC-Ag e 0,93 per il CA125. Nessuna ricalibrazione specifica del saggio per centro è stata effettuata poiché nessuna deviazione sistematica ha superato l'intervallo predefinito di controllo di qualità del laboratorio. I valori finali dei biomarcatori sono stati armonizzati mediante standardizzazione dell'unità e standardizzazione statistica basata sul gruppo di addestramento prima della costruzione del modello.
Definizione combinata del biomarcatore e costruzione del modello
Il pannello combinato di biomarcatori sierici era composto da CEA, SCC-Ag e CA125. Per l'analisi dell'associazione clinicopatologica e la stratificazione della sopravvivenza secondo Kaplan-Meier, ciascun marcatore è stato classificato come elevato o non elevato in base alla soglia clinica predefinita. Un elevato carico combinato di biomarcatori è stato definito come l'aumento di almeno due dei tre marcatori. Per la modellizzazione diagnostica e prognostica, i tre biomarcatori sono stati mantenuti come variabili continue, trasformati utilizzando il logaritmo naturale e standardizzati mediante la media e la deviazione standard del gruppo di addestramento. Gli stessi parametri di trasformazione sono stati applicati al gruppo di validazione esterna.
I biomarcatori standardizzati e trasformati in log sono stati calcolati utilizzando i seguenti parametri della coorte di addestramento:
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0,28)/0,57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3,05)/0,62
Il pannello diagnostico combinato è stato costruito utilizzando una regressione logistica multivariata nel gruppo di addestramento. Il predittore lineare diagnostico è stato calcolato come segue:
LPdiagnostic = -0.46 + 0.59 × zlnCEA + 1.05 × zlnSCC - Ag+0.42 × zlnCA125
La probabilità predetta individuale di ESCC è stata calcolata come segue:
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
Il valore soglia diagnostico ottimale per il pannello combinato è stato 0,57, selezionato nella coorte di addestramento utilizzando l'indice di Youden e applicato invariato nella validazione esterna.
Il punteggio prognostico basato sui biomarcatori è stato costruito utilizzando un modello di rischio proporzionale di Cox. Il modello basato esclusivamente sullo stadio TNM è stato utilizzato come riferimento per lo staging anatomico. Il modello basato sui biomarcatori ha utilizzato il carico combinato di biomarcatori. Il modello clinicopatologico ha incluso età, lunghezza del tumore, grado di differenziazione istologica, stadio pT, stato dei linfonodi e modalità di trattamento iniziale. Il modello integrato ha aggiunto al modello clinicopatologico un elevato carico combinato di biomarcatori. Per la sopravvivenza globale (OS), il predittore lineare prognostico integrato è stato calcolato come segue:
LPOS = 0.33 × età ≥65 anni + 0,36 × lunghezza del tumore ≥5 cm + 0,25 × scarsa differenziazione + 0,31 × pT3
- 4stadio + 0,66 × metastasi linfonodale
-0,58 × intervento chirurgico radicale - trattamento basato
+0,81 × highcombinedbiomarkerburden
Per il PFS, il predittore lineare prognostico integrato è stato calcolato come segue:
LPPFS = 0.27 × età ≥ 65 anni + 0.31 × lunghezza del tumore ≥ 5 cm + 0.24 × scarsa differenziazione + 0.25 × pT3
-4stadio + 0,55 × metastasi linfonodale
- 0,46 × trattamento basato su chirurgia radicale
+0,71 × highcombinedbiomarkerburden
Tutte le variabili binarie nelle equazioni prognostiche sono state codificate come 1 se presenti e 0 se assenti. Tutti i coefficienti, i parametri di standardizzazione e le soglie sono stati stimati nel gruppo di addestramento e applicati direttamente al gruppo di validazione esterna senza riottimizzazione.
Endpoint diagnostici e prognostici
La diagnosi patologica è stata utilizzata come standard di riferimento diagnostico. L'endpoint diagnostico primario era la discriminazione tra carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e controlli non ESCC, inclusi disturbi esofagei benigni e controlli sani. Gli endpoint diagnostici secondari includevano la discriminazione tra ESCC e malattia esofagea benigna, tra ESCC e controlli sani, e tra ESCC in stadio precoce e controlli non maligni. L'ESCC in stadio precoce è stato definito come malattia allo stadio I–II secondo la classificazione TNM. Le prestazioni diagnostiche sono state valutate mediante curve caratteristiche operative del ricevitore, area sotto la curva, sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo, accuratezza, punteggio F1, curve precisione-ricordo, curve di calibrazione, punteggi di Brier, intercette di calibrazione, pendenze di calibrazione e analisi delle curve decisionali.
L'analisi prognostica è stata condotta esclusivamente nei pazienti con carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC). L'endpoint prognostico primario era la sopravvivenza globale (OS), definita come l'intervallo tra la data del primo trattamento antitumorale definitivo e il decesso per qualsiasi causa. L'endpoint prognostico secondario era la sopravvivenza libera da progressione della malattia (PFS), definita come l'intervallo tra il primo trattamento e la progressione documentata della malattia, la ricaduta o il decesso. Nei pazienti sottoposti a chirurgia radicale, la ricaduta locale, la metastasi a distanza o il decesso correlato al tumore sono stati considerati eventi PFS qualora non fosse presente lesione residua dopo l'intervento. Nei pazienti sottoposti a chemioradioterapia definitiva o a trattamento palliativo, la progressione è stata determinata in base ai reperti di imaging, alla valutazione endoscopica e alla valutazione clinica.
I dati di follow-up sono stati ottenuti tramite visite ambulatoriali, cartelle di ricovero ospedaliero, cartelle di follow-up comunitario, referti di invio e contatti telefonici. I pazienti sono stati seguiti ogni 3 mesi durante i primi 2 anni dopo il trattamento, ogni 6 mesi dal terzo al quinto anno e annualmente successivamente. I pazienti senza decesso, recidiva o progressione alla data finale del follow-up sono stati censurati alla loro ultima data di contatto confermata. Gli eventi relativi all'esito sono stati revisionati indipendentemente da due ricercatori. Quando le date degli eventi differivano tra le fonti, sono stati verificati i referti di imaging, le cartelle di dimissione, i referti endoscopici, i documenti di invio e i registri anagrafici delle morti per determinare la data finale dell'evento. La data limite per il follow-up è stata il 31 dicembre 2025 per entrambi i centri partecipanti.
Analisi statistica
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando R 4.3.2 e SPSS 27.0. Le variabili continue sono state riassunte come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile), a seconda della distribuzione. Le variabili categoriche sono state riassunte come frequenze e percentuali. I confronti tra gruppi sono stati effettuati mediante il test t per campioni indipendenti, il test U di Mann-Whitney, l'analisi della varianza a un fattore, il test di Kruskal-Wallis, il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher, secondo le indicazioni. I dati mancanti sono stati valutati prima della costruzione del modello. I partecipanti con stato diagnostico chiave, valori dei biomarcatori pretrattamento, stadio TNM o dati sugli esiti di sopravvivenza/progressione mancanti sono stati esclusi in base ai criteri di idoneità predeterminati. Le covariate non chiave con dati mancanti inferiori al 5,0% sono state gestite mediante imputazione multipla tramite equazioni concatenate, con 20 set di dati imputati e 20 iterazioni17. I modelli di imputazione includevano gruppo diagnostico, centro, età, sesso, storia del fumo, consumo di alcol, valori dei biomarcatori, stadio TNM, modalità di trattamento, stato di OS, stato di PFS e tempo di follow-up. Sono state eseguite analisi su casi completi come analisi di sensibilità.
Il modello diagnostico è stato sviluppato nel gruppo di addestramento. Le curve caratteristiche operative del ricevitore sono state utilizzate per calcolare l'area sotto la curva, la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo, il valore predittivo negativo, l'accuratezza e il punteggio F1. Le aree sotto la curva sono state confrontate utilizzando il test di DeLong18. Le curve precisione-richiamo sono state utilizzate come valutazione diagnostica supplementare. La calibrazione è stata valutata mediante curve di calibrazione, punteggi di Brier, intercette di calibrazione e pendenze di calibrazione. L'utilità clinica è stata valutata mediante l'analisi della curva decisionale19. La validazione interna è stata effettuata utilizzando 1.000 ricampionamenti bootstrap per stimare la discriminazione e la calibrazione corrette per l'ottimismo. La validazione esterna è stata effettuata applicando direttamente al Centro B l'equazione del gruppo di addestramento, i parametri di standardizzazione e la soglia, senza ulteriore adattamento.
Per l'analisi prognostica, sono state generate curve di Kaplan-Meier per confrontare la sopravvivenza globale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS) tra i gruppi in base al carico di biomarcatori, e il test log-rank è stato utilizzato per valutare le differenze nella sopravvivenza. È stata impiegata la regressione di Cox per stimare i rapporti di rischio (hazard ratios) e gli intervalli di confidenza al 95%. Le variabili clinicamente rilevanti e quelle associate agli esiti nell'analisi univariata sono state considerate per i modelli multivariabili. Le prestazioni del modello sono state valutate mediante l'indice C di Harrell, curve ROC dipendenti dal tempo, curve di calibrazione, punteggi di Brier e analisi della curva decisionale20. La calibrazione prognostica è stata valutata a 1, 3 e 5 anni. L'assunzione di proporzionalità dei rischi è stata verificata mediante i residui di Schoenfeld e i grafici di sopravvivenza log-minus-log21. I valori P globali del test di Schoenfeld erano pari a 0,42 per il modello OS e a 0,37 per il modello PFS. La multicollinearità è stata valutata mediante i fattori di inflazione della varianza prima dell'interpretazione finale del modello; tutte le variabili candidate nei modelli diagnostici e prognostici finali presentavano fattori di inflazione della varianza inferiori a 2,1. Il valore prognostico aggiuntivo rispetto allo stadio TNM e ai modelli clinicopatologici convenzionali è stato valutato mediante il miglioramento netto della classificazione (net reclassification improvement) e il miglioramento integrato della discriminazione (integrated discrimination improvement). I parametri del modello stimati nel gruppo di addestramento sono stati applicati al gruppo di validazione esterna senza ulteriore aggiustamento22. Tutti i test erano a due code e un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Flusso dei partecipanti e riproducibilità del saggio
Sono stati sottoposti a screening complessivamente 326 individui, dei quali 49 sono stati esclusi: 12 avevano ricevuto un trattamento antitumorale prima del prelievo del sangue, 8 presentavano un'altra neoplasia primaria, 9 avevano infezione grave, malattia autoimmune o comorbidità non controllate che potrebbero influenzare i marcatori tumorali sierici, 11 avevano emolisi, lipemia, interferenza da ittero, volume insufficient...
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Questo studio multicentrico ha sviluppato e validato esternamente un pannello combinato di biomarcatori sierici che integra CEA, SCC-Ag e CA125 per la valutazione diagnostica e prognostica nell'ESCC. Il pannello combinato ha superato ciascun singolo biomarcatore nella capacità di distinguere l'ESCC dai controlli non maligni e ha mantenuto una discriminazione accettabile nella coorte di validazione esterna. Questo risultato è in linea con studi precedenti sull'ESCC che hanno dimostrato come i marcatori tumorali sierici po...
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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Gli autori ringraziano il personale del Dipartimento di Medicina di Laboratorio, dell'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Jiangsu, Ospedale affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Nanjing e del Centro di Servizio Sanitario della Comunità di Nanhu, Nanjing, per il supporto fornito nella raccolta dei campioni, nei test di laboratorio e nella gestione dei dati.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Calibratori Access CEA | Beckman Coulter | 33205 | Calibrazione per il saggio del CEA sierico |
| Controllo qualità Access CEA | Beckman Coulter | 33029 | Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del CEA sierico |
| Pacchetto reagenti Access CEA | Beckman Coulter | 33200 | Misurazione del CEA sierico sul sistema di immunodosaggio UniCel DxI 800 Access |
| Pipetta microlitrica regolabile, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Aliquotatura del siero dopo centrifugazione |
| Calibratori ARCHITECT CA 125 II | Abbott Diagnostics | 02K4502 | Calibrazione per il saggio del CA125 sierico |
| Controlli ARCHITECT CA 125 II | Abbott Diagnostics | 02K4511 | Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del CA125 sierico |
| Kit reagenti ARCHITECT CA 125 II | Abbott Diagnostics | 02K4529 | Misurazione del CA125 sierico sull'analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR |
| Analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR | Abbott Diagnostics | i2000SR | Piattaforma automatizzata per immunodosaggio chemiluminescente con microparticelle per test SCC-Ag e CA125 |
| Calibratore ARCHITECT SCC | Abbott Diagnostics | 8D1801 | Calibrazione per il saggio del SCC-Ag sierico |
| Controlli ARCHITECT SCC | Abbott Diagnostics | 8D1810 | Controllo qualità interno giornaliero per il saggio del SCC-Ag sierico |
| Kit reagenti ARCHITECT SCC | Abbott Diagnostics | 8D1828 | Misurazione del SCC-Ag sierico sull'analizzatore di immunodosaggio ARCHITECT i2000SR |
| Stampante etichette a codice a barre | Brady | BMP51 | Etichettatura a codice a barre di aliquote di siero e provette criogeniche |
| Ago per prelievo del sangue | BD Biosciences | 367286 | Prelievo di sangue venoso periferico |
| Contenitore criogenico per stoccaggio | Corning | 431131 | Stoccaggio organizzato di aliquote di siero congelate |
| Provetta criogenica, 2,0 mL, filettatura esterna, autoportante | Corning | 430659 | Stoccaggio di aliquote di siero etichettate a codice a barre a −80 °C |
| Modulo per l'estrazione dei dati e dizionario dati predefinito | Gruppo dello studio | Non applicabile | Estrazione standardizzata di variabili cliniche, patologiche, di laboratorio e di follow-up |
| Pacchetto dcurves | Pacchetto R | Versione 0.4.0 | Analisi della curva decisionale e stima del beneficio clinico netto |
| Sistema cartelle cliniche elettroniche | Ospedali partecipanti | Non applicabile | Estrazione di dati demografici, clinici, terapeutici e di follow-up |
| Punte filtrate per pipetta, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | Aliquotatura del siero controllata per contaminazione |
| Pacchetto ggplot2 | Pacchetto R | Versione 3.5.1 | Visualizzazione statistica e preparazione di figure |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versione 27.0 | Confronti alla baseline e verifica statistica supplementare |
| Sistema di gestione delle informazioni di laboratorio | Laboratorio dell'ospedale partecipante | Non applicabile | Recupero e collegamento dei referti dei test sui biomarcatori sierici |
| Pacchetto mice | Pacchetto R | Versione 3.16.0 | Imputazione multipla mediante equazioni concatenate |
| Pacchetto nricens | Pacchetto R | Versione 1.6 | Analisi del miglioramento della riclassificazione netta |
| Sistema di refertazione anatomopatologica | Ospedali partecipanti | Non applicabile | Conferma della diagnosi di carcinoma esofageo a cellule squamose, patologia benigna, caratteristiche del tumore e variabili relative allo stadio |
| Pacchetto pROC | Pacchetto R | Versione 1.18.5 | Analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) e confronto di DeLong |
| Software statistico R | Fondazione R per il Calcolo Statistico | Versione 4.3.2 | Analisi statistica, costruzione e validazione del modello, generazione di figure |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5810 R | Separazione del siero mediante centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti |
| Pacchetto rms | Pacchetto R | Versione 6.8-1 | Analisi di calibrazione, costruzione di nomogrammi e supporto al modello di regressione |
| Tubo per prelievo del sangue con separazione del siero, 5 mL | BD Biosciences | 367955 | Prelievo di sangue venoso periferico a digiuno per il test dei biomarcatori sierici |
| Pacchetto survival | Pacchetto R | Versione 3.5-7 | Regressione di Cox a rischi proporzionali e analisi della sopravvivenza |
| Pacchetto survminer | Pacchetto R | Versione 0.4.9 | Visualizzazione della curva di Kaplan–Meier |
| Modulo per registrazione del follow-up telefonico | Gruppo dello studio | Non applicabile | Raccolta e verifica delle informazioni su sopravvivenza, recidiva, progressione e ultima data di contatto |
| Pacchetto timeROC | Pacchetto R | Versione 0.4 | Analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) dipendente dal tempo |
| Freezer a temperatura ultra-bassa | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | Stoccaggio di aliquote di siero a −80 °C |
| Sistema di immunodosaggio UniCel DxI 800 Access | Beckman Coulter | DxI 800 | Piattaforma automatizzata per immunodosaggio chemiluminescente per il test del CEA sierico |
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