Rilevazione di antigeni delle cellule immunitarie intratumorali in un modello immunocompetente di cellule staminali del glioblastoma mediante immunoistochimica basata su substrato

Sourav Chakraborty; Connor Howard; Checo J. Rorie; Robert H. Newman; Samuel D. Rabkin; Dipongkor Saha

doi:10.3791/72193

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Articolo metodologico

Rilevazione di antigeni delle cellule immunitarie intratumorali in un modello immunocompetente di cellule staminali del glioblastoma mediante immunoistochimica basata su substrato

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DOI:

10.3791/72193

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21 agosto 2026

Sourav Chakraborty¹ , Connor Howard¹ , Checo J. Rorie¹ , Robert H. Newman¹ , Samuel D. Rabkin² , Dipongkor Saha¹

¹Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, ²Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Lo studio fornisce un flusso di lavoro dettagliato e riproducibile basato su substrato per l'immunohistochimica, finalizzato a una rilevazione costante di antigeni singoli e doppi in sezioni di tessuto tumorale derivato da cellule staminali del glioblastoma fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE). Il protocollo consente l'identificazione di diversi marcatori immunitari e tumorali affrontando al contempo le sfide tecniche, con possibili applicazioni in altri modelli tumorali.

Abstract

Il glioblastoma (GBM) è la neoplasia cerebrale primaria più comune e letale, per la quale mancano terapie efficaci. È caratterizzato da un microambiente tumorale fortemente immunosoppressivo, determinato in parte dalle cellule staminali simili a cellule staminali del glioblastoma (GSC) resistenti ai trattamenti. In questo studio, descriviamo protocolli riproducibili di immunoeistochimica (IHC) su supporto, monocromatica e bicolore, per la rilevazione di antigeni di superficie e intracellulari associati alle cellule immunitarie infiltranti il tumore, su sezioni tumorali cerebrali fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE). I tumori cerebrali sono stati ottenuti da GSC murine, impiantate ortotopicamente in topi immunocompetenti. Il protocollo IHC monocromatico utilizza un sistema di rilevazione cromogenico basato sulla perossidasi di rafano (HRP) per la visualizzazione di singoli antigeni cellulari immunitari, mentre il protocollo IHC bicolore impiega una strategia sequenziale di colorazione basata sulla fosfatasi alcalina (AP) per la rilevazione simultanea di due antigeni cellulari immunitari all'interno della stessa sezione tissutale, inclusi protocolli che utilizzano anticorpi primari della stessa origine ospite. Questi metodi forniscono un approccio pratico e riproducibile per l'analisi cromogenica degli antigeni associati alle cellule immunitarie infiltranti il tumore nei tessuti del GBM e potrebbero essere adattabili ad altri modelli tumorali preclinici e potenzialmente a campioni umani FFPE.

Introduzione

Il glioblastoma (GBM) è un tumore cerebrale primario maligno aggressivo, altamente invasivo e eterogeneo, associato a una scarsa sopravvivenza del paziente nonostante le terapie standard attuali¹. Una caratteristica distintiva del GBM è il suo microambiente tumorale (TME) profondamente immunosoppressivo, che contribuisce alla resistenza alle strategie immunoterapiche²^,³. Diversi meccanismi determinano l'immunosoppressione nel GBM, tra cui la ridotta infiltrazione di linfociti T effetori e l'induzione di disfunzione ed esaurimento dei linfociti T⁴. Inoltre, le cellule staminali simili a cellule staminali del glioblastoma (GSC), una sottopopolazione di cellule del GBM, promuovono ulteriormente l'evasione immunitaria mantenendo un TME immunologicamente “freddo”, caratterizzato da una limitata attività immunitaria citotossica⁵. Queste caratteristiche evidenziano l'importanza di caratterizzare con precisione le popolazioni di cellule immunitarie infiltranti il tumore e i loro stati funzionali nel TME del GBM.

L'immunohistochemia (IHC) rimane uno dei metodi più ampiamente utilizzati per valutare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nei tessuti tumorali, poiché preserva l'architettura tissutale consentendo al contempo la visualizzazione, localizzazione e una valutazione semiquantitativa dei marcatori cellulari in situ⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Studi precedenti di immunohistochemia e immunoprofilatura hanno notevolmente approfondito la nostra comprensione del panorama immunitario del GBM e identificato popolazioni di cellule immunitarie associate alla progressione tumorale e alla risposta terapeutica¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. L'IHC cromogenica a singolo colore è particolarmente utile per rilevare singoli marcatori immunitari in sezioni di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina (FFPE)¹²^,¹³^,¹⁵^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Al contrario, l'IHC cromogenica a doppio colore consente la visualizzazione simultanea di due marcatori nella stessa sezione tissutale, facilitando la valutazione del fenotipo cellulare, della proliferazione o dello stato di attivazione¹²^,¹⁹^,²¹.

Nonostante questi progressi, i protocolli IHC cromogenici basati su substrati pratici e standardizzati applicabili ai modelli di GBM derivati da GSC immunocompetenti rimangono limitati. Inoltre, l'IHC cromogenica è più complessa nel GBM rispetto a molti altri tumori solidi a causa dell'infiltrazione immunitaria scarsa ed eterogenea, dell'elevata eterogeneità intratumorale e dell'ambiente microscopico tumorale (TME) fortemente immunosoppressivo e complesso, che complicano la corretta visualizzazione e interpretazione di più popolazioni cellulari all'interno della stessa sezione tissutale²^,³^,⁴. L'IHC cromogenica doppia presenta ulteriori sfide tecniche, in particolare quando entrambi gli anticorpi primari sono prodotti nella stessa specie ospite, richiedendo un'attenta ottimizzazione della compatibilità degli anticorpi, una strategia di colorazione sequenziale per la rilevazione simultanea di due antigeni nella stessa sezione tissutale e la selezione di un substrato cromogenico che garantisca una chiara discriminazione dei marcatori mediante microscopia ottica.

In questo studio, descriviamo protocolli riproducibili di immunohistochimica (IHC) su base cromogenica, con rilevamento monocromatico e bicromatico, che consentono con successo la rilevazione di antigeni di superficie e intracellulari associati alle cellule immunitarie infiltranti il tumore in un modello ortotopico immunocompetente di GBM derivato da 005 GSC²²^,²³^,²⁴. Questi protocolli IHC cromogenici basati su substrato possono essere adattati anche ad altri modelli tumorali preclinici e potenzialmente a campioni tumorali umani in FFPE. I tessuti cerebrali di topo prelevati sono stati fissati in formalina neutra tamponata al 10% per tutta la notte (circa 12 h) prima della comune lavorazione del tessuto e inclusione in paraffina, come descritto in precedenza¹⁹. I blocchi FFPE sono stati tagliati (spessore di 5 µm¹⁹) su vetrini portaoggetti microscopici con carica positiva e conservati a temperatura ambiente fino all'uso. L’IHC monocromatica utilizza un sistema di rilevamento cromogenico basato sulla perossidasi di ravanello (HRP) con il 3,3′-diaminobenzidina (DAB) come substrato per generare un segnale marrone, visibile mediante microscopia ottica. Questo flusso di lavoro è adatto alla rilevazione sia di antigeni associati alla membrana che di antigeni intracellulari in sezioni di tessuto FFPE.

L'IHC a doppio colore consente la rilevazione simultanea di due antigeni all'interno della stessa sezione di tessuto, ma richiede un'ottimizzazione aggiuntiva per garantire la compatibilità degli anticorpi e una chiara separazione dei segnali cromogenici. La colorazione IHC a doppio colore è relativamente semplice quando gli anticorpi primari sono stati prodotti in specie ospiti diverse, permettendo l'uso di anticorpi secondari specifici per specie. Tuttavia, la rilevazione simultanea diventa più complessa dal punto di vista tecnico quando entrambi gli anticorpi primari provengono dalla stessa specie ospite. Per affrontare questa difficoltà, il protocollo IHC a doppio colore descritto in questo lavoro impiega una strategia sequenziale di colorazione cromogenica basata sull'alkaline fosfatasi (AP) che utilizza substrati distinti, consentendo una chiara discriminazione visiva tra i segnali di due antigeni mediante microscopia ottica.

Entrambi i flussi di lavoro includono deparaffinizzazione del tessuto, riidratazione, recupero dell'antigene, bloccaggio, colorazione, disidratazione, chiarificazione e montaggio. La preparazione dei reagenti è fondamentale per la qualità e la riproducibilità della colorazione (vedere File Supplementare 1). Analogamente, anche le diluizioni appropriate degli anticorpi primari sono essenziali per un protocollo di colorazione di successo, e vanno effettuate immediatamente prima dell'uso in siero equino o caprino normale al 2,5%, a seconda della specie ospite del corrispondente anticorpo secondario (vedere Tabella 1). Nella Tabella 2 è riportato un elenco di anticorpi secondari specifici per specie utilizzati per la colorazione monocromatica e bicolore. L'IHC monocromatica utilizza reagenti di chiarificazione e montaggio a base di xilolo, mentre l'IHC bicolore richiede alternative prive di xilolo (ad esempio, Histo-Clear), poiché il substrato è parzialmente solubile in xilolo (vedere l'elenco dei substrati nella Tabella 3).

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Protocollo

Questo protocollo è stato eseguito nel rispetto di tutte le normative e linee guida istituzionali pertinenti, inclusi i requisiti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) (numeri di protocollo IACUC: 2004N000067 e LA24-0045).

NOTA: Diversi passaggi nei protocolli IHC a singolo e doppio colore prevedono l'uso di reagenti infiammabili, tra cui etanolo e agenti per la chiarificazione dei tessuti. Di conseguenza, le procedure che coinvolgono sostanze chimiche infiammabili, inclusi deparaffinizzazione, reidratazione, disidratazione, chiarificazione e montaggio, devono essere eseguite in una cappa chimica certificata, seguendo le opportune pratiche di sicurezza di laboratorio. I reagenti infiammabili devono essere preparati e conservati in contenitori di vetro con tappo a vite, opportunamente etichettati, all'interno di armadi specifici per lo stoccaggio di sostanze infiammabili, in conformità alle linee guida istituzionali sulla sicurezza. I materiali e i volumi di reagenti sono configurati per l'elaborazione in batch fino a 48 vetrini (due rastrelliere per colorazione, 24 vetrini per rastrelliera), anche se il flusso di lavoro può essere facilmente adattato in base alle esigenze sperimentali.

1. IHC monocromatica per sezioni di tumore cerebrale in FFPE

NOTA: Il seguente protocollo descrive l'IHC monocromatica basata su substrato per la rilevazione di antigeni di superficie e intracellulari rappresentativi in sezioni di tumore cerebrale in FFPE ottenute dal modello ortotopico di GSC 005.

Deparaffinizzazione (20 min):
1. Posizionare i vetrini in una rack per vetrini in poliossimetilene (POM) e immergere la rack in contenitori per colorazione, prima in Xilene I e poi in Xilene II, per 10 min ciascuno in una cappa aspirante. Assicurarsi che le sezioni di tessuto rimangano completamente immerse nello xilene durante la deparaffinizzazione.
  ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio sotto cappa chimica con idonei dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi camice da laboratorio, occhiali protettivi, maschera facciale e guanti per le mani. Non permettere alle sezioni di asciugarsi in questa fase o nelle fasi successive, poiché ciò potrebbe causare danni al tessuto e perdita delle sezioni. Conservare le soluzioni di xilene in contenitori di vetro ermetici e riutilizzarle se appaiono pulite.
Riidratazione graduale (15 min):
1. Riidratare le sezioni sequenzialmente in etanolo al 100%, 90% e 70%, per 5 min ciascuno. A tale scopo, immergere i vetrini in etanolo al 100% nel contenitore per colorazione per 5 min (quindi restituire l’etanolo al 100% nella bottiglia di vetro per il riutilizzo), seguito da etanolo al 90% per 5 min (quindi restituirlo alla bottiglia) e infine in etanolo al 70% per 5 min (quindi restituirlo alla bottiglia).
  ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio sotto cappa chimica e utilizzare i DPI come al punto 1.1. Queste soluzioni di etanolo possono essere riutilizzate tra esperimenti se conservate in contenitori di vetro ermetici, a condizione che appaiano pulite.
Risciacquo con acqua (5 min):
1. Posizionare i vetrini in acqua distillata per 5 min, completando così il processo di riidratazione.
  NOTA: Durante l’esecuzione di questo passaggio, preparare da 600 mL (per 1 rack di vetrini) a 800 mL (per 2 rack di vetrini) di soluzione tampone di recupero dell’antigene 1× (tampone citrato di sodio 10 mM) in un becher di vetro microondeabile da 2 L, seguendo le istruzioni indicate nel File Supplementare 1.
Recupero dell’antigene (~20 min):
1. Coprire il becher da 2 L contenente la soluzione tampone di recupero dell’antigene appena preparata (citrato di sodio 10 mM) con pellicola trasparente per prevenire un’eccessiva evaporazione durante il preriscaldamento e il riscaldamento prolungato in microonde.
2. Praticare alcuni fori nella pellicola trasparente per evitare che il tampone fuoriesca a causa della pressione eccessiva generata durante l’ebollizione delle sezioni di tessuto.
  NOTA: Utilizzare i DPI come al punto 1.1.
3. Preriscaldare la soluzione tampone di recupero dell’antigene appena preparata (citrato di sodio 10 mM) per 3 min. Posizionare la rack di vetrini con le sezioni di tessuto riidratate nella soluzione di recupero dell’antigene preriscaldata.
4. Quindi esporre le sezioni di tessuto a microonde per 15 min alla massima potenza (ad es. P10), monitorando attentamente il becher per assicurarsi che le sezioni rimangano immerse e non si asciughino a causa dell’evaporazione.
  NOTA: In alternativa, eseguire il recupero dell’antigene in una vaschetta di plastica per colorazione posta all’interno di un forno a vapore per circa 15 min, un metodo di riscaldamento più delicato che richiede meno monitoraggio. Il tampone citrato di sodio (10 mM, pH 6,0) è stato validato con successo e utilizzato come tampone di recupero dell’antigene per tutti gli anticorpi primari elencati in Tabella 1. A seconda dell’anticorpo primario e delle raccomandazioni del produttore, potrebbero essere necessari altri tamponi, come EDTA o Tris-EDTA, per anticorpi non valutati in questo studio.
Raffreddamento (10–20 min):
1. Rimuovere il becher dal microonde, posizionarlo sul banco di lavoro e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 20 min. Per accelerare il raffreddamento, immergere il becher in acqua corrente fredda per circa 10 min.
  ATTENZIONE: Il becher sarà estremamente caldo; utilizzare guanti resistenti al calore o pinze da becher per maneggiarlo. Utilizzare i DPI come al punto 1.1.
Lavaggio con soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) (~10 min):
1. Rimuovere la rack di vetrini dal becher e immergere i vetrini in soluzione DPBS 1× nel contenitore per colorazione.
2. Risciacquare le sezioni due volte in DPBS 1× per 5 min ciascuna, usando lavaggi delicati e statici per evitare il distacco del tessuto.
Barriera idrofoba (<1 min/vetrino):
1. Durante il lavaggio con DPBS (passaggio 1.6), rimuovere con attenzione ogni vetrino singolarmente, asciugare delicatamente attorno alla sezione di tessuto con salviette senza pelucchi (ad es. Kim Wipes), evitando il contatto diretto con il tessuto.
2. Utilizzare una barriera idrofoba, come una penna perossidasi-anti-perossidasi (PAP), per tracciare un bordo repellente ai liquidi attorno a ogni sezione di tessuto, quindi reinserire il vetrino nella soluzione di lavaggio DPBS 1× nel contenitore per colorazione. Ripetere questi passaggi per tutti i vetrini.
  NOTA: Una barriera idrofoba attorno al tessuto impedisce il trabocco dei reagenti tra le sezioni e aiuta a trattenere gli anticorpi sul tessuto.
Blocco della perossidasi endogena (5 min):
1. Eliminare il DPBS 1× dal contenitore per colorazione, quindi aggiungere la soluzione di H₂O₂ al 3%, assicurandosi che i vetrini o le sezioni di tessuto siano completamente immersi per 5 min.
  NOTA: Un’incubazione prolungata in H₂O₂ al 3% potrebbe danneggiare il tessuto. Il blocco dell’attività della perossidasi endogena è un passaggio cruciale per prevenire il fondo causato dalla perossidasi endogena durante lo sviluppo del colore. Utilizzare i DPI come al punto 1.1.
Lavaggio con DPBS (~12 min):
1. Eliminare la soluzione di H₂O₂ al 3% e risciacquare nuovamente i vetrini in DPBS 1× due volte per 5 min ciascuna.
2. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere i vetrini dalla rack, posizionarli orizzontalmente nella camera umidificata e aggiungere acqua distillata ai bordi della camera umidificata.
3. Non far asciugare le sezioni; procedere immediatamente al blocco al punto 1.10.
  NOTA: Ogni camera umidificata elencata nella Tabella dei Materiali ha spazio e può contenere 30 vetrini.
Blocco con siero (~70 min):
1. Aggiungere 50 µL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) al 5% per sezione e incubare per 30 min a temperatura ambiente, mantenendo il coperchio della camera umidificata chiuso per prevenire l’evaporazione del tampone di blocco dalle sezioni di tessuto.
2. Dopo 30 min, battere delicatamente i vetrini su salviette senza pelucchi posizionate sul banco di lavoro per eliminare il BSA.
3. Quindi, aggiungere siero normale equino o caprino al 2,5% (una goccia per sezione), corrispondente alla specie ospite dell’anticorpo secondario, e incubare le sezioni per ulteriori 30 min a temperatura ambiente con il coperchio della camera umidificata chiuso, battere delicatamente i vetrini su carta assorbente o salviette senza pelucchi per rimuovere il siero e procedere immediatamente al punto 1.11.
  NOTA: Non far asciugare le sezioni. Preparare gli anticorpi primari diluiti nel corretto tampone di blocco (vedi Tabella 1) verso la fine del passaggio di blocco, in modo che siano pronti per l’uso al punto 1.11 una volta completato il blocco.
Incubazione con anticorpo primario (~16 h):
1. Applicare circa 50 µL di anticorpi primari, opportunamente diluiti nel tampone di blocco appropriato (vedi Tabella 1), sulle sezioni di tessuto e incubare per tutta la notte (~16 h) a 4 °C in una camera umidificata.
  NOTA: Assicurarsi che le aree designate della camera umidificata siano riempite con acqua distillata per mantenere l’umidità durante la notte. Inoltre, prestare attenzione affinché le aree/camere designate per i vetrini non vengano riempite con acqua distillata, poiché ciò potrebbe causare l’allagamento delle sezioni di tessuto.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Posizionare una rack di vetrini in un contenitore per colorazione e riempirla con tampone di lavaggio (DPBS 1×, 0,1% Tween 20).
2. Dopo l’incubazione notturna, rimuovere i vetrini dalla camera umidificata, eliminare gli anticorpi primari battendo delicatamente i vetrini su carta assorbente, quindi posizionare i vetrini in una rack immersa nel tampone di lavaggio (DPBS 1×, 0,1% Tween 20) nel contenitore per colorazione ed eliminare il tampone di lavaggio.
3. Quindi, lavare le sezioni in DPBS 1× (0,1% Tween 20) tre volte, per 5 min ciascuna, quindi rimuovere i vetrini dalla rack, posizionarli orizzontalmente nella camera umidificata e procedere immediatamente al punto 1.13.
  NOTA: Ogni tempo di lavaggio può essere esteso a 10–15 min se dopo lo sviluppo del colore al punto 1.15 si osserva una colorazione di fondo elevata. I lavaggi devono essere delicati e statici (senza oscillazioni o agitazioni) per evitare il distacco del tessuto dai vetrini.
Incubazione con anticorpo secondario (~32–35 min):
1. Aggiungere una goccia per sezione dell’anticorpo secondario coniugato con HRP (anti-coniglio o anti-ratto IgG, a seconda dei casi; vedere Tabella 2) e incubare le sezioni di tessuto per 30 min a temperatura ambiente con il coperchio della camera umidificata chiuso.
  NOTA: L’anticorpo secondario può essere diluito 1:1 in PBS per ridurre il fondo al punto 1.15.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Dopo l’incubazione con l’anticorpo secondario, rimuovere i vetrini dalla camera umidificata e battere delicatamente i vetrini su carta assorbente per eliminare l’anticorpo secondario.
2. Quindi, posizionare i vetrini in una rack immersa nel tampone di lavaggio (DPBS 1× con 0,1% Tween 20) all’interno di un contenitore per colorazione per un breve lavaggio ed eliminare il tampone di lavaggio.
3. Quindi, lavare le sezioni di tessuto tre volte con DPBS 1× (0,1% Tween 20) per 5 min ciascuna.
  1. Prima di iniziare il passaggio di sviluppo del cromogeno (cioè il punto 1.15), posizionare una rack separata in un contenitore per colorazione riempito con acqua distillata, un passaggio preparatorio per il punto 1.16, per arrestare la reazione cromogenica.
  2. Durante l’ultimo lavaggio, preparare fresca la soluzione lavorativa di DAB (una goccia di cromogeno per 1 mL di substrato; vedere File Supplementare 1).
Sviluppo del cromogeno (30 s–5 min):
1. Dopo il terzo lavaggio al punto 1.14, rimuovere i vetrini dalla rack e posizionarli orizzontalmente sul banco di lavoro con uno sfondo bianco.
2. Applicare 50 µL di soluzione lavorativa di DAB su ogni sezione e monitorare visivamente lo sviluppo del colore marrone su sfondo bianco o al microscopio ottico.
  NOTA: Utilizzare i DPI come al punto 1.1. L’uso di carta assorbente bianca aiuta a visualizzare lo sviluppo del colore marrone durante la fase cromogenica con DAB. Lo sviluppo del colore può richiedere da 20 a 60 s per alcuni marcatori e da 2 a 5 min per altri (vedere dettagli al punto 1.16).
Arresto della reazione (1–2 min):
1. Non appena appare il segnale di colore marrone desiderato al punto 1.15, arrestare immediatamente la reazione immergendo il vetrino in un contenitore di acqua distillata preparato al punto 1.14.3.1.
2. Mantenere i vetrini in risciacquo con acqua distillata per 1 min. Eliminare l’acqua distillata, quindi procedere al punto 1.17 (controcolorazione).
  NOTA: I vetrini possono rimanere in acqua distillata fino a 1 h senza influire sulla colorazione. Il tempo necessario per lo sviluppo del colore determina quando avviare il passaggio di arresto della reazione. Inoltre, se su uno stesso vetrino sono presenti 2–3 marcatori (come CD3, CD4, CD8 o altri), i tempi di reazione possono variare; ad esempio, nel sistema descritto qui, lo sviluppo del colore richiede generalmente circa 30 s per le cellule CD8⁺, da 1 a 3 min per le cellule CD3⁺ o CD4⁺, o più a lungo (3–5 min) per le cellule Granzima B⁺ e Ki67⁺. A causa delle differenze nei tempi di sviluppo del colore, non è possibile immergere l’intero vetrino in acqua distillata per arrestare la reazione. Invece, arrestare ogni reazione singolarmente per ogni sezione aggiungendo direttamente 200–300 µL di acqua distillata su ciascuna sezione.
Controcolorazione (<1 min):
1. Per migliorare il contrasto con la colorazione marrone, aggiungere ematossilina diluita (1:3 in acqua distillata) nel contenitore per colorazione, assicurandosi che i vetrini rimangano immersi nell’ematossilina diluita per circa 10–20 s.
  NOTA: Se il fondo di DAB è intenso, controcolorare più a lungo (fino a 1 min) o usare brevemente ematossilina non diluita.
Lavaggio con acqua corrente (6 min):
1. Eliminare l’ematossilina dal contenitore per colorazione e restituirla nella bottiglia di vetro per il riutilizzo.
2. Risciacquare i vetrini in acqua corrente per 1 min, quindi risciacquare in acqua corrente lenta per 5 min, mantenendo le sezioni rivolte lontano dal flusso diretto dell’acqua. Eliminare l’acqua corrente e procedere al punto 1.19.
  NOTA: I passaggi successivi fino al montaggio vengono eseguiti sotto cappa aspirante.
Deidratazione graduale (15–17 min):
1. Immergere i vetrini in etanolo al 70% nel contenitore per colorazione per 5 min (quindi restituire l’etanolo al 70% nella bottiglia di vetro per il riutilizzo), seguito da etanolo al 90% per 5 min (quindi restituirlo alla bottiglia) e infine in etanolo al 100% per 5 min (quindi restituirlo alla bottiglia).
2. Procedere al punto 1.20.
  NOTA: Eseguire questo passaggio sotto cappa chimica. Le stesse soluzioni di etanolo del punto 1.2 vengono utilizzate in questo passaggio di deidratazione e possono essere riutilizzate molte volte se appaiono pulite.
Chiarificazione:
1. Utilizzare le stesse soluzioni di Xilene I e II utilizzate per la deparaffinizzazione (punto 1.1) per pulire le sezioni di tessuto/vetrini.
2. Immergere prima i vetrini in soluzione di Xilene I nel contenitore per colorazione per 10 min (quindi restituire lo Xilene I nella bottiglia di vetro per il riutilizzo) e successivamente in soluzione di Xilene II per ulteriori 10 min.
3. Mantenere i vetrini in Xilene II fino al completamento del montaggio (cioè al punto 1.21).
  NOTA: Non far mai asciugare le sezioni in questo passaggio, poiché le sezioni asciutte diventano fragili; pertanto, se necessario, le sezioni possono rimanere più a lungo in Xilene II per il montaggio.
Montaggio:
1. Rimuovere i vetrini uno alla volta da Xilene II e posizionarli orizzontalmente sotto cappa chimica. Applicare una goccia di mezzo di montaggio a base di xilene su un’opportuna coprioggetto, quindi posizionare la coprioggetto sul vetrino, con il mezzo di montaggio rivolto verso le sezioni di tessuto.
2. Premere delicatamente la coprioggetto con il pollice per distribuire uniformemente il mezzo di montaggio su tutte e tre le sezioni ed eliminare le bolle d’aria.
  NOTA: È necessaria una coprioggetto 24 × 50 mm per coprire tre sezioni su un vetrino; 24 × 40 mm per due sezioni; e 24 × 24 mm per una sezione. È importante completare il montaggio entro 30 s per vetrino poiché il mezzo di montaggio può asciugarsi rapidamente a causa del flusso d’aria costante nella cappa, causando l’evaporazione rapida di Xilene II dal vetrino e rendendo le sezioni fragili.
Essiccazione all’aria e microscopia ottica:
1. Far asciugare i vetrini all’aria sotto cappa chimica per almeno 2 h prima della valutazione e dell’acquisizione delle immagini mediante microscopio ottico. Una volta asciutti, conservare i vetrini montati in cassette per vetrini a temperatura ambiente per anni.

2. IHC a due colori per sezioni tumorali cerebrali in FFPE

NOTA: Il seguente protocollo descrive un flusso di lavoro IHC cromogenico a due colori basato su substrato per la rilevazione simultanea di due antigeni all'interno della stessa sezione di tumore cerebrale in FFPE. Rispetto all'IHC a singolo colore, il flusso di lavoro a due colori richiede più tempo poiché prevede cicli di colorazione sequenziali con incubazioni indipendenti di anticorpi primari, inclusi passaggi di incubazione notturna per ogni ciclo di colorazione. Tuttavia, questo protocollo prolungato consente una rilevazione simultanea affidabile degli antigeni all'interno della stessa sezione di tessuto, preservando al contempo la morfologia del tessuto e mantenendo una chiara separazione dei segnali cromogenici in microscopia ottica.

Deparaffinizzazione (20 min):
1. Seguire lo stesso processo di deparaffinizzazione descritto sopra per l'IHC monocromatica al punto 1.1 in una cappa aspirante, ma utilizzare agenti di chiarificazione non a base di xilene (ad esempio, Histo-Clear I e Histo-Clear II invece dello xilene).
  ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) come al punto 1.1 ed eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante. Si raccomanda Histo-Clear poiché il cromogeno è parzialmente solubile nello xilene, e una procedura priva di xilene aiuta a preservare l'intensità della colorazione durante l'IHC bicromatica. Non permettere che le sezioni si secchino. Queste soluzioni di chiarificazione possono essere riutilizzate se conservate in contenitori di vetro ermetici e appaiono pulite.
Riidratazione graduale (15 min):
1. Uguale all'IHC monocromatica come descritto al punto 1.2. Riidratare le sezioni in modo sequenziale con una graduale diminuzione della concentrazione di etanolo (100%, 90% e 70%) per 5 min in ciascun passaggio.
  NOTA: Qui si utilizza un set separato di etanolo a gradazione crescente privo di xilene, poiché l'etanolo a gradazione crescente usato per l'IHC monocromatica al punto 1.2 è probabilmente contaminato con Xylene II.
Risciacquo con acqua (5 min):
1. Uguale all'IHC monocromatica al punto 1.3; posizionare i vetrini in acqua distillata per 5 min per completare il processo di riidratazione.
  NOTA: Uguale al punto 1.3; preparare la soluzione per il recupero dell'antigene durante questo periodo di 5 min.
Recupero dell'antigene (~20 min): Seguire lo stesso procedimento di recupero dell'antigene descritto per l'IHC monocromatica al punto 1.4.
Raffreddamento (10–20 min): Seguire lo stesso processo di raffreddamento descritto per l'IHC monocromatica al punto 1.5.
Lavaggio con DPBS (10 min): Seguire il procedimento di lavaggio della soluzione di recupero dell'antigene descritto per l'IHC monocromatica al punto 1.6.
Barriera idrofoba (<1 min/vetrino):
1. Durante il lavaggio con DPBS al punto 2.6, creare una barriera idrofoba intorno alle sezioni di tessuto seguendo lo stesso procedimento/protocollo del punto 1.7.
2. Utilizzare la penna per barriera idrofoba per tracciare una barriera repellente ai liquidi intorno a ciascuna sezione di tessuto, quindi riportare il vetrino nella soluzione di lavaggio DPBS nel contenitore di colorazione. Ripetere questi passaggi per tutti i vetrini.
Blocco della fosfatasi alcalina (5 min):
1. Dopo aver completato le barriere idrofobe su tutte le sezioni di tessuto, rimuovere i vetrini dal contenitore di colorazione, posizionarli in piano nella camera umidificata, aggiungere una goccia di soluzione bloccante per la fosfatasi alcalina endogena (ad esempio, BLOXALL) per ogni sezione ed incubare le sezioni per 5 min. Procedere immediatamente al punto 2.9.
  NOTA: Poiché nel protocollo di IHC bicromatica si utilizzano anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina (AP), è essenziale bloccare l'attività della fosfatasi alcalina endogena per ridurre il segnale di fondo durante lo sviluppo del colore rosso o blu. Qui si utilizza la soluzione bloccante BLOXALL per inibire la fosfatasi alcalina endogena. Inoltre, inibisce la perossidasi endogena, quindi questa soluzione bloccante può essere utilizzata anche nel protocollo di IHC monocromatica per bloccare l'attività della perossidasi endogena, al posto della soluzione di H₂O₂ al 3%.
Lavaggio con DPBS (10 min):
1. Risciacquare i vetrini in soluzione DPBS 1× nel contenitore di colorazione due volte per 5 min ciascuno.
2. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere i vetrini dal contenitore di colorazione, posizionarli in piano nella camera umidificata e aggiungere acqua distillata ai bordi della camera umidificata.
  NOTA: Non permettere che le sezioni si secchino; procedere immediatamente al blocco del legame antigeno-anticorpo non specifico al punto 2.10.
Blocco con siero (~70 min):
1. Seguire lo stesso procedimento di blocco con siero descritto nel protocollo di IHC monocromatica al punto 1.10.
  1. Prima, bloccare con il buffer bloccante universale (BSA al 5%; 50 µL/sezione) per 30 min a temperatura ambiente, quindi con siero normale di cavallo al 2,5% (una goccia/sezione), corrispondente alla specie ospite dell'anticorpo secondario anti-IgG coniugato con AP, per altri 30 min a temperatura ambiente con il coperchio della camera umidificata chiuso.
  2. Dopo questo periodo, tamponare delicatamente i vetrini su carta assorbente per eliminare il siero e procedere al punto 2.11.
    NOTA: Preparare l'anticorpo primario I (vedi Tabella 1) durante l'ultimo minuto del passaggio di blocco, come descritto al punto 1.10.
Incubazione con anticorpo primario I (~16 h):
1. Seguire lo stesso procedimento di incubazione con l'anticorpo primario descritto al punto 1.11. Ad esempio, aggiungere ~50 µL di anticorpo anti-CD3 da coniglio, diluito 1:100 in siero normale di cavallo al 2,5% (vedi Tabella 1), a ciascuna sezione di tessuto.
2. Incubare per tutta la notte (~16 h) a 4 °C in una camera umidificata.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Seguire lo stesso procedimento di lavaggio (3 passaggi di lavaggio, 5 min ciascuno) descritto per il protocollo di IHC monocromatica al punto 1.12.
2. Dopo il terzo lavaggio, posizionare i vetrini in piano all'interno della camera umidificata. Procedere immediatamente al punto 2.13.
  NOTA: Stesse note del punto 1.12, ad esempio, ciascun tempo di lavaggio può essere esteso a 10–15 min e il lavaggio deve essere delicato e statico. Non permettere che le sezioni si secchino.
Incubazione con anticorpo secondario I (~32–35 min):
1. Aggiungere una goccia per sezione di anticorpo secondario anti-IgG da coniglio coniugato con AP (vedi Tabella 2) ed incubare le sezioni di tessuto per 30 min a temperatura ambiente con il coperchio della camera umidificata chiuso.
  NOTA: L'anticorpo secondario può essere diluito 1:1 in PBS per ridurre il segnale di fondo al punto 2.15.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Seguire lo stesso procedimento di lavaggio con DPBS 1×/0,1% Tween 20, come al punto 1.14.
2. NOTA: Durante l'ultimo passaggio di lavaggio, preparare fresca la soluzione di substrato lavorata (5 mL, come raccomandato; vedi Tabella 3) secondo le istruzioni del produttore (vedi preparazione dei reagenti nel File Supplementare 1).
Sviluppo del colore rosso (12–15 min):
1. Dopo aver completato il punto 2.14, posizionare i vetrini in piano sul banco di lavoro con uno sfondo bianco, come carta assorbente bianca, come descritto al punto 1.15.
2. Mescolare accuratamente la soluzione di substrato rosso appena preparata, quindi aggiungere 50 µL a ciascuna sezione di tessuto (scartare qualsiasi soluzione in eccesso).
3. Incubare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente finché non appare il colore rosso, controllando periodicamente ogni 2–3 min contro uno sfondo bianco o al microscopio ottico.
  NOTA: Il tempo necessario per lo sviluppo del colore rosso varia a seconda dei marcatori e può richiedere 20–30 min. Tuttavia, per la colorazione delle cellule CD3⁺ in sezioni tumorali cerebrali 005 con il sistema di rilevamento AP, lo sviluppo del colore rosso avviene di solito entro 12–15 min.
Risciacquo con tampone (5 min):
1. Non appena appare il segnale desiderato di colore rosso al punto 2.15, risciacquare le sezioni in DPBS 1×/0,1% Tween 20 per 5 min in un contenitore di colorazione.
2. Durante questo tempo di lavaggio, preparare fresco l'anticorpo primario II in un opportuno buffer bloccante (ad esempio, anticorpo anti-Ki67 da coniglio diluito 1:100 in siero normale di cavallo al 2,5%; vedi Tabella 1).
  NOTA: A differenza del risciacquo con acqua distillata usato nell'IHC monocromatica (punto 1.16), qui si utilizza DPBS/0,1% Tween 20 non solo per arrestare la reazione, ma anche per rimuovere rigorosamente l'eccesso di cromogeno e prepararsi al secondo ciclo di colorazione.
Incubazione con anticorpo primario II (~16 h):
1. Portare i vetrini nella camera umidificata e aggiungere ~50 µL di anticorpo anti-Ki67 da coniglio appena preparato a ciascuna sezione di tessuto. Incubare per tutta la notte (~16 h) a 4 °C.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Seguire lo stesso procedimento del punto 1.12.
2. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere i vetrini dal contenitore di colorazione e posizionarli in piano nella camera umidificata. Procedere immediatamente al punto 2.19.
Incubazione con anticorpo secondario II (~32–35 min):
1. Seguire lo stesso procedimento del punto 2.13. Aggiungere una goccia per sezione di anticorpo secondario anti-IgG da coniglio coniugato con AP (vedi Tabella 2) ed incubare le sezioni di tessuto per 30 min a temperatura ambiente con il coperchio della camera umidificata chiuso.
Lavaggio con DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Seguire lo stesso procedimento di lavaggio con DPBS 1×/0,1% Tween 20, come al punto 1.14.
  NOTA: Durante l'ultimo passaggio di lavaggio, preparare fresca la soluzione di substrato lavorata (5 mL, come raccomandato; vedi Tabella 3) secondo le istruzioni del produttore (vedi preparazione dei reagenti nel File Supplementare 1).
Sviluppo del colore blu (10–12 min):
1. Dopo aver completato il punto 2.20, posizionare i vetrini in piano sul banco di lavoro con uno sfondo bianco.
2. Mescolare accuratamente la soluzione di substrato blu appena preparata, quindi aggiungere 50 µL a ciascuna sezione di tessuto (scartare qualsiasi soluzione in eccesso).
3. Incubare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente finché non appare il colore blu, controllando periodicamente ogni 2–3 min contro uno sfondo bianco o al microscopio ottico.
  NOTA: Come per lo sviluppo del colore rosso al punto 2.15, il tempo necessario per lo sviluppo del colore blu può richiedere 20–30 min. Tuttavia, per la colorazione delle cellule Ki67⁺ in sezioni tumorali cerebrali 005 con il sistema di rilevamento AP, il colore blu si sviluppa entro 10–12 min.
Lavaggio con tampone (5 min):
1. Non appena appare il segnale desiderato di colore blu al punto 2.21, immergere le sezioni in DPBS 1×/0,1% Tween 20 per 5 min in un contenitore di colorazione. Scartare la soluzione di lavaggio.
Risciacquo con acqua (1 min): Risciacquare le sezioni in acqua distillata per 1 min. Scartare l'acqua distillata dopo il risciacquo.
Disidratazione graduale (15–17 min):
1. Immergere i vetrini in etanolo al 70% nel contenitore di colorazione per 5 min (quindi riportare l'etanolo al 70% nella bottiglia di vetro per il riutilizzo), seguito da etanolo al 90% per 5 min (quindi riportarlo nella bottiglia) e infine in etanolo al 100% per 5 min (quindi riportarlo nella bottiglia).
2. Ripetere ogni passaggio in una cappa aspirante. Procedere al punto 2.25.
  NOTA: Le stesse soluzioni di etanolo (senza xilene) usate al punto 2.2 vengono utilizzate in questo passaggio di disidratazione e possono essere riutilizzate molte volte se appaiono pulite.
Chiarificazione senza xilene:
1. Utilizzare le stesse soluzioni senza xilene (cioè, Histo-Clear) usate al punto 2.1 per pulire le sezioni di tessuto/vetrini.
  1. Prima, immergere i vetrini nella soluzione senza xilene I nel contenitore di colorazione per 10 min (quindi riportare la soluzione senza xilene I nella bottiglia di vetro per il riutilizzo) e poi nella soluzione senza xilene II per ulteriori 10 min.
  2. Mantenere i vetrini nella soluzione senza xilene II fino al completamento del montaggio (cioè, punto 2.26).
    NOTA: Le sezioni possono rimanere più a lungo nella soluzione senza xilene II, se necessario, per il montaggio.
    ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) come al punto 1.1 ed eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante.
Montaggio senza xilene:
1. Rimuovere i vetrini uno alla volta dalla soluzione senza xilene II e posizionarli in piano in una cappa aspirante. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio senza xilene su un coprioggetto di dimensioni appropriate, quindi posizionare il coprioggetto sul vetrino, con il mezzo di montaggio rivolto verso le sezioni di tessuto.
2. Premere delicatamente il coprioggetto con il pollice per distribuire uniformemente il mezzo di montaggio su tutte e tre le sezioni e rimuovere le bolle d'aria.
  NOTA: Completare il montaggio entro 30 s per vetrino, poiché il mezzo di montaggio può asciugarsi rapidamente. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) come al punto 1.1 ed eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante.
Essiccazione all'aria e microscopia ottica: Far asciugare i vetrini all'aria nella cappa aspirante per almeno 2 h prima della valutazione e dell'acquisizione delle immagini mediante microscopio ottico. Una volta asciutti, i vetrini montati possono essere conservati in scatole per vetrini a temperatura ambiente per anni.

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Risultati

L'IHC a singolo colore che utilizza il sistema di rilevamento cromogenico basato sull'HRP ha prodotto una colorazione chiara e riproducibile in sezioni di tumore cerebrale FFPE 005. Le immagini rappresentative della colorazione degli antigeni di superficie sono mostrate in Figura 1, che dimostrano il rilevamento efficace dei marcatori delle cellule T (CD3, CD4, CD8), dei marcatori dei macrofagi associati al tumore (TAM) (CD68, F4/80) e della molecola del checkpoint immunitario programmed dea...

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Discussione

Questo studio descrive un protocollo cromogenico basato su substrato dettagliato e riproducibile per la rilevazione singola e doppia colorazione di antigeni di superficie e intracellulari in tessuti tumorali cerebrali in blocchetti di paraffina (FFPE) derivati da un modello ortotopico di GSC. L'obiettivo principale dello studio era metodologico, volto a stabilire un protocollo pratico, passo dopo passo, per una rilevazione cromogenica affidabile degli antigeni in tessuti di GBM immunocompetenti.

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Dichiarazioni

S.D.R. è co-inventore di brevetti relativi ai virus erpetici oncolitici, di proprietà e gestiti dalla Georgetown University e dal Massachusetts General Hospital, che hanno ricevuto royalties da Amgen e Acti\Vec Inc., e ha svolto attività di consulenza ricevendo compensi da Replimune, Cellinta e Greenfire Bio, oltre a compensi e partecipazioni azionarie da EG 427. Gli altri autori dichiarano che questo manoscritto è stato preparato in assenza di qualsiasi rapporto commerciale o finanziario che possa essere considerato un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

D.S. è stato sostenuto in parte da un fondo del College of Science and Technology della North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T), da una borsa di studio per docenti (GRADS-4C) presso la NCA&T e da un finanziamento del NIH (1R16NS147983-01). Allo stesso modo, S.D.R. è stato sostenuto in parte dalla cattedra Thomas A. Pappas in Neuroscienze, mentre R.H.N. è stato sostenuto in parte da un finanziamento del NIH (1R35GM153737). Ringraziamo il dottor Inder Verma e il dottor Yasushi Soda per i 005 GSCs.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bottiglie di vetro da 2 L	Corning	CORN1395-2L	Utilizzate per la preparazione e lo stoccaggio di DPBS 10×, DPBS 1×, acqua distillata e tampone citrato di sodio
Beccherino di vetro Pyrex da 2 L	Corning	1000-2L	Utilizzato per il recupero dell'antigene mediato da microonde nel tampone citrato di sodio (volume operativo di 600–800 mL)
Serum normale di cavallo al 2,5% o serum normale di capra			Forniti già pronti insieme agli anticorpi secondari da Vector Laboratories. Utilizzati per il blocco specifico per specie e per la diluizione degli anticorpi, in base alla specie ospite dell'anticorpo secondario (anti-rabbit o anti-rat IgG), per minimizzare il legame non specifico e la colorazione di fondo
Peroxido di idrogeno al 30% (H₂O₂)	Fisher Scientific	BP2633500
Bottiglie di vetro da 500 mL	VWR International	VWRU10754-818	Utilizzate per la preparazione e lo stoccaggio di reagenti infiammabili per l'IHC monocromatica e di reagenti privi di xilene per l'IHC bicolore
Carta assorbente da banco con Kimwipes			Utilizzata durante le procedure di colorazione per rimuovere l'eccesso di anticorpo o soluzione di lavaggio dalle sezioni di tessuto prima di incubazioni successive, minimizzando il trascinamento di reagenti e la contaminazione incrociata
Anti-CD3e	Abcam	ab5690
Anti-CD4	eBioscience	14-9766-80
Anti-CD68	Abcam	ab125212
Anti-CD8a	eBioscience	14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3	CST	9661
Anti-F4/80	Abcam	ab111101
Anti-FoxP3	Abcam	ab54501
Anti-GFP	Abcam	ab183734
Anti-Granzyme B	Abcam	ab4059
Anti-Ki67	Abcam	ab16667
Anti-NeuN	CST	24307
Anti-PD-L1	Abcam	ab205921
Anti-pSTAT1	CST	9167
Anti-T-bet	Abcam	ab91109
AP anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	MP-5401
AP anti-rat IgG	Vector Laboratories	MP-5404-15
Soluzione bloccante BLOXALL	Vector Laboratories	SP-6000-100	Utilizzata principalmente nell'IHC bicolore per inibire l'attività della perossidasi endogena e della fosfatasi alcalina
Albumina sierica bovina (BSA)	Bioworld	22070007-2	Utilizzata per preparare un tampone di blocco universale al 5% per ridurre il legame non specifico
Mezzo di montaggio permanente Cytoseal 60	Electron Microscopy Sciences	18006	Mezzo di montaggio compatibile con xilene, utilizzato per l'IHC monocromatica
Substrato e cromogeno DAB	DAKO	K346811-2	Utilizzati per la rilevazione cromogenica monocromatica basata su HRP. Preparare immediatamente prima dell'uso aggiungendo 1 goccia di cromogeno a 1 mL di substrato DAB secondo le istruzioni del produttore’. La soluzione operativa non utilizzata deve essere smaltita dopo la preparazione. Il DAB è un potenziale cancerogeno e deve essere manipolato in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza e sulla sicurezza chimica
Acqua distillata			Utilizzata per la preparazione di reagenti, lavaggi e tamponi. Può essere utilizzata anche acqua ultrapura o Milli-Q
DPBS (soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco’s)	Corning	55-031-PC
Etilene, 200 proof	Decon Labs	2701
Vetrini microscopici Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Vetrini di vetro carichi positivamente per sezioni di tessuto
Coprioggetti di vetro	Corning o Milipore Sigma		Le dimensioni appropriate devono essere selezionate in base al numero di sezioni di tessuto per vetrino. Le dimensioni comuni includono: 24 mm × 24 mm (singola sezione di tessuto), 24 mm × 40 mm (due sezioni di tessuto), 24 mm × 50 mm (tre sezioni di tessuto)
Ematossilina	Fisher Scientific	220-102
Histo-Clear (1 L)	Electron Microscopy Sciences	64111-01	Agente disidratante privo di xilene utilizzato per l'IHC bicolore. Preparare due bottiglie da 500 mL etichettate Histo-Clear I e Histo-Clear II
HRP anti-mouse IgG	Vector Laboratories	MP-7402-15
HRP anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	MP-7401
HRP anti-rat IgG	Vector Laboratories	MP-7444-15
Camere umidificate	Stellar Scientific	HS-120879	Per l'incubazione delle sezioni di tessuto con anticorpi primari e secondari
Penna a barriera idrofoba (penna PAP)	Vector Laboratories	H-4000	Utilizzata per creare una barriera idrorepellente attorno alle sezioni di tessuto per trattenere anticorpi e reagenti durante l'incubazione e prevenire la contaminazione incrociata tra più sezioni di tessuto sullo stesso vetrino
Kimwipes	Kimtech Science	34155	Utilizzati per la rimozione delicata dei reagenti residui e del tampone di lavaggio dalle sezioni di tessuto
Agitatore magnetico	IKA	I-10001529	Per la preparazione delle soluzioni stock di citrato di sodio e DPBS
Forno a microonde	Panasonic (Modello: NN-L931BF)	SN: 6H61050036	Capacità di 2,2 piedi cubi. Necessario per il recupero dell'antigene mediato dal calore utilizzando un becher di vetro da 2 L
Microscopio ottico Nikon	Nikon	SN: 707798	Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Telecamere: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (a colori) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/N)
Misuratore di pH	VWR International	77619-152	Per regolare il pH del tampone per il recupero dell'antigene
Pellicola trasparente	Fisher Scientific	01810	Utilizzata per coprire in modo approssimativo il tampone per il recupero dell'antigene durante il riscaldamento a microonde per minimizzare l'evaporazione e prevenire l'essiccamento del tessuto
Portavetrini in poliossimetilene (POM)	Mopec	SP234	Compatibili con i contenitori di colorazione sopra indicati; ogni portavetrini contiene fino a 24 vetrini
Bilancia di precisione	Mettler Toledo	30697420	Per pesare il citrato di sodio e la polvere di DPBS
Frigorifero	Thermo Scientific	TSG3005CA	Per lo stoccaggio di reagenti e anticorpi sensibili alla temperatura
Scatole per conservazione vetrini	Fisher Scientific	22-267294
Contenitori/dish per colorazione	Mopec	SP233	Ogni contenitore accoglie un portavetrini da 24 vetrini
Barre di agitazione	Fisher Scientific	14-512-128	Per la preparazione delle soluzioni stock di citrato di sodio e DPBS
Citrato trisodico diidrato	Thermo Scientific Chemicals	AA3643936
Tween 20	Thermo Scientific	AAJ20605AP
Mezzo di montaggio permanente VectaMount PT	Vector Laboratories	H-5600-60	Mezzo di montaggio permanente privo di xilene, utilizzato per l'IHC bicolore
Kit substrato fosfatasi alcalina Vector Blue	Vector Laboratories	SK-5300	Utilizzato per lo sviluppo del segnale cromogenico blu durante l'IHC bicolore basata su AP. Poiché il Vector Blue è parzialmente solubile in xilene, devono essere utilizzati agenti disidratanti e mezzi di montaggio privi di xilene nei protocolli di colorazione bicolore
Kit substrato fosfatasi alcalina Vector Red	Vector Laboratories	SK-5100	Utilizzato per lo sviluppo del segnale cromogenico rosso durante l'IHC bicolore basata su AP
Xilene (1 L)	StatLab	8400-1	Utilizzato come agente di deparaffinizzazione e disidratazione per l'IHC monocromatica. Preparare due bottiglie da 500 mL etichettate Xilene I e Xilene II

Riferimenti

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