Effetti dell'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento sulla microstruttura della capsula esterna e sull'eccitabilità del riflesso spinale in un modello ratto di spasticità post-ictus

Sommario

Questo protocollo descrive l'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento in un modello ratto di spasticità post-ictus e ne dimostra la valutazione tramite imaging comportamentale, di risonanza magnetica, di valutazione istologica ed elettrofisiologica per indagare i cambiamenti nella microstruttura della capsula esterna e nell'eccitabilità del riflesso spinale.

Abstract

La spasticità post-ictus (PSS) compromette gravemente la funzione motoria e la qualità della vita dopo l'ictus. La rottura della via cortico-reticolospinale e l'inibizione sopraspinale discendente compromessa sono considerati meccanismi patologici importanti; tuttavia, i meccanismi neurali e microstrutturali alla base degli effetti terapeutici dell'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento (MSSA) rimangono incompletamente compresi. Questo studio mirava a indagare gli effetti della MSSA sulla PSS utilizzando una valutazione multimodale che integra neuroimaging, elettrofisiologia e istologia in un modello ratto di occlusione dell'arteria cerebrale media. È stata effettuata l'imaging a risonanza magnetica pesata T2 per quantificare il volume dell'infarto cerebrale, e l'imaging a tensore di diffusione è stato utilizzato per valutare l'integrità microstrutturale della sostanza bianca della capsula esterna. La colorazione Luxol Fast Blue (LFB) ha valutato l'integrità della mielina all'interno della capsula esterna, mentre le registrazioni del riflesso H hanno valutato l'eccitabilità del riflesso spinale. Sono state effettuate analisi di correlazione per esaminare le relazioni tra volume dell'infartto, microstruttura della sostanza bianca, eccitabilità del riflesso spinale e gravità della spasticità. La MSSA ha ridotto il volume dell'infarto cerebrale, alleviato il danno microstrutturale della capsula esterna e attenuato la demielinizzazione. Inoltre, la MSSA ha migliorato i parametri anomali del riflesso H, normalizzato l'eccitabilità del riflesso spinale e ridotto la spasticità. Le analisi di correlazione hanno mostrato che gli infarti più grandi erano associati a una maggiore lesione della capsula esterna, mentre un'integrità della sostanza bianca meglio conservata era associata a una migliore regolazione del riflesso spinale e a una spasticità meno grave. Questi risultati suggeriscono che l'MSSA possa alleviare il PSS riducendo la lesione cerebrale ischemica, preservando l'integrità microstrutturale della capsula esterna e migliorando la funzione inibitoria discendente associata alla via cortico-reticolospinale, fornendo evidenze precliniche a supporto della sua applicazione terapeutica.

Introduzione

La spasticità post-ictus (PSS) è una conseguenza diffusa e invalidante dell'ictus ischemico, definita clinicamente da aumenti del tono muscolare dipendenti dalla velocità e dalla lunghezza. Questa condizione spesso porta a una postura degli arti anomala e a schemi di movimento disfunzionali, compromettendo gravemente l'indipendenza motoria e la qualità della vita dei pazienti, imponendo al contempo oneri economici e di caregiver a livello mondiale ^1,2. Come manifestazione tipica della sindrome del motoneurone superiore, la patogenesi del PSS è principalmente attribuita all'ipereccitabilità esagerata dei riflessi di stiramento spinali. Studi neuroanatomici e neurofisiologici accumulati hanno dimostrato che la perdita della modulazione inibitoria discendente dal sistema extrapiramidale ai circuiti riflessi spinali è un meccanismo patologico chiave alla base dell'inizio e della progressione del PSS, con la via cortico-reticolospinale che funge da circuito neurale principale che media questo controllo regolatorio ^{discendente 3,4,5}.

La tecnica del needling è un fattore chiave per l'efficacia dell'agopuntura e occupa una posizione centrale nella pratica clinica dell'agopuntura. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento (MSSA) è una tecnica distintiva di needling sviluppata specificamente per l'intervento PSS che combina l'agopuntura del cuoio capelluto con esercizi simultanei attivi o passivi degli arti³. Numerosi studi clinici hanno dimostrato che l'MSSA produce risultati superiori rispetto all'agopuntura del cuoio capelluto da sola o alla riabilitazione da esercizio fisico nel ridurre la gravità della spasticità, ripristinare la funzione locomotoria e migliorare le attività della vita quotidiana nei sopravvissuti a ictus 6,7,8,9. I nostri precedenti studi su animali hanno inoltre dimostrato che la MSSA esercita effetti antispastici più evidenti rispetto all'agopuntura convenzionale del cuoio capelluto nei modelli ratti di PSS. Meccanicamente, questi effetti terapeutici sono stati associati a un miglioramento della perfusione cerebrale nella penombra ischemica, a una riduzione dell'eccitabilità del riflesso di allungamento spinale e a un aumento dell'espressione del cotrasportatore di cloruro di potassio 2 (KCC2) nei motoneuroni del corno anteriore spinale. Questa modulazione molecolare può ulteriormente potenziare la trasmissione inibitoria spinale γ-aminobutiric acid (GABA)ergico, contribuendo così al sollievo della^{spasticità 10,11}.

Le indagini meccanicistiche esistenti sulla MSSA rimangono limitate, senza studi precedenti che esaminino specificamente come la sostanza bianca intracerebrale a monte all'interno delle vie discendenti extrapiramidali contribuisca alla PSS. La capsula esterna forma un segmento critico della sostanza bianca della via cortico-reticolospinale; Contiene fibre cortico-tegmentali che trasmettono segnali corticali alla formazione reticola del tronco encefalico, contribuendo così al controllo inibitorio sopraspinale dei circuiti riflessi^{spinali 12,13}. In linea con questo ruolo anatomico, studi multipli di mappatura lesioni-sintomo basati su voxel hanno mostrato che il danno della capsula esterna è associato a spasticità degli arti superiori e inferiori dopo^ictus 12,13,14. Queste osservazioni anatomiche e cliniche supportano la selezione della capsula esterna come regione primaria di interesse (ROI). Ad oggi, nessuna evidenza in vivo ha dimostrato se la MSSA preservi l'integrità microstrutturale della capsula esterna o se tali alterazioni siano associate a cambiamenti nell'eccitabilità del riflesso spinale. Le valutazioni cliniche basate su valutazioni comportamentali, risonanza magnetica convenzionale (MRI) e test elettrofisiologici permettono solo analisi correlazionali e possono essere influenzate dall'eterogeneità del paziente, dalla durata della malattia e da altri fattori clinici di confusione. Al contrario, i modelli standardizzati di PSS consentite un controllo rigoroso delle variabili sperimentali e dei protocolli di intervento uniformi, fornendo così una piattaforma complementare per l'indagine meccanicistica.

Concentrandosi sulla microstruttura della sostanza bianca cerebrale e sulla funzione neurofisiologica, questo studio ha integrato approcci multimodali, tra cui immagini ponderate T2 (T2WI), imaging a tensore di diffusione (DTI), registrazione elettrofisiologica del riflesso H, colorazione mirata con Luxol Fast Blue (LFB) della capsula esterna e valutazioni comportamentali. Attraverso l'istituzione di un quadro integrato di correlazione struttura-funzione-comportamento, questo studio ha mirato a indagare le relazioni tra infarto cerebrale, microstruttura della capsula esterna, eccitabilità del riflesso spinale e spasticità dopo il trattamento MSSA in un modello di PSS su ratto. I risultati mirano a fornire prove precliniche a supporto dell'associazione tra integrità della capsula esterna preservata e ridotta ipereccitabilità del riflesso spinale dopo l'MSSA, fornendo al contempo una base teorica per l'applicazione traslazionale dell'MSSA nella riabilitazione PSS.

Protocollo

Quaranta maschi adulti di ratti Sprague–Dawley (SD) Specifici Patogeno Liberi (SPF), con un peso compreso tra 240 e 280 g, sono stati acquistati presso Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licenza: SCXK (Jing) 2021-0011]. Tutti i ratti venivano ospitati nel Centro per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Pechino in condizioni controllate, con una temperatura ambiente di 23°C ± 1°C, umidità relativa del 50% ± 5% e un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, con libero accesso a cibo e acqua. I ratti sono stati acclimatati per 5 giorni, durante i quali è stato svolto contemporaneamente l'allenamento di acclimatazione su tapis roulant. Gli animali hanno effettuato un'acclimatazione sul tapis roulant una volta al giorno a una velocità di 10 m/min per 15 minuti per sessione senza stimolazione elettrica per ridurre lo stress durante la manovraggio.

Sulla base del nostro studio precedente, il tasso di successo dell'induzione PSS tramite il metodo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è di circa il 60^%. Utilizzando una tabella dei numeri casuali, 9 ratti furono selezionati casualmente in anticipo come gruppo gestito da simulazione; i restanti 31 ratti furono utilizzati per l'istituzione dei modelli. Dopo una modellazione riuscita del successo, questi ratti sono stati divisi casualmente in gruppo modello e gruppo MSSA. Alla fine, in ogni gruppo furono inclusi nove ratti. Questo esperimento è stato condotto in conformità con i principi 3R del benessere degli animali da laboratorio ed è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM 20250915-008).

Istituzione Modello

Il modello MCAO è stato stabilito nei ratti utilizzando una tecnica modificata del filamento intraluminale. I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% per l'induzione, e l'anestesia è stata mantenuta con l'1,5% di isoflurano somministrato in ossigeno a un flusso costante di 1 L/min durante tutta la procedura chirurgica. È stata effettuata un'incisione cervicale nella linea media, seguita da una dissezione contusa per esporre l'arteria carotide comune destra (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA). Una sutura monofilamento in nylon (diametro, 0,36 ± 0,02 mm) è stata introdotta nell'ICA tramite l'ECA e ha avanzato di circa 18–20 mm fino all'origine dell'arteria cerebrale media (MCA) per ottenere l'occlusione arteriosa. I vasi erano legati e l'incisione chiusa. I ratti venivano poi messi su una borsa termica fino al recupero dall'anestesia. I ratti del gruppo operato a simulazione hanno subito la stessa esposizione chirurgica di CCA, ICA ed ECA senza inserimento del filamento intraluminale.

Dopo l'intervento, tutti i ratti MCAO ricevevano cure post-operatorie standardizzate. Gli animali venivano mantenuti su un cuscinetto riscaldante a 37°C per le prime 12 ore per prevenire l'ipotermia. Le incisioni chirurgiche sono state pulite quotidianamente per tre giorni consecutivi, l'ampicillina (100 mg/kg) è stata somministrata tramite iniezione intraperitoneale per la profilassi dell'infezione e è stato fornito cibo ammorbidito per mantenere una nutrizione adeguata. L'attività generale, l'assunzione di cibo, la condizione della ferita e la funzione motoria degli arti sono state monitorate quotidianamente dai giorni postoperatori 1-10.

I deficit neurologici sono stati valutati da ricercatori ciechi sull'allocazione dei gruppi utilizzando il punteggio di deficit neurologico Zea Longa, e il tono muscolare è stato valutato utilizzando la Modified Ashworth Scale (MAS). Le valutazioni sono state effettuate 1 giorno prima dell'intervento (giorno −1), il giorno dell'intervento prima dell'MCAO (giorno 0) e nei giorni postoperatori 1, 3, 5, 7 e 10. I ratti con Zea Longa e punteggi MAS ≥1 al terzo giorno postoperatorio sono stati considerati aver stabilito un modello PSS di successo.

Trattamento MSSA

Gli interventi sono iniziati al terzo giorno post-operatorio. Il sito di stimolazione dell'agopuntura del cuoio capelluto era la linea ipsilesionale MS 6 (linea parietotemporale obliqua anteriore). In conformità con lo Standard Nazionale per le Manipolazioni Standardizzate dell'Agopuntura del Cuoio Capelluto (GB/T 21709.2-2021), la linea MS 6 si estende da GV 21 (Qianding) a GB 6 (Xuanli).

Aghi di agopuntura sterili usa e getta (0,25 × 13 mm) sono stati inseriti sotto la galea aponeurotica a GV 21 con un angolo obliquo di circa 15° rispetto alla superficie del cuoio capelluto e avanzati verso GB 6 lungo la linea parietotemporale obliqua anteriore fino a una profondità di circa 10 mm. La manipolazione rapida a rotazione (200 giri/min) veniva applicata ininterrottamente per 1 minuto. Dopo 15 minuti di ritenzione dell'ago, la manipolazione della stessa rotazione è stata ripetuta una volta, risultando in un tempo totale di ritenzione dell'ago di 30 minuti. Durante tutto il periodo di ritenzione degli aghi, i ratti hanno effettuato contemporaneamente esercizi sul tapis roulant a una velocità costante di 10 m/min.

I ratti nei gruppi a simulazione e modello non ricevevano né agopuntura né esercizio sul tapis roulant. Per controllare la maneggiazione non specifica e lo stress da contenzione, sono stati delicatamente maneggiati e trattenuti in supporti non compressivi per 30 minuti al giorno, corrispondendo alla durata totale giornaliera dell'intervento del gruppo MSSA.

Valutazioni comportamentali

Punteggio di Zea Longa per deficit neurologici:

I deficit neurologici nei ratti sono stati valutati utilizzando il sistema di punteggio Zea^{Longa 16}. Sono stati applicati i seguenti criteri: un punteggio di 0 non indicava alcun deficit neurologico e movimento normale e senza vincoli; un punteggio di 1 indicava un'estensione incompleta dell'arto anteriore o posteriore controlaterale al lato colpito; un punteggio di 2 indicava il giro verso il lato controlaterale durante la locomozione; un punteggio di 3 indicava una caduta sul lato controlaterale mentre camminava; e un punteggio di 4 indicava perdita di coscienza con assenza di deambulazione spontanea.

MAS per il tono muscolare:

Il tono muscolare è stato valutato utilizzando il MAS¹⁷. I criteri erano definiti come segue: grado 0, nessun aumento del tono muscolare; grado 1, lieve aumento del tono muscolare, con una presa transitoria o resistenza minima alla fine della flessione e dell'estensione passive; Grado 1+, marcato aumento del tono muscolare, con un blocco transitorio nel mezzo del movimento e resistenza persistente durante la seconda metà del movimento; Grado 2, aumento marcato del tono muscolare, con resistenza evidente per la maggior parte dell'intervallo di movimento, anche se l'arto rimaneva facilmente mobile; Grado 3, aumento sostanziale del tono muscolare che rendeva difficile la flessione e l'estensione passiva; e grado 4, movimento passivo limitato a causa della rigidità delle articolazioni. Al Grado 1+ è stato assegnato un punteggio di 2 punti, ottenendo un punteggio massimo MAS di 5 punti in questo studio¹⁰.

T2WI Neuroimaging per la quantificazione del volume dell'infarto cerebrale

Tutte le scansioni T2WI sono state acquisite utilizzando uno scanner PharmaScan MI operato con il software ParaVision 360 (versione 3.5). Una sequenza di impulsi turbo rapida pesata T2 con potenziamento di rilassamento (T2_TurboRARE, chiamata anche RARE/fast spin echo [FSE]) è stata applicata ai ratti MCAO per la quantificazione del volume dell'infarto cerebrale. I parametri di imaging erano configurati come segue: tempo di ripetizione (TR) = 3000,0 ms, tempo di eco (TE) = 33,0 ms, campo visivo (FOV) = 35,00 × 35,00^{mm 2}, dimensione della matrice = 250 × 250, spessore della fetta = 0,80 mm, numero di fette = 35, numero di eccitazioni (NEX) = 3,0 e angolo di rotazione (FA) = 180,0°. Le regioni dell'infarto cerebrale sono state delineate manualmente su base fetta per fetta nel software ITK-SNAP (versione 4.4.0) da un singolo investigatore cieco all'assegnazione di gruppo, utilizzando variazioni di intensità del segnale e caratteristiche morfologiche compatibili con l'infarto ischemico. Il volume dell'infarto cerebrale veniva quindi calcolato automaticamente dal software.

DTI Neuroimaging per la valutazione dell'integrità microstrutturale della sostanza bianca

I dati della risonanza magnetica sono stati acquisiti utilizzando uno scanner a risonanza magnetica PharmaScan da 7,0 T. L'anestesia è stata indotta con isoflurano al 3% somministrato in aria compressa (0,4–0,6 L/min) e mantenuta con isoflurano all'1% durante l'acquisizione del DTI. La temperatura corporea centrale è stata mantenuta tramite un bagno d'acqua controllato termostaticamente durante tutta la procedura di imaging.

Durante la risonanza magnetica, è stata applicata per la prima volta una sequenza di localizzazione a tre piani per posizionare il cervello del ratto all'interno del magnete. Il DTI veniva eseguito utilizzando una sequenza assiale di eco-planare spin-echo a colpo singolo con i seguenti parametri: TR/TE = 3000/27 ms, matrice = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm², spessore della fetta = 0,7 mm, 30 direzioni di gradiente di diffusione e valori b di 0 e 1000 s/^{mm 2}. Per l'analisi DTI, sono state disegnate regioni di interesse nella capsula esterna su tacche cerebrali di 1,3 mm posteriori al bregma. Le mappe parametriche di anisotropia frazionaria (FA), diffusività media (MD), diffusività assiale (AD) e diffusività radiale (RD) sono state ricostruite utilizzando il software ParaVision 360. I dati sono espressi come il rapporto tra l'emisfero colpito e quello sano controlaterale.

Colorazione LFB per la valutazione della lesione della mielina e la rimielinizzazione

La colorazione con LFB è stata eseguita per valutare i danni strutturali agli assoni mielinizzati nella capsula esterna. La lesione della mielina, caratterizzata da rarefazione e vacuolazione della mielina, è stata quantificata misurando la densità ottica integrata (IOD) delle fibre mielinizzate colorate con LFB all'interno del ROI nella capsula esterna utilizzando il software ImageJ (versione 6.0; soglia in scala di grigi, 35–225). Sulla base dell'atlante stereotasico cerebrale^{del ratto 18}, sono state analizzate tre sezioni coronali per ogni animale con bregma +1,0 mm, −1,3 mm e −1,6 mm, corrispondenti alle porzioni anteriore, media e media-posteriore della capsula esterna. La media IOD tra le tre sezioni è stata calcolata per rappresentare ogni animale (n = 4 per gruppo). I valori dell'IOD ipsilaterale sono stati normalizzati sul lato controlaterale ed espressi come^{percentuale 19}.

Registrazioni elettrofisiologiche per la valutazione dell'eccitabilità del riflesso spinale

Il riflesso H monosinaptico spinale è stato registrato utilizzando un sistema di esperimenti di funzione biologica. I ratti sono stati leggermente anestetizzati con α-cloraloso (50 mg/kg, intraperitoneale) per preservare l'eccitabilità del riflesso spinale durante le registrazioni elettrofisiologiche. Il nervo sciatico sinistro è stato esposto tramite dissezione contusiva e posto su elettrodi a gancio bipolare per stimolazione elettrica. Una soluzione vitaminica oleosa è stata applicata intermittentemente sul nervo esposto per mantenere l'idratazione dei tessuti e la vitalità neurale. Una coppia di elettrodi di registrazione in acciaio inox veniva inserita nei muscoli interossei della zampa posteriore sinistra e un elettrodo di massa veniva posizionato nella coda. Il riflesso H è stato evocato utilizzando uno stimolatore a impulsi monopolari-bipolare con una durata dell'impulso di 100 μs. La soglia del riflesso H e la soglia motoria (MT) sono state determinate tramite stimolazione elettrica incrementale, con la corrente aumentata in passi di 0,05 mA fino a un'intensità massima di 3,0 mA per evitare lesioni irreversibili del nervo periferico.

Utilizzando la stessa intensità di stimolazione che ha suscitato il riflesso H massimo (H_max), sono stati somministrati stimoli a impulsi di frequenze variabili (0,3, 5 e 10 Hz) per ottenere ampiezze del riflesso H a frequenze di stimolazione differenti. È stata applicata una stimolazione ripetuta a impulsi a 0,3 Hz per verificare che l'ampiezza dell'onda M rimanesse entro il 95% del suo valore iniziale; altrimenti, il dataset veniva scartato. La depressione dipendente dalla frequenza (FDD) del riflesso H è stata calcolata come la percentuale del rapporto di ampiezza H/M-onda (rapporto H/M) a 5 Hz e 10 Hz rispetto a 0,3 Hz, con il rapporto H/M a 0,3 Hz che funge da riferimento^{di base 10}.

Analisi dei Dati

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SPSS (versione 20.0). I dati continui sono presentati come la deviazione media ± standard (SD). La normalità dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per confrontare gli esiti di imaging convenzionali e altre variabili quantitative tra i gruppi. Quando l'omogeneità della varianza era soddisfatta, venivano eseguiti test post hoc di Bonferroni; altrimenti veniva applicato il test T3 di Dunnett. I dati comportamentali sono stati analizzati utilizzando ANOVA bidirezionale con il gruppo sperimentale e il punto temporale post-operatorio come fattori fissi. L'analisi di correlazione di Spearman è stata utilizzata per valutare le associazioni tra le variabili dello studio. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

MSSA mitiga i deficit funzionali neurologici

L'ANOVA a due vie a misure ripetute ha rivelato effetti principali significativi del tempo (F[2.613, 62.71] = 315.3, p < 0.001) e del gruppo (F[2, 24] = 142.9, p < 0.001), oltre a un'interazione significativa di tempo × gruppo (F[12, 144] = 99.94, p < 0.001) per i punteggi neurologici di Zea Longa. Un giorno prima dell'intervento, tutti i ratti dei gruppi sham-operati, modello e MSSA avevano un punteggio Zea Longa di 0, indicando una funzione neurologica basale intatta senza deficit neurologici. A partire dal primo giorno postoperatorio, i punteggi di Zea Longa sono aumentati gradualmente sia nel gruppo modello che in quello MSSA. Non sono state osservate differenze significative tra questi gruppi dal giorno 1 al giorno 5 postoperatorio (p > 0,05). Con l'intervento continuato, i punteggi di Zea Longa nel gruppo MSSA sono stati significativamente inferiori rispetto a quelli del gruppo modello nei giorni postoperatori 7 e 10 (p < 0,001), indicando un miglioramento della funzione neurologica (Figura 1A).

Figura 1. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento migliora i deficit neurologici e riduce il tono muscolare nei ratti con spasticità post-ictus. (A) Punteggi di deficit neurologico di Zea Longa misurati prima dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO; giorno −1), immediatamente prima dell'MCAO (giorno 0) e nei giorni postoperatori 1, 3, 5, 7 e 10. (B) Punteggi della Scala di Ashworth modificata misurati nei corrispondenti punti temporali. La linea verticale tratteggiata indica MCAO al giorno 0. I dati sono presentati come la deviazione media ± standard (SD). Le barre di errore rappresentano SD. ***p < 0,001 per i confronti indicati tra parentesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La MSSA riduce il volume dell'infarto cerebrale

I ratti operati a simulazione hanno mostrato risultati normali di T2WI con intensità parenchimatosa omogenea in tutto il cervello. Non sono state osservate iperintensità patologiche, infarto cerebrale, anomalie morfologiche o dilatazione ventricolare (Figura 2A). Al contrario, il gruppo modello ha mostrato una prominente iperintensità T2 nell'emisfero cerebrale ipsilaterale, corrispondente alla regione dell'infarto ischemico, insieme a un evidente ingrossamento ventricolare (Figura 2A). L'analisi morfometrica quantitativa ha dimostrato che il volume dell'infarto cerebrale è stato significativamente ridotto nel gruppo MSSA rispetto al gruppo modello (p < 0,001; Figura 2B). L'intervento MSSA è illustrato nella Figura 2C.

Figura 2. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento riduce il volume dell'infarto cerebrale nei ratti con spasticità post-ictus. (A) Immagini rappresentative del cervello con immagini ponderate T2 (T2WI) dai gruppi di agopuntura del cuoio capelluto simulata, modello e in stile movimento (MSSA) a 1,00, 0,20, −0,92 e −1,88 mm rispetto al bregma. (B) Quantificazione del volume dell'infarto cerebrale da T2WI. I singoli simboli rappresentano animali individuali. (C) Fotografia dell'intervento MSSA eseguito contemporaneamente all'esercizio sul tapis roulant. I dati sono presentati come media ± SD. Le barre di errore rappresentano SD. ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MSSA attenua la spasticità muscolare post-ictus

Per i punteggi MAS, l'ANOVA a misure ripetute a due vie ha rivelato effetti principali significativi del tempo (F[2.158, 51.79] = 183.7, p < 0.001) e del gruppo (F[2, 24] = 57.68, p < 0.001), insieme a un'interazione significativa nel tempo × gruppo (F[10, 120] = 58.70, p < 0.001). Tutti i ratti hanno mostrato un punteggio MAS di 0 un giorno prima dell'intervento e nel primo giorno postoperatorio, riflettendo un tono muscolare di base normale senza spasticità. Dal terzo giorno postoperatorio in poi, i punteggi MAS sono aumentati progressivamente nei gruppi modello e MSSA, indicando lo sviluppo di spasticità post-ictus degli arti, senza differenze significative osservate tra i due gruppi a questo punto. Dal giorno 5 al giorno 10 postoperatori, i punteggi MAS nel gruppo MSSA sono stati significativamente inferiori rispetto a quelli del gruppo modello (p < 0,01 a p < 0,001), indicando che MSSA alleviava il PSS (Figura 1B).

MSSA preserva l'integrità microstrutturale della sostanza bianca nella capsula esterna

Mappe rappresentative dei parametri DTI sono mostrate nella Figura 3A. Al decimo giorno postoperatorio, rispetto al gruppo operato a simulazione, il gruppo modello ha mostrato una marcata riduzione del rapporto di anisotropia frazionaria (rFA) all'interno della capsula esterna (p < 0,001; Figura 3B), accompagnati da aumenti significativi nei rapporti di diffusività media (rMD) e diffusività radiale (rRD) (entrambi p < 0,001; Figura 3C,D). Rispetto al gruppo di modelli, la MSSA ha aumentato significativamente la rFA (p < 0,001; Figura 3B) e una significativa riduzione della rMD e della rRD (entrambe p < 0,01; Figura 3C,D). Non è stata osservata differenza significativa nel rapporto di diffusività assiale (rAD) tra i gruppi (p > 0,05; Figura 3E). La posizione dei ratti durante l'acquisizione del DTI e la posizione anatomica del ROI della capsula esterna sono mostrate nella Figura 3F, G.

Figura 3. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento modifica i parametri di imaging del tensore di diffusione nei ratti con spasticità post-ictus. (A) Mappe rappresentative di anisotropia frazionaria (FA), diffusività media (MD), diffusività assiale (AD) e diffusività radiale (RD) dai gruppi di agopuntura del cuoio capelluto simulato, modello e in stile movimento (MSSA) a −1,30 mm rispetto al bregma. (B–E) Quantificazione dei rapporti tra FA ipsilesionale e controlaterale (rFA), MD (rMD), RD (rRD) e AD (rAD), rispettivamente. I singoli simboli rappresentano animali individuali. (F) Fotografia di un ratto posizionato per l'imaging del tensore di diffusione (DTI). (G) Immagine schematica e corrispondente della risonanza magnetica che mostra le regioni della capsula esterna controlaterale e ipsilesionale di interesse. I dati sono presentati come media ± SD. Le barre di errore rappresentano SD. #p < 0,05 e ###p < 0,001 rispetto al gruppo gestito a sham; **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MSSA migliora l'integrità della mielina nella capsula esterna

È stata effettuata una colorazione con LFB per valutare l'integrità della mielina nella capsula esterna. Istologicamente, le fibre mielinizzate hanno mostrato morfologia intatta e disposizione regolare nel gruppo operato a finzione, mentre una perdita evidente di mielina e disorganizzazione strutturale sono state osservate nella capsula esterna dei ratti modello MCAO (Figura 4A). L'analisi quantitativa ha mostrato che l'IOD relativo della colorazione LFB era significativamente inferiore nel gruppo modello rispetto al gruppo operato a simulazione (p < 0,001; Figura 4B). Rispetto al gruppo modello, il gruppo MSSA ha mostrato valori relativi IOD significativamente più alti (p < 0,001; Figura 4B), che indica un miglioramento dell'integrità mielinica nella capsula esterna dopo il trattamento MSSA.

Figura 4. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento attenua la lesione della mielina della capsula esterna nei ratti con spasticità post-ictus. (A) Sezioni cerebrali panoramiche rappresentative colorate con Luxol Fast Blue (LFB) e viste ingrandite delle regioni di interesse (ROI) della capsula esterna controlaterale e ipsilesionale dai gruppi di agopuntura del cuoio capelluto (MSSA) operata a simulazione, modello e a movimento. Le riquadre blu e rosse nelle immagini panoramiche indicano rispettivamente i ROI controlaterali e ipsilesionali. Barre di scala nelle immagini ingrandite = 50 μm. (B) Quantificazione della densità ottica integrata relativa (IOD) della colorazione LFB nella capsula esterna ipsilesionale normalizzata sul lato controlaterale. I singoli simboli rappresentano animali individuali; n = 4 per gruppo. I dati sono presentati come media ± SD. Le barre di errore rappresentano SD. ###p < 0,001 rispetto al gruppo gestito da simulazione; p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli; △p < 0,05 per il confronto indicato dalla parentesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La MSSA inibisce l'ipereccitabilità del riflesso H spinale

Le registrazioni rappresentative delle onde M e H sono mostrate nella Figura 5A, mentre la configurazione elettrofisiologica della registrazione è mostrata nella Figura 5B. Al decimo giorno postoperatorio, la valutazione elettrofisiologica ha dimostrato che, rispetto al gruppo operato a simulazione, il gruppo modello ha mostrato una soglia motoria significativamente aumentata (MT; p < 0,001) e il rapporto massima tra onda H/ampiezza massima dell'onda M (H_max/_{M max}) (p < 0,001), un modesto aumento della latenza dell'onda M (p < 0,05) e una corrispondente diminuzione della latenza del riflesso H (p < 0,05; Figura 5C–H). Rispetto al gruppo modello, il gruppo MSSA ha mostrato un rapporto MT significativamente inferiore (p < 0,001) e un_{rapporto massimo H/M (}p < 0,001), insieme a una soglia del riflesso H significativamente più alta (p < 0,001; Figura 5C–H). Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'intensità di stimolazione necessaria per provocare H_max espresso come multiplo di MT tra il modello e il gruppo MSSA (Figura 5H). Inoltre, quando normalizzato al rapporto H/M a 0,3 Hz, la FDD del riflesso H diminuiva progressivamente con l'aumento della frequenza di stimolazione in tutti e tre i gruppi (Figura 5I). Sia a 5 Hz che a 10 Hz, il rapporto H/M era significativamente più basso nel gruppo MSSA rispetto al gruppo modello (entrambi p < 0,001), indicando un parziale ripristino della FDD del riflesso H verso il modello fisiologico (Figura 5J; Tabella 1).

Figura 5. L'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento riduce l'ipereccitabilità del riflesso spinale nei ratti con spasticità post-ictus. (A) Tracce rappresentative sovrapposte di onde M e onde H dai gruppi di agopuntura del cuoio capelluto in stile sham-operated, modello e in stile movimento (MSSA). (B) Fotografia dell'impianto di registrazione elettrofisiologica che mostra il sito di stimolazione del nervo sciatico, gli elettrodi di registrazione e l'elettrodo di massa. (C–H) Quantificazione della soglia motoria (MT), rapporto massimo tra onda H e ampiezza massima onda M (H_max/_{M max}), latenza dell'onda H, soglia del riflesso H, latenza dell'onda M e intensità di stimolazione che provoca H_max espressa rispettivamente come multiplo di MT. I singoli simboli rappresentano animali individuali. (I) Tracce rappresentative del riflesso H ottenute a frequenze di stimolazione di 0,3 Hz, 5 Hz e 10 Hz in ciascun gruppo. (J) Depressione dipendente dalla frequenza del riflesso H, espressa come rapporto H/M a 5 Hz e 10 Hz normalizzato al rapporto H/M a 0,3 Hz. Le regioni ombreggiate rappresentano la SD dei valori medi. I dati sono presentati come media ± SD. Le barre di errore rappresentano SD. #p < 0,05 e ###p < 0,001 rispetto al gruppo operato a simulazione; p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gruppo	MT (mA)	Mmax (mV)	Hmax (mV)	Latenza M (ms)	Latenza H (ms)	Soglia del riflesso H (×MT)	Hmax (×MT)	Rapporto H/M (0,3 Hz)	Rapporto H/M (5 Hz)	Rapporto H/M (10 Hz)
Sham (n = 9)	0,808 ± 0,218	11.119 ± 7.802	2.804 ± 2.896	4,567 ± 0,731	11.311 ± 0.849	1.296 ± 0.251	1.554 ± 0.264	0,452 ± 0,264	0,304 ± 0,155	0,176 ± 0,137
Modello (n = 9)	1.855 ± 0.203###	3.282 ± 2.040##	2.307 ± 1.296	5.333 ± 0.893	10.456 ± 1.056	0,729 ± 0,299	1.517 ± 0.303	0,826 ± 0,120##	0.741 ± 0.129###	0.684 ± 0.131###
MSSA (n = 9)	0,663 ± 0,236	5.908 ± 2.751	1.497 ± 0.688	4.744 ± 0.590	10.978 ± 0.602	1.939 ± 0.819	1.832 ± 1.557	0,556 ± 0,238*	0,390 ± 0,193**	0,142 ± 0,134

Tabella 1: Parametri elettrofisiologici del riflesso H nei ratti con spasticità post-ictus. Misurazioni elettrofisiologiche ottenute dai gruppi di agopuntura del cuoio capelluto (MSSA) operata a simulazione, modello e in stile movimento, inclusi soglia motoria (MT), ampiezza massima dell'onda M (M_max), massima ampiezza dell'onda H (H_max), latenza dell'onda M, latenza dell'onda H, soglia del riflesso H espressa come multiplo di MT (×MT), intensità di stimolazione che esegue H_max espressi come un multiplo di MT (×MT) e rapporti H/M misurati a frequenze di stimolazione di 0,3, 5 e 10 Hz. I dati sono presentati come media ± SD. ##p < 0,01 e ###p < 0,001 contro il gruppo simulato; *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo di modelli.

Correlazioni tra il volume dell'infarto T2WI, le metriche DTI della capsula esterna, gli indici elettrofisiologici e i punteggi MAS

Sono state inizialmente esaminate le correlazioni tra il volume dell'infarto cerebrale misurato tramite metriche T2WI e DTI della capsula esterna. Nell'analisi aggregata, il volume dell'infarto era fortemente correlato negativamente con la rFA (ρ = −0,902, p < 0,001) e positivamente correlato con la rMD e la rRD (ρ = 0,511, p = 0,03; ρ = 0,661, p = 0,003; Figura 6A–D). Non sono state osservate correlazioni significative tra il volume dell'infarto e i parametri DTI nelle analisi dei sottogruppi. Sono state quindi valutate le relazioni tra le metriche DTI della capsula esterna, gli indici elettrofisiologici di eccitabilità del riflesso spinale e il tono muscolare valutato dal MAS. Nell'analisi aggregata, una rFA più bassa era associata a un rapporto H_max/_M max più alto (ρ = −0,895, p < 0,001), mentre una rRD più alta era associata a una soglia del riflesso H più bassa (ρ = −0,504, p = 0,03; Figura 6E, F). Inoltre, rapporti H_max/_M max più alti e soglie più basse del riflesso H erano associate a punteggi MAS più alti (ρ = 0,760, p < 0,001; ρ = −0,479, p = 0,01; Figura 6G,H). Le analisi dei sottogruppi hanno dimostrato una correlazione negativa significativa tra la soglia del riflesso H e il punteggio MAS solo nel gruppo modello (ρ = −0,736, p = 0,03), mentre non sono state osservate correlazioni significative nei gruppi operati a simulazione o MSSA.

Figura 6. Associazioni tra il volume dell'infarto cerebrale, i parametri di imaging del tensore di diffusione, gli indici del riflesso H e il tono muscolare nei ratti con spasticità post-ictus. (A–D) Associazioni del volume dell'infarto cerebrale derivato da T2 (T2WI) con i rapporti ipsilesionali-controlaterali di anisotropia frazionaria (rFA), diffusività media (rMD), diffusività radiale (rRD) e diffusività assiale (rAD), rispettivamente. (E) Associazione tra rFA e il rapporto massimo di ampiezza H-onda/M-onda massima (H_max/_{M max}). (F) Associazione tra rRD e soglia del riflesso H. (G) Associazione tra H_max/_{M max} e punteggio Modified Ashworth Scale (MAS). (H) Associazione tra la soglia del riflesso H e il punteggio MAS. Cerchi, quadrati e triangoli rappresentano rispettivamente i gruppi di agopuntura del cuoio capelluto a smoking operata, modello e a movimento (MSSA). Le linee tratteggiate corrispondono alla curva di adattamento di regressione lineare generata dai dati misurati. I coefficienti di correlazione di Spearman (ρ) complessivi e specifici per gruppo e i corrispondenti valori p sono visualizzati in ogni pannello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Disponibilità dei dati:

Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e nel Materiale Supplementare. I dataset grezzi a supporto dei risultati di questo studio sono forniti nella Tabella Supplementare 1.

Tabella supplementare 1. Dataset grezzi a supporto delle analisi quantitative presentate in questo studio. Il workbook contiene i dati sperimentali grezzi utilizzati per le valutazioni comportamentali, l'analisi del volume degli infarti ponderata T2 (T2WI), le metriche di diffusione per tensore (DTI), la quantificazione della colorazione Luxol Fast Blue (LFB) e le misurazioni elettrofisiologiche del riflesso H-reflex per tutti i gruppi sperimentali. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Dal punto di vista della medicina tradizionale cinese, la PSS rientra nella categoria dei disturbi muscolo-tendini, con una patogenesi centrale descritta come lesione cerebrale come causa principale e spasticità degli arti come manifestazione^{superficiale 20}. Le strategie terapeutiche dovrebbero quindi affrontare sia la lesione cerebrale primaria sia le manifestazioni periferiche^{secondarie 21}. La motivazione alla base della MSSA enfatizza la regolazione olistica dal cervello ischemico agli arti spastici, con gli obiettivi terapeutici di promuovere la circolazione sanguigna, sbloccare i meridiani, rilassare i tendini e alleviare la spasticità. La tecnica del needling è fondamentale per l'efficacia dell'agopuntura e la scelta di una tecnica adatta al modello patologico è fondamentale per ottenere risultati clinici favorevoli. La MSSA è una modalità caratteristica di agopuntura del cuoio capelluto per la PSS che combina l'agopuntura del cuoio capelluto con il movimento attivo o passivo degli arti durante la ritenzione^{dell'ago 3}. Una recente revisione sistematica e meta-analisi ha dimostrato che la MSSA produce effetti superiori nella riduzione della spasticità muscolare, nel miglioramento della funzione motoria e nel potenziamento delle attività quotidiane nei pazienti con PSS rispetto all'agopuntura convenzionale del cuoio capelluto o alla riabilitazione da esercizio^{fisico da sola9.} In particolare, la somministrazione concomitante di agopuntura del cuoio capelluto e riabilitazione dell'esercizio, come implementata nella MSSA, produce risultati migliori rispetto all'intervento asincrono, come supportato da evidenze cliniche di qualità^{moderata 9}. MS 6, come definito nel GB/T 21709.2-2021, è una linea di agopuntura parietotemporale obliqua anteriore del cuoio capelluto selezionata per la sua rilevanza anatomica e la sua affermata utilità^{clinica 9}. Sovrasta le cortecce motorie primaria e secondaria, che sono le principali fonti di proiezioni corticofughe discendenti che modellano l'uscita reticulare del tronco encefalico e modulano l'eccitabilità del riflesso spinale. Clinicamente, la MS 6 è la linea di agopuntura del cuoio capelluto più comunemente utilizzata per la PSS, come confermato dalla meta-analisi sopra menzionata, rendendola un bersaglio ottimale per modulare le vie motorie nel presente studio. Questi risultati evidenziano le caratteristiche procedurali distintive e i potenziali vantaggi clinici della MSSA nella gestione della PSS. Gli studi preclinici hanno inoltre dimostrato che l'MSSA migliora la perfusione cerebrale nella penumbra ischemica e modula l'eccitabilità dei motoneuroni del corno anteriore spinale, fornendo un supporto meccanicistico preliminare per la sua applicazione^{terapeutica 10,11}.

Nella teoria neurologica moderna, la patogenesi della PSS è principalmente attribuita a tre processi patologici interconnessi: inibizione discendente sopraspinale compromessa, elaborazione anomala del segnale intraspinale e alterazione delle proprietà muscolari intrinseche. Tra questi, i meccanismi con cui le vie discendenti sopraspinali regolano l'eccitabilità del riflesso spinale rimangono incompletamente compresi². Il tratto reticolospinale (RST) svolge un ruolo essenziale nel mantenere l'equilibrio dell'arco riflesso di stretching. La RST laterale riceve input eccitatorio dalla corteccia premotoria controlaterale e dall'area motoria supplementare attraverso la via cortico-reticulare, scende all'interno del funico dorsolaterale del midollo spinale ed esercita un controllo inibitorio sull'attività riflessa di allungamento spinale. Al contrario, la RST mediale non è regolata dalla corteccia controlaterale, scende all'interno del funicolo ventromediale e facilita l'attività riflessa di allungamento. L'ictus corticale interrompe la via cortico-reticulare, riduce l'input eccitatorio alla formazione reticolare midollare e porta alla predominanza dell'attività RST mediale. Questo squilibrio contribuisce all'ipereccitabilità del riflesso di stretching spinale e alla manifestazione clinica della spasticità degli arti³. Studi clinici di neuroimaging hanno collegato la PSS a lesioni che coinvolgono la corteccia premotoria, il putamen, l'arto posteriore della capsula interna e la capsula esterna^12,14,22. Tra questi, la capsula esterna rappresenta un condotto chiave della sostanza bianca all'interno della via cortico-reticolospinale, un importante tratto extrapiramidale che integra input corticali, sinapsi nei nuclei reticoli del tronco encefalico e proietta verso il midollo spinale per esercitare un controllo inibitorio discendente su α-motoneuroni e interneuroni²³. Questo quadro anatomico è supportato da studi di tracciamento neurale e DTI, che identificano costantemente la capsula esterna come collegamento principale tra la corteccia cerebrale, i gangli della base e il tronco encefalico^23,24. In particolare, la spasticità è sempre più riconosciuta come un disturbo a livello di rete dovuto alla rottura dell'equilibrio tra molteplici sistemi motori discendenti, inclusi sia i percorsi corticospinali che extrapiramidali, piuttosto che dalla disfunzione di un singolo tratto. In questo contesto, la capsula esterna funge da struttura rappresentativa per sondare i contributi extrapiramidali al PSS, poiché il suo coinvolgimento è stato costantemente associato a un'attività esplosiva del riflesso spinale esagerata, mentre lesioni corticospinali isolate producono più comunemente debolezza senza spasticità proporzionata. Di conseguenza, abbiamo selezionato la capsula esterna come ROI principale per indagare i cambiamenti microstrutturali della sostanza bianca associati alla gravità della spasticità. In linea con questo contesto, il T2WI non ha mostrato un infarto cerebrale evidente nel gruppo operato a simulazione, mentre lesioni infartitiche prominenti sono state osservate nel gruppo modello. Il trattamento MSSA ha migliorato significativamente la funzione neurologica, come valutata dalla scala Zea Longa, suggerendo un effetto neuroprotettivo contro lesioni cerebrali ischemiche. L'effetto di risparmio degli infarti della MSSA può coinvolgere molteplici meccanismi sinergici. Innanzitutto, è stato dimostrato che l'MSSA potenzia la perfusione cerebrale regionale nella penumbra ischemica¹⁰, creando così un microambiente più favorevole alla sopravvivenza neuronale. Inoltre, sebbene le evidenze dirette per la MSSA siano attualmente limitate, studi meccanicistici sull'agopuntura del cuoio capelluto hanno suggerito diverse altre vie che potrebbero contribuire, inclusa la promozione dell'angiogenesi tramite l'attivazione della via di segnalazione MATN2/WNT3a/β-catenina²⁵ e attenuazione della neuroinfiammazione post-ischemica tramite la soppressione della differenziazione Th17 mediata da RORγt e il ripristino dell'equilibrio Th17/Treg²⁶. Questi risultati sollevano la possibilità che l'MSSA possa attivare meccanismi neuroprotettivi simili oltre agli effetti emodinamici. Tuttavia, il contributo relativo di ciascun percorso resta da determinare e merita ulteriori indagini.

Il DTI consente una valutazione quantitativa sensibile della microstruttura della sostanza bianca, con FA che riflette l'integrità della fibra, RD che funge da indicatore di demielinizzazione e AD che riflette l'integrità^{assonale 23}. Nel presente studio, la capsula esterna è stata selezionata come ROI per valutare le alterazioni microstrutturali associate alla via cortico-reticolospinale nella PSS. Rispetto al gruppo operato a simulazione, i ratti modello hanno mostrato riduzioni significative dell'AF relativa insieme a notevoli aumenti della MD e della RD relative, indicativo di alterazione dell'integrità della sostanza bianca, edema cerebrale e demielinizzazione all'interno della capsula esterna. La colorazione con LFB ha ulteriormente dimostrato una evidente perdita di mielina e disorganizzazione dei fasci di sostanza bianca, fornendo supporto istologico ai risultati DTI. Collettivamente, i risultati neuroimaging e istologici indicano che la lesione ischemica è associata a un marcato deficit microstrutturale della capsula esterna, che è stato attenuato dopo il trattamento con MSSA. Il riflesso H è una misura elettrofisiologica ben consolidata per valutare l'eccitabilità del pool di α-motoneuroni spinali e la regolazione discendente^{sopraspinale 27}. Il rapporto H_max/_{M max} riflette l'eccitabilità complessiva dei motoneuroni spinali, mentre la soglia del riflesso H riflette l'inibizione presinaptica mediata dagli interneuroni spinali insieme a input sovraspinali discendenti^{integrati 27}. La rottura indotta dall'ictus della via cortico-reticolospinale indebolisce la regolazione inibitoria discendente, causando ipereccitabilità dei motoneuroni spinali caratterizzata da un aumento del rapporto_H-max/M_max e da una soglia ridotta del riflesso^{H 27}. I nostri esperimenti preliminari hanno esplorato i meccanismi molecolari alla base degli effetti antispastici dell'MSSA, dimostrando che questa terapia può aumentare l'espressione spinale di KCC2 e ripristinare la funzione inibitoria^{GABAergica 10}. Sulla base di questi risultati molecolari spinali, il presente studio chiarisce ulteriormente i meccanismi supraspinali a monte responsabili dei riflessi spinali esagerati, dimostrando che una lesione microstrutturale della capsula esterna all'interno della via cortico-reticolospinale è associata a un notevole aumento dell'eccitabilità spinale. Questi risultati insieme, suggeriscono che la MSSA possa favorire la ricostruzione delle vie inibitorie discendenti sopraspinali e invertire l'ipereccitabilità del riflesso spinale nei ratti con PSS.

Data la natura trasversale dei dati presenti, tutte le analisi di correlazione devono essere interpretate come esplorative e generanti ipotesi, piuttosto che come prove di relazioni causali. Sono state effettuate analisi di correlazione per indagare le relazioni tra carico infartto, integrità microstrutturale della capsula esterna, eccitabilità del riflesso spinale e gravità della spasticità. In tutti gli animali, volumi di infarti maggiori erano associati a una perturbazione microstrutturale derivata da DTI più grave all'interno della capsula esterna, suggerendo un legame tra lesioni ischemiche primarie e cambiamenti secondari della sostanza bianca lungo la via cortico-reticolospinale. In particolare, queste correlazioni complessive sembravano essere guidate principalmente dalle differenze tra i gruppi piuttosto che dalla variazione individuale all'interno del gruppo, poiché non sono state osservate correlazioni significative all'interno di nessun singolo gruppo. Un FA relativo (rFA) più elevato era associato a un rapporto H_max/_{M max} più basso, mentre un RD relativo (rRD) più elevato era associato a una soglia del riflesso H più bassa, coerente con l'idea che l'integrità della capsula esterna preservata sia associata a una regolazione inibitoria discendente più efficace. Inoltre, rapporti H_max/_M max più alti e soglie più basse del riflesso H erano entrambi associati a punteggi MAS più elevati, supportando un'associazione tra alterazioni elettrofisiologiche e gravità della spasticità. Le analisi dei sottogruppi hanno inoltre rivelato che i modelli complessivi di correlazione erano prevalentemente attribuibili alle differenze tra i gruppi. In particolare, una correlazione negativa significativa tra la soglia del riflesso H e il punteggio MAS è stata osservata solo nel gruppo modello, suggerendo che l'inibizione presinaptica compromessa possa essere associata a una maggiore spasticità in condizioni patologiche non trattate.

Devono essere riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, l'assenza di gruppi di controllo basati solo sull'agopuntura e solo con esercizio fisico esclude la dissezione dei loro contributi indipendenti e sinergici. Studi futuri che incorporano questi gruppi di confronto aiuterebbero a chiarire i meccanismi alla base dell'intervento combinato. In secondo luogo, il periodo di osservazione è stato limitato alla fase acuta (giorni postoperatori 0–10), selezionata sulla base della finestra di spasticità di picco nel modello permanente MCAO. Se l'MSSA conferisca benefici terapeutici duraturi oltre la fase acuta resta sconosciuto, e la validazione nei modelli cronici di PSS sarà importante per determinarne il potenziale traslazionale a lungo termine. In terzo luogo, sebbene il MAS sia ampiamente utilizzato per valutare il tono muscolare, è intrinsecamente soggettivo e semi-quantitativo. Per completare questa limitazione, il riflesso H è stato valutato contemporaneamente come misura elettrofisiologica oggettiva dell'eccitabilità del riflesso spinale. In quarto luogo, la dimensione del campione era modesta a causa delle esigenze tecniche associate alle valutazioni multimodali, e studi che includevano un numero maggiore di animali migliorerebbero la potenza statistica e la robustezza dei risultati. Infine, tutti gli endpoint sono stati valutati solo al giorno 10 postoperatorio. Studi futuri che incorporeranno valutazioni longitudinali in più momenti temporali fornirebbero una comprensione più completa della traiettoria temporale dei cambiamenti neuroplastici indotti dalla MSSA.

Studi futuri potrebbero indagare i meccanismi di neurogenesi e remielinizzazione dopo l'intervento MSSA. Poiché il DTI non può visualizzare direttamente la rigenerazione neuronale, approcci complementari come il tracciamento neurale e l'immunoistochimica possono ulteriormente caratterizzare la plasticità neuronale e la remielinizzazione. Da una prospettiva traslazionale, le metriche DTI della capsula esterna, in particolare FA e RD, possono aiutare a stratificare i pazienti con ictus in base alla gravità della lesione della via cortico-reticolospinale e a identificare coloro che hanno maggiori probabilità di beneficiare della MSSA. Un approccio guidato da biomarcatori potrebbe facilitare la selezione dei pazienti e la stratificazione del trattamento in futuri studi clinici, anche se la sua utilità clinica resta da validare nelle coorti potenziali di ictus. In conclusione, questo studio ha indagato i meccanismi neurali associati al trattamento MSSA per PSS utilizzando un quadro integrato che comprende la valutazione dell'infarto basata su T2WI, valutazione DTI della microstruttura della sostanza bianca, elettrofisiologia del riflesso H e analisi istologica LFB. I risultati suggeriscono che l'MSSA è associata a una riduzione del volume dell'infarto cerebrale, alla conservazione dell'integrità microstrutturale della capsula esterna e a una migliore regolazione inibitoria discendente della via cortico-reticolospinale. Questi cambiamenti sono stati accompagnati dalla normalizzazione dell'eccitabilità del riflesso spinale e da una riduzione della spasticità. Collettivamente, i risultati forniscono intuizioni meccanicistiche e prove precliniche a supporto della potenziale applicazione traslazionale della MSSA nella gestione della PSS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
α-Chloralose	GoldBio	C-118-250	Anestetico per registrazioni di riflesso H
Etanolo assoluto	Beijing Tong Guang Fine Chemicals Co., Ltd.	VS104021-500 mL	Reagente istologico
Agghili da agopuntura (0,25 × 13 mm)	Beijing Zhongyan Taihe Acupuncture Needle Co., Ltd.	NA	Agghili sterili monouso per agopuntura cranica
Ampicillina	Beijing Rui Da Heng Hui Technology Development Co., Ltd.	HD-3018-500g	Antibiotico per profilassi infettiva postoperatoria
Sistema di sperimentazione di funzione biologica (BL420N)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd.	NA	Sistema di registrazione elettrofisiologica
Software di analisi di risonanza magnetica a tensore di diffusione (ParaVision 360)	Bruker	NA	Acquisizione RMN e ricostruzione DTI
Soluzione di deceratura e chiarimento ecologica	Servicebio	G1128-500ML	Reagente istologico
Microtomo rotativo completamente automatico	Leica Microsystems	RM2255	Sezionamento dei tessuti
Cuscino termico	Suzhou Caiyang Electric Heating Technology Co., Ltd.	TT180×150-1XD	Mantenimento della temperatura postoperatoria
ImageJ 6.0	National Institutes of Health	NA	Analisi quantitativa delle immagini
Isoflurano	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	I8000-25g	Anestetico inalatorio
ITK-SNAP 4.4.0	University of Pennsylvania	NA	Segmentazione dell'infarto cerebrale
Soluzione di blu di Luxol rapido	Servicebio	G1030-100ML	Colorazione della mielina
Sutura in nylon monofilamento (0,36 ± 0,02 mm)	Beijing Cinontech Co., Ltd.	NA	Induzione MCAO
Paraformaldeide (4% in PBS)	Servicebio	TBAB0102	Fissazione dei tessuti
Scanner di risonanza magnetica PharmaScan 7.0 T	Bruker	NA	Acquisizione RMN
SPSS Statistics 20.0	IBM	NA	Analisi statistica
Topi Sprague–Dawley (SPF, maschi)	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	NA	Animali da esperimento
Sistema di bagno d'acqua con termostato	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-5A	Mantenimento della temperatura durante la RMN
Treadmill per roditori	Clever	TreadScan	Allenamento fisico durante l'acclimatazione e MSSA