Microaghi Raman a diffusione superficiale redox per monitorare le risposte agopunture in ratti con tolleranza al glucosio compromessa

Sommario

Questo studio esplorativo su modello ratto presenta un microago attivo con scattering Raman potenziato superficiale (SERS) sensibile al redox per interventi di agopuntura simultanea e il tracciamento ratiometrico degli indici SERS legati alla capacità ossidativa locale e al potenziale redox nei ratti con tolleranza al glucosio compromessa.

Abstract

La tolleranza al glucosio (IGT) compromessa è associata a un'omeostasi redox disturbata e a un aumento dello stress ossidativo, ma il monitoraggio dinamico in vivo dei cambiamenti associati al redox durante l'intervento di agopuntura rimane tecnicamente complesso. Questo studio ha sviluppato un sistema di microago attivo per scattering Raman potenziato superficiale (SERS) sensibile al redox per interventi simultanei di agopuntura e il tracciamento relativo dei SERS correlati alla capacità ossidativa (OC) e al potenziale redox (RP) nei ratti con IGT. Sonde SERS sensibili a ossidativo e redox sono state preparate funzionalizzando nanogusci d'oro (GNS) con p-fenilenamina (p-PDA) per la risposta agli OC e antrachinone per la risposta RP, rispettivamente. Le sonde sono state inserite in due scanalature incise su aghi di agopuntura per costruire microaghi attivi per SERS. In questo studio esplorativo sono stati utilizzati maschi di Sprague–Dawley privi di patogeni specifici. Tre ratti hanno fatto da controlli normali e 20 ratti sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi e somministrati con streptozotocina (STZ) per indurre l'IGT. Dopo lo screening, 18 ratti IGT idonei sono stati divisi in gruppi a dieta ad alto contenuto di grassi e gruppi a dieta normale, con 9 ratti per gruppo dietetico. Ogni gruppo dietetico è stato ulteriormente suddiviso in sottogruppi con torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, con 3 ratti per sottogruppo. Il needling è stato eseguito due volte al giorno per 7 giorni consecutivi, e sono stati registrati gli indici SERS correlati a digiuno (FPG), glucosio postprandiale a 2 ore (2hPG) e gli indici SERS correlati a OC e RP. I risultati hanno mostrato che il needling nei punti di agopuntura con torsione era associato a valori più bassi di FPG e 2hPG e alterava gli indici SERS correlati a OC e RP in questo modello di ratto IGT. Poiché curve di calibrazione esterne, saggi biochimici di stress ossidativo indipendenti, test di liscivia a sonda e saghi di biocompatibilità non sono stati inclusi, i rapporti SERS devono essere interpretati come indici ottici relativi associati al redox piuttosto che come concentrazioni biochimiche assolute o valori del potenziale redox assoluto. Questi risultati supportano la fattibilità dei microaghi attivi sul SERS come piattaforma preclinica esplorativa per combinare l'intervento di agopuntura con il tracciamento SERS ratiometrico locale nei ratti IGT.

Introduzione

La tolleranza al glucosio compromessa (IGT), ovvero una diminuzione della capacità del corpo di tollerare il glucosio, rappresenta una fase di transizione tra glicemia normale e glicemia^{diabetica 1}. L'IGT è quindi un segnale chiave di allarme precoce e una fase reversibile nello sviluppo del diabete^{di tipo 2.} I dati clinici mostrano che circa il 30% della popolazione con IGT progredirà verso il diabete di tipo 2 entro 5–10^{anni 3}; tuttavia, con un intervento tempestivo, questa percentuale può essere ridotta a meno del 10^%.

L'IGT è un processo dinamico e complesso, e un ambiente persistente ad alto contenuto di glucosio è un fattore chiave per i disturbi del metabolismo^{ossidativo 5}. Quando il corpo è in uno stato prolungato di iperglicemia, la catena respiratoria mitocondriale funziona in modo anomalo e il tasso di generazione di specie reattive di ossigeno aumenta del 30–50%, aumentando direttamente il potere ossidativo^{nel corpo 6}; Contemporaneamente, alti livelli di zucchero inibiscono l'attività di enzimi chiave, come la glutatione reduttasi, impedendo al sistema antiossidante di rimuovere tempestivamente le specie reattive di ossigeno in eccesso e alterando ulteriormente l'equilibrio ossidazione-riduzione. Inoltre, l'IGT è accompagnata da cambiamenti patologici, tra cui resistenza all'insulina e lieve distruzione della funzione β-cellulare, che danno origine a una serie di risposte biologiche^{e biochimiche 7,8}. Insieme all'evoluzione dello stato redox, questi cambiamenti aggravano ulteriormente la perturbazione del metabolismo del glucosio e aumentano il rischio potenziale di complicazioni diabetiche, tra cui retinopatia, nefropatia e malattie^{cardiovascolari 9,10}. Pertanto, il monitoraggio della capacità ossidativa (OC) e del potenziale redox (RP) in individui o modelli animali con IGT dovrebbe migliorare la nostra comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo della IGT e guidare la progettazione di strategie terapeutiche mirate.

L'agopuntura ha una storia di oltre 3.000 anni e ha dimostrato buona efficacia clinica nel trattamento di molte malattie¹¹. Inoltre, numerosi studi sperimentali su animali hanno dimostrato che l'agopuntura esercita effetti benefici nella regolazione degli stati di stress ossidativo nei modelli animali, potenziando il sistema enzimatico antiossidante e riducendo la perossidazione^{lipidica 12}. Come pratica medica tradizionale cinese, l'agopuntura ha anche dimostrato benefici significativi nel trattamento del diabete e dell'IGT. Sono stati segnalati che i punti di agopuntura Guanyuan (CV4) e Sanyinjiao (SP6) attivano la via SIRT1/PGC-1α nel muscolo scheletrico, alleviando così la resistenza all'insulina dei topi obesi^{diabetici 13}. Inoltre, i punti di agopuntura di Tianshu (ST25) modulano l'attività dei neuroni inibitori del glucosio situati nella regione ipotalamica laterale e contribuiscono alla regolazione del metabolismo^{glicolipidico 14}. Tuttavia, la maggior parte degli studi sui meccanismi dell'agopuntura intravascolare si è concentrata principalmente sui sistemi neuromodulatorio, immunomodulatore e gastrointestinale, in cui l'agopuntura può influenzare il metabolismo del glucosio modulando la funzione autonoma o regolare indirettamente i livelli di glucosio nel sangue migliorando l'equilibrio della flora^{intestinale 15,16}. Il meccanismo specifico dell'effetto dell'agopuntura nel trattamento con IGT e i suoi effetti sullo stress ossidativo sono mancati di indagini approfondite e di supporto di dati sperimentali.

La diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS) offre grande sensibilità e specificità, permettendo la rilevazione di una vasta gamma di analiti. Le nano-sonde SERS basate su nano-fibre^{ottiche 17}, membrane di chitosano¹⁸ e studi precedenti hanno dimostrato che gli aghi di^{agopuntura 19} possono essere utilizzati per la rilevazione di biomarcatori, neurotrasmettitori e altri aspetti della biochimica cellulare in vivo. Gli aghi di agopuntura, in particolare, rappresentano strumenti promettenti per i test dei tessuti profondi, permettendo un monitoraggio in situ minimamente invasivo seguito da un'analisi ex vivo. L'agopuntura, come metodo terapeutico ben consolidato, ha una gamma estremamente ampia di applicazioni cliniche. Studi recenti hanno dimostrato che fibre ottiche, medicazioni per ferite e dispositivi a microago abilitati per SERS possono supportare il tracciamento in situ o minimamente invasivo dei segnali associati al redox in contesti biologicamente^{rilevanti 20,21}. Parallelamente, aghi di agopuntura attivi per SERS e sistemi di microaghi correlati sono emersi come promettenti portatori per integrare la capacità di rilevamento con l'intervento^{tissutale 19}, portando a microaghi attivi per SERS con risposta in vivo e capacità di rilevamento SERS in vitro.

Il presente studio si basa sulla strategia precedentemente riportata con la micro-aghi attivi SERS per rilevare segnali correlati alla capacità ossidativa e al potenziale redox nei modelli di stress indotti dalla glucosio. Tuttavia, il lavoro presente differisce dallo studio precedente sia per il contesto biologico che per lo scopo sperimentale. In particolare, questo studio applica la piattaforma a microago attivi SERS a un modello di ratto con tolleranza al glucosio compromessa e integra il tracciamento SERS proporzionale locale con l'intervento di agopuntura. Il studio attuale confronta inoltre i punti di agopuntura con siti non agopunturi adiacenti, valuta diverse manipolazioni di needling e monitora gli indici SERS associati al redox durante un periodo di intervento di 7 giorni. Rispetto alle fibre ottiche basate su SERS, medicazioni per ferite e microaghi attivi a SERS progettati principalmente per il rilevamento biochimico a sito singolo o a funzione singola, la piattaforma attuale offre due progressi. Innanzitutto, le sonde rispondenti a OC e RP sono integrate in due scanalature incise indipendenti su un singolo ago di agopuntura, consentendo il monitoraggio simultaneo dei parametri redox complementari. In secondo luogo, l'ago di agopuntura funziona non solo come portatore della sonda SERS, ma anche come dispositivo terapeutico, permettendo di effettuare il monitoraggio redox durante l'intervento di agopuntura piuttosto che dopo il trattamento. Come mostrato nella Figura 1, dopo che i microaghi sono stati inseriti nei tessuti, si formano piccole ferite e le sonde nei due scanalature reagiscono con i tessuti, permettendo loro di rilevare i livelli di OC e RP in vivo. L'obiettivo dello studio era utilizzare questi microaghi attivi nel SERS per esaminare i cambiamenti nell'OC e nella RP nei ratti con IGT e determinare gli effetti dell'agopuntura abbinata a punti di agopuntura in questi animali, ottenendo così preziose informazioni sul meccanismo degli effetti dell'agopuntura nel trattamento dell'IGT e sulla relazione tra redox e stati iperglicemici anomali.

Protocollo

Animali e modelli dell'IGT

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Istituto di Ricerca dell'Università Sud-Est di Suzhou (n. di approvazione. SEU-IACUC-20250318007) e sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I ratti sono stati raccolti e ospitati in condizioni di specifici patogeni liberi (SPF) a 25 °C con un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di oscurità. Per le procedure che richiedevano anestesia, i ratti venivano anestetizzati usando isoflurano somministrato in ossigeno attraverso una camera di induzione e mantenuti tramite un cono nasale. L'isoflurano è stato usato al 3% per l'induzione e all'1% per il mantenimento, con la concentrazione regolata in base alla frequenza respiratoria e alla risposta procedurale.

Una profondità anestetica adeguata è stata confermata prima di pungente o iniezione dalla perdita del riflesso di raddrizzamento e dall'assenza di risposta al pizzicamento del dito del piede. Durante l'anestesia, venivano monitorati il circuito respiratorio, la posizione corporea e il recupero, e gli animali venivano posizionati su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea. Gli animali erano ospitati 2 per gabbia con libero accesso a cibo e acqua, a meno che non fosse necessario digiunar per il test del glucosio. Dopo l'arrivo, i ratti sono stati acclimatati per una settimana prima dell'induzione del modello. Il benessere animale veniva monitorato quotidianamente, inclusi attività generali, toelettatura, assunzione di cibo, peso corporeo, condizioni del sito di iniezione e recupero dopo anestesia. Al termine dello studio, i ratti sono stati soppressi secondo il protocollo approvato per gli animali. L'eutanasia è stata eseguita tramite inalazione graduale di CO₂ a riempimento, seguita dalla conferma della morte tramite il metodo della lussazione cervicale. Gli animali che soddisfacevano i criteri umani di endpoint, tra cui grave perdita di peso, immobilità persistente, respirazione anomala, incapacità di mangiare o bere, o grave disagio, sono stati eutanasiati immediatamente invece di essere mantenuti fino al punto finale programmato. In questo studio sono stati utilizzati maschi di grado Sprague–Dawley di grado specifico e privo di patogeni specifici, con un peso di 200 ± 20 g. Dopo una settimana di acclimatazione, i ratti sono stati assegnati casualmente in due gruppi: i tre ratti del gruppo normale sono stati nutriti con cibo normale, mentre i 20 ratti del gruppo modello sono stati nutriti con cibo ad alto contenuto di grassi (50% cibo basale + 10% strutto + 25% saccarosio + 15% polvere di tuorlo) per 3 settimane. Gli animali del gruppo modello hanno ricevuto iniezione intraperitoneale di 20 mg/kg di soluzione STZ al 2% (solubilizzata in 0,1 mol/L, pH 4,4 citratto tampone) per 12 ore, dopo 12 ore di digiuno senza restrizione idrica. Coloro che appartenevano al gruppo normale ricevevano un'iniezione intraperitoneale della corrispondente dose di soluzione tampone di citrato dopo essere stati nutriti con cibo normale. Un test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (IPGTT) è stato eseguito una settimana dopo. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

La glicemia a digiuno (FPG) è stata misurata tramite prelievo di sangue dalla punta della coda di ratti in ciascun gruppo dopo 12 ore di digiuno senza restrizione idrica, e 2 ore di glucosio postprandiale (2hPG) sono state registrate dopo l'iniezione intraperitoneale di destrosio al 20% 20% 2 g/kg. Nel gruppo normale, l'intervallo FPG era di 5,1–6,6 mmol/L, mentre quello di glucosio di 2hPG era 7,3–9,4 mmol/L, rispetto a un FPG di ≤7,0 mmol/L e un intervallo di 2hPG di 10–16 mmol/L nel gruppo modello. Dei 20 ratti assegnati all'induzione modello IGT, 18 soddisfarono i criteri predefiniti dell'IGT dopo l'IPGTT e furono inclusi nell'esperimento di intervento successivo. Due ratti sono stati esclusi perché i loro valori FPG o 2hPG erano fuori dal range IGT predefinito. I 18 ratti ammessi sono stati poi assegnati casualmente a un gruppo a dieta ricca di grassi e a uno a dieta normale, con 9 ratti per gruppo. Ogni gruppo dietetico è stato ulteriormente suddiviso in tre sottogruppi: torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, con tre ratti per sottogruppo. Si trattava di uno studio esplorativo di sviluppo di metodi progettato per valutare la fattibilità di combinare l'intervento con l'agopuntura con il tracciamento ratiometrico basato su SERS in un modello preclinico di ratti IGT. Non è stato effettuato alcun calcolo formale della potenza statistica. La dimensione del sottogruppo di tre ratti è stata selezionata sulla base della fattibilità, degli studi preliminari SERS-microago e del principio di riduzione animale. I ratti venivano assegnati casualmente dall'esperimento; Non furono eseguiti occultamenti formali e accecamento.

I protocolli di trattamento con agopuntura sono stati esaminati facendo riferimento alle linee guida cliniche basate sull'evidenza per la medicina tradizionale cinese e alla fattibilità degli esperimenti sugli^{animali 22}. I punti di agopuntu selezionati sono stati Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), bilaterale Tianshu (ST25), bilaterale Shuidao (ST28) e bilaterale Zusanli (ST36). RN12, RN9 e RN7 erano localizzati sulla linea medio-anteriore e trattati come singoli punti della linea mediana, mentre ST25, ST28 e ST36 sono stati trattati bilateralmente. Le coppie dei punti di agopuntura si basavano su quelle utilizzate per il trattamento clinico di^{IGT 23}. L'adattamento si basava sulla letteratura^24,25, utilizzando il metodo dicotomico. Per i ratti, i punti di agopuntura sono stati localizzati in base a punti di riferimento anatomici e conversione proporzionale rispetto alle posizioni standard dei punti di agopuntura umani. I punti addominali RN/CV sono stati identificati lungo la linea medio-anteriore utilizzando il processo xifoide, l'ombelico e la simfisi pubica come punti di riferimento anatomici. ST25 è stata segnata bilateralmente a livello ombelicale e ST28 è stata contrassegnata bilateralmente nella regione inferiore dell'addome, alla stessa distanza laterale dalla linea medio-anteriore. ST36 è stato identificato sul ramo posteriore anterolaterale nella regione tibiale anteriore, lateralmente al tubercolo tibiale. I siti di confronto adiacenti non legati all'agopuntura erano contrassegnati a 5 mm laterali rispetto ai corrispondenti punti di agopuntura e al di fuori della linea meridiana riconosciuta, evitando però vasi visibili, cicatrici e precedenti punti di puntura. Prima dell'agunciamento, i ratti venivano anestetizzati con isoflurano secondo il protocollo approvato per animali e posizionati in posizione supina su un cuscinetto riscaldante. La pelle addominale e posteriore sopra ciascun sito bersaglio è stata rasata e disinfettata con il 75% di etanolo. Microaghi attivi per SERS sono stati inseriti approssimativamente perpendicolari alla pelle fino a una profondità di circa 10 mm. Per i gruppi di torsione dei punti di agopuntura, microaghi attivi per SERS sono stati inseriti nei punti selezionati e ruotati delicatamente in modo bidirezionale durante il periodo di ritenzione di 20 minuti. Per i gruppi non basati sul sito di agopuntura, la stessa procedura è stata eseguita nei punti di confronto non agopuntura adiacenti a 5 mm. Per i gruppi a inserimento diretto, microaghi attivi SERS sono stati inseriti nei punti di agopuntura e trattenuti per 20 minuti senza torsione. Tutte le procedure di needling venivano eseguite dallo stesso operatore addestrato per minimizzare la variazione tra operatori.

Il needling veniva eseguito due volte al giorno, alle 10:00 e alle 15:00, per 7 giorni consecutivi. Prima di ogni procedura giornaliera, la FPG veniva misurata dopo 8 ore di digiuno senza restrizione idrica. Dopo ogni procedura giornaliera di needling, sono state registrate le risposte di OC e RP. Il giorno 7, dopo il trattamento di agopuntura, è stata eseguita la IPGTT e sono stati registrati valori di 2hPG.

Precauzioni

La streptozotocina è pericolosa e dovrebbe essere trattata come una sostanza chimica tossica. Prepara la soluzione di streptozotocina in una cappa chimica o in un armadietto certificato per la biosicurezza, indossando un camice da laboratorio, guanti di nitrilo, occhiali protettivi e mascherina. Siringhe, aghi, salviette, lettieri, gabbie e rifiuti animali contaminati da streptozotocina devono essere maneggiati secondo le procedure istituzionali di rifiuti biologici e chimici pericolosi. Gli aghi e le siringhe usati devono essere gettati immediatamente in contenitori per pezzi taglienti resistenti a punture senza ricappiare.

Fabbricazione di microaghi attivi SERS per la rilevazione di OC e RP

Sono stati preparati aghi per agopuntura come precedentemente^{riportato 26}. Durante lo studio, microaghi attivi per SERS sono stati realizzati utilizzando lo stesso tipo di aghi commerciali in acciaio inox (0,25 mm × 26 mm). Gli aghi venivano inseriti approssimativamente perpendicolarmente alla pelle fino a una profondità di 10 mm. Per i gruppi di torsione, la rotazione bidirezionale manuale è stata applicata in modo delicato e costante per 20 minuti durante il periodo di ritenzione dallo stesso operatore addestrato. La manipolazione non era controllata dallo strumento; pertanto, la frequenza e l'ampiezza esatte della rotazione non sono state quantificate. Questa limitazione è stata riconosciuta nella Discussione.

Inizialmente, gli aghi sono stati immersi in una soluzione PMMA al 20% (p/v) in MMA, seguiti dall'asciugatura a temperatura ambiente (25 °C) per 1 giorno. Successivamente, furono realizzate due rientranze parallele di dimensioni uniformi e forma e profondità simili nello strato protettivo PMMA (distanti 5 mm) utilizzando una piccola lama da coltello da artigianato pulita con etanolo; poi, gli aghi venivano immersi in acido solforico da 0,5 M che fungeva da elettrolita per 10 secondi per sottoporsi all'incisione elettrochimica a una tensione di 12 V, generando così due scanalature quasi circolari nei punti di incisione. In terzo anno, dopo aver risciacquato tre volte, gli aghi sono stati immersi a temperatura ambiente per 24 ore in una soluzione etanolica contenente 0,1 mol L⁻¹ MPTES e 0,3 mol L⁻¹ APTES, conferendo così una funzionalità solfidril alle superfici scanalate. Quarto, il rivestimento è stato rimosso immergendo l'ago nella MMA. Microaghi SERS-attivi a risposta al potenziale redox sono stati preparati basandosi su un metodo^{precedentemente riportato 27}. Il substrato SERS veniva adsorbito su una delle scanalature incise di ciascun ago di agopuntura, dopo di che i microaghi attivi SERS risultanti venivano immersi in una soluzione acquosa di p-PDA a una concentrazione di 1 × ^10-4 mol/L per 60 minuti a 37 °C, producendo microaghi SERS attivi e sensibili all'ossidazione. I substrati SERS basati su nanogusci d'oro sono stati sintetizzati come descritto^{in precedenza, 28}. Nel presente lavoro, questi microaghi venivano inseriti nell'altra scanalatura di ciascun ago di agopuntura, che poi venivano lasciati asciugare naturalmente. Questo ha prodotto microaghi attivi per SERS con risposta a OC e RP.

Valutazione ex vivo della risposta a OC e RP ai microaghi attivi nel SERS

Le risposte delle sonde OC e RP sono state valutate inserendo i microaghi attivi nel SERS nel tessuto ex vivo. Per verificare la reattività della sonda OC ai cambiamenti ossidativi, sono stati registrati spettri SERS di p-PDA prima e dopo l'ossidazione. Spettri delle sonde redox SERS sono stati acquisiti anche in una soluzione fortemente riducente di_{NaBH 4} e in una soluzione fortemente ossidante di HAuCl₄. La selettività della sonda OC è stata valutata utilizzando agenti riducenti, tra cui 1 × ^10-4 M_{FeSO 4}, 1 × 10-4 M _{Na 2}SO₄ e 1 × ^10-4 M acido ascorbico, e agenti ossidanti, inclusi 1 × ^10-4 M_{CuSO 4}, 1 × 10-4 M_{H 2O 2}, 1 × ^10-4 M_{FeCl 3}, e 1 × ^10-4 M HAuCl₄. Tutte le soluzioni sono state preparate in 20 mM PBS (pH 7,4), e le sonde sono state incubate con ciascuna soluzione per 20 minuti a 37 °C. La robustezza dei microaghi attivi per SERS è stata valutata registrando le risposte OC prima e dopo la reazione con 1 × ^10-4 mol/L FeCl₃ a temperatura ambiente. Questi test ex vivo e basati su soluzione sono stati utilizzati per confermare la risposta della sonda in condizioni controllate. Tuttavia, non riproducono completamente la complessità del microambiente tissutale in vivo, dove variazioni locali del pH, adsorbimento proteico, componenti della matrice extracellulare e altre sostanze biologiche possono influenzare i segnali SERS. Pertanto, le letture in vivo di OC e RP sono state interpretate come indici SERS relativi associati al redox piuttosto che come misurazioni biochimiche indipendenti dalla matrice.

Rilevamento di OC e RP nei siti di agopuntura e non agopuntura

Per valutare le prestazioni delle sonde OC e RP nei punti di agopuntura e nei punti non agopuntura, i microaghi attivi per SERS sono stati inseriti in ratti sani ai punti di agopuntura ST36 e RN12, e a 5 mm adiacenti a ciascuno di questi punti, a una profondità di circa 10 mm, per lo stesso intervallo di tempo.

Effetti della torsione dell'ago sul rilevamento di OC e RP

Per valutare la reattività delle sonde OC e RP sotto diverse tecniche di needling, sono stati inseriti microaghi attivi per SERS nei punti di agopuntura ST36 e RN12 e 5 mm adiacenti a questi punti nei ratti sani, fino a una profondità di circa 10 mm. In ogni punto di agopuntura, un ago veniva torto, mentre l'ago corrispondente adiacente alla punta no, e viceversa (un ago adiacente al punto di agopuntura veniva torto, mentre il suo corrispettivo al punto di agopuntura no). I segnali SERS delle sonde sono stati raccolti nello stesso tempo di inserimento per ciascun ago.

Cambiamenti nell'OC e nella RP nei ratti con IGT riguardo ai punti di agopuntura, torsioni dell'ago e condizioni alimentari

Per valutare gli effetti dei punti di agopuntura, della torsione dell'ago e delle condizioni alimentari su OC e RP dei ratti con IGT, i ratti del gruppo con dieta ricca di grassi sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (A1, A2 e A3; tre ratti per gruppo), così come quelli del gruppo della dieta normale (gruppi B1, B2 e B3; tre ratti in ciascun gruppo). Per i ratti dei gruppi A1 e B1, microaghi attivi per SERS venivano inseriti nei punti di agopuntura dopo la sedazione e torsionati per 20 minuti; la stessa procedura fu eseguita per i ratti nei gruppi A2 e B2, tranne che i microaghi furono inseriti a 5 mm adiacenti ai punti di agopuntura. Per i ratti in A3 e B3, i microaghi attivi per SERS venivano inseriti nei punti di agopuntura del ratto senza torsione; Gli aghi sono stati lasciati al loro posto per 20 minuti. Il needling veniva eseguito due volte al giorno, alle 10:00 e alle 15:00, per 7 giorni. Prima di ogni procedura giornaliera, veniva utilizzato un glucometro per registrare i valori FPG per ogni gruppo di ratti (dopo il digiuno ma senza restrizione d'acqua per 8 ore). Dopo ogni giorno di needling, sono state misurate e registrate le risposte a OC e RP. Al giorno 7, dopo l'agopuntura, è stata eseguita la IPGTT su ciascun gruppo di ratti e sono stati registrati valori di 2hPG.

Caratterizzazione e misurazione

La morfologia dei microaghi attivi per SERS è stata esaminata con microscopia elettronica a scansione (SEM). Gli spettri SERS sono stati acquisiti a 25 °C, utilizzando uno spettrometro Raman configurato con un obiettivo a distanza di lavoro lunga del 50× (NA: 0,5) e un laser da 785 nm. Per tutte le misurazioni, il tempo di acquisizione era di 10 s, e il sistema Raman operava a una potenza laser nominale di 600 μW con la stessa configurazione ottica. La potenza laser effettiva fornita sulla superficie tissutale non è stata misurata direttamente in questo studio. Pertanto, gli spettri SERS sono stati utilizzati per confronti relativi tra gruppi sotto impostazioni di acquisizione identiche, e non sono state traccolte conclusioni riguardo alla sicurezza fototermica assoluta dei tessuti. I rapporti di intensità di due sonde SERS sono stati calcolati con il seguente approccio: il rapporto tra i valori di intensità a 1450 cm⁻¹ e quello a 1500 ^cm−1 è stato designato come indicatore per OC (I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ ^cm−1), dopo aver sottratto l'intensità a 1700 cm⁻¹ (come sfondo ) da ciascuno dei due picchi, rispettivamente, come nei rapporti ^{precedenti 17}; e usando I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ ^cm−1 come indicatore di RP, l'intensità a 1700 cm⁻¹ (come sfondo ) veniva sottratta da ciascuno dei due picchi, rispettivamente. I valori calcolati di_{I 1450} cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 e I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ ^cm−1 sono stati analizzati come indici relativi derivati dal SERS delle risposte associate a OC e RP, rispettivamente. Questi rapporti venivano utilizzati per confrontare i cambiamenti tra gruppi e momenti temporali con impostazioni di acquisizione identiche.

Nel presente studio non è stata stabilita alcuna curva di calibrazione esterna per convertire questi rapporti in concentrazioni assolute di specie ossidative o valori di potenziale redox elettrochimico assoluto. Ogni spettro è stato registrato due volte in cinque punti diversi della sonda SERS in tre campioni replicati. Origin veniva utilizzato per elaborare dati e produrre grafici. Per minimizzare la variabilità legata all'acquisizione, sono stati applicati a tutti i gruppi la stessa lunghezza d'onda laser, obiettivo, tempo di acquisizione, impostazione della potenza laser e flusso di lavoro di elaborazione spettrale. I potenziali effetti fototermici o fotochimici causati dall'irradiazione laser non sono stati quantificati indipendentemente e sono riconosciuti come una limitazione. I dati statistici sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). La dimensione del campione e il test statistico utilizzato per ogni esperimento o pannello di figure sono specificati nelle relative legende delle figure. Per esperimenti di validazione ex vivo della sonda, la sonda SERS o microago preparato indipendentemente veniva utilizzato come unità di analisi. Per le analisi in vivo della glicemia e dell'indice SERS, il ratto è stato utilizzato come unità di analisi biologica. Gli spettri raccolti da più punti della stessa sonda sono stati trattati come misurazioni tecniche e mediati prima dell'analisi a livello di gruppo. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software SPSS. I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando i test statistici indicati nelle relative leggende delle figure. Le misurazioni seriali di glucosio a digiuno e indice SERS durante il periodo di intervento di 7 giorni sono state interpretate come tendenze longitudinali esplorative a causa della piccola dimensione dei sottogruppi, e non è stato applicato alcun modello formale di misure ripetute o effetti misti. La significanza statistica è stata definita come p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Risultati

Fabbricazione di microaghi attivi SERS per la rilevazione di OC e RP

Per identificare i cambiamenti in OC e RP, sono stati fabbricati microaghi attivi SERS contenenti le sonde corrispondenti. Immagini rappresentative SEM confermarono la struttura a due scanalature dei microaghi attivi nel SERS. La Figura 2A mostra il corpo dell'ago di agopuntura con due scanalature incise, la Figura 2B mostra una scanalatura carica di GNS, e la Figura 2C mostra una vista ampliata della GNS distribuita all'interno della scanalatura. Queste immagini hanno confermato che le scanalature incise potevano servire come siti di carico localizzati per le sonde SERS rispondenti a OC e RP. Il rapporto delle intensità di picco I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 è stato utilizzato per rappresentare il grado in cui la p-PDA era ossidata. La Figura 3A mostra gli spettri SERS di p-PDA prima e dopo l'interazione con 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, mentre la Figura 3B presenta spettri per la sonda redox in 1 × 10⁻³ M NaBH4 e 1 × 10-4 soluzioni acquose M HAuCl₄. La risposta della sonda RP è stata espressa come rapporto di intensità massima (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1), che è diminuito con l'aumento della RP.

Per valutare la selettività della sonda responsiva alla capacità ossidativa, è stato misurato il rapporto I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ dopo esposizione a diversi agenti riducenti e ossidanti. Misurazioni indipendenti con sonda sono state effettuate con n = 3 per gruppo, e la sonda SERS o microago preparato indipendentemente è stato utilizzato come unità di analisi (Figura 3C). Rispetto al gruppo CK (test di Kruskal–Wallis seguito dal test di confronto multiplo di Dunn), gli agenti riducenti_{FeSO 4} e Na₂SO₄ non hanno alterato significativamente il rapporto I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ (p > 0,05). L'acido ascorbico (AA, p < 0,001) ha prodotto anch'esso un rapporto aumentato nelle condizioni attuali del saggio, nonostante fosse incluso come agente riducente. Pertanto, la risposta AA è stata interpretata con cautela come una risposta spettrale specifica della sonda in questo saggio basato sulla soluzione, piuttosto che come prova di comportamento ossidante. Al contrario, i reagenti ossidanti o associati all'ossidazione aumentavano il rapporto in misura variabile. Il rapporto è stato aumentato dopo l'esposizione a CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) e HAuCl₄ (p < 0,0001). Per valutare la stabilità della sonda OC a temperatura ambiente, gli spettri SERS sono stati acquisiti a intervalli orari per un periodo di 6 ore prima della reazione della sonda con 1 × 10⁻⁴ M_{FeCl 3} (Figura 3D), e i corrispondenti rapporti I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 furono calcolati. Dopo l'adsorbimento della sonda, il valore iniziale è rimasto stabile intorno a 0,20 ± 0,02, così come quello della reazione con_{FeCl 3} intorno a 0,9 ± 0,10, nell'arco di 6 ore. Questi risultati suggeriscono che il p-PDA su GNS è stabile nell'aria.

Risposte OC e RP nei punti di agopuntura e non agopuntura

Studi^{precedenti hanno mostrato} che la sonda OC raggiunge la sua massima risposta 10 minuti dopo l'inserimento. Le Figure 4A e B illustrano la risposta dei microaghi attivi per SERS nei ratti sani posti nei punti di agopuntura ST36 e RN12, così come in quelli posizionati a 5 mm adiacenti ai punti, per 10 minuti. Per questi esperimenti, n = 3 ratti per gruppo e spettri raccolti da più punti della stessa sonda sono stati trattati come repliche tecniche e mediati prima dell'analisi a livello di gruppo. I microaghi attivi per SERS hanno risposto efficacemente ai cambiamenti di OC e RP in vivo, senza differenze significative tra OC e RP nel gruppo dei punti di agopuntura rispetto a quelli non con punti di agopuntura (test t dei campioni indipendenti, p > 0,05).

Per determinare ulteriormente gli effetti della torsione dell'ago su OC locale e RP in vivo, microaghi attivi per SERS sono stati inseriti in ratti sani ai punti di agopuntura ST36 e RN12, e 5 mm oltre questi punti, fino a una profondità di 10 mm. Durante la manovra di torsione su ciascun punto di agopuntura, l'ago adiacente al punto veniva non torto, e viceversa, e sono stati registrati vari nei valori di OC e RP nel punto di puntura (Figure 4C–F). Non ci sono stati cambiamenti significativi nel CO e nella RP a seconda che la torsione fosse eseguita in nessuno dei punti di agopuntura o non nei ratti sani, né vi è stato alcun effetto della torsione in un punto adiacente (p > 0,05).

Cambiamenti nell'OC e nella RP nei ratti con IGT associati ad agopuntura, torsione dell'ago e condizioni alimentari

Per confermare l'affermazione con successo di un modello di ratto per IGT, sono stati registrati valori FPG e 2hPG utilizzando un saggio IPGTT rispettivamente su ratti modello e controllo. Il gruppo di controllo includeva n = 3 ratti, mentre il gruppo modello includeva n = 18 ratti che soddisfacevano i criteri predefiniti per la tolleranza al glucosio compromessa. I ratti modello hanno mostrato una glicemia a digiuno più elevata rispetto ai ratti di controllo (6,92 mmol/L contro 5,54 mmol/L; Test U di Mann–Whitney, p < 0,01) e una glicemia postprandiale più alta in 2 ore rispetto ai ratti di controllo (11,52 mmol/L contro 7,92 mmol/L; Test U di Mann–Whitney, p < 0,001) (Figura 5), che indica l'induzione riuscita dell'IGT negli animali modello.

Per verificare gli effetti della combinazione di punti di agopuntura, torsione dell'ago e condizioni alimentari sui ratti IGT, è stato selezionato un tipico insieme di coppie di punti di agopuntura. I 18 ratti modello idonei sono stati poi suddivisi in gruppi a dieta ricca di grassi e gruppi a dieta normale, con n = 9 ratti per gruppo dietetico. Ogni gruppo dietetico è stato ulteriormente suddiviso in tre sottogruppi di intervento: torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, con n = 3 ratti per sottogruppo. I valori FPG sono stati registrati prima di ogni giorno di needling (Figure 6A–C), e i valori di 2hPG (Figura 6D) sono stati misurati dopo 7 giorni di needling tramite test IPGTT in ciascun gruppo. In questo dataset esplorativo, non è stata osservata una differenza chiara tra FPG o 2hPG tra i gruppi modello con dieta ricca di grassi e quello normale, dopo il needling nei punti di agopuntura. I confronti tra needling nel punto di agopuntura e il needling non nel sito di agopuntura suggerirono che la torsione del punto di agopuntura era associata a valori di glucosio nel sangue più bassi nelle condizioni sperimentali attuali (test t a campioni indipendenti, p < 0,05). Poiché la dimensione del sottogruppo era piccola e la dieta dieta, la posizione dei punti di agopuntu e la manipolazione della torsione non potevano essere completamente separati statisticamente, questi risultati sono stati interpretati come osservazioni preliminari di modelli animali.

Le variazioni negli indici SERS correlati alla capacità ossidativa e al potenziale redox sono state monitorate durante una settimana di intervento di agopuntura nei ratti IGT. Per queste analisi, sono stati inclusi n = 3 ratti per sottogruppo, e ogni ratto è stato trattato come unità di analisi biologica. Nei ratti ad alto contenuto di grassi, l'indice SERS correlato alla capacità ossidativa è diminuito nel tempo nei gruppi di torsione del punto di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, mentre è rimasto relativamente più alto nel gruppo di torsione non del sito di agopuntura (Figura 7A). L'indice SERS correlato al potenziale redox è aumentato nel tempo nei gruppi di torsione del punto di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, mentre il gruppo di torsione non del sito di agopuntura ha mostrato un aumento relativamente debole (Figura 7B). Tendenze simili sono state osservate nei ratti IGT a dieta normale. L'indice SERS correlato alla capacità ossidativa è diminuito nel tempo nei gruppi di torsione del punto di agopuntura e di inserimento diretto del punto di agopuntura, con una variazione minore nel gruppo di torsione non del sito di agopuntura (Figura 7C). L'indice SERS correlato al potenziale redox è aumentato nel tempo nei gruppi di torsione del punto di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura, mentre il gruppo di torsione non del sito di agopuntura è rimasto relativamente più basso (Figura 7D).

Per confrontare ulteriormente le condizioni dietetiche sotto la stessa manipolazione dell'agopuntura, sono stati confrontati i sottogruppi di torsione dei punti di agopuntura provenienti dai gruppi dieta ad alto contenuto di grassi e quelli a dieta normale. In questo confronto, l'indice SERS correlato alla capacità ossidativa è diminuito nel tempo in entrambe le condizioni dietetiche, con una diminuzione maggiore osservata nel sottogruppo della torsione dei punti di agopuntura nella dieta normale entro il giorno 7 (Figura 7E). L'indice SERS correlato al potenziale redox è aumentato nel tempo in entrambe le condizioni dietetiche, con un valore più alto al giorno 7 nel sottogruppo della torsione del punto di agopuntura nella dieta normale (Figura 7F). Questi risultati suggeriscono che la torsione del punto di agopuntura e la normalizzazione della dieta erano associate a cambiamenti negli indici SERS associati al redox locale nei ratti IGT. Poiché ogni sottogruppo conteneva solo tre ratti e non sono stati effettuati sagaggi biochimici indipendenti sullo stress ossidativo, questi risultati dovrebbero essere interpretati come osservazioni esplorative di modelli animali piuttosto che come prove biochimiche definitive di miglioramento dello stress ossidativo.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

Tutti i dati numerici grezzi utilizzati per la generazione delle figure e l'analisi statistica, incluse misurazioni della glicemia nel genere, valori di rapporto derivati dal SERS e dati di origine per i panel di figure quantitative, sono stati organizzati e caricati come Tabella Supplementare 1. Per gli esperimenti di monitoraggio continuo della sonda generati direttamente dallo strumento analitico, i valori esportati e gli output rappresentativi generati dallo strumento utilizzati per valutare le prestazioni della sonda sono inclusi nel File Supplementare 1.

Figura 1: Flusso metodologico per l'intervento in agopuntura e il tracciamento SERS ratiometrico locale utilizzando un microago SERS attivo a doppia scanalatura. Lo schema illustra l'inserimento della microago SERS-attiva a due scanalature in un punto di agopuntura o in un sito adiacente non agopuntura, seguita dall'acquisizione spettrale Raman. Gli autori hanno creato questa figura utilizzando il software WPS, e non è richiesta alcuna licenza per copyright. Abbreviazioni: SERS = scattering Raman potenziato sulla superficie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative SEM di microaghi attivi nel SERS. (A) Corpo dell'ago per agopuntura con due scanalature; barra di scala = 200 μm; ingrandimento = 77×. (B) Una scanalatura integrata con GNS; barra della scala = 20 μm; ingrandimento = 1.000×. (C) Un'immagine ingrandita della scanalatura in B; barra di scala = 2 μm; ingrandimento = 30.000×. Abbreviazioni: SEM = microscopia elettronica a scansione; GNS = nanogusci d'oro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione delle sonde SERS OC-responsive e RP-responsive. (A) Spettri normalizzati di p-PDA prima e dopo l'interazione con FeCl₃. (B) Spettri SERS normalizzati di sonde RP in soluzioni di_{NaBH 4} e_{HAuCl 4}, rispettivamente. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ per sonde OC in varie soluzioni ossidanti e riducenti. n=3 misurazioni indipendenti con sonde per gruppo. Il test di Kruskal–Wallis seguito dal test di confronto multiplo di Dunn rispetto al gruppo CK. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). (D) Valutazione della stabilità di sei ore della sonda OC-responsiva prima e dopo la reazione con FeCl₃. Abbreviazioni: SERS = scattering Raman potenziato sulla superficie; CK = controllo controllo; p-PDA = p-fenilediamina; AA = acido ascorbico. p < 0,001, ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Indici SERS correlati a OC e RP misurati con diversi metodi di needling nei siti di agopuntura e non agopuntura in ratti sani. (A) Indice SERS correlato a OC dopo l'inserimento diretto nei punti di agopuntura e nei siti non agopunturi adiacenti. (B) Indice SERS correlato alla RP dopo l'inserimento diretto nei punti di agopuntura e nei siti non agopunturi adiacenti. (C) Indice SERS correlato a OC dopo inserzione diretta nei siti non agopunturi e torsione dell'ago nei punti di agopuntura. (D) Indice SERS correlato alla RP dopo l'inserimento diretto nei siti non agopunturi e la torsione dell'ago nei punti di agopuntura. (E) Indice SERS correlato a OC dopo l'inserimento diretto nei punti di agopuntura e la torsione dell'ago nei siti adiacenti non agopunturi. (F) Indice SERS correlato al RP dopo l'inserimento diretto nei punti di agopuntura e la torsione dell'ago nei siti non agopunturi adiacenti. OC è stato calcolato come_{I 1450} ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1, e RP come_{I 1606} ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 per ogni gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Non sono state osservate differenze significative tra i confronti accoppiati. Abbreviazioni: OC = capacità ossidativa; RP = potenziale redox. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: valori FPG e 2hPG secondo il saggio IPGTT nei ratti modello e controllo (CK). Sono stati misurati FPG e 2hPG per verificare l'istituzione del modello di ratti con tolleranza al glucosio compromessa. n = 3 ratti nel gruppo di controllo e n = 18 ratti nel gruppo modello. L'analisi statistica è stata effettuata tramite il test U di Mann–Whitney, e i risultati sono presentati come media ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Valori FPG e 2hPG per i ratti IGT durante le procedure di agopuntura. (A) Valori FPG per il gruppo che riceve agopuntura con torsione dell'ago nei punti di agopuntura e inserimento diretto dell'ago nei punti di agopuntura (n = 3 per gruppo). (B) Valori FPG per il gruppo che riceve pungente con torsione nei punti di agopuntura e nei punti non agopunturi (n = 3 per gruppo). (C) Valori FPG per i gruppi dietetici ricchi di grassi e normali (n = 3 per gruppo). (D) Giorno 7 Valori di 2hPG in ratti ad alta ricca di grassi e a dieta normale sotto le condizioni di torsione del punto di agopuntura, torsione non del sito di agopuntura e inserimento diretto del punto di agopuntura. (n = 3 per gruppo). I risultati sono presentati come media ± SEM. I confronti a coppie pianificati degli endpoint nel pannello D sono stati analizzati utilizzando un test t di Student a due code non accoppiati. *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Cambiamenti nel CO e nella RP dei ratti in ciascun gruppo durante 1 settimana di agopuntura. (A) Cambiamenti nell'OC nei ratti IGT ad alto contenuto di grassi. (B) Cambiamenti nella RP nei ratti IGT ad alto contenuto di grassi. (C) Cambiamenti nell'OC nei ratti IGT della dieta normale. (D) Cambiamenti nella RP nei ratti IGT della dieta normale. (E) Confronto dell'indice SERS correlato a OC tra le condizioni di dieta ad alto contenuto di grassi e quelle normali all'interno del sottogruppo di torsione del punto di agopuntura; (F) Confronto dell'indice SERS relativo alla RP tra le condizioni di dieta ad alto contenuto di grassi e quelle normali all'interno del sottogruppo della torsione del punto di agopuntura. n = 3 ratti per sottogruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Le misurazioni seriali sono state interpretate come tendenze longitudinali esploratorie. Abbreviazioni: OC = capacità ossidativa; RP = potenziale redox. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Output rappresentativi generati dallo strumento per la valutazione della sonda-risposta. Questo file contiene output rappresentativi di monitoraggio continuo generati direttamente dallo strumento analitico e utilizzati per valutare le prestazioni della sonda-risposta. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Tabella dei dati grezzi per analisi quantitative. Questo file contiene i dati numerici di origine utilizzati per la generazione delle figure e l'analisi statistica, incluse misurazioni della glicemia nel sangue, valori di rapporto derivati dal SERS e dati di panel di figure quantitative. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La tolleranza al glucosio compromessa rappresenta una fase transitoria reversibile prima del diabete di tipo 2 ed è strettamente associata a squilibri metabolici, resistenza all'insulina e disregolazione legata allo stress ossidativo. L'intervento nello stile di vita e altre strategie terapeutiche precoci possono ridurre il rischio di progressione da tolleranza al glucosio compromessa al diabete, ma gli strumenti per monitorare dinamicamente le risposte biochimiche locali durante l'intervento restano^{limitati 30}. L'agopuntura è stata segnalata come influenzabile sul metabolismo del glucosio e sulle vie correlate allo stress ossidativo in studi sperimentali e clinici. Tuttavia, la maggior parte degli studi meccanicistici sull'agopuntura si basa su misurazioni finali del sangue o dei tessuti, e relativamente pochi metodi consentono un monitoraggio minimamente invasivo delle risposte locali associate al redox durante l'intervento di agopuntura. Precedenti studi clinici sui trattamenti per l'IGT hanno confermato che il rischio di diabete può essere notevolmente ridotto attraverso interventi nello stile di vita, tra cui modifiche dietetiche, riduzione della massa corporea e aumento dell'attività^{fisica 31}. L'agopuntura si è dimostrata efficace nel migliorare gli indici metabolici del glucosio e nel ridurre il digiuno e il 2hPG. Pertanto, l'elucidazione della relazione tra agopuntura, redox e IGT può fornire approcci per invertire l'IGT o intervenire nella sua progressione, riducendo così l'incidenza del diabete mellitus e fornendo una comprensione della patologia dell'IGT e dei meccanismi alla base del suo sviluppo.

Il presente studio propone una piattaforma a microago Raman attivo con scattering attivo a doppia scanalatura redox sensibile alla superficie, per combinare intervento agopuntura con il tracciamento SERS ratiometrico locale in un modello di ratto con tolleranza al glucosio compromessa. In questo sistema, due scanalature incise su un singolo ago di agopuntura venivano utilizzate per trasportare sonde sensibili alla capacità ossidativa e al potenziale redox. Questo design ha permesso all'ago di agopuntura di funzionare non solo come strumento di intervento, ma anche come portatore rilevante per letture ottiche relative locali associate al redox. I risultati hanno mostrato che il needling nei punti di agopuntura con torsione era associato a valori più bassi di glicemia a digiuno e 2hPG, nonché a cambiamenti negli indici SERS correlati alla capacità ossidativa e al potenziale redox nei ratti con tolleranza al glucosio compromessa. Questi risultati supportano la fattibilità dell'uso di microaghi attivi nel SERS per esplorare le risposte locali associate al redox durante l'intervento di agopuntura. Nel complesso, i risultati suggeriscono che il needling nei punti di agopuntura con torsione era associato a valori più bassi di FPG e 2hPG e a cambiamenti negli indici SERS correlati a OC e RP nei ratti IGT. Questi risultati supportano la fattibilità dell'uso di microaghi attivi sul SERS per seguire risposte ottiche locali associate al redox durante l'intervento di agopuntura. Tuttavia, poiché non sono stati eseguiti saghi biochimici standard di stress ossidativo, analisi di lisciviazione a sonda e test di biocompatibilità tissutale, i cambiamenti osservati nell'indice SERS non devono essere interpretati come prova biochimica definitiva del miglioramento dello stress ossidativo.

Potrebbero essere utilizzati diversi approcci alternativi per approfondire ulteriormente la stessa ipotesi. I test biochimici standard di stress ossidativo, incluse misurazioni di specie reattive di ossigeno, malondialdeide, dismutasi superossida, catalasi, glutatione perossidasi e rapporti glutatione/disolfuro glutatione, potrebbero essere utilizzati per validare se le variazioni negli indici derivati dal SERS corrispondano ai biomarcatori di stress ossidativo^{convenzionali 32,33}. Sonde redox elettrochimiche, sensori redox basati su fluorescenza, saggi di chemiluminescenza, microdialisi seguita da analisi biochimica e validazione immunoistochimica o istologica a base tissutale possono fornire informazioni complementari. Combinare il microneedle detecting attivo per SERS con questi approcci indipendenti aiuterebbe a determinare se i cambiamenti ottici osservati riflettano specifiche alterazioni biochimiche redox o risposte locali più ampie ai tassi di needling e allo stato^{metabolico 34}.

Le potenziali applicazioni di questo metodo vanno oltre l'attuale modello di tolleranza al glucosio compromesso. Poiché lo squilibrio redox è coinvolto nelle malattie metaboliche, nelle lesioni tissutali, nell'infiammazione e nella riparazione delle ferite, i microaghi attivi per SERS possono fornire uno strumento preclinico utile per monitorare le risposte locali associate al redox in modelli legati al diabete, studi sulla guarigione delle ferite, modelli di malattie infiammatorie e altri contesti di intervento minimamente^{invasivi 35}. Nella ricerca sull'agopuntura, la piattaforma può essere utile per confrontare punti di agopuntura, siti non agopunturi, diverse manipolazioni di needling e diversi programmi di intervento. Tuttavia, queste applicazioni rimangono esplorative e richiedono ulteriori validazioni tecniche e biologiche.

Va sottolineata diverse limitazioni. Innanzitutto, le letture OC e RP sono state calcolate come indici ratiometrici derivati dal SERS e non sono state calibrate rispetto alle concentrazioni standard di specie ossidative o ai valori di potenziale redox elettrochimici assoluti. Pertanto, i risultati attuali dovrebbero essere interpretati come risposte ottiche relative associate al redox in condizioni di acquisizione identiche, piuttosto che come misurazioni biochimiche assolute. In secondo luogo, il microambiente tissutale biologico può introdurre ulteriori fonti di variazione del segnale, inclusi cambiamenti locali del pH, adsorbimento proteico, componenti della matrice extracellulare e altri effetti della matrice. Questi fattori non sono stati valutati completamente in mezzi contenenti siero o che imitano tessuti. In terzo luogo, la potenza laser effettiva fornita alla superficie tissutale e il cambiamento locale di temperatura durante l'acquisizione del Raman non venivano misurati direttamente; Pertanto, non si possono escludere del tutto effetti fototermici o fotochimici. In quarto luogo, la riproducibilità a livello batch della geometria delle scanalature e del carico della sonda non è stata valutata quantitativamente tramite imaging SEM multi-ago o analisi dell'efficienza di carico. Infine, non sono state effettuate validazioni biochimiche indipendenti, analisi di lisciviazione a sonda e test di biocompatibilità locale. Studi futuri dovrebbero stabilire curve di calibrazione in matrici biologicamente rilevanti, correlare gli indici SERS con i test standard di stress ossidativo e redox, quantificare la liscivia delle sonde, valutare la compatibilità locale dei tessuti dopo ripetute inserzioni e convalidare il dispositivo in coorti animali più grandi. I microaghi attivi per SERS possono fornire una piattaforma utile per combinare l'intervento di agopuntura con il monitoraggio SERS relativo degli indici locali associati al redox in un modello preclinico di ratto IGT. Ulteriori calibrazioni, validazioni biochimiche, valutazione della liscivia delle sonde e studi di biocompatibilità sono necessari prima che si possa rivendicare il monitoraggio quantitativo assoluto o l'applicazione traslazionale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Ascorbic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Blood glucose meter	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Blood glucose test strips	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Copper sulfate (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Ethyl alcohol (≥99.7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Ferrous sulfate (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glucose (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Iron chloride (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Methyl methacrylate (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Micro-Raman spectrometer	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Phenylenediamine (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polymethyl methacrylate (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Scanning electron microscope	Zeiss	ULTRA Plus
Sodium borohydride (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Sodium sulfite (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Stainless steel acupuncture needles	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Statistical analysis software	International Business Machines Corporation	Version 2021
Streptozotocin (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Tetrachloroauric acid (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS software	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	version 26.0
rats	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
basal chow	Anuokang Biotech.	SY10001
Lard	MCE	HY-W127601
Sucrose	MCE	HY-B1779
Egg yolk powder	MCE	HY-B2235B
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Citrate buffer	beyotime	P0086
Phosphate-buffered saline	beyotime	ST448-1L
Isoflurane	Bioss	D54468
Small-animal isoflurane anesthesia system	RWD Life Science	R500
Induction chamber and nose cone	RWD Life Science	R500compatible accessories
Warming pad	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% ethanol	Boyu Bio.	YB60401
CO2 euthanasia chamber	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365