La pillola Zuogui modula l'accoppiamento tra osteoblasti e osteoclasti in ratti ovariectomizzati: uno studio fattoriale tre per tre

Sommario

Questo studio valuta gli effetti della pillola Zuogui sull'osteoporosi postmenopausale in ratti ovariectomizzati, utilizzando un disegno sperimentale fattoriale tre per tre. I risultati supportano effetti sinergici dei componenti Yin e Yang sul metabolismo osseo e sui marcatori associati della via EphB4/ephrinB2, anche se le evidenze meccanicistiche rimangono di tipo associativo piuttosto che causale.

Abstract

L'osteoporosi postmenopausale è determinata dalla carenza di estrogeni associata a un'alterazione del bilanciamento tra formazione e riassorbimento osseo. Questo studio ha quantificato gli effetti indipendenti e interattivi delle formulazioni parziali di Zuogui Pill, ricostituite per l'azione nutritiva del Yin, in un modello di ratto ovariectomizzato, esaminando le associazioni con la via EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatasi alcalina. In conformità con le linee guida ARRIVE 2.0, 130 ratti femmina Sprague-Dawley liberi da agenti patogeni specifici sono stati assegnati casualmente a 13 gruppi (n=10/gruppo), inclusi nove gruppi organizzati secondo un disegno fattoriale 3x3. I parametri valutati comprendevano P1NP, CTX-1, densità minerale ossea del femore misurata mediante densitometria a raggi X a doppia energia (DXA), istologia trabecolare ed espressione di acido ribonucleico messaggero e proteico analizzata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa e immunoblotting. La formula completa (I2A2) si è associata a valori più elevati di P1NP, a livelli più bassi di CTX-1 e a una maggiore densità minerale ossea rispetto al gruppo modello. L'analisi fattoriale ha evidenziato un'interazione Yin-Yang tra P1NP e densità minerale ossea, a sostegno di una sinergia farmacologica. Le modifiche molecolari sono state associate a un aumento dell'espressione di EphB4, ephrinB2 e ALP e a una riduzione dell'espressione di RhoA. Questi risultati supportano un'associazione tra il trattamento con Zuogui Pill, il miglioramento dei fenotipi ossei e la modulazione dei marcatori della via di segnalazione; la dipendenza causale della via richiede ulteriore conferma mediante studi con inibitori, silenziamento genico e colture cellulari in co-coltura.

Introduzione

L'osteoporosi postmenopausale (OPM) colpisce una vasta popolazione di donne ed è caratterizzata da un'alterazione dell'equilibrio tra formazione e riassorbimento osseo associata alla carenza di estrogeni^1,2. Il sistema recettore-legante EphB4/ephrinaB2 media la comunicazione tra osteoblasti e osteoclasti; il segnale di EphB4 favorisce la differenziazione degli osteoblasti e l'attività della fosfatasi alcalina (ALP), mentre il segnale inverso dell'ephrinaB2 può inibire l'osteoclastogenesi attraverso meccanismi legati a RhoA^3,4. La ridotta accoppiamento cellulare nell'osso carente di estrogeni fornisce una base meccanicistica per valutare interventi che influenzano entrambe le componenti cellulari del rimodellamento.

Le attuali terapie per l'osteoporosi, compresi agenti antiriossorbenti e anabolizzanti, riducono il rischio di fratture ma possono essere limitate da aderenza al trattamento, costo, controindicazioni, effetti di rimbalzo o eventi avversi durante l'uso a lungo termine⁵. Pertanto, trattamenti sperimentali che migliorino la formazione ossea limitando al contempo un'eccessiva riassorbimento rimangono scientificamente rilevanti.

La pillola Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) è una prescrizione classica a base multi-componente utilizzata nella medicina tradizionale cinese per la carenza di essenza renale, un quadro teorico associato alla debolezza ossea. I componenti nutritivi dello Yin includono Rehmannia glutinosa (radice preparata, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (frutto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (frutto, Gou Qi Zi, 12 g), la gelatina del piastrone di Chinemys reevesii (gelatina derivata dal piastrone, Gui Ban Jiao, 12 g) e Cyathula officinalis (radice, Chuan Niu Xi, 9 g). I componenti potenziatori dello Yang includono Cuscuta australis (seme, Tu Si Zi, 12 g) e la gelatina del palco di Cervus elaphus (gelatina derivata dal palco, Lu Jiao Jiao, 12 g). Secondo la teoria classica, il principio dello "ricercare lo Yang all'interno dello Yin" prevede che le erbe potenziatrici dello Yang possano potenziare una base nutritiva dello Yin piuttosto che agire come semplici additivi indipendenti. Evidenze cliniche e studi preclinici hanno riportato un'attività anti-osteoporotica della ZGP o di interventi contenenti ZGP, inclusi effetti sulla DMO, sull'osteogenesi e sul comportamento farmacocinetico^6,7,8,9,10.

La novità di questo studio risiede nella separazione formale, secondo uno schema fattoriale tre per tre, dei componenti tonificanti lo Yin e quelli potenziatori dello Yang in ratti ovariectomizzati (OVX), con la contemporanea valutazione dei fenotipi ossei e dei marcatori del percorso EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Questo disegno sperimentale verifica la teoria della compatibilità delle formulazioni in modo più diretto rispetto agli studi che utilizzano esclusivamente la prescrizione completa o un singolo comparatore, pur riconoscendo che le variazioni dei marcatori del percorso rimangono associative a meno che non vengano bloccate o silenziate meccanicamente¹¹.

Protocollo

Tutte le procedure di questo studio sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Medica della Mongolia Interna (Numero di Approvazione: YKD202404105) e sono state condotte in conformità con ARRIVE 2.0¹².

Progettazione dello studio

Lo studio è stato condotto presso la piattaforma sperimentale sugli animali dell'Università di Medicina di Inner Mongolia. È stato applicato un disegno fattoriale completo 3×3 con due fattori: formulazione base per il nutrimento dello Yin (I; tre livelli di dose: 0, 27, 54 g equivalenti di droga grezza) e formulazione per il potenziamento dello Yang (A; tre livelli di dose: 0, 8, 16 g equivalenti di droga grezza), ottenendo nove celle fattoriali più quattro gruppi di riferimento. Il disegno fattoriale è mostrato nella Tabella 1. I2A2 rappresenta la formula completa ZGP alla dose equivalente clinica. Per la conversione delle dosi è stato utilizzato il metodo dell'area della superficie corporea (fattore ratto:uomo = 6,25)¹³.

Animali, randomizzazione e cecità

Centoventi ratti femmina Sprague-Dawley specific pathogen-free (6 mesi di età, 220–250 g) sono stati assegnati mediante una tabella di numeri casuali generata al computer. I codici di assegnazione sono stati inseriti in buste sigillate in ordine sequenziale da un ricercatore non coinvolto nella valutazione degli esiti. I ratti sono stati alloggiati in gruppi di 3–4 per gabbia ventilata, in un ciclo luce/buio di 12 h, a 22 ± 2 ^oC e umidità del 50–60%, con accesso libero all'acqua, alimento standard per roditori con contenuto di calcio e fosforo documentato, attività nella gabbia e arricchimento ambientale. I saggi molecolari, la valutazione istologica, la quantificazione delle immagini e la densitometria sono stati eseguiti da ricercatori ciechi rispetto all'assegnazione. La dimensione del campione è stata determinata mediante analisi a priori della potenza statistica, ottenendo n = 10 per gruppo.

Modello OVX e trattamento farmacologico

È stata eseguita una OVX bilaterale sotto anestesia inalatoria con isoflurano somministrato tramite vaporizzatore di precisione. L'induzione anestetica è avvenuta con una concentrazione del 3-4% in ossigeno e mantenuta al 1,5-2,5% attraverso un cono nasale. La profondità adeguata è stata confermata dall'assenza del riflesso di ritrazione plantare e del riflesso palpebrale, con una respirazione stabile. Il successo della OVX è stato valutato dall'assenza del ciclo estrale vaginale al giorno 5 e dalla riduzione della densità minerale ossea (BMD) a 12 settimane dall'intervento chirurgico. Dopo la validazione del modello, il trattamento per gavaggio è stato somministrato per 8 settimane (1 mL/100 g/giorno). Le decotti sono stati preparati mediante estrazione acquosa in ebollizione controllata (100 °C, con riflusso), utilizzando un volume 10 volte superiore per 2 h, seguito da un volume 8 volte superiore per 1,5 h, filtrati attraverso quattro strati di garza medica e concentrati sotto pressione ridotta fino a 0,968 g di droga grezza/mL. L'estratto concentrato è stato conservato a 4 °C ed utilizzato entro 7 giorni dalla preparazione. I controlli positivi sono stati i granuli Gusukang (1,8 g/kg/giorno) e il dietilstilbestrolo (0,04 mg/kg/giorno). Al termine dell'esperimento, i ratti sono stati profondamente anestetizzati con isoflurano al 5% fino alla scomparsa dei riflessi plantare e corneale, quindi sottoposti a esanguinazione e dislocazione cervicale. La morte è stata confermata dall'arresto del battito cardiaco e della respirazione. Le carcasse e i tessuti sono stati smaltiti come rifiuti biologici; i residui chimici sono stati smaltiti come rifiuti pericolosi; gli aghi o le lame sono stati collocati in contenitori per materiali taglienti approvati.

Misurazioni dei risultati

I livelli sierici di P1NP e CTX-1 sono stati misurati mediante saggio ELISA a sandwich (Jiyinmei)¹⁴. La densità minerale ossea (BMD) del femore è stata quantificata mediante DXA. L'istologia trabecolare è stata valutata mediante colorazione con ematossilina ed eosina a 200x. L'espressione genica è stata analizzata mediante RT-qPCR utilizzando il metodo 2^-ΔΔCt, normalizzata rispetto alla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). L'espressione proteica è stata valutata mediante Western blot e quantificazione con ImageJ (vedere Tabella dei Materiali). I pesi molecolari osservati e le informazioni sui cataloghi degli anticorpi sono riportati in Tabella Supplementare 1. Le sequenze dei primer erano: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Analisi statistica

La normalità è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità della varianza mediante il test di Levene prima dell'analisi parametrica. I dati sono espressi come media ± DS e tutte le barre di errore nei grafici quantitativi indicano la DS. È stata applicata un'ANOVA fattoriale a due vie alle nove celle fattoriali per stimare gli effetti principali e l'interazione tra I e A, con eta quadro parziale (ηp²) come misura dell'effetto. Confronti a coppie tra tutti e 13 i gruppi sono stati effettuati utilizzando un'ANOVA a una via con correzione di Bonferroni. Le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism. I simboli di significatività sono definiti in modo coerente come segue: *, **, ***, **** indicano rispettivamente p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 rispetto al modello; #, ##, ###, #### indicano le stesse soglie rispetto alla formula completa di ZGP.

Risultati

Convalida del modello mediante citologia vaginale

Il successo dell'OVX è stato confermato in tutti gli animali ovariectomizzati, come dimostrato dall'interruzione del ciclo estrale entro 5 giorni dall'intervento chirurgico (Figura 1A), mentre gli animali sottoposti a intervento fittizio hanno mantenuto un ciclo di 4 giorni (Figura 1B). A 12 settimane, la DXA ha mostrato una densità minerale ossea femorale inferiore ne...

Discussione

Il termine di interazione fattoriale supporta una relazione non additiva tra i componenti che nutrono lo Yin e quelli che potenziano lo Yang nel ZGP. Questo risultato è coerente con il principio tradizionale di ricercare lo Yang all'interno dello Yin, secondo cui i componenti che potenziano lo Yang dovrebbero attivare o potenziare la base nutritiva dello Yin¹⁵. Il risultato va interpretato come una sinergia farmacologica a livello di formulazione. Tuttavia, non identifica i singoli costituenti att...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua ammoniacale al 1%	N/A	N/A	Soluzione di rivelazione blu dopo la differenziazione con ematossilina.
Alcool acido cloridrico al 1%	N/A	N/A	Soluzione di differenziazione per la colorazione con ematossilina.
Mix qPCR 2x	N/A	N/A	Master mix per PCR quantitativa. Volume della reazione di origine: 12,5 µL per reazione.
Soluzione di paraformaldeide al 4%	N/A	N/A	Fissazione dei campioni di femore e tibia sinistri per analisi istologica.
Tampone di caricamento 5x	N/A	N/A	Denaturazione del campione prima dell'elettroforesi.
Anticorpo primario ALP	Affinity Biosciences	N/A	Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE.
Coppia di primer ALP	N/A	N/A	L'mRNA di ALP è stato misurato mediante qRT-PCR, ma la tabella principale dei primer non fornisce le sequenze dei primer ALP. Richiesta conferma da parte dell'autore.
Reagente anticorpale biotinilato	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Aggiunto ai pozzetti del campione durante l'ELISA.
Gelatina di palco di Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente tonificante per lo Yang. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. La gelatina è stata sciolta nella decotto.
Gelatina di piastra di Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4. La gelatina è stata sciolta nella decotto.
Cloroformio	N/A	N/A	Separazione delle fasi durante l'estrazione dell'RNA.
Stadio di raffreddamento	Leica	1150	Supporto criogenico o di raffreddamento per il processo di sezionamento.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente tonificante per lo Yang. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 9 g, rapporto 3.
PBS trattato con DEPC	N/A	N/A	Lavaggio delle vertebre lombari L4-L5 prima del congelamento in azoto liquido.
Diethylstilbestrolo	N/A	N/A	Controllo positivo farmacologico occidentale. Dose di origine: 0,04 mg/kg/giorno, 1 mL/100 g/giorno. Il documento principale contiene anche un'incoerenza nella nomenclatura cinese che dovrebbe essere armonizzata come diethylstilbestrolo.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4.
Miscela dNTP	N/A	N/A	Inclusa nella reazione di trascrizione inversa.
Reagente chemiluminescente ECL	N/A	N/A	Reagente di rivelazione per Western blot.
Reagente cromogenico ELISA A	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Reagente di sviluppo del colore per ELISA.
Reagente cromogenico ELISA B	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Reagente di sviluppo del colore per ELISA.
Soluzione di arresto ELISA	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Utilizzata per interrompere la reazione cromogenica dell'ELISA.
Reagente ELISA marcato enzimaticamente	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Aggiunto ai pozzetti non vuoti nell'ELISA.
Anticorpo primario EphB4	Proteintech	N/A	Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE.
Coppia di primer EphB4	N/A	Prodotto PCR 232 bp	Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. L'errore di battitura nella tabella principale Rat RphB4 deve essere corretto in Rat EphB4.
Anticorpo primario ephrinB2	Affinity Biosciences	N/A	Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE.
Coppia di primer ephrinB2	N/A	Prodotto PCR 172 bp	Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Etilene, assoluto e graduato al 95%, 85%, 75%	N/A	N/A	Disidratazione e riidratazione graduale durante la colorazione con ematossilina ed eosina.
Ratti femmine Sprague-Dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Numero di certificato animale e licenza non fornito nell'articolo di origine	Femmine sane non gravide, libere da patogeni specifici, di 6 mesi. Il documento cinese riporta un peso di 230-270 g; una precedente bozza inglese indica 220-250 g. Verificare un intervallo definitivo prima dell'invio.
Anticorpo primario GAPDH	Servicebio	N/A	Anticorpo di controllo di carico. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE.
Coppia di primer GAPDH	N/A	Prodotto PCR 253 bp	Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 9.4.1; RRID:SCR_002798	Analisi statistica e creazione di grafici. Normalità, omogeneità della varianza, ANOVA, correzione di Bonferroni e dimensione dell'effetto devono essere mantenute nei file di output.
Granuli Gusukang	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Controllo positivo di medicina tradizionale cinese. Dose di origine: 1,8 g/kg/giorno o 0,5 mL/100 g/giorno.
Soluzione di colorazione con ematossilina	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Colorazione istologica. La procedura di origine prevede una colorazione con ematossilina di 5 minuti.
Microcentrifuga ad alta velocità	N/A	TG16W	Centrifugazione per procedure sieriche e acidi nucleici.
Absorptiometro a raggi X a doppia energia Hologic	Hologic	N/A	Analisi della densità minerale ossea. Il documento di origine riporta scansioni femorali in vivo ed ex vivo.
Software ImageJ	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Quantificazione densitometrica delle bande di Western blot. La versione non è indicata nell'articolo di origine.
Piastra riscaldante a induzione	Midea	N/A	Indicata nella tabella strumenti cinese principale.
Isoflurano	N/A	N/A	Anestesia per ovariectomia bilaterale e posizionamento per DXA. Il protocollo rivisto dovrebbe specificare induzione, mantenimento, via e criteri di profondità anestetica.
Isopropanolo	N/A	N/A	Precipitazione dell'RNA durante l'estrazione.
Azoto liquido	N/A	N/A	Congelamento rapido dei campioni di vertebre lombari.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 12 g, rapporto 4.
Lettore di micropiastre	N/A	AMR-100	Rilevamento dell'assorbanza ELISA a 450 nm.
Lavatrice per micropiastre	N/A	APW-200	Passaggio di lavaggio per piastre ELISA.
Trascrittasi inversa MMLV	N/A	N/A	Enzima per trascrizione inversa.
Gomma neutra per montaggio	Sinopharm Group	N/A	Mezzo di montaggio per vetrini colorati con ematossilina ed eosina.
Soluzione fisiologica	N/A	N/A	Veicolo per somministrazione per gavaggio ai gruppi controllo vuoto, sham-operato e modello.
Primer Oligo(dT)18	N/A	N/A	Utilizzato per la trascrizione inversa.
Penicillina	N/A	N/A	Profilassi post-operatoria contro le infezioni. Dose di origine: 20.000 U/kg per via intramuscolare per 3 giorni.
Pentola a pressione	Xinfei	N/A	Indicata nella tabella strumenti cinese principale.
Inibitore di proteasi	N/A	N/A	Aggiunto durante l'estrazione delle proteine.
Tampone di lisi proteica	N/A	N/A	Estrazione proteica da tessuto osseo per Western blot.
Membrana PVDF	N/A	N/A	Membrana di trasferimento per Western blot attivata con metanolo.
Strumento qRT-PCR	N/A	N/A	PCR quantitativa di trascrizione inversa per EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP e GAPDH.
Kit ELISA per CTX-1 ratto	Jiyinmei	JYM0026Ra	ELISA sandwich per il telopeptide C-terminale del collagene di tipo 1 sierico. Rilevamento a 450 nm.
Kit ELISA per P1NP ratto	Jiyinmei	JYM0030Ra	ELISA sandwich per il propeptide N-terminale del procollagene di tipo 1 sierico. Rilevamento a 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Componente nutritiva per lo Yin. Dose totale della formula di origine: 24 g, rapporto 8.
Anticorpo primario RhoA	Proteintech	N/A	Anticorpo per Western blot. Diluizione di origine: 1:2000. RRID e numero di lotto richiesti per JoVE.
Coppia di primer RhoA	N/A	Prodotto PCR 177 bp	Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. La terminologia è stata armonizzata da RHoA a RhoA.
Inibitore di RNasi	N/A	N/A	Incluso nella reazione di trascrizione inversa.
Acqua priva di RNasi	N/A	N/A	Scioglimento dell'RNA dopo l'essiccazione.
Microtomo rotativo	Leica	2245	Sezionamento istologico.
Anticorpo secondario per Western blot	N/A	N/A	Diluizione di origine: 1:15000. Reattività verso l'ospite e RRID richiesti per JoVE.
Latte scremato al 5%	N/A	N/A	Reagente di bloccaggio per Western blot, incubazione a temperatura ambiente per 2 h.
Macchina per stesura e cottura di vetrini	Jinhua Yidi	N/A	Preparazione di vetrini per istologia.
Pentobarbital sodico, 3%	N/A	N/A	Anestesia terminale prima del prelievo di sangue dall'aorta addominale nel documento cinese principale. La procedura finale di eutanasia e il metodo di conferma devono essere verificati.
Diluente standard per campioni	Fornito con il kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Utilizzato per diluizioni seriali standard nella procedura ELISA.
Tampone TBST	N/A	N/A	Tampone di lavaggio per Western blot.
Incubatore termostatico con agitazione	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Incubazione e agitazione in laboratorio.
Reagente TRIzol	N/A	N/A	Estrazione dell'RNA da 100 mg di tessuto osseo.
Microscopio eretto	Leica	DM1000	Acquisizione di immagini istologiche con ematossilina ed eosina a 200x.
Incubatore termostatico a camicia d'acqua	N/A	GNP-9080	Incubazione per procedure analitiche.
Soluzione colorante eosina idrosolubile	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Controcolorazione istologica. La procedura di origine prevede una colorazione con eosina di 3 minuti.
Sistema elettroforetico per Western blot	N/A	N/A	Separazione proteica. Elettroforesi di origine: 80 V inizialmente, poi 120 V.
Sistema di imaging per Western blot	N/A	N/A	Acquisizione di immagini di membrane chemiluminescenti. Richieste membrane non ritagliate per l'invio.
Sistema di trasferimento per Western blot	N/A	N/A	Trasferimento delle proteine sulla membrana PVDF. Condizioni di trasferimento di origine: 400 mA, 90 min, bagno di ghiaccio.
Xilene	N/A	N/A	Deparaffinazione e chiarificazione del tessuto durante l'istologia.
Erbe componenti della pillola Zuogui	Beijing Tongrentang	N/A	Formulazione a otto erbe: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina della piastra di Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis e gelatina del palco di Cervus elaphus.