Articolo metodologico

Un protocollo ottimizzato per il modello di stenosi della valvola aortica indotta da filoguida nei topi

DOI:

10.3791/72218

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21 agosto 2026

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1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un modello ottimizzato di stenosi aortica indotta da guida introduttiva in topi C57BL/6. Una piattaforma vascolare di supporto personalizzata, realizzata mediante stampa 3D, consente un controllo preciso dell'emorragia, ottenendo una sopravvivenza del 95% a 24 ore (19/20) e un successo complessivo del modello del 90% a 4 settimane (18/20).

Abstract

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La stenosi della valvola aortica (AVS) è una grave malattia cardiovascolare la cui prevalenza aumenta nelle popolazioni anziane, tuttavia la scarsità di tessuto valvolare malato limita fortemente gli studi meccanicistici e lo sviluppo di terapie. Questo protocollo stabilisce e ottimizza un modello murino riproducibile di stenosi della valvola aortica, migliorando il metodo di lesione valvolare indotta da guida metallica di Honda attraverso una gestione controllata dell'emorragia. Topi C57BL/6 maschi e femmine vengono sottoposti a lesione della valvola aortica indotta da guida metallica; la procedura viene affinata mediante una piattaforma di supporto vascolare personalizzata, stampata in 3D, che consente un controllo preciso dell'emorragia durante l'inserimento e il ritiro della guida. I parametri di valutazione includono la sopravvivenza a 24 ore, la valutazione ecocardiografica a 4 settimane e la conferma istopatologica. Il protocollo ottimizzato raggiunge una percentuale di sopravvivenza del 95% a 24 ore (19 su 20 animali); tra i sopravvissuti, il 94,7% (18 su 19) soddisfa il criterio emodinamico predeterminato di successo a 4 settimane, con un tasso complessivo di successo del modello del 90% (18 su 20 animali), confermato mediante analisi ecocardiografica e istologica. Questo modello standardizzato fornisce una piattaforma affidabile e riproducibile per lo studio dei meccanismi di degenerazione valvolare e per la valutazione di potenziali interventi terapeutici.

Introduzione

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Le malattie valvolari cardiache rimangono un peso considerevole per i sistemi sanitari sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo, con una prevalenza in aumento parallela all'invecchiamento della popolazione1. Sebbene l'implantazione percutanea della valvola aortica (TAVI) abbia trasformato il trattamento della stenosi aortica severa2,3, i meccanismi cellulari e molecolari alla base della degenerazione valvolare non sono ancora completamente compresi, e non esiste alcuna terapia farmacologica approvata in grado di rallentare o invertire la progressione della malattia4,5. Un ostacolo centrale nella ricerca sulle malattie valvolari è la limitata disponibilità di tessuto malato per lo studio6,7. Ottenere campioni di valvola aortica umana in quantità sufficiente è difficile, e anche i modelli animali in grado di riprodurre in modo affidabile le alterazioni patologiche delle valvole sono stati altrettanto rari8. Questa lacuna ha stimolato sforzi continui volti a sviluppare modelli animali che riproducano le caratteristiche emodinamiche e istologiche della stenosi valvolare aortica (AVS).

Gli approcci dietetici convenzionali, come l'alimentazione prolungata ad alto contenuto di grassi nei topi ApoE⁻/⁻, richiedono 20–24 settimane e presentano bassi tassi di successo, con solo una minoranza di animali che sviluppa un fenotipo stenosico definitivo9,10,11,12. Il modello di lesione valvolare indotta da guida-filo descritto da Honda et al. ha affrontato molte di queste limitazioni provocando meccanicamente lesioni alle cuspidi valvolari mediante accesso all'arteria carotidea13. La tecnica originale prevede dissezione dell'arteria carotidea, passaggio retrogrado del filo guida fino alla valvola aortica, ripetuti graffi sulle cuspidi e rotazione del filo, producendo rapidi cambiamenti emodinamici entro pochi giorni e un fenotipo stenosico stabile entro 4 settimane13,14,15,16. Grazie alla sua relativa rapidità e diretta efficacia, il metodo Honda è stato ampiamente adottato nelle recenti ricerche sulle valvole. Tuttavia, permangono alcune importanti lacune. I dettagli procedurali completi non sono stati pienamente documentati in letteratura, manca una standardizzazione tra i laboratori e il ruolo del controllo dell'emorragia—un fattore determinante importante della morbilità perioperatoria in questo modello—non è mai stato affrontato sistematicamente. Queste incongruenze riducono la riproducibilità e limitano la traslazionalità clinica.

Si è ipotizzato che un'ottimizzazione sistematica del controllo dell'emorragia potesse migliorare in modo significativo la sopravvivenza perioperatoria e l'affidabilità del modello. Questo protocollo presenta un approccio perfezionato e standardizzato, sviluppato a partire dal metodo Honda, che introduce una piattaforma di sostegno vascolare personalizzata, realizzata mediante stampa 3D. Il dispositivo consente una tensione longitudinale regolabile sull'arteria carotidea, garantendo un'emostasi temporanea completa durante l'inserimento e il ritiro del filo guida, senza schiacciare il vaso. Con questo approccio, il protocollo ottimizzato raggiunge una percentuale di sopravvivenza del 95% a 24 ore (19 su 20 animali); tra i sopravvissuti, il 94,7% (18 su 19) soddisfa il criterio predefinito di successo emodinamico a 4 settimane, con un tasso complessivo di successo del modello del 90% (18 su 20 animali). Viene fornita una documentazione dettagliata passo dopo passo della procedura per facilitarne la riproducibilità tra diversi laboratori.

Protocollo

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NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida per la Cura e l'Utilizzo degli Animali da Laboratorio e sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Ospedale di West China (Protocollo n. 20240311055). Sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (8–10 settimane; circa 22–25 g) e topi femmine C57BL/6 (8–10 settimane; circa 18–20 g). Tutti i materiali, reagenti, strumenti, software e dispositivi personalizzati utilizzati in questo protocollo, inclusa la piattaforma di supporto vascolare personalizzata stampata in 3D, sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione preoperatoria e incisione chirurgica

  1. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano (3% per l'induzione, 1,5–2% per il mantenimento) vaporizzato in ossigeno al 100%. Verificare la profondità anestetica adeguata controllando l'assenza del riflesso di ritrazione plantare (pinzata delle dita dei piedi).
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile. Utilizzarlo con un sistema attivo di aspirazione o in un'area ben ventilata, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati e seguire le procedure di sicurezza dell'istituto.
  2. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma chirurgica regolata termicamente mantenuta a 37 °C.
  3. Preparare la sede chirurgica rimuovendo il pelo dalla regione cervicale anteriore con una crema depilatoria chimica.
  4. Disinfettare la cute con tre cicli alternati di povidone-iodio (o clorexidina) ed alcol al 70% (o soluzione fisiologica sterile tiepida), terminando con l'antisettico.
  5. Infiltrare lidocaina allo 0,5% per via sottocutanea lungo la linea prevista per l'incisione al fine di ottenere un'analgesia locale preventiva.
  6. Praticare quindi un'incisione cutanea longitudinale mediana (di circa 1,0–1,5 cm) sul collo anteriore, posizionata leggermente a destra della linea mediana tracheale, utilizzando forbici microchirurgiche.
    ATTENZIONE: Forbici microchirurgiche, aghi, fili guida e altri oggetti appuntiti possono causare lesioni. Manipolarli con attenzione e smaltire gli oggetti appuntiti usati in appositi contenitori omologati.

2. Isolamento del vaso e posizionamento del punto di sutura

  1. Sotto un microscopio stereoscopico chirurgico, esporre l'arteria carotide comune destra (RCCA) mediante dissezione ottusa attraverso i tessuti fasciali e muscolari sovrastanti. Separare con attenzione la RCCA dal nervo vago adiacente e dai tessuti connettivi circostanti, avendo cura di evitare irritazioni meccaniche del nervo vago.
    NOTA: Mantenere le ghiandole salivari e i tessuti esposti costantemente umidi con soluzione salina sterile tiepida per tutta la durata dell'intervento, al fine di prevenire la disidratazione.
  2. Legare in modo permanente l'estremità distale della RCCA con un punto di sutura in seta 6-0, annodato in un nodo sicuro e non scorrevole.
  3. Posizionare un nodo scorsoio lento in seta 6-0 attorno al segmento prossimale della RCCA, lasciandolo non stretto per un uso successivo durante l'inserimento del filo guida.

3. Applicazione della piattaforma e arteriotomia

NOTA: Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare la piattaforma stampata in 3D utilizzando gas ossido di etilene (EtO), seguito da un'adeguata aerazione, e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici metallici mediante autoclave.

ATTENZIONE: L'ossido di etilene è tossico, infiammabile e cancerogeno. Utilizzare la sterilizzazione con EtO esclusivamente in impianti autorizzati, consentire un'adeguata aerazione e seguire le procedure istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti.

  1. Inserire con attenzione la piattaforma di sostegno vascolare stampata in 3D al di sotto del segmento isolato della RCCA, posizionando l'apice a forma di V capovolta direttamente sotto il vaso.
  2. Regolare lentamente la piattaforma per aumentare la tensione longitudinale sulla RCCA agganciando i punti pre-posizionati nelle scanalature laterali progressivamente più alte.
    NOTA: L'apice a forma di V capovolta è progettato con un angolo di 120° per adattarsi alla curvatura del vaso senza schiacciarne la parete. Arrestare l'aumento della tensione nel preciso punto in cui il polso arterioso non è più visivamente percepibile. Questo punto finale visivo critico garantisce un'emostasi temporanea senza provocare danni eccessivi al vaso.
  3. Eseguire una piccola arteriotomia trasversale (circa metà della circonferenza del vaso) sul segmento di RCCA stabilizzato utilizzando forbici microchirurgiche. Deve verificarsi un'emorragia minima o nulla se la tensione è stata impostata correttamente.

4. Inserimento del guidewire e lesione della valvola

  1. Sotto visualizzazione microscopica, inserire il filo guida (diametro di 0,014 pollici / 0,36 mm) nel lume arterioso attraverso l'arteriotomia trasversa in direzione retrograda verso la radice aortica.
    NOTA: Questo calibro è standard nei modelli pubblicati di lesione da filo guida e approssima il diametro luminale della RCCA murina (~0,4–0,5 mm), determinando un rapporto filo guida/vaso di circa 0,7–0,9.
    ATTENZIONE: Il filo guida può perforare i vasi o i tessuti circostanti. Avanzare lentamente sotto visualizzazione e smaltire i fili guida usati come materiale tagliente o rifiuto chirurgico contaminato.
  2. Stringere il nodo scorsoio prossimale precedentemente posizionato attorno sia al vaso che al filo guida per ottenere un'emostasi completa nel sito di inserzione. Una volta fissato il nodo scorsoio, rimuovere con attenzione la piattaforma stampata in 3D da sotto il vaso.
    NOTA: Se si verifica un sanguinamento imprevisto durante l'inserzione, o se il diametro del filo guida genera un'eccessiva frizione, riposizionare temporaneamente la piattaforma per assistere nell'emostasi, oppure ridurre leggermente la tensione della piattaforma per permettere al lume vascolare di espandersi prima di riprovare l'inserzione.
  3. Avanzare con attenzione il filo guida in direzione retrograda attraverso la RCCA, oltre l'arco aortico e verso la valvola aortica. Con guida ecocardiografica in tempo reale, confermare che la punta del filo guida abbia attraversato la valvola aortica ed entri nel ventricolo sinistro.
  4. Con il nodo scorsoio prossimale completamente stretto per mantenere l'emostasi, eseguire la lesione meccanica della valvola effettuando 100 movimenti di spinta-trazione (avanti e indietro) attraverso la valvola aortica, seguiti da 100 movimenti rotazionali del filo guida contro le cuspidi valvolari.
    NOTA: I 100 movimenti di spinta-trazione e i 100 movimenti rotazionali sono stati stabiliti attraverso un'ampia ottimizzazione interna come il numero che meglio bilancia la durata della procedura con un'induzione affidabile di una stenosi emodinamicamente significativa.

5. Rimozione del guidacavo e chiusura della ferita

  1. Al termine della lesione della valvola, ritirare lentamente il filo guida dal vaso.
  2. Convertire immediatamente il nodo scorsoio prossimale in un nodo solido non scorrevole per legare l'arteria carotide comune prossimale (RCCA) e prevenire qualsiasi emorragia post-procedurale.
  3. Chiudere l'incisione cutanea con punti separati in nylon 5-0 o con graffe chirurgiche.
  4. Non somministrare farmaci anti-infiammatori non steroidei (NSAID) post-operatori. Non somministrare antibiotici perioperatori, poiché la procedura viene eseguita in condizioni asettiche.
  5. Trasferire l'animale in una gabbia di recupero pulita e riscaldata e monitorarlo continuamente fino al ripristino completo della deambulazione.

6. Valutazione ecocardiografica dell'emodinamica transvalvolare

  1. Eseguire valutazioni ecocardiografiche su tutti i topi sopravvissuti a 4 settimane dall'intervento chirurgico per valutare la gravità della stenosi aortica.
  2. Indurre l'anestesia posizionando l'animale in una camera di induzione con il 3% di isoflurano in ossigeno al 100%. Verificare la profondità anestetica controllando la perdita del riflesso di ritrazione plantare. Depilare la parete toracica anteriore utilizzando una crema chimica per la rimozione dei peli. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la desiccazione corneale.
  3. Trasferire il topo anestetizzato su una piattaforma di imaging regolata termicamente, posizionandolo in posizione supina.
  4. Fissare le zampe agli elettrodi dell'elettrocardiogramma (ECG) superficiali per un monitoraggio continuo della frequenza cardiaca. Titolare la concentrazione di isoflurano (tipicamente 1,0–1,5%) per mantenere una frequenza cardiaca fisiologica stabile di 450–550 battiti al minuto.
  5. Pulire la parete toracica anteriore e applicare uno strato abbondante di gel acustico preriscaldato.
  6. Acquisizione dell'immagine in modo B
    1. Utilizzando un sistema ecografico Vevo 3100 con una sonda MX550D (40 MHz), premere il tasto B-Mode per iniziare l'acquisizione in tempo reale di immagini bidimensionali.
    2. Posizionare la sonda in posizione parasternale sinistra per ottenere una vista longitudinale parasternale del ventricolo sinistro, della valvola aortica e dell'aorta ascendente. Ottimizzare profondità, larghezza e guadagno in 2D.
  7. Acquisizione in modo M e misurazione del ventricolo sinistro
    1. Dalla vista longitudinale parasternale, premere il tasto M-Mode. Posizionare la linea di campionamento attraverso il ventricolo sinistro al livello dei muscoli papillari.
    2. Premere Avvia per iniziare l'acquisizione. Una volta ottenuta una traccia stabile che copra almeno tre cicli cardiaci, premere Salva.
    3. In Vevo LAB, utilizzare lo strumento Tracciamento VS (LV Trace) per delineare l'endocardio in fine diastole e in fine sistole, e registrare le dimensioni interne del ventricolo sinistro, lo spessore delle pareti anteriore e posteriore (LVAWd, LVPWd) e la massa del ventricolo sinistro.
  8. Riposizionare e inclinare la sonda per acquisire una vista dedicata dell'arco aortico.
    ​NOTA: Ottenere questa specifica vista dell'arco aortico è essenziale per misurazioni accurate della velocità transvalvolare, poiché garantisce un allineamento ottimale del fascio ultrasuonico con la direzione del flusso ematico attraverso la valvola aortica.
  9. Valutazione con Doppler a colori
    1. Dalla vista dell'arco aortico, premere il tasto Color. Posizionare la finestra di colore sulla valvola aortica e sulla porzione prossimale dell'aorta ascendente.
    2. Regolare la scala del colore e il guadagno in modo che il getto sistolico sia chiaramente visibile senza aliasing. Premere Avvia, quindi Salva.
  10. Misurazione della velocità con Doppler ad onda pulsata
    1. Premere il tasto Doppler ad onda pulsata (PW Doppler). Posizionare la porta del volume di campionamento nel punto più stretto del getto (vena contracta) e applicare la correzione angolare (<60°).
    2. Premere Avvia per iniziare la traccia spettrale; una volta registrati almeno tre cicli cardiaci, premere Salva. In Vevo LAB, misurare la velocità transvalvolare di picco con lo strumento Velocità di Picco (Peak Velocity), mediando almeno tre cicli.

7. Elaborazione istologica e colorazione della radice aortica

  1. Dopo la valutazione ecocardiografica, confermare un'anestesia profonda verificando l'assenza completa del riflesso di ritrazione plantare. Eseguire la dislocazione cervicale come metodo secondario di eutanasia, in conformità con le AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals (edizione 2020) e i protocolli approvati a livello istituzionale.
    ATTENZIONE: Le carcasse animali, i tessuti escissi e i materiali contaminati con sangue sono rifiuti biologici/animali. Smaltirli secondo le normative istituzionali di biosicurezza e dei laboratori animali.
  2. Eseguire una toracotomia utilizzando microbisturi chirurgici per esporre il cuore.
  3. Inserire un ago per la perfusione all'apice del ventricolo sinistro e lavare la circolazione sistemica con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) sterile e fredda. Una perfusione efficace è indicata dall'ispallidimento del fegato e dei polmoni.
  4. Escindere il cuore integro e immergerlo in paraformaldeide al 4% (PFA) a temperatura ambiente per un minimo di 24 ore per garantire una fissazione completa.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica e irritante. Manipolare la PFA al 4% in una cappa chimica con dispositivi di protezione individuale adeguati e smaltire i rifiuti di PFA come rifiuti chimici pericolosi.
  5. Trasferire il tessuto fissato in un processore automatico per tessuti per una disidratazione sequenziale mediante una serie di etanolo a gradazione crescente, seguita da chiarificazione con xilene e infiltrazione con paraffina a 65 °C.
    ATTENZIONE: Lo xilene è infiammabile e tossico, e la paraffina calda può causare ustioni. Manipolare lo xilene in una cappa o in un processore approvato e smaltire i rifiuti contenenti xilene come rifiuti chimici pericolosi.
  6. Incorporare i cuori processati in blocchi di paraffina.
    NOTA: L'orientamento corretto del cuore durante l'incorporazione è fondamentale. Posizionare il cuore in modo da consentire sezioni trasversali attraverso la radice aortica al livello delle tre cuspidi valvolari.
  7. Utilizzando un microtomo rotativo, tagliare sezioni trasversali seriali di spessore 4–5 µm attraverso il piano della valvola aortica, assicurandosi di includere tutte e tre le cuspidi. Montare le sezioni su vetrini di vetro e conservarle a temperatura ambiente.
  8. Eseguire la colorazione con Ematossilina ed Eosina (H&E) su alcuni vetrini selezionati per valutare la morfologia del tessuto, il rimodellamento strutturale e lo spessore delle cuspidi valvolari.
  9. Eseguire la colorazione di Von Kossa su sezioni seriali adiacenti per rilevare e quantificare la calcificazione distrofica, identificabile come depositi minerali di colore marrone scuro fino al nero all'interno delle cuspidi valvolari.

8. Procedura chirurgica fittizia

NOTA: Questa sezione descrive la procedura di controllo Sham. I topi Sham vengono sottoposti alla stessa anestesia, preparazione della cute, esposizione del vaso, arteriotomia e inserimento retrogrado del filo guida del gruppo con lesione da filo aortico (AWI); il filo guida viene avanzato fino al livello sopravalvolare ma non viene fatto passare oltre la valvola aortica, e non viene effettuata alcuna lesione meccanica della valvola.

  1. Anestetizzare il topo e preparare il campo operatorio come descritto nei passaggi da 1.1 a 1.5.
  2. Sotto visualizzazione al microscopio stereoscopico, esporre la RCCA mediante dissezione tronca come descritto al passaggio 2.1.
  3. Ligare in modo permanente l'estremità distale della RCCA con un filo di seta 6-0 e posizionare un nodo scorsoio prossimale lasso (come nei passaggi 2.2–2.3).
  4. Eseguire l'arteriotomia trasversale e inserire il filo guida come descritto nei passaggi da 3.1 a 4.2.
  5. Avanzare il filo guida in direzione retrograda fino al livello sopravalvolare dell'aorta ascendente sotto guida ecocardiografica, confermando che la punta del filo guida NON attraversi la valvola aortica.
    NOTA: NON eseguire le manovre di lesione valvolare di spinta-trazione o rotazione descritte al passaggio 4.4. Ritirare il filo guida e legare immediatamente la RCCA prossimale come descritto nei passaggi da 5.1 a 5.2.
  6. Chiudere l'incisione cutanea con punti separati in nylon 5-0 o clip per ferite.
    NOTA: Come nel gruppo AWI, l'analgesia intraoperatoria viene fornita mediante infiltrazione locale di lidocaina (passaggio 1.5). Trasferire l'animale in una gabbia riscaldata per il recupero e monitorarlo fino a quando non sia completamente deambulante.
  7. Sottoporre i topi Sham allo stesso monitoraggio post-operatorio, valutazione ecocardiografica a 4 settimane ed elaborazione istologica del gruppo AWI.

9. Analisi statistica e progettazione dello studio

  1. Per tutta la durata dello studio, 20 topi (10 maschi, 10 femmine) sono stati sottoposti alla procedura AWI e 6 topi C57BL/6 (3 maschi, 3 femmine) alla procedura Sham.
  2. Misurare la velocità massima transvalvolare (il criterio che definisce il successo del modello) in tutti gli animali sopravvissuti (19 AWI, 6 Sham).
  3. Analizzare gli indici ecocardiografici e istologici dettagliati in un sottogruppo predefinito e bilanciato per sesso di 6 topi AWI (3 maschi, 3 femmine).
  4. Garantire che tutte le misurazioni ecocardiografiche e istologiche siano effettuate da ricercatori ciechi rispetto all'assegnazione dei gruppi.
  5. Valutare la normalità dei dati mediante il test di Shapiro-Wilk prima di effettuare test parametrici. Confrontare i due gruppi indipendenti (AWI rispetto a Sham) utilizzando un test t di Student non appaiato a due code.
  6. Analizzare e rappresentare i dati di sopravvivenza utilizzando il metodo di Kaplan-Meier.
  7. Eseguire tutte le analisi con GraphPad Prism. Presentare i dati come media ± SEM, considerando statisticamente significativo un valore di p < 0,05.

Risultati

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Sviluppo di una piattaforma stampata in 3D per il controllo dell'emorragia

Per affrontare l'emorragia perioperatoria—la principale causa di morbosità e mortalità nel modello convenzionale di AVS indotta da guida metallica—è stata progettata una piattaforma di supporto vascolare stampata in 3D (Figura 1). La piattaforma è stata realizzata mediante stampa stereolitografica (SLA) a partire da una resina fotopolimerica biocompatibile (conforme agli standard USP Classe VI / ISO 10993), con uno spessore strutturale di 1,07 mm. Dopo la stampa, le parti sono state lavate in alcol isopropilico per rimuovere la resina non polimerizzata e successivamente polimerizzate sotto luce ultravioletta. Il file di progettazione completo (.stp) è fornito in modo che la piattaforma possa essere riprodotta su sistemi SLA standard. La piattaforma presenta una superficie apicale a forma di V rovesciata con un angolo al vertice di 120° (Figura 1A–B), che si adatta alla curvatura dell'arteria carotide comune destra isolata senza indurre una compressione eccessiva della parete. Diversi intagli laterali a gradini (Figura 1C–D) permette all'operatore di agganciare le suture precedentemente posizionate e applicare una tensione longitudinale regolabile al vaso. La tensione viene aumentata in modo graduale fino a quando non è più visibile il polso arterioso—a un punto finale visivo che indica un'emostasi temporanea adeguata. Questo approccio garantisce un campo operatorio stabile per l'arteriotomia e l'inserimento del guidoncino, evitando al contempo lesioni da schiacciamento eccessivo alla parete vascolare.

Conferma intraoperatoria della posizione del filo guida

La corretta posizione del filo guida è stata verificata in due fasi durante l'intervento. In primo luogo, mediante visualizzazione diretta stereomicroscopica, si è osservato il filo guida entrare nel lume della RCCA attraverso l'arteriotomia trasversa in senso retrogrado (Figura 2A). In secondo luogo, l'ecocardiografia in tempo reale ha confermato che la punta del filo guida aveva attraversato la valvola aortica ed era entrata nel ventricolo sinistro. L'immagine in modo B ha identificato il filo guida come un'artefatto lineare iperecogeno che attraversa il piano della valvola aortica (Figura 2B). L'ecografia in modo Doppler colorato ha evidenziato un flusso turbolento localizzato a livello della valvola aortica, fornendo una conferma aggiuntiva del posizionamento del guidewire attraverso le cuspidi valvolari (Figura 2C; Video supplementare 1).

Sopravvivenza perioperatoria e tasso di successo del modello

L'integrazione della piattaforma regolabile per la tensione nel flusso chirurgico ha determinato un'elevata sopravvivenza precoce. L'analisi di Kaplan-Meier ha mostrato un tasso di sopravvivenza del 95% a 24 ore dalla chirurgia (19 su 20 topi; Figura 3A). L'esame post-mortem dell'unico animale deceduto non ha rivelato segni di emorragia grave, danni strutturali o ischemia cardiaca, suggerendo che la morte fosse attribuibile a complicanze legate all'anestesia piuttosto che a un trauma chirurgico. Il successo del modello a 4 settimane è stato valutato utilizzando un criterio predeterminato: velocità di flusso transvalvolare di picco superiore a 2.000 mm/s, insieme a reperti istologici di supporto. Dei 19 animali sopravvissuti, 18 (94,7%) hanno soddisfatto questo criterio, determinando un tasso complessivo di successo del modello del 90% nell'intero gruppo (18 su 20 topi; Figura 3B). Gli esiti sono risultati comparabili tra i sessi: la sopravvivenza a 24 ore è stata di 9 su 10 nei maschi e di 10 su 10 nelle femmine, mentre il tasso di successo del modello a 4 settimane è stato del 90% (9 su 10) in entrambi i sessi; l'unico decesso perioperatorio è stato un maschio (legato all'anestesia) e l'unico insuccesso del modello si è verificato in una femmina sopravvissuta.

Conferma ecocardiografica della stenosi aortica

L'ecocardiografia transtoracica a 4 settimane dal intervento chirurgico ha confermato modifiche emodinamiche compatibili con una stenosi aortica severa nel gruppo AWI. I valori ecocardiografici quantitativi sono riportati come media ± errore standard della media (SEM); i parametri funzionali e di rimodellamento del ventricolo sinistro sono stati analizzati in 6 topi Sham e 6 topi AWI, mentre la velocità massima del flusso transvalvolare è stata misurata in tutti i topi AWI sopravvissuti e nei controlli Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). La frazione di eiezione del ventricolo sinistro era leggermente inferiore nel gruppo AWI rispetto ai controlli Sham a 4 settimane (56,21 ± 1,15% vs. 61,57 ± 2,12%; p = 0,0503; Figura 3C), una differenza che non ha raggiunto la significatività statistica. Le registrazioni Doppler ad onda pulsata hanno dimostrato un marcato aumento della velocità del getto transvalvolare nel gruppo AWI, raggiungendo 2740,89 ± 104,10 mm/s, rispetto a 988,00 ± 126,24 mm/s nel gruppo di controllo Sham (Figura 3D). L'analisi quantitativa ha confermato un aumento altamente significativo della velocità massima del getto transvalvolare nel gruppo AWI rispetto ai controlli Sham (p < 0,0001; Figura 3E). In accordo con una fase iniziale di adattamento al sovraccarico pressorio, il gruppo AWI ha mostrato un rimodellamento concentrico del ventricolo sinistro: lo spessore della parete anteriore in diastole era significativamente aumentato (LVAWd 1,14 ± 0,02 vs. 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Figura 3F), mentre lo spessore della parete posteriore in diastole e la massa del ventricolo sinistro erano più elevati ma non hanno raggiunto la significatività statistica (LVPWd 1,01 ± 0,12 vs. 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Figura 3G; massa del VS 124,51 ± 10,63 vs. 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Figura 3H).

Convalida istopatologica del rimodellamento valvolare e della calcificazione

L'esame istologico delle radici aortiche ha confermato i risultati ecocardiografici. I valori istologici quantitativi sono espressi come media ± SEM ed sono stati analizzati in 6 topi Sham e 6 topi AWI. La colorazione con ematossilina-eosina (H&E) nel gruppo AWI ha rivelato un marcato ispessimento delle cuspidi e una disorganizzazione strutturale, caratteristiche assenti nei controlli Sham (Figura 3I). La morfometria quantitativa ha confermato un aumento significativo dello spessore medio delle cuspidi valvolari nel gruppo AWI rispetto al gruppo Sham (p < 0,0001; Figura 3J). La colorazione di Von Kossa ha evidenziato un'ampia calcificazione distrofica all'interno delle cuspidi valvolari ispessite del gruppo AWI, identificata come depositi minerali di colore marrone scuro fino al nero. I controlli Sham hanno mostrato depositi minerali trascurabili (Figura 3K). Un'analisi quantitativa delle immagini ha rivelato un aumento significativo dell'area totale di calcificazione (µm2) nel gruppo AWI rispetto ai controlli Sham (p < 0,0001; Figura 3L).

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Figura 1: Progetto della piattaforma di supporto vascolare stampata in 3D mostrata in quattro viste. (A) Vista obliqua anteriore-sinistra. (B) Vista obliqua posteriore-destra. (C) Vista laterale del profilo longitudinale complessivo della piattaforma. (D) Vista angolata che evidenzia la regione apicale a forma di V invertita. Etichette dei componenti: 110, corpo della piattaforma; 120, bracci laterali; 121, intagli laterali a gradini; 130, estremità operativa; 140, apice di inserimento a forma di V invertita; 150, superficie di supporto a contatto con il vaso; 160, pendenza di transizione tra intagli adiacenti; 190, arteria carotide comune destra (RCCA). La piattaforma è realizzata in resina fotopolimerica biocompatibile (spessore strutturale: 1,07 mm). Il disegno strutturale 3D è stato generato dagli autori a partire dal file CAD originale (.stp) della piattaforma di supporto vascolare, utilizzando FreeCAD, un software gratuito e open source per la modellazione e la visualizzazione CAD. Non sono stati adattati disegni tratti da pubblicazioni di terzi né disegni protetti da copyright. Il file CAD originale è disponibile come file supplementare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Conferma intraoperatoria ed ecocardiografica del posizionamento del filo guida. (A) Fotografia intraoperatoria che mostra l'inserimento retrogrado del filo guida (freccia) attraverso la arteriotomia trasversa nel lume dell'arteria carotide comune destra (RCCA) sotto visualizzazione stereomicroscopica diretta. (B) Immagine ecocardiografica in modo B che mostra il filo guida (identificato come un artefatto lineare iperecogeno; freccia) che attraversa la valvola aortica ed entra nel ventricolo sinistro. (C) Immagine ecocardiografica in Doppler colorato che dimostra un flusso turbolento localizzato a livello della valvola aortica, confermando il posizionamento del filo guida attraverso le cuspidi valvolari. La visualizzazione in tempo reale del flusso transvalvolare in Doppler colorato durante il posizionamento del filo guida è mostrata nel Video Supplementare 1. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Esiti di sopravvivenza, emodinamici, rimodellamento ventricolare e istopatologici del modello ottimizzato di lesione aortica con filo (AWI). (A) Curva di sopravvivenza a 24 ore secondo Kaplan-Meier nei topi AWI (n = 20). (B) Successo (rosso) rispetto al fallimento (nero) nel gruppo AWI a 4 settimane (n = 20); il successo è stato definito come velocità transvalvolare di picco > 2.000 mm/s. (C) Frazione di eiezione (EF; p = 0,0503). (D) Ecocardiogrammi rappresentativi con Doppler ad onda pulsata (PW) da un topo Sham (sinistra) e da un topo AWI (destra). (E) Velocità transvalvolare di picco (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0,0001). (F) Spessore della parete anteriore del ventricolo sinistro in diastole (LVAWd; p = 0,0016). (G) Spessore della parete posteriore del ventricolo sinistro in diastole (LVPWd; p = 0,0650). (H) Massa del ventricolo sinistro (p = 0,0961). (I) Sezioni rappresentative della radice aortica colorate con ematossilina-eosina (Sham, sinistra; AWI, destra). (J) Spessore delle cuspidi della valvola aortica (p < 0,0001). (K) Sezioni rappresentative della radice aortica colorate con Von Kossa (Sham, sinistra; AWI, destra). (L) Area totale di deposito di calcio (µm2; p < 0,0001). Le barre della scala = 500 µm. Per tutti i grafici a barre quantitativi, le barre rappresentano i valori medi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). I confronti quantitativi tra i gruppi Sham e AWI nei pannelli C, E–H, J e L sono stati effettuati utilizzando un test t di Student a due code non appaiato. I dati quantitativi provengono dai gruppi Sham e AWI (n = 6 per gruppo), eccetto per la velocità transvalvolare di picco nel pannello E, che è stata misurata in tutti i topi AWI sopravvissuti e nei controlli Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video supplementare 1: Visualizzazione ecocardiografica con Doppler colorato del flusso ematico transvalvolare durante il posizionamento del filo guida. Il video mostra l'imaging in tempo reale con Doppler colorato a livello della valvola aortica durante la procedura AWI, evidenziando un flusso turbolento localizzato indotto dal posizionamento del filo guida attraverso le cuspidi valvolari. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

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Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di un modello animale stabile e sicuro di stenosi aortica. Una caratteristica di questo approccio è una piattaforma ausiliaria che facilita l'inserimento del filo guida nell'arteria carotidea comune. La piattaforma viene realizzata mediante stampa stereolitografica (SLA) partendo da una resina fotopolimerica biocompatibile (spessore strutturale 1,07 mm) e incorpora una superficie apicale a forma di V capovolta con un angolo al vertice di 120°; il file completo del progetto è disponibile gratuitamente come file supplementare .stp. Questo dispositivo garantisce un inserimento regolare del filo guida, controlla oggettivamente la perdita ematica perioperatoria e, di conseguenza, protegge sia la sopravvivenza a breve sia quella a lungo termine dei topi modello. Dalla descrizione originale, il modello indotto dal filo guida è stato ulteriormente perfezionato e caratterizzato, comprendendo varianti di gravità graduata che modulano l'intensità della lesione per produrre stenosi da lieve a severa17 e recenti studi che documentano le sue complicanze perioperatorie18; il presente protocollo si basa su questo corpus di lavori affrontando sistematicamente l'emorragia perioperatoria.

Diversi passaggi di questo protocollo sono critici per un'induzione di successo del modello e meritano particolare attenzione. In primo luogo, il grado di tensione longitudinale applicata tramite la piattaforma stampata in 3D deve essere calibrato con precisione: la tensione deve essere aumentata solo fino a quando il polso arterioso diventa visivamente impercettibile. Una tensione insufficiente provoca sanguinamento continuo durante l'arteriotomia, mentre una tensione eccessiva comporta il rischio di danno endoteliale e rottura del vaso. In secondo luogo, il nodo scorsoio prossimale deve essere stretto saldamente sia intorno al vaso che al filo guida prima della rimozione della piattaforma; la rimozione prematura della piattaforma con un nodo scorsoio insufficientemente fissato è la causa più comune di emorragia durante la procedura. In terzo luogo, è essenziale confermare, mediante guida ecocardiografica, l'ingresso del filo guida nel ventricolo sinistro. Senza questo passaggio di verifica, l'operatore non può essere certo che il filo guida sia correttamente posizionato alla valvola aortica, e una lesione incompleta porterà al fallimento del modello.

È possibile prevedere e gestire diverse complicanze comuni. Se si verifica sanguinamento durante l'inserimento del filo guida, la piattaforma deve essere riposizionata al di sotto del vaso per ristabilire un'emostasi temporanea prima di proseguire. Negli animali con arterie carotidi di calibro ridotto, una leggera riduzione della tensione della piattaforma può dilatare il lume vascolare per consentire l'inserimento del filo guida. Questo modello presenta diversi limiti da considerare nell'interpretazione dei risultati. Il danno meccanico provocato dal filo causa un'iniziale lesione valvolare di tipo meccanico e infiammatorio, diversa dal processo degenerativo cronico, legato ai lipidi, che caratterizza la stenosi aortica calcifica umana17,19,20,21. Di conseguenza, le caratteristiche istologiche—sebbene riproducano l'ispessimento delle cuspidi e la calcificazione distrorofica—potrebbero non riprodurre completamente tutti gli eventi molecolari della malattia umana. Il protocollo è stato sviluppato e validato sia in topi C57BL/6 maschi che femmine di età compresa tra 8 e 10 settimane; tuttavia, l'applicabilità ad altre linee o ad animali di età differente richiede una validazione indipendente. Differenze legate al sesso nel diametro dell'arteria carotide e nell'anatomia cardiaca possono influenzare la difficoltà chirurgica e gli esiti emodinamici; si raccomanda agli sperimentatori di riportare il sesso come variabile biologica nelle analisi successive22. Inoltre, la legatura permanente della carotide comune destra è intrinseca alla procedura; sebbene il Circolo di Willis assicuri una perfusione collaterale cerebrale nei topi e non siano stati osservati deficit neurologici evidenti, non si possono escludere effetti cerebrovascolari o cognitivi sottili. Non è stata eseguita ecocardiografia basale (pre-intervento); il gruppo finto intervento è stato utilizzato come controllo per la normale funzione valvolare, e si raccomanda un'ecografia basale laddove possibile, per consentire confronti intra-individuali e per escludere le rare anomalie spontanee della valvola aortica riportate nei topi C57BL/6 (~0,3% nelle linee non modificate). L'insufficienza aortica non è stata valutata sistematicamente in questo studio; la frequenza dell'insufficienza aortica indotta dal danno e la sua relazione con la gravità della stenosi richiedono una valutazione specifica e saranno affrontate in futuri lavori.

Vanno considerati anche i potenziali svantaggi della piattaforma. Il dispositivo potrebbe irritare meccanicamente strutture adiacenti, inclusi il nervo vago che corre lungo l’arteria carotidea; questo rischio è ridotto al minimo grazie ai bordi arrotondati e smussati della piattaforma, al suo apice di 120° conformabile al vaso e alla breve durata dell’applicazione, e nello studio non sono state osservate anomalie respiratorie né altre complicazioni evidenti attribuibili al dispositivo. Rispetto agli approcci alternativi consolidati, questo protocollo ottimizzato offre diversi vantaggi pratici. I modelli dietetici nei topi ApoE⁻/⁻ richiedono 20–24 settimane di alimentazione ad alto contenuto lipidico e determinano fenotipi stenotici variabili, con molti animali che non sviluppano una malattia emodinamicamente significativa. Il presente protocollo produce un fenotipo stenotico costante entro 4 settimane, con un tasso di successo complessivo del 90% (18 su 20 animali). Rispetto al metodo originale con guida a filo di Honda, il principale avanzamento di questo protocollo consiste nel controllo sistematico dell’emorragia perioperatoria mediante la piattaforma stampata in 3D.

L'emorragia durante l'inserimento del guidewire è stata riconosciuta come una complicanza della tecnica originale, ma è stata scarsamente affrontata. Nell'esperienza retrospettiva dello stesso laboratorio con la procedura convenzionale (pre-piattaforma) (oltre 400 casi), si è verificata un'emorragia intraoperatoria maggiore in circa il 40% dei casi, con una mortalità post-emorragia del ~60% e una sopravvivenza a 24 ore del ~75%, e l'emorragia—principalmente a livello del sito di accesso carotideo—è stata responsabile di quasi tutti i decessi perioperatori. Questo dato è in accordo con Qian et al., i quali hanno identificato il sanguinamento al sito di puntura carotideo come causa principale della morte perioperatoria in questo modello. Controllando la perdita ematica, la piattaforma stampata in 3D ha aumentato la sopravvivenza a 24 ore fino al 95%, senza alcun decesso attribuibile a emorragia osservato nel presente gruppo di pazienti. Poiché l'emorragia non è più la preoccupazione limitante, l'intensità del danno meccanico può essere variata per produrre una stenosi di gravità graduata. Questa regolabilità ha un'importanza traslazionale diretta: per terapie sperimentali con effetti di entità modesta, un danno di base più grave potrebbe essere necessario per rivelare differenze legate al trattamento che altrimenti sarebbero occultate in un modello più lieve.

Questo modello è particolarmente adatto a diverse categorie di indagini successive. Poiché il fenotipo stenotico si sviluppa entro un arco di tempo definito e riproducibile, può fungere da piattaforma per la valutazione preclinica di potenziali terapie farmacologiche finalizzate a rallentare la calcificazione o la fibrosi valvolare23. Il modello è inoltre compatibile con approcci genetici: il protocollo può essere applicato a topi transgenici o knockout sul ceppo C57BL/6 per analizzare il contributo di specifiche vie di segnalazione alla progressione della malattia valvolare. Inoltre, il punto terminale a 4 settimane offre una finestra pratica per il monitoraggio ecocardiografico seriale dell'evoluzione della malattia o della risposta al trattamento. I file di progettazione della piattaforma in 3D possono essere condivisi liberamente come file supplementare .stp, e ci si attende che la standardizzazione di questo dispositivo tra diversi laboratori migliori ulteriormente la riproducibilità intersito.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto né conflitti di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Nazionale di Grande Rilevanza Scientifica e Tecnologica sulle Malattie Croniche Non Trasmissibili (2026ZD0554300); dalla Fondazione Nazionale delle Scienze Naturali della Cina (U23A20395, 82170375, 82500455); dalla Fondazione delle Scienze Naturali della Provincia di Sichuan (2026NSFSC0552); dai Fondi per la Ricerca Fondamentale delle Università Centrali; dai Progetti Scientifici e Tecnologici della Regione Autonoma del Tibet, Cina (XZ202501ZY0120); e dal Progetto «1.3·5» dell'Ospedale di West China, Università di Sichuan (ZYGD23021, 23HXFH009). Gli autori ringraziano Qipu Feng (Centro per gli Esperimenti sugli Animali, Ospedale di West China, Università di Sichuan) per l'assistenza nell'ecografia su piccoli animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piattaforma di supporto vascolare stampata in 3DPersonalizzatoN/DPiattaforma di supporto vascolare personalizzata stampata in 3D; file CAD supplementare fornito in formato .stp.
Paraformaldeide al 4%ServicebioG1101-3MLFissazione dei tessuti
Chirurgia in nylon 5-0Jinhuan MedicalF503Chiusura cutanea mediante punti separati
Chirurgia in seta 6-0Jinhuan MedicalRC411Ligatura permanente della RCCA distale e nodo scorrevole prossimale
Gel di accoppiamento acustico (pre-riscaldato)KepplerKL-250Ecocardiografia
Resina fotopolimerizzabile biocompatibileFormlabsRS-F2-BMCL-01Materiale per stampa SLA utilizzato per realizzare la piattaforma di supporto vascolare personalizzata stampata in 3D.
Topi C57BL/6 (8–10 settimane; maschi 22–25 g, femmine 18–20 g)GemPharmatechC57BL/6Entrambi i sessi utilizzati; mantenuti in condizioni standard
Gas di ossido di etileneStruttura istituzionale di sterilizzazioneN/DSterilizzazione della piattaforma di supporto vascolare personalizzata stampata in 3D.
FreeCADFreeCAD Project Association1.1.1Visualizzazione CAD e generazione del disegno strutturale 3D a partire dal file .stp.
GraphPad PrismGraphPad Software9.0Analisi statistica e creazione di grafici
Filo guida, diametro 0,014 polliciBoston ScientificH749393071900Lesione meccanica della valvola aortica
Kit di colorazione Ematossilina ed Eosina (H&E)BeyotimeC0105SMorfologia e spessore delle cuspidi
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22-2Induzione al 3%; mantenimento al 1,5–2% in O2 al 100%
LidocainaShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045Infiltrazione locale preventiva nel sito dell'incisione (0,5%, passaggio 1,5)
Forbici microchirurgicheRWD Life ScienceF11022-11Incisione cutanea, arteriotomia, toracotomia
Trasduttore MX550D (40 MHz)FUJIFILM VisualSonicsMX550DEcocardiografia
Crema depilatoria NairNair255 gPer la depilazione della regione cervicale anteriore e della parete toracica
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)ServicebioG4202-100MLPerfusione
Microtomo rotativoLeica BiosystemsRM2125 RTSTaglio in serie a 4–5 µm
Stereomicroscopio (chirurgico)OlympusSZX7Isolamento dei vasi e microchirurgia
Sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione Vevo 3100FUJIFILM VisualSonicsVevo 3100Ecocardiografia
Kit di colorazione di Von KossaServicebioG1043-20MLRilevamento della calcificazione distrofica
XileneNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209Chiarificazione dei tessuti durante la lavorazione in paraffina.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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