Questo studio valuta gli effetti della pillola Zuogui sull'osteoporosi postmenopausale in ratti ovariectomizzati, utilizzando un disegno sperimentale fattoriale tre per tre. I risultati supportano effetti sinergici dei componenti Yin e Yang sul metabolismo osseo e sui marcatori associati della via EphB4/ephrinB2, anche se le evidenze meccanicistiche rimangono di tipo associativo piuttosto che causale.
Articolo di ricerca
La pillola Zuogui modula l'accoppiamento tra osteoblasti e osteoclasti in ratti ovariectomizzati: uno studio fattoriale tre per tre
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11 settembre 2026
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osteoporosi postmenopausale è determinata dalla carenza di estrogeni associata a un'alterazione del bilanciamento tra formazione e riassorbimento osseo. Questo studio ha quantificato gli effetti indipendenti e interattivi delle formulazioni parziali di Zuogui Pill, ricostituite per l'azione nutritiva del Yin, in un modello di ratto ovariectomizzato, esaminando le associazioni con la via EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatasi alcalina. In conformità con le linee guida ARRIVE 2.0, 130 ratti femmina Sprague-Dawley liberi da agenti patogeni specifici sono stati assegnati casualmente a 13 gruppi (n=10/gruppo), inclusi nove gruppi organizzati secondo un disegno fattoriale 3x3. I parametri valutati comprendevano P1NP, CTX-1, densità minerale ossea del femore misurata mediante densitometria a raggi X a doppia energia (DXA), istologia trabecolare ed espressione di acido ribonucleico messaggero e proteico analizzata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa e immunoblotting. La formula completa (I2A2) si è associata a valori più elevati di P1NP, a livelli più bassi di CTX-1 e a una maggiore densità minerale ossea rispetto al gruppo modello. L'analisi fattoriale ha evidenziato un'interazione Yin-Yang tra P1NP e densità minerale ossea, a sostegno di una sinergia farmacologica. Le modifiche molecolari sono state associate a un aumento dell'espressione di EphB4, ephrinB2 e ALP e a una riduzione dell'espressione di RhoA. Questi risultati supportano un'associazione tra il trattamento con Zuogui Pill, il miglioramento dei fenotipi ossei e la modulazione dei marcatori della via di segnalazione; la dipendenza causale della via richiede ulteriore conferma mediante studi con inibitori, silenziamento genico e colture cellulari in co-coltura.
Introduzione
L'osteoporosi postmenopausale (OPM) colpisce una vasta popolazione di donne ed è caratterizzata da un'alterazione dell'equilibrio tra formazione e riassorbimento osseo associata alla carenza di estrogeni1,2. Il sistema recettore-legante EphB4/ephrinaB2 media la comunicazione tra osteoblasti e osteoclasti; il segnale di EphB4 favorisce la differenziazione degli osteoblasti e l'attività della fosfatasi alcalina (ALP), mentre il segnale inverso dell'ephrinaB2 può inibire l'osteoclastogenesi attraverso meccanismi legati a RhoA3,4. La ridotta accoppiamento cellulare nell'osso carente di estrogeni fornisce una base meccanicistica per valutare interventi che influenzano entrambe le componenti cellulari del rimodellamento.
Le attuali terapie per l'osteoporosi, compresi agenti antiriossorbenti e anabolizzanti, riducono il rischio di fratture ma possono essere limitate da aderenza al trattamento, costo, controindicazioni, effetti di rimbalzo o eventi avversi durante l'uso a lungo termine5. Pertanto, trattamenti sperimentali che migliorino la formazione ossea limitando al contempo un'eccessiva riassorbimento rimangono scientificamente rilevanti.
La pillola Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) è una prescrizione classica a base multi-componente utilizzata nella medicina tradizionale cinese per la carenza di essenza renale, un quadro teorico associato alla debolezza ossea. I componenti nutritivi dello Yin includono Rehmannia glutinosa (radice preparata, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (frutto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (frutto, Gou Qi Zi, 12 g), la gelatina del piastrone di Chinemys reevesii (gelatina derivata dal piastrone, Gui Ban Jiao, 12 g) e Cyathula officinalis (radice, Chuan Niu Xi, 9 g). I componenti potenziatori dello Yang includono Cuscuta australis (seme, Tu Si Zi, 12 g) e la gelatina del palco di Cervus elaphus (gelatina derivata dal palco, Lu Jiao Jiao, 12 g). Secondo la teoria classica, il principio dello "ricercare lo Yang all'interno dello Yin" prevede che le erbe potenziatrici dello Yang possano potenziare una base nutritiva dello Yin piuttosto che agire come semplici additivi indipendenti. Evidenze cliniche e studi preclinici hanno riportato un'attività anti-osteoporotica della ZGP o di interventi contenenti ZGP, inclusi effetti sulla DMO, sull'osteogenesi e sul comportamento farmacocinetico6,7,8,9,10.
La novità di questo studio risiede nella separazione formale, secondo uno schema fattoriale tre per tre, dei componenti tonificanti lo Yin e quelli potenziatori dello Yang in ratti ovariectomizzati (OVX), con la contemporanea valutazione dei fenotipi ossei e dei marcatori del percorso EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Questo disegno sperimentale verifica la teoria della compatibilità delle formulazioni in modo più diretto rispetto agli studi che utilizzano esclusivamente la prescrizione completa o un singolo comparatore, pur riconoscendo che le variazioni dei marcatori del percorso rimangono associative a meno che non vengano bloccate o silenziate meccanicamente11.
Protocollo
Tutte le procedure di questo studio sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Medica della Mongolia Interna (Numero di Approvazione: YKD202404105) e sono state condotte in conformità con ARRIVE 2.012.
Progettazione dello studio
Lo studio è stato condotto presso la piattaforma sperimentale sugli animali dell'Università di Medicina di Inner Mongolia. È stato applicato un disegno fattoriale completo 3×3 con due fattori: formulazione base per il nutrimento dello Yin (I; tre livelli di dose: 0, 27, 54 g equivalenti di droga grezza) e formulazione per il potenziamento dello Yang (A; tre livelli di dose: 0, 8, 16 g equivalenti di droga grezza), ottenendo nove celle fattoriali più quattro gruppi di riferimento. Il disegno fattoriale è mostrato nella Tabella 1. I2A2 rappresenta la formula completa ZGP alla dose equivalente clinica. Per la conversione delle dosi è stato utilizzato il metodo dell'area della superficie corporea (fattore ratto:uomo = 6,25)13.
Animali, randomizzazione e cecità
Centoventi ratti femmina Sprague-Dawley specific pathogen-free (6 mesi di età, 220–250 g) sono stati assegnati mediante una tabella di numeri casuali generata al computer. I codici di assegnazione sono stati inseriti in buste sigillate in ordine sequenziale da un ricercatore non coinvolto nella valutazione degli esiti. I ratti sono stati alloggiati in gruppi di 3–4 per gabbia ventilata, in un ciclo luce/buio di 12 h, a 22 ± 2 oC e umidità del 50–60%, con accesso libero all'acqua, alimento standard per roditori con contenuto di calcio e fosforo documentato, attività nella gabbia e arricchimento ambientale. I saggi molecolari, la valutazione istologica, la quantificazione delle immagini e la densitometria sono stati eseguiti da ricercatori ciechi rispetto all'assegnazione. La dimensione del campione è stata determinata mediante analisi a priori della potenza statistica, ottenendo n = 10 per gruppo.
Modello OVX e trattamento farmacologico
È stata eseguita una OVX bilaterale sotto anestesia inalatoria con isoflurano somministrato tramite vaporizzatore di precisione. L'induzione anestetica è avvenuta con una concentrazione del 3-4% in ossigeno e mantenuta al 1,5-2,5% attraverso un cono nasale. La profondità adeguata è stata confermata dall'assenza del riflesso di ritrazione plantare e del riflesso palpebrale, con una respirazione stabile. Il successo della OVX è stato valutato dall'assenza del ciclo estrale vaginale al giorno 5 e dalla riduzione della densità minerale ossea (BMD) a 12 settimane dall'intervento chirurgico. Dopo la validazione del modello, il trattamento per gavaggio è stato somministrato per 8 settimane (1 mL/100 g/giorno). Le decotti sono stati preparati mediante estrazione acquosa in ebollizione controllata (100 °C, con riflusso), utilizzando un volume 10 volte superiore per 2 h, seguito da un volume 8 volte superiore per 1,5 h, filtrati attraverso quattro strati di garza medica e concentrati sotto pressione ridotta fino a 0,968 g di droga grezza/mL. L'estratto concentrato è stato conservato a 4 °C ed utilizzato entro 7 giorni dalla preparazione. I controlli positivi sono stati i granuli Gusukang (1,8 g/kg/giorno) e il dietilstilbestrolo (0,04 mg/kg/giorno). Al termine dell'esperimento, i ratti sono stati profondamente anestetizzati con isoflurano al 5% fino alla scomparsa dei riflessi plantare e corneale, quindi sottoposti a esanguinazione e dislocazione cervicale. La morte è stata confermata dall'arresto del battito cardiaco e della respirazione. Le carcasse e i tessuti sono stati smaltiti come rifiuti biologici; i residui chimici sono stati smaltiti come rifiuti pericolosi; gli aghi o le lame sono stati collocati in contenitori per materiali taglienti approvati.
Misurazioni dei risultati
I livelli sierici di P1NP e CTX-1 sono stati misurati mediante saggio ELISA a sandwich (Jiyinmei)14. La densità minerale ossea (BMD) del femore è stata quantificata mediante DXA. L'istologia trabecolare è stata valutata mediante colorazione con ematossilina ed eosina a 200x. L'espressione genica è stata analizzata mediante RT-qPCR utilizzando il metodo 2-ΔΔCt, normalizzata rispetto alla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). L'espressione proteica è stata valutata mediante Western blot e quantificazione con ImageJ (vedere Tabella dei Materiali). I pesi molecolari osservati e le informazioni sui cataloghi degli anticorpi sono riportati in Tabella Supplementare 1. Le sequenze dei primer erano: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Analisi statistica
La normalità è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità della varianza mediante il test di Levene prima dell'analisi parametrica. I dati sono espressi come media ± DS e tutte le barre di errore nei grafici quantitativi indicano la DS. È stata applicata un'ANOVA fattoriale a due vie alle nove celle fattoriali per stimare gli effetti principali e l'interazione tra I e A, con eta quadro parziale (ηp2) come misura dell'effetto. Confronti a coppie tra tutti e 13 i gruppi sono stati effettuati utilizzando un'ANOVA a una via con correzione di Bonferroni. Le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism. I simboli di significatività sono definiti in modo coerente come segue: *, **, ***, **** indicano rispettivamente p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 rispetto al modello; #, ##, ###, #### indicano le stesse soglie rispetto alla formula completa di ZGP.
Risultati
Convalida del modello mediante citologia vaginale
Il successo dell'OVX è stato confermato in tutti gli animali ovariectomizzati, come dimostrato dall'interruzione del ciclo estrale entro 5 giorni dall'intervento chirurgico (Figura 1A), mentre gli animali sottoposti a intervento fittizio hanno mantenuto un ciclo di 4 giorni (Figura 1B). A 12 settimane, la DXA ha mostrato una densità minerale ossea femorale inferiore nel gruppo modello OVX rispetto ai controlli fittizi (0,214 ± 0,020 vs. 0,281 ± 0,019 mg/cm3; Bonferroni-adjusted p < 0,001), confermando l'instaurazione del modello di perdita ossea indotta da OVX prima del trattamento.
Densità minerale ossea
La formula completa di ZGP (I2A2) ha mostrato il recupero maggiore di DMO tra le sottocategorie fattoriali ed è statisticamente paragonabile a entrambi i controlli positivi (Tabella 2, Figura 2). Tutte le sottocategorie fattoriali hanno aumentato la DMO rispetto al gruppo modello. L'elevato nutrimento dello Yin da solo (I3A1: 0,253 mg/cm3) e l'elevato potenziamento dello Yang da solo (I1A3: 0,243 mg/cm3) sono rimasti inferiori rispetto alla ZGP completa (I2A2: 0,307 mg/cm3), a sostegno di un'interazione piuttosto che di un semplice effetto dose.
Marker sierici del rimodellamento osseo
Rispetto al gruppo modello, la formulazione completa di ZGP è stata associata a un aumento del P1NP (+51%; IC 95%: 210,3–327,5 pg/mL; p <0,0001) e a una diminuzione del CTX-1 (-16%; p <0,01), in linea con un migliorato equilibrio tra formazione e riassorbimento (Figura 3A,B). In alcuni confronti, i bracci con monoterapia ad alta dose hanno prodotto valori assoluti di P1NP più elevati, ma il modello fattoriale ha indicato un'attività combinata ottimizzata piuttosto che una risposta massima alla dose in un singolo braccio. I dati completi a livello di gruppo sono riportati in Tabella 3.
ANOVA fattoriale e interazione sinergica
Un'ANOVA fattoriale a due vie delle nove celle fattoriali ha identificato effetti principali significativi dei fattori nutritivi dello Yin e potenziatori dello Yang, nonché termini di interazione I per A significativi in tutti i punti finali primari (Tabella 4). L'effetto di interazione per P1NP (ηp2 = 0.74) suggerisce che i componenti potenziatori dello Yang hanno amplificato l'attività dei componenti nutritivi dello Yin in queste condizioni sperimentali.
Densità ossea (convalida del modello)
La densità ossea del femore era inferiore nel gruppo Modello (OVX) rispetto ai gruppi Controllo e Finto-operato, confermando un'induzione riuscita del fenotipo di perdita ossea OVX prima del trattamento, come mostrato nella Figura 4.
Espressione di EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
Le analisi di RT-qPCR hanno utilizzato campioni biologici di ogni gruppo con reazioni in triplicato tecnico, e la densitometria di Western blot è stata eseguita su lisati biologici indipendenti (Figura 5 e Figura 6). Rispetto al gruppo modello, la formula completa di ZGP è risultata associata a valori più elevati di EphB4 (0,498 ± 0,009 vs. 0,048 ± 0,002; p < 0,0001), ephrinB2 (0,411 ± 0,036 vs. 0,048 ± 0,003; p < 0,0001) e ALP (0,842 ± 0,019 vs. 0,090 ± 0,003; p < 0,0001), e a valori più bassi di RhoA (1,658 ± 0,028 vs. 7,332 ± 0,430; p < 0,0001). Questi risultati molecolari vanno interpretati come associazioni con marcatori del percorso, piuttosto che come prova di una mediazione causale.
Disponibilità dei dati
I file di dati originali utilizzati per generare i risultati dello studio attuale sono forniti come File di Codice Supplementare allegato a questo articolo
Figura 1. Citologia vaginale rappresentativa utilizzata per verificare il ciclo estrale dopo ovariectomia (colorazione con ematossilina ed eosina, 200x). (A) Striscio vaginale rappresentativo di un ratto ovariectomizzato che mostra una citologia persistente non ciclica. (B) Striscio vaginale rappresentativo di un ratto sottoposto a intervento fittizio che dimostra un normale ciclo estrale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Densità minerale ossea femorale in tutti i gruppi. Le barre di errore indicano la deviazione standard (DS). I simboli statistici indicano confronti aggiustati con il metodo di Bonferroni rispetto al modello o alla formula completa di ZGP, come definito nella sezione Analisi statistica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Marcatori sierici del turnover osseo. (A) P1NP, un marcatore della formazione ossea. (B) CTX-1, un marcatore del riassorbimento osseo. Le barre di errore indicano la DS. I simboli statistici indicano confronti aggiustati con il metodo di Bonferroni rispetto al modello o alla formula completa di ZGP. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Densità ossea del femore che conferma la perdita ossea indotta da OVX prima del trattamento. Grafico a barre che confronta la densità ossea del femore (mg/cm3) tra i gruppi Controllo (non ovariectomizzati, non trattati), Finto intervento e Modello (OVX) al momento della validazione del modello pre-trattamento. Le barre rappresentano la media ± DS (n = 10/gruppo). *** = p < 0,001 rispetto al gruppo Controllo e rispetto al gruppo Finto intervento (ANOVA a un fattore con correzione di Bonferroni). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Espressione genica relativa dell'mRNA. Livelli di espressione di (A) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) ALP mediante il metodo 2^-ΔΔCt normalizzato rispetto a GAPDH. La qPCR ha utilizzato reazioni in triplicato tecnico per ogni campione biologico. Le barre di errore indicano la DS. I simboli statistici indicano confronti aggiustati con il metodo di Bonferroni. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6. Espressione proteica mediante Western blot. I riquadri mostrano immunoblot rappresentativi per EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e il controllo di caricamento GAPDH, selezionati da campioni biologici indipendenti. La densitometria è stata normalizzata rispetto a GAPDH utilizzando ImageJ. Pesi molecolari osservati: EphB4, 110 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (vedere Tabella Supplementare 1). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Fattore nutritivo dello yin (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Fattore di potenziamento di Yang (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Modello) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tabella 1: Disegno sperimentale fattoriale 3x3 e gruppi sperimentali. La tabella presenta i 13 gruppi sperimentali organizzati secondo un disegno fattoriale 3x3 in base ai livelli di dose di tonificazione dello Yin (I) e di potenziamento dello Yang (A), più 4 gruppi di riferimento. †I₂A₂ = formula completa della pillola Zuogui alla dose equivalente clinica. Conversione delle dosi mediante il metodo della superficie corporea (ratto : uomo = 6,25).
| Gruppo | Cella fattoriale | BMD (mg/cm³, x̄ ± DS) | vs. Modello |
| Controllo vuoto | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Finto intervento | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Modello (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Potenziamento dello Yang | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Alto potenziamento dello Yang | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Nutrizione dello Yin | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Alta nutrizione dello Yin | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Alto-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Alto-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Combinazione alta completa | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| Formula completa ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| Controllo positivo MTC | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Controllo medicina occidentale | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tabella 2: Densità minerale ossea femorale in tutti i gruppi (n=10/gruppo, media ± DS). * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p<0,001, **** = p<0,0001 rispetto al modello (corretto con Bonferroni).
| Gruppo | Cellula | P1NP (pg/mL, x̄ ± DS) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± DS) |
| Controllo vuoto | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| Sham-operato | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Modello (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Potenziamento dello Yang | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Alto potenziamento dello Yang | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Nutrizione dello Yin | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| Alta nutrizione dello Yin | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Alto-Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Alto-Yin + Yang | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Completamente alto | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Formula completa ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| Controllo positivo TCM | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| Controllo medicina occidentale | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tabella 3: P1NP e CTX-1 sierici in tutti i gruppi (n=10/gruppo, media ± DS). ** = p <0,01, **** = p <0,0001 rispetto al modello; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,001, #### = p <0,0001 rispetto a ZGP (Bonferroni). IC 95% per P1NP ZGP rispetto al modello: 210,3–327,5 pg/mL.
| Esito | Fattore | df | F | Valore p | η² parziale |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17,84 | <0,001 | 0,31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6,22 | 0,003 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 57,21 | <0,001 | 0,74 | |
| BMD (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31,90 | <0,0001 | 0,44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28,70 | <0,0001 | 0,41 | |
| I × A | 4, 81 | 24,60 | <0,0001 | 0,55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14,22 | <0,001 | 0,26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5,88 | 0,004 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 19,43 | <0,001 | 0,49 |
Tabella 4: ANOVA fattoriale 3x3 con effetti principali e termini di interazione, confronti post-hoc corretti con metodo di Bonferroni. La dimensione dell'effetto è espressa come eta quadrato parziale. df indica i gradi di libertà.
Tabella supplementare 1. Informazioni sugli anticorpi per il Western blot. La tabella elenca le proteine bersaglio, i pesi molecolari osservati, i fornitori, i numeri di catalogo, le specie di origine e le diluizioni di lavoro degli anticorpi primari e secondari utilizzati in questo studio.Cliccare qui per scaricare il file.
File di codice supplementare 1. Dati sperimentali grezzi a supporto dello studio. Questo archivio contiene i file di dati originali utilizzati per generare i risultati presentati nel manoscritto, inclusi i singoli valori di misurazione della BMD, i dati grezzi degli ELISA, i valori di Ct della RT-qPCR con le curve di amplificazione e di fusione, le immagini originali dei Western blot e i file di analisi della densitometria, immagini rappresentative di microscopia istologica e file di output generati dagli strumenti associati a questi esperimenti.Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Il termine di interazione fattoriale supporta una relazione non additiva tra i componenti che nutrono lo Yin e quelli che potenziano lo Yang nel ZGP. Questo risultato è coerente con il principio tradizionale di ricercare lo Yang all'interno dello Yin, secondo cui i componenti che potenziano lo Yang dovrebbero attivare o potenziare la base nutritiva dello Yin15. Il risultato va interpretato come una sinergia farmacologica a livello di formulazione. Tuttavia, non identifica i singoli costituenti attivi responsabili dell'effetto.
EphB4 ed ephrinB2 sono mediatori biologicamente plausibili dell'accoppiamento osteoblasto-osteoclasto3,4, ma le evidenze attuali sono di tipo correttivo. L'aumento osservato di EphB4, ephrinB2 e ALP con la riduzione di RhoA è compatibile con un miglioramento dell'accoppiamento, ma non dimostra che questa via sia necessaria o sufficiente per l'azione di ZGP. Sono necessari esperimenti con inibitori della via, approcci bloccanti anti-EphB4 o anti-ephrinB2, modulazione di RhoA/ROCK16, silenziamento genico ed esperimenti di co-coltura osteoblasto-osteoclasto per verificare la dipendenza causale.
La traduzione clinica richiede cautela. La conversione della dose equivalente uomo-ratto supporta la scala iniziale, ma la somministrazione nell'uomo richiede anche studi farmacocinetici, farmacodinamici e sulla sicurezza a lungo termine. Un prodotto ZGP standardizzato necessiterebbe di un profilo chimico mediante HPLC o LC-MS, limiti per i composti marcatore, confrontabilità tra lotto e lotto, test per contaminanti e documentazione relativa all'approvvigionamento delle erbe, all'estrazione, alla concentrazione e alle pratiche di produzione17. La traduzione regolatoria deve inoltre considerare le interazioni tra i costituenti, la compatibilità con i farmaci anti-osteoporotici esistenti e gli esiti clinici comparativi, come la riduzione delle fratture, piuttosto che la sola DMO.
Questo studio presenta diversi limiti. Il modello di ratto OVX induce un'improvvisa carenza di estrogeni e non riesce a riprodurre completamente la menopausa umana, l'invecchiamento, la regolazione immunitaria, la durata della vita, le comorbidità o la dinamica del rimodellamento osseo a lungo termine18,19. Gli effetti endocrini sistemici potrebbero contribuire ai risultati osservati, pertanto non si deve presumere un segnale diretto sulle cellule ossee. L'assenza di inibizione delle vie di segnalazione o di silenziamento genico impedisce affermazioni meccanicistiche di tipo causale. La mancanza di profili mediante HPLC o LC-MS limita la riproducibilità e impedisce l'attribuzione degli effetti a costituenti specifici. Non è stata effettuata una valutazione quantitativa della microarchitettura dell'osso trabecolare. Studi futuri dovrebbero includere analisi mediante micro-TC o istomorfometria quantitativa, comprendenti BV/TV, Tb.N, Tb.Th e Tb.Sp, al fine di fornire una valutazione più completa dei cambiamenti strutturali dell'osso20. La variabilità tra lotti di erbe, le procedure di estrazione e i requisiti di controllo qualità rimangono ostacoli importanti alla traduzione clinica.
In ratti con PMOP indotta da OVX, la pillola Zuogui a formula completa è stata associata a un miglioramento della DMO, a marcatori sierici favorevoli del turnover osseo e a modifiche coordinate dei marcatori della via EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. L'analisi fattoriale tre per tre supporta un'interazione sinergica tra i componenti nutritivi dello Yin e quelli potenziatori dello Yang, coerente con la teoria tradizionale della compatibilità delle formulazioni. Questi dati sostengono ulteriori indagini sulla ZGP come candidata multi-obiettivo per la PMOP, ma sono necessari studi con inibitori, esperimenti di silenziamento genico, colture co-colturali di osteoblasti e osteoclasti, profilazione chimica, analisi quantitative della microarchitettura ossea, studi di farmacocinetica, test di sicurezza a lungo termine e prove cliniche prima che possano essere formulate affermazioni meccanicistiche o traslazionali definitive.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della Mongolia Interna (Grant No. 2025LHMS08047), dal Progetto Generale dell'Università di Medicina della Mongolia Interna (Grant No. YKD2025MS015) e dal Fondo di Avviamento per il Dottorato dell'Università di Medicina della Mongolia Interna (Grant No. YKD2023BSQD007). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua ammoniacale al 1% | N/A | N/A | Soluzione di rivelazione blu dopo la differenziazione con ematossilina. |
| Alcool acido cloridrico al 1% | N/A | N/A | Soluzione di differenziazione per la colorazione con ematossilina. |
| Mix qPCR 2x | N/A | N/A | Master mix per PCR quantitativa. Volume della reazione di origine: 12,5 µL per reazione. |
| Soluzione di paraformaldeide al 4% | N/A | N/A | Fissazione dei campioni di femore e tibia sinistri per analisi istologica. |
| Tampone di caricamento 5x | N/A | N/A | Denaturazione del campione prima dell'elettroforesi. |
| Anticorpo primario ALP | Affinity Biosciences | N/A | Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE. |
| Coppia di primer ALP | N/A | N/A | L'mRNA di ALP è stato misurato mediante qRT-PCR, ma la tabella principale dei primer non fornisce le sequenze dei primer ALP. Richiesta conferma da parte dell'autore. |
| Reagente anticorpale biotinilato | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Aggiunto ai pozzetti del campione durante l'ELISA. |
| Gelatina di palco di Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente tonificante per lo Yang. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. La gelatina è stata sciolta nella decotto. |
| Gelatina di piastra di Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. La gelatina è stata sciolta nella decotto. |
| Cloroformio | N/A | N/A | Separazione delle fasi durante l'estrazione dell'RNA. |
| Stadio di raffreddamento | Leica | 1150 | Supporto criogenico o di raffreddamento per il processo di sezionamento. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente tonificante per lo Yang. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 9 g, rapporto 3. |
| PBS trattato con DEPC | N/A | N/A | Lavaggio delle vertebre lombari L4-L5 prima del congelamento in azoto liquido. |
| Diethylstilbestrolo | N/A | N/A | Controllo positivo farmacologico occidentale. Dose di origine: 0,04 mg/kg/giorno, 1 mL/100 g/giorno. Il documento principale contiene anche un'incoerenza nella nomenclatura cinese che dovrebbe essere armonizzata come diethylstilbestrolo. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. |
| Miscela dNTP | N/A | N/A | Inclusa nella reazione di trascrizione inversa. |
| Reagente chemiluminescente ECL | N/A | N/A | Reagente di rivelazione per Western blot. |
| Reagente cromogenico ELISA A | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Reagente di sviluppo del colore per ELISA. |
| Reagente cromogenico ELISA B | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Reagente di sviluppo del colore per ELISA. |
| Soluzione di arresto ELISA | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Utilizzata per interrompere la reazione cromogenica dell'ELISA. |
| Reagente ELISA marcato enzimaticamente | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Aggiunto ai pozzetti non vuoti nell'ELISA. |
| Anticorpo primario EphB4 | Proteintech | N/A | Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE. |
| Coppia di primer EphB4 | N/A | Prodotto PCR 232 bp | Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. L'errore di battitura nella tabella principale Rat RphB4 deve essere corretto in Rat EphB4. |
| Anticorpo primario ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE. |
| Coppia di primer ephrinB2 | N/A | Prodotto PCR 172 bp | Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Etilene, assoluto e graduato al 95%, 85%, 75% | N/A | N/A | Disidratazione e riidratazione graduale durante la colorazione con ematossilina ed eosina. |
| Ratti femmine Sprague-Dawley | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Numero di certificato animale e licenza non fornito nell'articolo di origine | Femmine sane non gravide, libere da patogeni specifici, di 6 mesi. Il documento cinese riporta un peso di 230-270 g; una precedente bozza inglese indica 220-250 g. Verificare un intervallo definitivo prima dell'invio. |
| Anticorpo primario GAPDH | Servicebio | N/A | Anticorpo di controllo di carico. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE. |
| Coppia di primer GAPDH | N/A | Prodotto PCR 253 bp | Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 9.4.1; RRID:SCR_002798 | Analisi statistica e creazione di grafici. Normalità, omogeneità della varianza, ANOVA, correzione di Bonferroni e dimensione dell'effetto devono essere mantenute nei file di output. |
| Granuli Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Controllo positivo di medicina tradizionale cinese. Dose di origine: 1,8 g/kg/giorno o 0,5 mL/100 g/giorno. |
| Soluzione di colorazione con ematossilina | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Colorazione istologica. La procedura di origine prevede una colorazione con ematossilina di 5 minuti. |
| Microcentrifuga ad alta velocità | N/A | TG16W | Centrifugazione per procedure sieriche e acidi nucleici. |
| Absorptiometro a raggi X a doppia energia Hologic | Hologic | N/A | Analisi della densità minerale ossea. Il documento di origine riporta scansioni femorali in vivo ed ex vivo. |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Quantificazione densitometrica delle bande di Western blot. La versione non è indicata nell'articolo di origine. |
| Piastra riscaldante a induzione | Midea | N/A | Indicata nella tabella strumenti cinese principale. |
| Isoflurano | N/A | N/A | Anestesia per ovariectomia bilaterale e posizionamento per DXA. Il protocollo rivisto dovrebbe specificare induzione, mantenimento, via e criteri di profondità anestetica. |
| Isopropanolo | N/A | N/A | Precipitazione dell'RNA durante l'estrazione. |
| Azoto liquido | N/A | N/A | Congelamento rapido dei campioni di vertebre lombari. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. |
| Lettore di micropiastre | N/A | AMR-100 | Rilevamento dell'assorbanza ELISA a 450 nm. |
| Lavatrice per micropiastre | N/A | APW-200 | Passaggio di lavaggio per piastre ELISA. |
| Trascrittasi inversa MMLV | N/A | N/A | Enzima per trascrizione inversa. |
| Gomma neutra per montaggio | Sinopharm Group | N/A | Mezzo di montaggio per vetrini colorati con ematossilina ed eosina. |
| Soluzione fisiologica | N/A | N/A | Veicolo per somministrazione per gavaggio ai gruppi controllo vuoto, sham-operato e modello. |
| Primer Oligo(dT)18 | N/A | N/A | Utilizzato per la trascrizione inversa. |
| Penicillina | N/A | N/A | Profilassi post-operatoria contro le infezioni. Dose di origine: 20.000 U/kg per via intramuscolare per 3 giorni. |
| Pentola a pressione | Xinfei | N/A | Indicata nella tabella strumenti cinese principale. |
| Inibitore di proteasi | N/A | N/A | Aggiunto durante l'estrazione delle proteine. |
| Tampone di lisi proteica | N/A | N/A | Estrazione proteica da tessuto osseo per Western blot. |
| Membrana PVDF | N/A | N/A | Membrana di trasferimento per Western blot attivata con metanolo. |
| Strumento qRT-PCR | N/A | N/A | PCR quantitativa di trascrizione inversa per EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e GAPDH. |
| Kit ELISA per CTX-1 ratto | Jiyinmei | JYM0026Ra | ELISA sandwich per il telopeptide C-terminale del collagene di tipo 1 sierico. Rilevamento a 450 nm. |
| Kit ELISA per P1NP ratto | Jiyinmei | JYM0030Ra | ELISA sandwich per il propeptide N-terminale del procollagene di tipo 1 sierico. Rilevamento a 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 24 g, rapporto 8. |
| Anticorpo primario RhoA | Proteintech | N/A | Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE. |
| Coppia di primer RhoA | N/A | Prodotto PCR 177 bp | Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. La terminologia è stata armonizzata da RHoA a RhoA. |
| Inibitore di RNasi | N/A | N/A | Incluso nella reazione di trascrizione inversa. |
| Acqua priva di RNasi | N/A | N/A | Scioglimento dell'RNA dopo l'essiccazione. |
| Microtomo rotativo | Leica | 2245 | Sezionamento istologico. |
| Anticorpo secondario per Western blot | N/A | N/A | Diluizione di origine: 1:15000. Reattività verso l'ospite e RRID richiesti per JoVE. |
| Latte scremato al 5% | N/A | N/A | Reagente di bloccaggio per Western blot, incubazione a temperatura ambiente per 2 h. |
| Macchina per stesura e cottura di vetrini | Jinhua Yidi | N/A | Preparazione di vetrini per istologia. |
| Pentobarbital sodico, 3% | N/A | N/A | Anestesia terminale prima del prelievo di sangue dall'aorta addominale nel documento cinese principale. La procedura finale di eutanasia e il metodo di conferma devono essere verificati. |
| Diluente standard per campioni | Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Utilizzato per diluizioni seriali standard nella procedura ELISA. |
| Tampone TBST | N/A | N/A | Tampone di lavaggio per Western blot. |
| Incubatore termostatico con agitazione | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Incubazione e agitazione in laboratorio. |
| Reagente TRIzol | N/A | N/A | Estrazione dell'RNA da 100 mg di tessuto osseo. |
| Microscopio eretto | Leica | DM1000 | Acquisizione di immagini istologiche con ematossilina ed eosina a 200x. |
| Incubatore termostatico a camicia d'acqua | N/A | GNP-9080 | Incubazione per procedure analitiche. |
| Soluzione colorante eosina idrosolubile | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Controcolorazione istologica. La procedura di origine prevede una colorazione con eosina di 3 minuti. |
| Sistema elettroforetico per Western blot | N/A | N/A | Separazione proteica. Elettroforesi di origine: 80 V inizialmente, poi 120 V. |
| Sistema di imaging per Western blot | N/A | N/A | Acquisizione di immagini di membrane chemiluminescenti. Richieste membrane non ritagliate per l'invio. |
| Sistema di trasferimento per Western blot | N/A | N/A | Trasferimento delle proteine sulla membrana PVDF. Condizioni di trasferimento di origine: 400 mA, 90 min, bagno di ghiaccio. |
| Xilene | N/A | N/A | Deparaffinazione e chiarificazione del tessuto durante l'istologia. |
| Erbe componenti della pillola Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | Formulazione a otto erbe: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina della piastra di Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis e gelatina del palco di Cervus elaphus. |
Riferimenti
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