Presentiamo un modello riproducibile di lacerazione epatica murina con emorragia grave che integra perdita di sangue, coagulopatia indotta dal trauma e esiti di sopravvivenza. Il modello consente la valutazione di interventi emostatici, inclusi il fattore VIIa ricombinante e l'acido tranexamico, insieme a valutazioni della coagulazione, fibrinolisi e mortalità, fornendo una piattaforma economica e scalabile per la ricerca meccanicistica e traslazionale sull'emorragia.
Articolo metodologico
Un modello di lacerazione epatica murina per semplificare la quantificazione della coagulopatia emorragica, dell'infiammazione e della sopravvivenza indotte dal trauma
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ematragia incontrollata rimane una delle principali cause di morte prevenibile nei pazienti traumatizzati, e la coagulopatia indotta dal trauma (TIC) è un fattore determinante della mortalità precoce. Modelli sperimentali che riproducano in modo affidabile l'ematragia e le relative risposte coagulopatiche sono essenziali per studi meccanicistici e per la valutazione di interventi mirati. Descriviamo qui un modello murino standardizzato di emorragia grave, basato su una lacerazione epatica (LL) riproducibile che provoca emorragia, quantificabile con precisione, consentendo al contempo il monitoraggio simultaneo della coagulopatia sistemica, dei marcatori infiammatori e della mortalità.
Ai topi viene praticata una laparotomia mediana standardizzata seguita da LL, e la perdita di sangue viene quantificata mediante garze imbevute di sangue. I marcatori sistemici della coagulazione, della fibrinolisi e dei marcatori infiammatori vengono raccolti tramite prelievo ematico retro-orbitale prima e a intervalli seriali predeterminati dopo l'intervento. LL con perdita ematica produce in modo affidabile TIC (caratterizzata da allungamento del tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT), aumento del complesso trombina-antitrombina (TAT), deplezione selettiva dei fattori della coagulazione (F) V e VIII e attivazione della fibrinolisi). Parallelamente, l'attivazione infiammatoria è dimostrata dall'aumento dell'interleuchina-6 (IL-6). Inoltre, il modello consente ulteriormente analisi della sopravvivenza dopo la riparazione dell'incisione mediana.
Come applicazione traslazionale, il rhFVIIa e l'acido tranexamico (TXA) vengono utilizzati per dimostrare che il modello è sensibile al controllo dell'emorragia mediante modulazione farmacologica dei parametri della coagulazione e della fibrinolisi. Rispetto ai modelli su animali di grandi dimensioni, questo sistema murino offre un'opportunità economica, versatile e facilmente scalabile per studiare interventi innovativi e mirati sull'emorragia traumatica.
Introduzione
Il trauma è una delle principali cause di morte e disabilità nei giovani adulti (età < 45 anni)1,2, e l'emorragia incontrollata rappresenta una causa significativa della mortalità precoce3. Un fattore critico legato a esiti sfavorevoli nei pazienti gravemente feriti è lo sviluppo di coagulopatia indotta dal trauma (TIC)4,5. La TIC è una disregolazione complessa e multifattoriale dell'emeostasi, caratterizzata dalla deplezione dei fattori della coagulazione V e VIII6,7, da una fibrinolisi disregolata7,8,9 e da un'attivazione sistemica infiammatoria10. La TIC contribuisce al sanguinamento persistente ed è associata a un aumento delle richieste trasfusionali11, insufficienza d'organo5 e mortalità, nonostante i progressi nelle tecniche di rianimazione di controllo dei danni e negli interventi terapeutici5.
Pertanto, modelli sperimentali che riproducano in modo affidabile lo shock emorragico con le associate alterazioni coagulopatiche sono essenziali per l'indagine meccanicistica e la valutazione di interventi emostatici mirati. I modelli di emorragia controllata impiegano un prelievo di sangue standardizzato, che potrebbe non causare lesioni tissutali, contribuendo così alla risposta coagulopatica sistemica osservata nel trauma clinico12. Di conseguenza, modelli di emorragia che includano lesioni di organi solidi dovrebbero offrire una maggiore rilevanza clinica, a condizione che il sanguinamento prolungato e le risposte sistemiche possano essere valutati quantitativamente13,14,15,16. Modelli più complessi di CMT incorporano combinazioni di lesioni cerebrali traumatiche, fratture di ossa lunghe o arti, lesioni dei tessuti molli, laparotomia e shock emorragico controllato per riprodurre diversi componenti del trauma grave17,18. Sebbene questi approcci forniscano una rappresentazione più completa del politrauma, le loro multiple procedure lesive e manipolazioni fisiologiche possono aumentare la complessità tecnica e la variabilità sperimentale.
Nonostante decenni di ricerca, i modelli sperimentali clinicamente rilevanti e riproducibili di TIC rimangono limitati ed eterogenei. Le revisioni hanno sottolineato la necessità di modelli robusti che riproducano in modo più accurato la sequenza clinica di danno tissutale e shock emorragico e che supportino la valutazione di interventi terapeutici17,19. Modelli complessi che richiedono uno strumento estensivo, inclusa la cateterizzazione cardiaca e il monitoraggio emodinamico continuo, possono fornire informazioni fisiologiche dettagliate ma richiedono anche apparecchiature specializzate e ulteriori manipolazioni procedurali. Per eliminare gli ostacoli alla ricerca sul trauma, sembra fondamentale semplificare l'approccio sperimentale mantenendo al contempo le caratteristiche chiave del TIC. Qui descriviamo un modello murino standardizzato che induce uno shock emorragico incontrollato14 mediante LL riproducibili, che provocano un sanguinamento profondo e riproducono le caratteristiche principali del TIC. Questo modello permette la valutazione delle risposte di coagulazione e infiammatorie, inclusi parametri generali di coagulazione (aPTT e generazione di trombina), il depletamento selettivo di fattori della coagulazione (FV e FVIII) come tratto distintivo del TIC, marcatori della fibrinolisi e il profilo dei citochine. Per dimostrare la sensibilità e la rilevanza di questo modello rispetto al trauma umano, valutiamo gli effetti del rhFVIIa (agente proemostatico) e del TXA (agente antifibrinolitico), utilizzati nel rianimare i traumi, sulla gravità dell'emorragia, sul progresso della coagulopatia e sugli esiti di sopravvivenza.
Il modello supporta inoltre prelievi ematici seriali e terminali, consentendo una valutazione longitudinale delle traiettorie della coagulazione e dell'infiammazione in relazione alla gravità della lesione e all'intervento terapeutico. Nel complesso, il modello fornisce un sistema murino riproducibile e scalabile per lo studio della coagulopatia indotta dal trauma (TIC) in condizioni di emorragia grave, nonché per la valutazione di interventi emostatici e farmacologici mirati, utilizzando endpoint clinicamente rilevanti, tra cui perdita ematica, coagulopatia, fibrinolisi, infiammazione e sopravvivenza.
Rispetto ai modelli murini di lacerazione epatica precedentemente pubblicati, inclusa la metodica descritta da Dyer et al.13, questo metodo introduce diversi importanti progressi metodologici. Tra questi vi sono la misurazione gravimetrica quantitativa della perdita ematica, la standardizzazione della gravità della lesione mediante normalizzazione della massa epatica lacerata rispetto al peso corporeo, e un'analisi completa di TIC, fibrinolisi e infiammazione. Inoltre, il modello permette campionamenti seriali, modulazione farmacologica e analisi di sopravvivenza che descrivono dettagliatamente tecniche di chiusura addominale, favorendo il recupero fisico anziché l'eutanasia. Tutte le procedure possono essere eseguite all'interno di un singolo approccio sperimentale, fornendo una piattaforma scalabile e traslazionale per lo studio dell'emorragia e degli interventi emostatici mirati.
Protocollo
Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California di San Diego (UCSD) ha approvato tutti i protocolli sugli animali. I topi C57BL/6J sono stati allevati e mantenuti presso l'impianto di allevamento interno dell'UCSD. Negli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine di età compresa tra 8 e 10 settimane. Una panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale e della tempistica è riportata nella Figura supplementare 1.
NOTA: Le dimensioni dei campioni sono state determinate sulla base di esperimenti preliminari, della variabilità attesa per ciascun endpoint e dell'esperienza precedente con il modello murino di lacerazione epatica. Le dimensioni finali dei campioni per ciascun endpoint sperimentale e per i gruppi sperimentali sono indicate nelle legende delle figure corrispondenti. Per le misurazioni del peso epatico, i dati provenienti da esperimenti indipendenti sono stati raggruppati per valutare la coerenza tra i diversi gruppi sperimentali. Per i saggi di coagulazione eseguiti in esperimenti separati, campioni precedentemente analizzati sono stati inclusi in più ripetizioni al fine di monitorare la coerenza e la riproducibilità tra i diversi saggi.
1. Preparazione preliminare all'esperimento
- Prelevamento del campione basale (Giorno -1)
- Prelevare circa 200 µL di sangue da ciascun topo (di età compresa tra 8 e 10 settimane) tramite accesso retro-orbitale 24 ore prima dell'esperimento per stabilire i parametri basali.
- Somministrare circa 200 µL di soluzione salina sterile per uso iniettabile per via sottocutanea dopo il prelievo del sangue.
- Allevare i topi in gabbie pulite in condizioni standard di laboratorio, con temperatura controllata di 20–24 °C, umidità relativa del 30%–70% e ciclo luce/buio di 12 ore, con accesso libero a cibo e acqua fino al giorno dell'esperimento.
- Preparazione della gabbia (Giorno 0)
- Trasferire il topo in una gabbia pulita foderata con salviette di carta fresche nel giorno dell'esperimento.
- Rimuovere cibo e acqua 15 minuti prima dell'esperimento e mantenerli sospesi fino alla rimozione delle spugne assorbenti dopo l'intervento chirurgico.
2. Preparazione dello strumento e del campo operatorio
- Sterilizzazione dello strumento
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici, il cotone, gli applicatori e le carte filtro mediante autoclave.
- Disinfettare la superficie chirurgica utilizzando etanolo al 70%.
- Preparazione del tavolo chirurgico
- Disporre gli strumenti sterili su un telo sterile.
- Preparare un contenitore in acciaio inossidabile con etanolo al 70% e cotone sterile per la pulizia temporanea degli strumenti.
- Accendere uno sterilizzatore a microsfere e lasciarlo raggiungere 150 °C per la sterilizzazione tra un animale e l'altro.
3. Preparazione per il mantenimento della temperatura
- Preparazione del tappetino termico
- Attivare il tappetino riscaldante isoterma immediatamente prima dell'intervento chirurgico seguendo le istruzioni del produttore.
- Impostare il tappetino riscaldante isoterma in modo da mantenere la temperatura corporea del topo entro un intervallo target di 36–37 °C per tutta la durata dell'anestesia e dell'intervento chirurgico.
- Verificare una distribuzione uniforme del calore sulla superficie del tappetino.
- Posizionare il tappetino sulla piattaforma operatoria e coprirlo con un telo sterile.
- Collegare la tavola chirurgica al sistema di anestesia con isoflurano.
4. Anestesia e procedure preoperatorie
- Induzione dell'anestesia
- Indurre l'anestesia posizionando il topo in una camera di induzione con isoflurano al 2% in ossigeno a 2 L/min.
- Verificare un'anestesia adeguata mediante il riflesso alla pressione sulle dita dei piedi.
- Registrare il peso corporeo prima dell'intervento chirurgico.
- Somministrazione di analgesia e trattamento
- Somministrare buprenorfina (3,25 mg/kg, per via sottocutanea) per l'analgesia.
- Preparare agenti emostatici secondo necessità.
- Per i gruppi in trattamento, somministrare fattore VII umano ricombinante attivato (rhFVIIa; 3 mg/kg) o acido tranexamico (10 mg/kg) mediante iniezione endovenosa retro-orbitale 5 minuti prima della lesione.
- Somministrare un volume equivalente (~100 µL) di soluzione salina sterile per uso iniettabile agli animali di controllo.
5. Preparazione chirurgica
- Preparazione del sito chirurgico
- Trasferire il topo anestetizzato sulla tavola chirurgica posizionata sul tappetino isoterico.
- Mantenere l'anestesia mediante cono nasale utilizzando isoflurano al 1,5%–2% in ossigeno a 2 L/min per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
- Posizionare il topo in posizione supina e fissare tutte e quattro le zampe con del nastro adesivo.
- Radere la regione addominale.
- Eseguire la preparazione asettica utilizzando alternativamente povidone-iodio ed etanolo al 70% (tre cicli).
6. Procedura di lacerazione epatica
- Pesatura preliminare dei materiali
- Pre-pesare due provette da 1,5 mL, includendo una provetta contenente 0,5 mL di soluzione salina e una provetta vuota.
- Pre-pesare tre triangoli assorbenti primari e due secondari per ogni animale e registrare la loro massa combinata.
- Pre-pesare un portacampioni per ogni animale per la successiva pesatura del tessuto epatico escisso.
- Induzione del danno epatico
- Eseguire una laparotomia mediana di circa 0,5 pollici (12,7 mm) di lunghezza per esporre il fegato.
- Posizionare due triangoli assorbenti lungo le pareti addominali destra e sinistra, evitando il contatto con il fegato.
- Esteriorizzare il lobo epatico sinistro e identificare i margini del lobo per standardizzare l'estensione della resezione del tessuto. Evitare lesioni tissutali non intenzionali.
- Utilizzando forbici affilate, lacerare approssimativamente il 75% del lobo con un unico movimento controllato per garantire coerenza tra gli animali.
- Trasferire il tessuto lacerato escisso nella provetta pre-pesata vuota per la successiva quantificazione della gravità della lesione.
- Inserire un terzo triangolo assorbente nella cavità addominale per facilitare una raccolta uniforme del sangue durante la fase di emorragia.
- Chiusura addominale rapida per mantenere l’emorragia interna (passaggio critico)
- Chiudere immediatamente la parete addominale entro ~10–15 s utilizzando due clip chirurgiche autoclavabili.
- Assicurare un allineamento preciso dei margini dell'incisione per ottenere una chiusura completa senza spazi. Una chiusura incompleta potrebbe causare perdita di sangue esterna e una sottostima della perdita ematica.
- Applicare una tensione costante ma delicata durante la chiusura, evitando la compressione del contenuto addominale, che potrebbe alterare la dinamica dell'emorragia.
- Rinforzare la chiusura con adesivo tissutale (2–3 gocce) per garantire un compartimento addominale completamente sigillato.
- Monitoraggio post-danno
- Pesare il tessuto epatico escisso e normalizzare il valore rispetto al peso corporeo per quantificare e confermare l'estensione del danno epatico.
- Riportare il topo nella gabbia posizionata sul tappetino isoterma.
- Lasciare procedere l’emorragia per 60 min nei gruppi sottoposti a analisi terminale e di sopravvivenza.
7. Raccolta del sangue e quantificazione della perdita ematica
- Prelievo ed elaborazione del campione ematico
- Per il gruppo terminale, riindurre l'anestesia nel topo con isoflurano a 60 minuti dopo la lacerazione epatica.
- Per il gruppo di sopravvivenza, riindurre l'anestesia nel topo con isoflurano a 6 ore e a 7 giorni dopo la lacerazione epatica per il prelievo ematico.
- Prelievo del sangue mediante puntura retro-orbitale in provette contenenti soluzione di citrato di sodio (rapporto sangue-anticoagulante: 9:1) per la preparazione del plasma.
- Centrifugare i campioni a 2.000 × g per 10 minuti, seguita da una seconda centrifugazione a 12.000 × g per 5 minuti, al fine di ottenere un plasma povero di piastrine per saggi successivi di coagulazione e fibrinolisi.
- Misurazione della perdita ematica
- Riaprire l'addome a 60 minuti dopo la lacerazione epatica sia per il gruppo terminale che per quello di sopravvivenza ed estrarre le spugne assorbenti contenenti sangue.
- Trasferire tutte le spugne imbevute di sangue in una provetta pre-pesata contenente soluzione salina sterile.
- Utilizzare ulteriori spugne assorbenti pre-pesate per raccogliere il sangue residuo all'interno della cavità addominale.
- Pesare la provetta di raccolta dopo il prelievo del sangue per ottenere il peso finale della provetta.
- Calcolare la perdita ematica utilizzando la seguente equazione gravimetrica:
Perdita ematica (µL/g) = [(peso finale della provetta − peso iniziale della provetta – peso della spugna assorbente) / peso corporeo del topo] × 1000.
NOTA: Tutti i pesi sono espressi in grammi. Il fattore 1.000 converte i grammi di sangue in microlitri, assumendo una densità del sangue di circa 1 g/mL.
- Gruppo di sopravvivenza e risultati longitudinali
- Dopo la misurazione della perdita ematica a 60 minuti, chiudere immediatamente l'incisione utilizzando punti metallici chirurgici e adesivo tissutale per garantire un compartimento addominale completamente sigillato.
- Somministrare 400 µL di soluzione salina sterile per via sottocutanea prima del recupero.
- Riportare il topo nell'allevamento standard e monitorarlo continuamente durante il risveglio dall'anestesia, valutandolo a 2 ore, 6 ore e 24 ore dopo l'intervento chirurgico, seguito da monitoraggio giornaliero fino al giorno 7.
8. Cura post-operatoria
- Monitoraggio post-operatorio
- Monitorare continuamente gli animali durante il recupero iniziale dall'anestesia per rilevare segni di sofferenza o morbosità.
- Registrare lo stato di sopravvivenza e le osservazioni cliniche a ogni valutazione programmata.
- Cura di supporto
- Somministrare 400 µL di soluzione salina sterile per via sottocutanea ogni giorno per 3 giorni.
- Somministrare analgesia (buprenorfina, 3,25 mg/kg, per via sottocutanea) ogni 72 h secondo il protocollo approvato per la cura degli animali.
- Mantenere i topi in condizioni standard di alloggiamento con accesso libero a cibo e acqua.
- Endpoint umani
- Monitorare gli animali per rilevare gli endpoint umani predeterminati, inclusi letargia grave o persistente, incapacità di deambulare o raggiungere cibo e acqua, grave difficoltà respiratoria, mancata risposta o altri segni di sofferenza grave specificati nel protocollo istituzionale approvato per la cura degli animali.
- Eutanasia degli animali che raggiungono gli endpoint umani predeterminati in conformità con le linee guida istituzionali.
- Continuare il monitoraggio della sopravvivenza fino al giorno 7 o fino al raggiungimento di un endpoint umano.
9. Procedure finali e raccolta dei tessuti
- In corrispondenza di punti finali sperimentali predeterminati, anestetizzare i topi e raccogliere il sangue mediante puntura retro-orbitale.
- Eutanasia mediante inalazione di CO₂ in conformità con le linee guida istituzionali.
- Prelevare gli organi ed elaborare i tessuti per l'analisi istologica secondo le procedure successive specificate.
10. Saggi di coagulazione, fibrinolisi e citochine
NOTA: I reagenti, i kit per saggi e l'equipaggiamento utilizzati per queste procedure sono elencati nella Tabella dei Materiali.
- Misurazione del tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT)
- Registrare tutti i tempi di coagulazione utilizzando il coagulometro indicato nella Tabella dei materiali.
- Mescolare 25 µL di plasma murino con 25 µL di reagente aPTT e incubare per 3 min a 37 °C. Avviare la coagulazione aggiungendo 25 µL di CaCl₂ (25 mM) preparato in HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4) e registrare il tempo di coagulazione.
- Misurazione dell'attività di FV, FII e FX
- Mescolare 5 µL di plasma murino con 20 µL di plasma deficitario per il fattore corrispondente e 25 µL di HBS contenente 0,5% di albumina sierica bovina.
- Incubare per 1 min a 37 °C e avviare la coagulazione aggiungendo il reagente Innovin indicato nella Tabella dei materiali.
- Determinare l'attività del fattore in rapporto al sistema di calibrazione/riferimento corrispondente.
- Misurazione del fattore VIII (FVIII)
- Determinare il FVIII mediante un saggio cromogeno per FVIII seguendo le istruzioni del produttore.
- Misurazione del fibrinogeno
- Determinare la concentrazione di fibrinogeno utilizzando il metodo di Clauss. Aggiungere 10 µL di plasma murino a 40 µL di soluzione salina tamponata con HEPES contenente 0,01% di albumina sierica bovina e incubare per 3 min a 37 °C.
- Avviare la formazione del coagulo aggiungendo 25 µL di trombina (25 U/mL) e determinare la concentrazione di fibrinogeno utilizzando la curva di calibrazione del saggio.
- Misurazione dei biomarcatori plasmatici
- Misurare i complessi TAT plasmatici, i complessi PAP e il D-dimero utilizzando i kit per saggio disponibili in commercio indicati nella Tabella dei materiali. Eseguire ciascun saggio seguendo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare standard, calibratori e controlli specifici per ogni saggio come indicato dai produttori e calcolare le concentrazioni degli analiti a partire dalle curve standard corrispondenti.
- Misurazione dell'IL-6 plasmatica
- Misurare le concentrazioni plasmatiche di IL-6 al basale e a 60 min e 6 h dopo la lacerazione epatica, utilizzando il saggio multiplex per citochine indicato nella Tabella dei materiali.
- Eseguire il saggio seguendo le istruzioni del produttore e analizzare i dati utilizzando il software Q-View del produttore.
Risultati
Il modello LL determina una gravità della lesione riproducibile e standardizzata nei topi. Figura 1A illustra la coerenza del peso del fegato lacerato quando normalizzato rispetto al peso corporeo (%PC), con una lesione mediana del 1,4% PC nei diversi gruppi sperimentali. Questa coerenza conferma un'induzione chirurgica affidabile e permette la riproducibilità tra gli animali e in diverse condizioni sperimentali. La possibilità di standardizzare la gravità della lesione è fondamentale per valutare le risposte fisiologiche successive, indipendentemente dalla variabilità del danno tissutale.
La validazione della risposta emorragica e della modulazione terapeutica all'interno del modello è mostrata in Figura 1B. I topi sono stati pretrattati con soluzione salina, l'agente preemostatico rhFVIIa o l'agente antifibrinolitico TXA, e la perdita di sangue è stata quantificata e normalizzata rispetto al peso corporeo (µL/g). I topi trattati con soluzione salina hanno mostrato un'emorragia consistente dopo la LL, mentre i topi trattati con rhFVIIa o TXA hanno mostrato una riduzione della perdita ematica. Questi risultati dimostrano la capacità di questo modello di rilevare la modulazione farmacologica dell'emorragia e di valutare interventi emostatici in condizioni di sanguinamento incontrollato.
Il modello riproduce anche caratteristiche chiave della coagulopatia indotta da trauma. Come mostrato in Figura 1C, la LL ha determinato un allungamento del tempo di TCA, indicativo di una compromissione della coagulazione dopo il trauma. Il trattamento con rhFVIIa o TXA ha attenuato tale allungamento, suggerendo un ripristino della funzione coagulativa. Analogamente, la generazione di trombina, valutata mediante complessi TAT, è aumentata dopo la LL ed è risultata ridotta con il trattamento TXA, mentre rhFVIIa non riduce i livelli di TAT (Figura 1D), suggerendo una modulazione dell'attivazione della coagulazione.
Un'ulteriore caratterizzazione della coagulopatia è mostrata in Figura 2. Il LL ha determinato un'esaurimento selettivo dei fattori della coagulazione V e VIII, coerente con la TIC, e questi cambiamenti sono stati ripristinati con il trattamento con rhFVIIa o TXA (Figura 2A,B). Al contrario, i fattori II e X non sono risultati significativamente alterati (Figura 2C,D), indicando che tali modifiche avvengono in un contesto di fattori II e X preservati, a sostegno di un fenotipo predominante di TIC piuttosto che di una coagulazione intravascolare disseminata (DIC)-like.
Lo sviluppo della fibrinolisi dopo il trauma da schiacciamento (LL) è illustrato nella Figura 3. I livelli di fibrinogeno si ridussero dopo il trauma, indicando un consumo, e non furono completamente ripristinati con rhFVIIa o TXA (Figura 3A). Al contrario, i marcatori fibrinolitici, inclusi i complessi plasmina-antiplasmina (PAP) e il D-dimero, aumentarono dopo il trauma da schiacciamento. L’rhFVIIa ridusse i livelli di complessi PAP, ma non modificò in modo significativo i livelli di D-dimero. La TXA ridusse sia i livelli di complessi PAP sia quelli di D-dimero dopo il trauma da schiacciamento (Figura 3B,C).
Infine, la risposta infiammatoria sistemica e gli esiti di sopravvivenza sono valutati in Figura 4. I livelli plasmatici di interleuchina-6 (IL-6) vengono misurati a 60 minuti e a 6 ore dopo il LL in tutti i gruppi di trattamento. I livelli di IL-6 risultano elevati nei tempi precoci in tutti i gruppi (Figura 4A). La sopravvivenza nel periodo di 7 giorni è valutata mediante analisi di Kaplan-Meier. La sopravvivenza a 7 giorni è del 75% nel gruppo trattato con soluzione salina, del 55% nel gruppo rhFVIIa e dell'80% nel gruppo trattato con TXA. Non si osserva alcuna differenza significativa tra i gruppi salina e TXA, mentre la sopravvivenza è significativamente ridotta nel gruppo rhFVIIa rispetto ai gruppi salina e TXA (Figura 4B).
Figura 1: Convalida del modello di lacerazione epatica (LL): riproducibilità della gravità della lesione, perdita ematica quantitativa e induzione di coagulopatia. Un'emorragia interna grave viene indotta mediante laparotomia mediana seguita da lacerazione epatica standardizzata. I topi vengono pretrattati con soluzione salina (~100 µL) o fattore VII attivato ricombinante umano (rhFVIIa; 3 mg/kg), oppure acido tranexamico (TXA; 10 mg/kg) prima della lesione, al fine di valutare la modulazione farmacologica dell'emorragia e della coagulopatia. (A) La gravità della lesione viene quantificata come peso del fegato lacerato normalizzato rispetto al peso corporeo (%BW), dimostrando un'induzione riproducibile di lesione standardizzata tra gli animali. (B) La perdita ematica viene quantificata mediante un metodo gravimetrico e normalizzata rispetto al peso corporeo (µL/g), mostrando un'emorragia misurabile che risulta ridotta con il trattamento con TXA. (C) Il tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) e (D) i complessi trombina–antitrombina (TAT) dimostrano un'induzione riproducibile di coagulopatia dopo la lacerazione epatica, con una modulazione osservata in seguito al trattamento con rhFVIIa o TXA. I dati sono presentati come valori individuali con mediana e intervallo interquartile; i confronti sono stati effettuati mediante il test non parametrico di Mann-Whitney U (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Adattato con autorizzazione da Joseph et al.16. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Convalida della coagulopatia indotta dal trauma (TIC) dopo lacerazione epatica (LL): deplezione selettiva dei fattori della coagulazione. Un'emorragia interna grave viene indotta mediante laparotomia mediana seguita da lacerazione epatica standardizzata (LL). I topi vengono pretrattati con soluzione salina (~100 µL) o fattore VII attivato ricombinante umano (rhFVIIa; 3 mg/kg), oppure acido tranexamico (TXA; 10 mg/kg) prima del trauma, al fine di valutare la modulazione farmacologica della coagulopatia. I parametri della coagulazione vengono valutati a 60 minuti dalla lacerazione epatica. (A) I livelli del Fattore V e (B) del Fattore VIII mostrano una deplezione riproducibile dopo la lacerazione epatica, in accordo con la TIC. (C) Il Fattore II e (D) il Fattore X rimangono relativamente preservati, indicando una deplezione selettiva dei fattori della coagulazione piuttosto che un consumo globale. I dati sono rappresentati come valori individuali con mediana e intervallo interquartile (n = 7–10). I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney U. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adattato con autorizzazione da Joseph et al.16. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Convalida dell'attivazione fibrinolitica dopo lacerazione epatica (LL). Un'emorragia interna grave viene indotta mediante laparotomia mediana seguita da LL standardizzata. I topi vengono pretrattati con soluzione salina (~100 µL), o fattore VII umano ricombinante attivato (rhFVIIa; 3 mg/kg), o acido tranexamico (TXA; 10 mg/kg) prima del trauma per valutare la modulazione farmacologica della fibrinolisi. I parametri fibrinolitici vengono valutati a 60 minuti dopo la LL. (A) I livelli di fibrinogeno mostrano un consumo dopo il trauma, coerente con l'attivazione della fibrinolisi e l'esaurimento dei fattori della coagulazione. (B) I complessi plasmina–antiplasmina (PAP) e (C) i livelli di D-dimero risultano aumentati dopo la LL, indicando una degradazione attiva del fibrina e un'attivazione sistemica della fibrinolisi. I dati sono riportati come valori individuali con mediana e intervallo interquartile (n = 8–13). I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney U. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adattato con autorizzazione da Joseph et al.16. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Convalida della risposta infiammatoria sistemica e valutazione della sopravvivenza dopo la lacerazione epatica (LL). Un'emorragia interna grave viene indotta mediante laparotomia mediana seguita da LL standardizzata. I topi vengono pretrattati con soluzione salina (100 µL), fattore VII umano ricombinante attivato (rhFVIIa; 3 mg/kg) o acido tranexamico (TXA; 10 mg/kg) prima del trauma. Dopo la lesione, l'incisione addominale viene chiusa con clip chirurgiche e adesivo tissutale, e gli animali vengono riportati nei loro contenitori originari. Le cure di supporto prevedono la somministrazione sottocutanea giornaliera di soluzione salina (400 µL) per i primi tre giorni successivi al trauma. Campioni di plasma vengono raccolti a 60 minuti e a 6 ore dopo la LL per valutare l'attivazione infiammatoria sistemica. (A) I livelli di interleuchina-6 (IL-6) mostrano una risposta infiammatoria sistemica prolungata dopo la lesione. I dati sono riportati come valori individuali con mediana e intervallo interquartile. I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando un test non parametrico di Mann-Whitney U (n = 9–13). (B) La sopravvivenza a sette giorni è stata valutata mediante analisi di Kaplan-Meier, dimostrando la capacità del modello di supportare endpoint basati su esiti longitudinali (n = 20). ****P ≤ 0,0001. Adattato con autorizzazione da Joseph et al.16. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Panoramica schematica del modello di lacerazione epatica e della linea temporale sperimentale. Questa figura riassume il flusso di lavoro sperimentale per il modello standardizzato di lacerazione epatica (LL) murina come modello di emorragia incontrollata. I topi vengono sottoposti a laparotomia mediana seguita da una lacerazione epatica riproducibile di circa il 75% del lobo epatico sinistro. Prima della lesione, i topi ricevono per via endovenosa, tramite iniezione retro-orbitale 5 minuti prima della LL, soluzione salina (~100 µL, controllo veicolare) oppure fattore VII umano ricombinante attivato (rhFVIIa; 3 mg/kg) o acido tranexamico (TXA; 10 mg/kg). La quantificazione della perdita ematica viene effettuata utilizzando garze addominali pre-pesate posizionate in cavità addominale al momento della lesione, recuperate 60 minuti dopo la LL e nuovamente pesate per determinare l'emorragia totale. L'addome viene quindi chiuso mediante clip chirurgiche e adesivo tissutale. I campioni ematici vengono raccolti tramite accesso retro-orbitale a 60 minuti nel gruppo terminale e a 6 ore e 7 giorni nel gruppo di sopravvivenza. Il plasma viene analizzato per parametri della coagulazione, inclusi il tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT), l'attività dei fattori della coagulazione, i complessi trombina-antitrombina (TAT), i complessi plasmina-α2-antiplasmina (PAP) e il D-dimero a 60 minuti. Il profilo citochinico viene effettuato a 60 minuti e a 6 ore. Il tasso di sopravvivenza viene monitorato per un periodo di 7 giorni. Adattato con permesso da Joseph et al.16. Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
In questo studio, presentiamo un modello murino riproducibile di emorragia grave mediante lacerazione epatica standardizzata (LL) che integra la valutazione quantitativa della perdita ematica, la caratterizzazione della coagulopatia indotta dal trauma (TIC) e dell'infiammazione, e l'analisi della sopravvivenza all'interno di un singolo esperimento. Il modello produce una gravità della lesione costante, come dimostrato dal peso del fegato lacerato normalizzato rispetto al peso corporeo, consentendo al contempo una valutazione riproducibile dell'emorragia e delle risposte emostatiche sistemiche tra i diversi gruppi sperimentali. L'uso di un modello di roditore di piccole dimensioni con lesione standardizzata e misure quantitative degli esiti consente una valutazione efficiente di multipli endpoint sperimentali all'interno di un unico schema sperimentale, favorendo indagini riproducibili e scalabili della TIC, senza richiedere procedure tecnicamente complesse.
È importante notare che questo modello riproduce caratteristiche chiave della coagulopatia indotta dal trauma (TIC), inclusa la prolungata durata dei parametri generali della coagulazione (aPTT), l'aumento della generazione di trombina evidenziato dai complessi TAT, l'esaurimento selettivo dei fattori della coagulazione V e VIII e l'attivazione della fibrinolisi, dimostrata dall'aumento dei complessi PAP e dalla formazione di D-dimero. Questi cambiamenti si verificano in presenza di livelli conservati dei fattori II e X, sostenendo un fenotipo predominante di TIC piuttosto che di coagulazione intravascolare disseminata. La possibilità di quantificare simultaneamente questi parametri fornisce un quadro clinicamente rilevante per valutare il deregolamento emostatico successivo a un trauma.
Un punto di forza fondamentale di questo modello è l'inclusione della sopravvivenza come endpoint di esito nel contesto di emorragia traumatica. Per testare strategie di salvataggio clinicamente rilevanti, abbiamo valutato sia il rhFVIIa che il TXA, due agenti utilizzati o studiati per la rianimazione del trauma nell'uomo. Il TXA ha dimostrato effetti costanti nel ridurre la perdita di sangue, nel normalizzare la coagulopatia e l'attivazione fibrinolitica, traducendosi in un miglioramento della sopravvivenza. Al contrario, il rhFVIIa ha determinato una mortalità significativa associata al sovracorretto dei parametri emostatici e al controllo incompleto della fibrinolisi16.
Questi risultati evidenziano un aspetto importante del modello: la sopravvivenza è determinata da un'interazione complessa tra gravità dell'emorragia, coagulopatia e risposta sistemica, piuttosto che dalla correzione isolata di singoli percorsi emostatici. Sembra che questo modello di emorragia sia sensibile all'integrazione dei parametri emostatici biochimici con la sopravvivenza, quest'ultima essendo un determinante critico dell'esito nella pratica clinica. Sebbene l'emorragia traumatica grave sia la lesione principale riprodotta in questo sistema, anche le lesioni d'organo secondarie potrebbero contribuire all'esito. Nel nostro studio precedente che utilizzava questo modello, sono stati osservati microtrombi polmonari e depositi di fibrina nei topi trattati con rhFVIIa, associati a una mortalità aumentata, suggerendo un possibile contributo della lesione d'organo trombo-infiammatoria all'esito16.
Sebbene nel presente studio non sia stato incluso un gruppo contemporaneo sottoposto a intervento fittizio, in precedenza abbiamo dimostrato che la laparotomia senza perdita epatica (LL) non ha determinato la coagulopatia indotta dal trauma (TIC), evidenziando la necessità di una ulteriore perdita ematica rapida (shock) per produrre le alterazioni della coagulazione caratteristiche della TIC14.
Diversi aspetti tecnici sono importanti per la riproducibilità di questo modello. L'estensione e la localizzazione della lesione epatica (LL) devono essere standardizzate, poiché le variazioni nella quantità di fegato asportata possono influenzare in modo significativo la gravità dell'emorragia e la conseguente risposta coagulopatica. Nel nostro protocollo, viene asportato circa il 75% del lobo epatico sinistro, normalizzando il peso del fegato lacerato rispetto al peso corporeo, fornendo così una misura oggettiva della coerenza della lesione. Anche una chiusura addominale rapida e sicura è fondamentale per prevenire la perdita di sangue all'esterno e mantenere un ambiente emorragico intraddominale contenuto durante il periodo di osservazione. Per una misurazione accurata della perdita ematica, le garze pre-pesate devono essere recuperate in modo costante, utilizzando la stessa procedura e tempistica di raccolta in tutti i gruppi sperimentali. Questi passaggi riducono al minimo le variazioni dipendenti dall'operatore e sono particolarmente importanti perché differenze nella perdita ematica iniziale possono influenzare la successiva coagulopatia e la sopravvivenza. Se si verifica un'emorragia eccessiva prima della chiusura o se il sangue viene perso all'esterno, l'animale deve essere escluso.
Un limite di questo modello è che si concentra sul danno d'organo, il quale non rispecchia l'eterogeneità del politrauma, che può includere fratture delle ossa lunghe, traumi da schiacciamento dei tessuti molli e altri complessi stati di shock. Tuttavia, questo danno specifico rappresenta anche una caratteristica intenzionale del modello, consentendo di studiare gli effetti dell'emorragia grave e del TIC senza la complessità procedurale aggiuntiva e la variabilità introdotte da molteplici modalità di lesione. In conclusione, questo modello murino di LL fornisce un approccio economicamente vantaggioso (rispetto agli studi su animali di grandi dimensioni), robusto e scalabile per lo studio dell'emorragia traumatica, del TIC e della mortalità. Combinando una piattaforma sperimentale semplice su piccoli roditori con una lesione standardizzata, la misurazione quantitativa della perdita di sangue, un profilo emostatico completo e la valutazione della sopravvivenza, il modello rappresenta un'alternativa pratica ai modelli di trauma più estesamente strumentati. Esso permette una valutazione integrata della perdita di volume ematico, della coagulazione (aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), della fibrinolisi (fibrinogeno, PAP, D-dimero) e degli endpoint di sopravvivenza in un contesto clinicamente rilevante, particolarmente adatto per valutare interventi antifibrinolitici e terapie emostatiche mirate.
Dichiarazioni
A.v.D. ha ricevuto compensi per aver partecipato a comitati scientifici consultivi, attività di consulenza e interventi oratori per BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech e uniQure. A.v.D. è cofondatore di Hematherix LLC, un'azienda biotecnologica che sta sviluppando una terapia con superFVa per le complicanze emorragiche. B.C.J., M.L.C. e R.M. non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Laurent Mosnier, PhD, per i consigli tecnici.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago 25 G | BD Diagnostics | 305124 | |
| Ago 30 G | BD Diagnostics | 305106 | |
| Sistema di anestesia | Patterson Scientific | 78915712 | |
| Reagente aPTT - STA-C.K. Prest. 5 | Stago | 597 | |
| Autoclip | Fine Science Tools | 12022-19 | |
| Applicatore per Autoclip | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Rimozione per Autoclip | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | 10735078001 | |
| Cloruro di calcio | Fisher scientific | C79-500 | |
| Tubo capillare – semplice | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Applicatore di cotone | Medique | 19-090-701 | |
| Palline di cotone | Fisher Scientific | 22-456-103 | |
| Kit ELISA per D-dimero | Invitrogen | EEL094 | |
| Cuscinetto isotermico Delta Phase | Braintree Scientific | 50-195-4663 | |
| Etilene | Fisher scientific | BP28184 | |
| Ethiqa | Fidelis | SKU 072117 | |
| Plasma deficitario di fattore II | Affinity Biologicals | FII-DP | |
| Plasma deficitario di fattore V | Affinity Biologicals | FV-DP | |
| Plasma deficitario di fattore VIII | Affinity Biologicals | FVIII-DP | |
| Plasma deficitario di fattore X | Affinity Biologicals | FX-DP | |
| Carta filtrante, extra spessa, 7 cm × 8,4 cm | Fisher Scientific | PI88605 | |
| Pinze di Graefe | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Camera di induzione | Patterson Scientific | 78933385 | |
| Soluzione salina per uso iniettabile | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Innovin | Siemens Healthineers | 23-044-778 | |
| Isoflurano | Med Vet International | 50-304-2993 | |
| K824086 Chromogenix Coatest SP Fattore VIII | Diapharma | K822585 | |
| Adesivo tissutale rapido Liqui Vet | World Precision Instrument | 50-253-9340 | |
| Sterilizzatore a microperle | Fisher scientific | 14-955-342 | |
| Provette microcentrifuga – 1,5 mL | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Kit multiplex citochine per topo | Quansys Biosciences | 111049MS-13P | |
| Kit per saggio complesso PAP | Biotechne | NBP3-06903 | |
| Povidone-iodio | Med Vet International | 50-283-2277 | |
| Fattore VII umano ricombinante attivato | Novo Nordisk | 0169-7001 | |
| Citrato di sodio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Telo chirurgico | Stoelting | 10-000-695 | |
| Piattaforma chirurgica equaflow mouse 5 con collettore per anestesia | Patterson Scientific | 78919268 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools | 91405-11 | |
| Nastro | Fisher scientific | 15-901-5R | |
| Kit per saggio complesso TAT | Siemens Healthineers | 23-044-704 | |
| Trombina | Invitrogen | PIRP43100 | |
| Acido tranexamico | Auromedics | 55150-0188-10 | |
| Tagliacapelli | Stoelting | 10-000-792 | |
| Sistema di filtrazione a carbone attivo WAG | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Barca da pesatura | Fisher Scientific | 01-549-752 |
Riferimenti
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