Ricostituzione funzionale dei supercomplessi respiratori mitocondriali

Sommario

Presentiamo un protocollo semplice per la ricostruzione di supercomplessi respiratori mitocondriali funzionali in proteoliposomi ben definiti, al fine di effettuare una caratterizzazione strutturale e funzionale correlata.

Abstract

I mitocondri sono centri centrali del metabolismo bioenergetico e rappresentano la principale fonte di ATP. La membrana mitocondriale interna ospita il sistema di fosforilazione ossidativa, che comprende i complessi della catena di trasporto degli elettroni (CI, CII, CIII₂, e CIV) e l'ATP sintasi (CV). Nei mammiferi, CI, CIII₂, e il CIV formano strutture di ordine superiore chiamate supercomplessi (SC), come il SC I+III₂+IV, SC I+III₂e SC III₂+IV. Sebbene i fattori fisiologici che favoriscono la formazione dei complessi superiori (SC) rimangano poco chiari, si è ipotizzato che la loro assemblaggio possa potenziare i tassi di trasferimento di elettroni tra i complessi, ridurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno o prevenire l'aggregazione non specifica delle proteine all'interno della membrana interna mitocondriale altamente densa. Gli studi strutturali e funzionali sui complessi superiori della catena respiratoria si sono basati principalmente su complessi estratti con detergenti. Sebbene tali studi abbiano migliorato la comprensione della catena di trasporto degli elettroni, l'assenza di un doppio strato lipidico integro ne limita la capacità di indagare i vantaggi funzionali dell'assemblaggio in supercomplessi. Tuttavia, progressi recenti hanno dimostrato che le proteine di membrana possono essere caratterizzate strutturalmente in ambienti lipidici ricostruiti simili a quelli nativi, offrendo un contesto più fisiologico per queste indagini. In questo lavoro presentiamo un protocollo semplice, rapido e riproducibile per la ricostruzione dei complessi superiori respiratori in liposomi. Questo metodo consente di valutare gli effetti di diverse composizioni lipidiche, concentrazioni proteiche e potenziale di membrana sulla funzione dei complessi superiori respiratori, fornendo uno strumento prezioso per futuri studi meccanicistici.

Introduzione

I mitocondri sono centrali per la respirazione eucariotica. La membrana interna mitocondriale (IMM) ospita il sistema di fosforilazione ossidativa, costituito dai complessi della catena di trasporto degli elettroni (CI–CIV) e dall'ATP sintasi (CV)¹. CI e CII trasferiscono elettroni da substrati ridotti al ubiquinone (CoQ), generando ubiquinolo (CoQH₂), che trasferisce gli elettroni attraverso CIII₂ e, tramite citocromo c, a CIV, dove l'ossigeno viene ridotto a acqua. Il pompaggio di protoni da parte di CI, CIII₂ e CIV stabilisce la forza proton-motrice (PMF), che viene sfruttata da CV per sintetizzare ATP da ADP e fosfato inorganico (P)¹.

Oltre a funzionare in modo indipendente, CI, CIII₂ e CIV possono assemblarsi in strutture di supercomplessi (SC) di ordine superiore con definite stechiometrie, come SC I+III₂+IV (noto anche come respirasoma), SC I+III₂ e SC III₂+IV^2,3,4,5. I vantaggi funzionali di questi assemblaggi non sono ancora chiari⁶. Le ipotesi riguardo alla loro funzione spaziano da ruoli nell'assemblaggio e nel canale degli substrati fino al considerarli un sottoprodotto dell'elevata densità proteica nella membrana mitocondriale interna (IMM)^{3,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Studi recenti suggeriscono che le proprietà della membrana, inclusa la tensione della membrana indotta dal mismatch idrofobico, le interazioni proteina-proteina e le interazioni proteina-lipidi, contribuiscono alla formazione e alla stabilità dei supercomplessi¹⁶.

Gli studi strutturali e funzionali delle proteine di membrana si sono tradizionalmente basati su complessi solubilizzati con detergenti, che alterano l'ambiente nativo della membrana e limitano l'indagine di processi dipendenti dal potenziale di membrana e dai gradienti ionici. Al contrario, i recenti progressi dimostrano che le proteine di membrana possono essere caratterizzate strutturalmente in membrane reintrodotte^17,18,19 o membrane native^20,21,22,23, migliorando notevolmente la nostra capacità di esaminare i meccanismi funzionali delle proteine di membrana che dipendono dal potenziale di membrana e dai gradienti ionici.

Questo protocollo descrive un metodo semplice e riproducibile per ricostituire supercomplessi respiratori mitocondriali (SC) in proteoliposomi definiti. Il sistema risultante fornisce una piattaforma potente per indagare questioni fondamentali relative alla formazione, stabilità e funzione dei supercomplessi respiratori in un ambiente di membrana controllato e simile al nativo. Incorporando CoQ₁₀ e citocromo c durante la ricostituzione, dimostriamo che i supercomplessi ricostituiti nei proteoliposomi supportano il consumo di ossigeno guidato da NADH, indicando che i complessi mantengono la loro competenza funzionale all'interno del doppio strato lipidico. Mostriamo inoltre che i supercomplessi possono essere facilmente visualizzati nei proteoliposomi mediante microscopia elettronica criogenica (cryo-EM), consentendo così una correlazione diretta tra organizzazione strutturale e attività biochimica.

Sebbene il metodo sia robusto e facilmente riproducibile, il successo della ricostituzione dipende da un'attenta ottimizzazione della composizione lipidica, della concentrazione del detergente, del rapporto proteina-lipidi e della sigillatura efficiente della membrana per preservare la stabilità e l'attività del supercomplesso.

L'obiettivo generale di questo metodo è consentire un'analisi strutturale e funzionale integrata delle SC respiratorie in condizioni di membrana definite. Questo approccio supera i principali limiti dei sistemi basati su detergenti, ripristinando le SC in un doppio strato lipidico sigillato in grado di sostenere la formazione di un potenziale di membrana e interazioni proteina-lipidi fisiologicamente rilevanti. Inoltre, il sistema permette un controllo preciso sulla composizione lipidica, sui cofattori e sul contenuto proteico, rendendolo particolarmente adatto per testare in modo sistematico come le proprietà della membrana influenzino la stabilità e l'attività delle SC. Rispetto ai preparati solubilizzati con detergenti o agli approcci in situ, questo metodo offre il vantaggio distintivo di combinare saggi funzionali, come il consumo di ossigeno guidato da NADH, con analisi strutturale basata su criomicroscopia elettronica, consentendo così correlazioni struttura-funzione difficilmente ottenibili con altri sistemi.

Protocollo

Le membrane mitocondriali del cuore di suino sono state isolate da cuori acquistati commercialmente tessuto prelevato da animali macellati per il consumo umano. Nessun animale è stato utilizzato vivente specificamente per questo protocollo. L'uso di questo materiale è stato considerato esente dall'approvazione etica sugli animali poiché il tessuto è stato ottenuto come sottoprodotto da animali macellati per il consumo umano

1. Purificazione del supercomplesso mitocondriale SC I+III₂/SC I+III₂+IV da membrane lavate di mitocondri cardiaci suini

1. Scongelare 40 mg (4 mL) di membrane mitocondriali lavate sotto forma di aliquote da 10 mg/mL (le membrane lavate sono preparate come precedentemente descritto^24,25).
2. Diluire le membrane in 4 mL di Buffer MX (30 mM HEPES, pH 7,7, 150 mM acetato di potassio, 10% glicerolo, 1 mM EDTA, 0,002% (p/v) fenilmetilsolfonil fluoruro, 0,1% (p/v) CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propanosulfonato), 1 mM ferricianuro di potassio). Aggiungere 8 mL di digitonina al 2% (p/v) in Buffer MX (160 mg di digitonina in 8 mL; rapporto finale 4:1, mg di digitonina: mg di proteina totale di membrana). Il volume finale è di 16 mL.
3. Omogeneizzare manualmente in un omogeneizzatore Dounce (50 passaggi), avendo cura di non introdurre bolle. Incubare (in rotazione) per 1 h a 4 °C.
4. Centrifugare l'omogeneato a 16.000 × g, 4 °C per 30 min. Raccogliere il soprannatante.
5. Concentrare il soprannatante fino a 1 mL utilizzando un concentratore a filtro centrifugo con cutoff di 100 kDa a 3000 × g, 4 °C. Concentrare in cicli di 10 minuti, risospendendo accuratamente tra una centrifugazione e l'altra, fino al raggiungimento del volume desiderato (i campioni tendono ad aggregare se non risospesi tra i cicli di centrifugazione a causa dell'aumento della concentrazione locale del detergente vicino al filtro).
6. Dividere il campione concentrato in quattro aliquote da 250 µL. 
7. Equilibrare la colonna di cromatografia ad esclusione dimensionale (volume della colonna: 24 mL) con il buffer per cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC buffer; 30 mM HEPES pH 7,8, 150 mM acetato di potassio, 1 mM EDTA, 0,005% detergente glycocide) per un volume di 48 mL (2 volumi di colonna).
8. Impostare il programma di cromatografia per raccogliere frazioni da 1 mL a partire da un volume di eluizione di 6 mL fino a un volume di eluizione di 24 mL. Iniettare un’aliquota da 250 µL (dal passaggio 1.6) su una resina per cromatografia ad esclusione dimensionale da 24 mL. Utilizzare la colonna pre-equilibrata con il buffer per cromatografia ad esclusione dimensionale (dal passaggio 1.7). Raccogliere le frazioni dal frazionatore prima di iniziare il successivo ciclo.
9. Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 per le restanti aliquote concentrate del passaggio 1.6.
10. Caricare 10 µL di ciascuna frazione delle corsie SEC, mescolati con 5 µL di colorante di carico per elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni native blu (BN-PAGE), su un gel al 3%–12% di acrilamide in gradiente e sottoporre a saggio colorimetrico in-gel per l'attività della CI con NADH/cloruro di nitrotetrazolio blu²⁶  per verificare la presenza di attività della CI nelle frazioni. 
    NOTA: I supercomplessi respiratori eluiscono dal mezzo di filtrazione su agarosio reticolato da 24 mL a un volume di eluizione di circa 11,5 mL.
11. Raggruppare le frazioni che mostrano l'attività massima della CI ad alto peso molecolare nel saggio in-gel per l'attività della CI. Concentrare il campione come descritto nel passaggio 1.5.
    NOTA: I supercomplessi concentrati in detergente glicosidico glyco-diosgenina (GDN) possono essere conservati con il 30% (v/v) di glicerolo a una concentrazione finale di circa 10 mg/mL in azoto liquido (N₂). Da 40 mg di complesso mitocondriale lavato si sono ottenuti 3,4 mg di proteina totale in base a un saggio BCA.

2. Preparazione della miscela lipidica

NOTA: Modificato da protocolli precedentemente descritti^27,28. Il cloroformio è tossico, volatile e sospettato cancerogeno. Manipolarlo esclusivamente in una cappa chimica certificata e con idonei dispositivi di protezione individuale (DPI). Il pentano è altamente infiammabile. Tenerlo lontano da fonti di accensione. Manipolarlo solo in una cappa chimica certificata con adeguati DPI. Smaltire i rifiuti di solventi organici in contenitori approvati per rifiuti di solventi alogenati/non alogenati, secondo le politiche istituzionali di sicurezza e igiene ambientale (EH&S).

1. In una cappa chimica, preparare soluzioni stock da 25 mg/mL di POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolammina) e CL (cardiolipina: 1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-glicerolo; da tessuto cardiaco bovino) in cloroformio, separatamente. 
2. Preparare 10 mM di CoQ₁₀ in cloroformio. Per 25 mg di miscela lipidica totale, aggiungere in un tubo da saggio in vetro da 13 mL: 0,4 mL (10 mg) di POPC, 0,4 mL (10 mg) di POPE, 0,2 mL (5 mg) di CL e 50 µL di CoQ₁₀ 10 mM (500 nmol finali di CoQ₁₀ (20 nmol CoQ₁₀/mg di lipidi)). Il rapporto finale in peso di POPC:POPE:CL è 2:2:1.
3. Asciugare la miscela sotto un flusso di gas inerte (argon o azoto) per rimuovere il cloroformio, ruotando delicatamente il tubo per formare uno strato sottile della miscela lipidica lungo le pareti del tubo. Asciugare con un flusso costante di gas inerte per 10 minuti.
4. Ridisciogliere lo strato lipidico essiccato con 1 mL di pentano e ripetere il passaggio 2.3, facilitando così l'eliminazione del cloroformio residuo.
5. Incubare il tubo con i lipidi essiccati in un essiccatore sotto vuoto a temperatura ambiente per tutta la notte, per rimuovere completamente i solventi. 
6. Aggiungere 5 mL di Proteoliposome Buffer (PLB; 10 mM MOPS pH 7,4, 150 mM KCl) per idratare la miscela lipidica, sigillare ermeticamente il tubo per evitare fuoriuscite e agitare delicatamente al vortex fino a completa solubilizzazione dei lipidi (i lipidi essiccati non devono più essere visibili sulla superficie del tubo).
7. Rimuovere la chiusura, riempire il tubo con gas inerte (argon o azoto), richiudere e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo 1 ora di incubazione, allestire aliquote da 300 µL della miscela lipidica e conservarle a −20 °C. 
   NOTA: La miscela POPC:POPE:cardiolipina (2:2:1) è stata selezionata in base a un'ottimizzazione empirica e perché PE e cardiolipina sono costituenti principali della membrana interna mitocondriale; tuttavia, il protocollo può essere facilmente adattato per testare composizioni lipidiche alternative.

3. Ricostruzione dei SC mitocondriali in liposomi

1. Scongelare le aliquote di SC conservate in azoto liquido  (passo 1.12) su ghiaccio. Eseguire uno scambio di tampone per rimuovere la glicerolo dal campione risospendendo il campione nel tampone SEC. Concentrare il campione utilizzando filtri centrifughi con cutoff di 100 kDa a 3000 × g a 4 °C. Tra una centrifugazione e l'altra (~ogni 5 min) continuare a effettuare lo scambio di tampone risospendendo il campione nel tampone SEC.
2. Verificare la concentrazione finale del SC mediante saggio BCA (kit per saggio proteico con acido bicinconinico).
3. Scongelare un'aliquote da 300 µL della miscela lipidica preparata al passo 2.7 ed estruderla attraverso un estrusore assemblato con una membrana in policarbonato da 100 nm per sei cicli a temperatura ambiente (un ciclo consiste nel passare la miscela lipidica dalla siringa sinistra a quella destra e viceversa). Al termine dei cicli di estrusione, raccogliere i liposomi da 100 nm risultanti dalla siringa opposta rispetto al lato di partenza. In alternativa, i liposomi possono essere generati mediante sonificazione. 
4. Aggiungere 9 µL di detergente al 20% (p/v) (concentrazione finale 0,6% p/v) a 250 µL della miscela lipidica estrusa in un tubo separato.
   NOTA: È possibile provare diversi detergenti. Il colato di sodio, un detergente salino biliare anionico, ha dato i migliori risultati in questi esperimenti.
5. Mescolare per inversione e incubare a 4 °C per 30 min. 
6. Aggiungere 120 µg (o superiore) di SC mitocondriale e 3 µL di citocromo c 10 mM (concentrazione finale di 100 µM) alla miscela. Portare il volume a 300 µL con PLB. Il rapporto finale lipidi:proteine è approssimativamente 10:1 (p:p). Come ulteriore controllo, generare liposomi vuoti in parallelo aggiungendo tampone SEC (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM acetato di potassio, 1 mM EDTA, 0,005% di un detergente glicosidico) alla miscela lipidi-detergente invece di SC mitocondriali e citocromo c. 
7. Mescolare per inversione e incubare a 4 °C per 30 min. 
8. Lavare una colonna cromatografica pre-impacchettata contenente resina G-25 con tampone PLB per quattro volte mediante flusso per gravità. Successivamente, lavare la colonna mediante centrifugazione a 1.000 × g per 2 min.
9. Aggiungere il campione di proteoliposomi alla colonna cromatografica desalting pre-impacchettata e lavata contenente resina G-25 e centrifugare la colonna a 1.000 × g a 4 °C per 2 min per rimuovere il detergente. Raccogliere l'eluito.
   NOTA: I liposomi preparati mediante estrusione mostravano una distribuzione dimensionale più uniforme rispetto a quelli generati mediante sonificazione. Non centrifugare la colonna cromatografica pre-impacchettata per un tempo superiore a quanto raccomandato dal produttore, per evitare contaminazione del campione con detergente. I proteoliposomi sono stati conservati a 4 °C e generalmente utilizzati entro 36 h per minimizzare la perdita di attività e preservare l'integrità dei supercomplessi.

4. Saggio di galleggiamento dei lipidi²⁹

1. Preparare soluzioni di saccarosio al 27% e al 7% (p/v) in PLB. Preparare un gradiente a gradini sovrapponendo 1,5 mL di saccarosio al 27% e 0,9 mL di saccarosio al 7% in un tubo da centrifuga da 3,5 mL.
2. Sovrapporre delicatamente 300 µL di proteoliposomi (dal passaggio 3.9) contenenti SC sul gradiente di saccarosio. Centrifugare i gradienti a 100.000 × g in un rotore ad angolo fisso per 2 h a 4 °C.
3. Prelevare con attenzione (cercando di evitare mescolamenti) nove frazioni da 300 µL (oppure dieci frazioni da 270 µL) dall'alto verso il basso. Se presente, risospendere il pellet nell'ultima frazione e raccoglierlo come frazione 9 o 10. Eventuali complessi SC non ricostituiti dovrebbero accumularsi nella frazione 9 o 10.
   NOTA: Il saggio di galleggiamento consente di separare i proteoliposomi ricostituiti da liposomi vuoti e complessi proteici non ricostituiti. Viene utilizzato per ottimizzare la ricostituzione.

5. Saggio spettroscopico dell'attività della ferricianuro CI e saggio dell'attività della CI in gel

1. Preparare la quantità necessaria di tampone di reazione ferricianuro (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% p/v 3-[(3-cholamidopropil)dimetilammonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 1 mM ferricianuro di potassio).
2. Aliquotare 990 µL di tampone di reazione in una cuvetta da 1 mL. Aggiungere 5 µL del campione (da ciascuna frazione del gradiente) alla cuvetta, quindi aggiungere 5 µL di NADH 20 mM (concentrazione finale 100 µM) alla reazione. Sigillare la cuvetta con pellicola trasparente e mescolare per inversione.
3. Monitorare il tasso di decadimento dell'assorbanza a 340 nm a 25 °C in uno spettrometro. Il decadimento dell'assorbanza a 340 nm indica l'ossidazione dell'NADH. Ripetere per tutte le frazioni in triplicato. Utilizzare 5 µL di PLB invece del campione per registrare il bianco.
4. Calcolare il tasso di ossidazione dell'NADH dopo aver sottratto il bianco e riportare l'attività totale di ciascuna frazione.
   NOTA: In alternativa, l'esperimento può essere eseguito in una piastra a 96 pozzetti.
5. Raggruppare le frazioni con attività totale massima (evitare le frazioni in fondo al tubo che mostrano attività, poiché corrispondono a proteine non ricostituite). Portare il volume delle frazioni raggruppate a 20 mL totali con PLB per diluire il saccarosio.
6. Centrifugare i campioni a 150.000 × g, 4 °C per 1 h in un rotore ad angolo fisso. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µL di PLB.
7. Mescolare 25 µL del pellet risospeso ottenuto nel passaggio precedente con 25 µL di digitonina al 2% p/v in PLB e incubare (con agitazione rotatoria) a 4 °C per 1 h.
8. Centrifugare le proteine non estratte a 16.000 × g per 20 min. Raccogliere il soprannatante.
9. Aggiungere 10 µL di colorante di carica per BN-PAGE a 30 µL del soprannatante e caricare su una BN-PAGE con gradiente 3%–12%. Eseguire due gel per effettuare i saggi di attività in-gel per CI e CIV²⁶.
10. Eseguire il gel a 150 V per 30 min con tampone BN-PAGE scuro (25 mM Tris, 0,192 g di glicina, 200 mg di blu di Coomassie). Sostituire il tampone blu scuro con tampone blu chiaro (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g di glicina, 20 mg di blu di Coomassie) ed eseguire per ulteriori 2 h a 200 V.
11. Al termine dell'elettroforesi, trasferire i gel in un contenitore adatto ed effettuare i saggi di attività in-gel per CI e CIV²⁶.
    NOTA: Per studi strutturali e funzionali dei complessi ricostituiti in liposomi, utilizzare i proteoliposomi risospesi rimanenti del passaggio 5.6. Una volta ottimizzata completamente la ricostituzione, è possibile saltare i passaggi 4 e 5 ed utilizzare direttamente i proteoliposomi ricostituiti ottenuti al passaggio 3.

6. Saggio di soppressione della fluorescenza di ACMA per misurare l'integrità della membrana dei proteoliposomi ricostruiti²⁹

1. Preparare la quantità necessaria di tampone di reazione ACMA (9-amino-6-cloro-2-metossiacridina) (10 mM MOPS pH 7,4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0,5 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA), 2 mM 2-mercaptoetanolo). 
2. Aliquotare 930 µL di tampone di reazione in una cuvetta da 1 mL. Aggiungere 50 µL dei proteoliposomi ricostituiti alla cuvetta, sigillare la cuvetta e mescolare per inversione. Incubare al riparo dalla luce per 8 minuti.
3. Impostare i parametri dello spettrometro su: lunghezza d'onda di eccitazione 410 nm, lunghezza d'onda di emissione 490 nm. 
4. Trascorso il tempo di incubazione, mescolare nuovamente la cuvetta per inversione e leggere la fluorescenza con lo spettrometro a temperatura ambiente per 8 minuti.
5. Aggiungere 4 µL di valinomicina 20 µM (concentrazione finale di 80 nM) alla cuvetta, mescolare per inversione e misurare per 8 minuti.
6. Aggiungere 6 µL di CCCP (idrazona del cianuro carbonilico m-clorofenil) 1 mM (concentrazione finale di 6 µM) alla cuvetta, mescolare per inversione e misurare per 8 minuti.
7. Per stabilire un controllo con vescicole vuote, ripetere i passaggi da 6,2 a 6,6 sostituendo i proteoliposomi ricostituiti con "liposomi vuoti". I liposomi vuoti vengono ottenuti seguendo gli stessi passaggi dei proteoliposomi ricostituiti, ma utilizzando il tampone SEC al posto dell'aggiunta di SCs durante la ricostituzione (passaggio 3,6).
8. Ripetere la misurazione in triplice replicato sia per i proteoliposomi ricostituiti che per i liposomi vuoti e tracciare l'andamento della loro fluorescenza relativa nel tempo.
   NOTA: I dati ottenuti sia dai proteoliposomi ricostituiti che dai liposomi vuoti vengono normalizzati secondo la formula (F_i − F_min)/(F_max−F_min), dove F_max rappresenta il valore iniziale della fluorescenza di baseline del campione e F_min è il valore minimo di fluorescenza di baseline dello stesso campione dopo l'aggiunta di CCCP.
   AVVERTENZA: Il CCCP è un disaccoppiante mitocondriale tossico e deve essere manipolato indossando guanti e sotto cappa da aspirazione.

7. Misurazioni di consumo di ossigeno mediante respirometria per valutare la funzione delle SC reintrodotte³⁰.

NOTA: Il tasso di consumo di ossigeno viene misurato utilizzando un sistema elettrodo per l'ossigeno di tipo Clark. I saggi funzionali dei SC ricostruiti vengono eseguiti direttamente sull'eluito dalla colonna desalatrice (passaggio 3.9).

1. Impostare lo strumento del sistema elettrodo dell'ossigeno seguendo le istruzioni del produttore e aprire il software di controllo dello strumento. Aggiungere 2 mL di acqua ultrapura nella camera di misura.
2. Regolare la velocità di agitazione finché il grafico della concentrazione di ossigeno rimane costante all'aumentare della velocità di agitazione (partire da 10, aumentare a incrementi di 10). Rimuovere l'acqua MQ e aggiungere acqua ossigenata (acqua MQ in un flacone agitato vigorosamente).
3. Fare clic su Calibra > Calibrazione in fase liquida > Acqua satura d'aria e attendere che la calibrazione si stabilizzi (velocità 0 nmol al minuto). Utilizzando una piccola spatola, aggiungere alcuni cristalli (4–6) di ditionite di sodio nel reattore per stabilire una condizione di zero ossigeno nella camera.
4. Attendere che il segnale raggiunga un plateau prima di proseguire. Salvare la calibrazione e pulire la camera di reazione con 5 × 1 mL di etanolo al 70%, con 5 × 1 mL di EDTA 0,1 mM, con 5 × 1 mL di acqua MQ e con 5 × 1 mL di tampone di reazione per ossigrafo (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl₂, 5 mM KH₂PO₄, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
5. Aggiungere 2 mL di ORB, fare clic sul pulsante "inizia lettura" nel software e attendere che il grafico si stabilizzi. Durante l'aggiunta dei proteoliposomi (campione) nella camera di reazione, etichettare il grafico nel software per indicare l'aggiunta del campione.
   NOTA: La concentrazione proteica nel campione di proteoliposomi è stimata in base alla proteina totale aggiunta ai liposomi. Un rapporto proteina:lipide di 1:12 e una concentrazione finale di 50 µg/mL di proteina nella camera del sistema elettrodo dell'ossigeno (2 mL) hanno dato i migliori risultati. Il rendimento preciso dei proteoliposomi non è stato misurato.
6. Dopo che la lettura del sistema elettrodo dell'ossigeno si è stabilizzata, aggiungere NADH nella camera di reazione ed etichettare contemporaneamente il grafico nel software per indicare l'aggiunta di NADH. Continuare la lettura per 5 minuti.
7. Aggiungere CCCP ed etichettare l'aggiunta nel software, quindi continuare la lettura per 5 minuti.
8. Aggiungere un inibitore (ad esempio, inibitore del Complesso I (Piericidina A) o inibitore del CIII₂ (Mixotiazolo) o inibitore del CIV (NaN₃)) ed etichettare l'aggiunta nel software, leggere per 2 minuti, quindi interrompere la lettura. 
9. Salvare il grafico e pulire la camera di reazione con 5 × 1 mL di etanolo al 70%, 5 × 1 mL di EDTA 0,1 mM, 7 × 1 mL di acqua MQ e 5 × 1 mL di ORB prima di effettuare un'altra misurazione.
10. Per correggere i dati rispetto alla velocità di fondo, calcolare la velocità di fondo, ovvero la pendenza della lettura prima dell'aggiunta di NADH, ed estrapolare linearmente questa velocità lungo l'intero periodo di misurazione, calcolando una concentrazione attesa di [O₂] di fondo per ogni punto temporale. Successivamente, sottrarre la [O₂] di fondo estrapolata dalla [O₂] misurata per ogni punto temporale.
11. Calcolare i tassi di consumo di ossigeno (OCR) come pendenza delle misurazioni di concentrazione di [O₂] corretti per il fondo, dopo l'aggiunta di ciascun reagente.
12. Per calcolare i tassi relativi all'OCR dopo l'aggiunta di NADH, per ogni tracciato individuale dividere ciascun OCR misurato (ad esempio, OCR dopo l'aggiunta di NADH, CCCP e inibitore, rispettivamente) per l'OCR misurato dopo l'aggiunta di NADH.     
    NOTA: ATTENZIONE: La ditionite di sodio è un agente riducente forte e può reagire violentemente con ossidanti o umidità. Manipolarla con guanti. Smaltire i rifiuti contenenti inibitori come rifiuti chimici pericolosi seguendo le linee guida istituzionali.

8. Stima delle dimensioni dei liposomi ricostruiti mediante scattering dinamico della luce

1. Accendere lo strumento di scattering dinamico della luce (DLS) e attendere circa 30 minuti per la stabilizzazione del laser.
2. Avviare il software di acquisizione dello strumento e chiudere tutti i file precedenti.
3. Filtrare i proteoliposomi (0,2 μm) per rimuovere eventuali particelle.
4. Trasferire 70 µL di proteoliposomi in una cuvetta pulita, evitando impronte digitali o macchie.
5. Inserire la cuvetta nello strumento e chiudere saldamente il coperchio.
6. Creare un nuovo file e selezionare Misurazione manuale > Dimensione.
7. Impostare la temperatura a 25 °C e mantenere l'indice di attenuazione su automatico.
8. Definire le proprietà del dispersante (viscosità e indice di rifrazione; ad esempio, RI = 1,330 per acqua/tampone).
9. Impostare i parametri di acquisizione (durata automatica, circa 3 misurazioni, elaborazione per uso generale).
10. Avviare la misurazione e monitorare dimensione, indice di polidispersione (PDI) e frequenza di conteggio (obiettivo ~100–500 kcps).
11. Analizzare i risultati: verificare la distribuzione dimensionale (intensità/volume), il PDI (<0,3 accettabile) e la qualità dell'autocorrelazione (decadimento regolare, linea di base stabile); salvare i dati.

9. Preparazione e screening della griglia per microscopia elettronica criogenica

1. Utilizzare il campione di proteoliposomi del passaggio 5.11 (o del passaggio 3.9 se i passaggi 4 e 5 vengono saltati) per preparare le griglie per microscopia elettronica (EM). Concentrare i proteoliposomi se necessario ripetendo il passaggio 5.6 e risospendendoli in un volume minore di PLB.
2. Sottoporre a glow-discharge griglie di rame da 300 mesh rivestite con carbonio forato per 90 s a 20 mA utilizzando aria in un sistema di pulizia a glow-discharge.
3. Impostare un sistema automatico di congelamento rapido per il congelamento a immersione con umidità al 95% e a 15 °C con i seguenti parametri: tempo di assorbimento 10 s, forza di assorbimento −8, tempo di attesa 10 s e tempo di drenaggio 0.
4. Fissare le pinzette con la griglia sottoposta a glow-discharge al sistema di congelamento rapido.
5. Aggiungere 4,0 µL del campione di proteoliposomi sulla griglia sottoposta a glow-discharge su un dispositivo automatico di immersione.
6. Incubare le griglie per 10 s prima di assorbire per 10 s e congelare rapidamente in etano liquido. Trasferire con attenzione le griglie nella scatola delle griglie all'interno della camera a N₂ liquido, quindi successivamente nel contenitore criogenico di stoccaggio con N₂ liquido.
7. Caricare le griglie congelate e schermarle su un microscopio elettronico a trasmissione dotato di sistema di caricamento del campione criogenico. È stato utilizzato un microscopio elettronico a trasmissione equipaggiato con un rivelatore elettronico diretto.
8. Configurare il microscopio secondo le istruzioni del produttore e schermare le griglie per individuare i proteoliposomi ricostituiti. Salvare le immagini.
   NOTA: ATTENZIONE: L'etano liquido è altamente infiammabile e criogenico; maneggiarlo indossando idonei DPI e lontano da fonti di accensione per evitare incendi e ustioni da freddo. L'azoto liquido è criogenico e può causare gravi ustioni da freddo e dislocazione dell'ossigeno. Manipolarlo con idonei DPI criogenici e utilizzarlo esclusivamente in aree ben ventilate.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, abbiamo identificato le condizioni ottimali di ricostruzione per i supercomplessi mitocondriali (SCs) isolati da mitocondri cardiaci di suino (Figura 1A,B). Il protocollo con gradiente a gradini di saccarosio separa in modo efficace i proteoliposomi ricostruiti dalle vescicole vuote e dalle proteine non incorporate, consentendo test rapidi e l'ottimizzazione delle condizioni. I risultati rappresentativi mostrati in Figura 2 illustrano un gradiente con il campione applicato prima e dopo la centrifugazione. Inoltre, abbiamo ottimizzato il detergente utilizzato per la ricostruzione dei supercomplessi respiratori nei liposomi. Quattro detergenti diversi—un detergente salino biliare anionico, CHAPS, digitonina e un detergente glicosidico—sono stati utilizzati separatamente per la ricostruzione con i supercomplessi. L'attività totale della CI nelle frazioni è stata misurata mediante saggio di ossidoriduzione NADH-ferricianuro per ciascun detergente testato (Figura 3A–D). Nei casi di ricostruzione riuscita, l'attività massima della CI è stata osservata nelle frazioni all'interfaccia tra le due concentrazioni di saccarosio (saccarosio al 27% p/v e saccarosio al 7% p/v). In particolare, un'attività minima è stata rilevata nella Frazione ^#10 con il detergente salino biliare anionico e con CHAPS, mentre la Frazione ^#10 con digitonina e detergente glicosidico mostra un'attività significativa, indicando che digitonina e un detergente glicosidico non ricostruiscono efficacemente i supercomplessi nei liposomi. Per tutte le ricostruzioni successive è stato utilizzato un detergente salino biliare anionico.

Il saggio di attività in-gel di CI e CIV eseguito su gel di elettroforesi nativa blu di proteoliposomi POPC:POPE:CL (2:2:1) estratti con digitonina dimostra le quantità relative dei supercomplessi e dei singoli complessi della catena respiratoria dopo la ricostruzione (Figura 4). I risultati indicano che l'interazione tra CI e CIII₂ è in gran parte mantenuta nei proteoliposomi dopo la re-estrazione con digitonina e BN-PAGE. Sebbene una certa attività di CIV sia presente nella banda del supercomplesso, un segnale intenso è osservato anche a un peso molecolare inferiore, compatibile con CIV da solo, indicando una dissociazione. La permeabilità della membrana dei liposomi ricostruiti è stata misurata mediante il saggio di soppressione della fluorescenza di ACMA, indicando che i proteoliposomi non erano significativamente permeabili ai protoni (Figura 5A,B). La dimensione dei liposomi ricostruiti è stata stimata mediante DLS, mostrando che l'estruzione prima della ricostruzione porta a una distribuzione dimensionale finale di 82,9 ± 0,8 nm di diametro per vescicole vuote e di 110,6 ± 0,4 nm per i proteoliposomi del supercomplesso ricostruiti (RSPs) (Figura 6). Il consumo di ossigeno da parte dei proteoliposomi è stato utilizzato per valutare la funzione del supercomplesso, rivelando un chiaro consumo di ossigeno guidato da NADH e sensibile agli inibitori (Figura 7A). Riportando graficamente i tassi di consumo di ossigeno (OCR) rispetto all'OCR dopo l'aggiunta di NADH si ottiene una misura del grado di accoppiamento all'interno degli RSPs, ovvero l'OCR aumenta di un fattore di circa 1,5 dopo l'aggiunta di CCCP rispetto all'aggiunta di NADH da solo (Figura 7B). Le griglie di microscopia crioelettronica analizzate hanno permesso la visualizzazione dei supercomplessi nella membrana dei proteoliposomi, confermando una ricostruzione riuscita (Figura 8A–I).

Figura 1: Isolamento e caratterizzazione di supercomplessi solubilizzati con detergente ottenuti da mitocondri cardiaci di suino. (A) Cromatogramma rappresentativo della purificazione mediante cromatografia di esclusione molecolare (SEC) di complessi di membrane mitocondriali di suino estratti con digitonina. (B)  Elettroforesi in gel in condizioni native colorata al blu (BN-PAGE) delle frazioni di A, rivelata mediante colorazione in-gel per l'attività della complessa I (CI). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Gradienti a gradini di saccarosio con proteoliposomi. Prima della centrifugazione (a sinistra), dopo la centrifugazione (a destra) a 100.000 × g per 2 h in un ultracentrifugo. Il campione di proteoliposomi caricato sul gradiente si separa in vescicole vuote, proteoliposomi e proteina aggregata sul fondo. Il gradiente viene quindi frazionato per ulteriori caratterizzazioni, come descritto. L'estensione approssimativa di ciascuna frazione è indicata ed etichettata. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Saggio di galleggiamento per valutare l'efficienza di reidratazione in diversi detergenti. Attività di NADH-ferricianuro della CI sulle frazioni ottenute dal gradiente discontinuo di saccarosio dopo la reidratazione con (A) detergente salino biliare anionico, (B) 3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propanosolfonato (CHAPS) (0,6% (p/v)), (C) digitonina (0,6% p/v), (D) detergente glicosidico (GDN) (0,6% (p/v)). La frazione ^nº10 è ottenuta risospendendo qualsiasi pellet presente nell'ultima frazione. L'attività nella frazione ^nº10 indica che le proteine non si sono reidratate. n = 3 e le barre di errore indicano la DS = deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Saggio di attività in gel su proteoliposomi estratti con digitonina, separati su BN-PAGE 3%–12%. Saggio di attività in gel per CI (a sinistra) e CIV (a destra). R = respirasoma (SC I+III₂+IV), SC_1,3 (SC I+III₂), IGA CI = (saggio di attività in gel per CI); IGA = saggio di attività in gel, CIV = (saggio di attività in gel per CIV). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Saggio di soppressione della fluorescenza ACMA per rilevare la perdita protonica in proteoliposomi ricostituiti. Mediante un colorante sensibile al pH (ACMA), il pH interno di proteoliposomi ricostituiti (in blu) è stato confrontato con quello di liposomi vuoti (in arancione) dopo l'aggiunta sequenziale di valinomicina e CCCP. Sono mostrati tracciati rappresentativi della fluorescenza ACMA ottenuti da diverse preparazioni di proteoliposomi a scopo comparativo. (A) Liposomi ricostituiti con membrana compromessa (permeabili). (B) Liposomi ricostituiti con membrana integra. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Misure di scattering dinamico della luce di liposomi vuoti e proteoliposomi di SC ricostruiti. Sono mostrate le distribuzioni medie ponderate per volume delle dimensioni dei liposomi vuoti estrusi (arancione) e dei proteoliposomi di SC ricostruiti (ciano). Le misurazioni sono state eseguite in triplicato tecnico. I liposomi vuoti presentano un diametro idrodinamico medio di 82,9 ± 0,8 nm, mentre i proteoliposomi presentano un diametro idrodinamico medio di 110,6 ± 0,4 nm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Saggi di consumo di ossigeno per valutare l'accoppiamento dei SC ricostruiti in liposomi. Il consumo di ossigeno è stato misurato per valutare l'attività respiratoria e l'accoppiamento dei complessi della catena respiratoria dopo la ricostruzione in liposomi generati per estrusione. (A) Traccia rappresentativa corretta per il fondo, ottenuta con elettrodo per l'ossigeno, che mostra le variazioni della concentrazione di ossigeno a seguito dell'aggiunta sequenziale di NADH per avviare la respirazione mediata da CI, CCCP per dissipare il gradiente di protoni e misurare la velocità massima di consumo di ossigeno non accoppiato (OCR), piericidina A per inibire CI, antimicina A per inibire CIII₂, o NaN₃ (azide) per inibire CIV. (B) Quantificazione dell'OCR nelle condizioni indicate e corretta secondo il passaggio 7.10. I punti dati relativi all'OCR dopo l'aggiunta di NADH sono mostrati per ogni traccia, insieme alla media ± DS (barre di errore). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Visualizzazione mediante microscopia elettronica criogenica di SC ricostituiti nelle membrane di proteoliposomi. (A–C) Micrografie elettroniche rappresentative delle griglie analizzate, che mostrano SC ricostituiti associati alle membrane di proteoliposomi. Gli SC ricostituiti sono indicati con frecce gialle. Barre della scala = 50 nm. (D–I) Particelle di SC rappresentative osservate con ingrandimento maggiore sulle membrane di proteoliposomi. Barre della scala = 10 nm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Viene presentato un metodo semplice e riproducibile per ricostituire i supercomplessi mitocondriali della catena respiratoria in proteoliposomi definiti, consentendo un'indagine controllata della loro struttura e funzione. Diversi passaggi di questo protocollo sono critici per una corretta ricostituzione. Secondo la nostra esperienza, i liposomi generati per estrusione presentano una distribuzione dimensionale più uniforme (valutata mediante scattering dinamico della luce) rispetto a quelli prodotti per sonicazione. Un'efficace rimozione del detergente mediante una colonna cromatografica per desalting pre-imbustata è essenziale per favorire la sigillatura della membrana e il corretto inserimento dei supercomplessi in un doppio strato lipidico; un'eliminazione incompleta può portare a proteoliposomi permeabili o instabili. L'ottimizzazione della composizione lipidica, del rapporto proteina/lipidi e della scelta del detergente è altrettanto importante, poiché questi parametri influenzano fortemente l'efficienza di ricostituzione e la stabilità dei supercomplessi. Il saggio di galleggiamento su gradiente di saccarosio è utile per l'ottimizzazione iniziale; tuttavia, una volta stabiliti i parametri, è preferibile utilizzare i proteoliposomi direttamente dopo il passaggio attraverso la colonna cromatografica pre-imbustata per le analisi strutturali e funzionali successive, evitando così perdite di campione e perturbazioni durante la frazionatura su gradiente. Il volume della frazione necessario per osservare l'attività varia tra diverse preparazioni. Regolare il volume da aggiungere alla miscela di reazione in base alla specifica preparazione. L'orientazione del supercomplesso respiratorio all'interno della membrana del proteoliposoma può influenzare in modo significativo le misurazioni respiratorie. La procedura di ricostituzione non è stata ottimizzata per imporre una singola topologia; pertanto, sebbene ci si aspetti una popolazione mista di orientamenti, saggi di accessibilità del ferricianuro a CI indicano una marcata prevalenza di bracci periferici di CI orientati verso l'esterno.

L'orientamento dei supercomplessi ricostruiti è stato valutato sperimentalmente e l'attività della ferricianuro di CI è stata misurata in presenza e in assenza del detergente. Nei RSP integri, il NADH aggiunto esternamente può accedere solo alle molecole di CI il cui braccio periferico è esposto al mezzo esterno, mentre la permeabilizzazione con detergente permette l'accesso del NADH a tutti i complessi. Pertanto, questo saggio stima la frazione di bracci periferici di CI funzionalmente accessibili rivolti verso il mezzo esterno, piuttosto che fornire una determinazione strutturale completa della topologia dei proteoliposomi. Il confronto delle attività misurate in queste condizioni ha indicato che l'83,1% ± 0,04% dei respirasomi (il SC) era orientato con il braccio periferico di CI rivolto verso l'esterno, rivelando un significativo bias orientazionale durante la ricostruzione.

Diverse modifiche e strategie di risoluzione dei problemi possono migliorare la riproducibilità e la stabilità. I saggi di attività in gel per CI e CIV, eseguiti su frazioni aggregate estratte con digitonina da gradienti di saccarosio, mostrano bande per i supercomplessi (SC), indicando che gli SC non si dissociano completamente durante la ricostruzione. Tuttavia, la banda SC è più intensa nel gel di attività per CI rispetto a quella nel gel di attività per CIV, indicando che CIV potrebbe dissociarsi parzialmente da CI e CIII₂ dopo la ricostruzione (Figura 4). La modifica della composizione lipidica potrebbe migliorare la stabilità degli SC. La dissociazione parziale di CIV potrebbe derivare anche dalla scelta del detergente o dalla rapida rimozione del detergente durante la ricostruzione, il che potrebbe destabilizzare le interazioni proteina-proteina più deboli all'interno del supercomplesso. Un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di scambio del detergente potrebbe migliorare il mantenimento di CIV. Inoltre, ridurre al minimo lo stress meccanico, evitare passaggi di purificazione non necessari e manipolare con attenzione i campioni possono contribuire a preservare l'integrità dei proteoliposomi. Per i saggi funzionali, è fondamentale garantire la completa sigillatura dei proteoliposomi, poiché la permeabilità della membrana impedisce l'accoppiamento al gradiente protonico transmembranario. Per la preparazione delle griglie per microscopia crioelettronica (cryo-EM), l'uso di griglie rivestite con uno strato continuo di carbonio è importante poiché si è dimostrato che migliora la distribuzione delle particelle all'interno dei fori della griglia¹⁹.

Nonostante i suoi vantaggi, questo approccio presenta delle limitazioni. I proteoliposomi non riproducono completamente la complessità compositiva e dinamica della membrana mitocondriale interna nativa, e la parziale dissociazione dei componenti del complesso superossidativo, in particolare del CIV, rimane una sfida. Anche le letture funzionali potrebbero essere influenzate da un accoppiamento incompleto o da eterogeneità nell'efficienza di ricostruzione. Tuttavia, rispetto ai sistemi solubilizzati con detergenti, questo metodo preserva le interazioni lipide-proteina e supporta un ambiente membranoso simile a quello nativo, offrendo al contempo un maggiore controllo sperimentale rispetto agli approcci in situ. Pertanto, fornisce una piattaforma preziosa per l'indagine sistematica di come la composizione lipidica e le proprietà della membrana regolino la stabilità e l'attività del complesso superossidativo.

Comprendere queste relazioni è particolarmente importante perché il disturbo dell'organizzazione dei supercomplessi respiratori è stato associato a un'ampia gamma di patologie mitocondriali e metaboliche^{31,32,33,34,35,36,37,38,39,40}. Difetti nell'assemblaggio dei complessi della catena respiratoria, nella sintesi della cardiolipina o nel rimodellamento lipidico, osservati in patologie come la sindrome di Leigh^{41,42,43,44,45,46,47}, la sindrome di Barth^{48,49,50,51,52,53,54} e la sindrome di Sengers⁴⁸, possono destabilizzare i supercomplessi, compromettere il trasferimento degli elettroni, ridurre la produzione di ATP e aumentare la generazione di specie reattive dell'ossigeno. Questi difetti bioenergetici colpiscono in modo sproporzionato tessuti con elevato fabbisogno energetico come il cuore, il muscolo scheletrico e il cervello, portando a fenotipi quali cardiomiopatia, intolleranza all'esercizio fisico e neurodegenerazione^36,37,38. Al contrario, evidenze recenti indicano che la formazione di supercomplessi può svolgere ruoli compensativi e protettivi in condizioni di stress, stabilizzando i complessi della catena respiratoria e limitando la produzione patologica di ROS^55,56. La piattaforma di proteoliposomi ricostruiti descritta in questo studio fornisce un sistema controllato per verificare direttamente come rimodellamenti lipidici associati a malattie, mutazioni o interventi farmacologici alterino l'assemblaggio e la funzione dei supercomplessi, consentendo così studi meccanicistici sul malfunzionamento mitocondriale e contribuendo a definire future strategie terapeutiche.

Bassi tassi di consumo di ossigeno possono derivare da un'incorporazione inefficace nei supercomplessi, da una parziale dissociazione del CIV, da detergente residuo, da una concentrazione insufficiente di CoQ₁₀ o citocromo c, da NADH degradato o da una bassa concentrazione proteica nella camera dell'ossigrafo. Confermare il ripristino mediante saggio di galleggiamento o BN-PAGE, verificare l'integrità della membrana tramite il test di soppressione dell'ACMA, preparare NADH fresco e ottimizzare il rapporto proteina-lipidi, la concentrazione dei cofattori, la rimozione del detergente e la concentrazione del campione. I proteoliposomi permeabili possono essere causati da una rimozione incompleta del detergente, da una concentrazione eccessiva di detergente, da un trattamento troppo aggressivo, da cicli ripetuti di congelamento-scongelamento o da lipidi danneggiati. Se si osserva una perdita protonica nel saggio con ACMA, ripetere la rimozione del detergente utilizzando una colonna desaltante appena equilibrata, evitare di centrifugare eccessivamente la colonna, preparare liposomi freschi, ridurre al minimo lo stress meccanico e utilizzare i proteoliposomi immediatamente dopo la ricostituzione. L'aggregazione durante le fasi di concentrazione può verificarsi a causa di alte concentrazioni locali di proteina o detergente sulla membrana del concentratore. Concentrare i campioni in cicli brevi (10 min) di centrifugazione, risospendere delicatamente il campione tra una centrifugazione e l'altra, evitare la sovraconcentrazione, mantenere i campioni a 4 °C ed eliminare gli aggregati visibili mediante una chiarificazione a bassa velocità prima dell'uso successivo. Un comportamento di galleggiamento irregolare può riflettere una dimensione variabile dei liposomi, una rimozione incompleta del detergente, aggregazione, stratificazione scorretta dello zucchero o alterazione del gradiente durante il caricamento del campione o la raccolta delle frazioni. Preparare soluzioni fresche di saccarosio, stratificare i gradienti lentamente senza mescolare le interfacce, utilizzare liposomi uniformemente estrusi, mantenere costanti le condizioni di centrifugazione e raccogliere le frazioni delicatamente dall'alto verso il basso. Una scarsa distribuzione delle particelle in criomicroscopia elettronica può derivare da una bassa concentrazione di proteoliposomi, da aggregazione, da un'adsorbimento preferenziale al carbonio, da un bagnamento inadeguato della griglia, da ghiaccio troppo spesso o da un'eccessiva asciugatura. Ottimizzare la concentrazione di proteoliposomi, rimuovere gli aggregati prima della preparazione della griglia, regolare le condizioni di ionizzazione della griglia, testare la durata e la forza dell'asciugatura, valutare diversi tipi di griglie o supporti in carbonio e utilizzare campioni appena preparati ogni volta che possibile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (POPC)	Avanti Research	860320
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerolo-3-fosfoetanolamina (POPE)	Avanti Research	850757
1,3-bis(sn-3’-fosfotidil)-sn-glicerolo (cardiolipina, da tessuto cardiaco bovino)	Avanti Research	840012
2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico --- HEPES	Sigma-Aldrich	H23830
3-(N-morfolino)propanesolfonico (MOPS)	Sigma-Aldrich	M12545
3,3′-Diaminobenzidina ---- DABB	Sigma-Aldrich	D4293
Cianuro di carbonile m-clorofenilidrazone ---- CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
CHAPS	Sigma-Aldrich	220201
Cloroformio	Sigma-Aldrich	650948
Coenzima Q10	Sigma-Aldrich	C9538
Citocromo c da cuore equino	Sigma-Aldrich	C2506
Digitonina	Sigma-Aldrich	300410
Etileglicole-bis(2-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-tetraacetico --- EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Acido etilendiamminotetraacetico -- EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G7893
Glico-diosgenina	Anatrace	GDN101	detergente
Lauryl Maltosio Neopentil Glicole ---- LMNG	Sigma-Aldrich	NG310
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Myxotiazolo	Sigma-Aldrich	T5580
NADH, sale di sodio	Sigma-Aldrich	481913
Cloruro di nitrotetrazolio blu	Sigma-Aldrich	N6876
Piericidina A	Sigma-Aldrich	96861
Acetato di potassio	Sigma-Aldrich	P5708
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P3911
Ferricianuro di potassio	Sigma-Aldrich	702587
Fosfato monobasico di potassio ---- KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Azoturo di sodio	Sigma-Aldrich	S2002
Colato di sodio idrato	Sigma-Aldrich	C1254
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S9888
Ditionite di sodio	Sigma-Aldrich	71699
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378
TRIS	Sigma-Aldrich	T1503
ACMA (9-ammino-6cloro-2-metossiacridina)	Sigma-Aldrich	SML4162
Attrezzature e kit
Filtro centrifugo Amicon® Ultra, 100 kDa MWCO 0,5 mL	Millipore	UFC5100
Filtro centrifugo Amicon® Ultra, 100 kDa MWCO 15 mL	Millipore	UFC9100
Ultracentrifuga Beckman Optima TLX	Beckman Coulter
Gel BN-PAGE			gel di elettroforesi su poliacrilamide native blu
Ultracentrifuga Beckman Optima XE	Beckman Coulter
Sistema di pulizia a scarica al plasma			sistema di pulizia a scarica al plasma
Glacios 2 Cryo-TEM con rivelatore Gatan K3	Thermo Fisher Scientific		il microscopio elettronico a trasmissione
Set per omogenizzatore tissutale KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D9188
Plunger automatico Leica GP2	Leica
Microfuga 16	Beckman Coulter	A46474
Sistema di cromatografia NGC Discover 10	Bio-Rad	7880009
Oxygraph+			sistema con elettrodo per ossigeno
Colonna desaliante PD-10	Cytiva	28918007	colonna spin per esclusione dimensionale
Kit per saggio proteico Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	kit per saggio proteico con acido bicinconinico
Sonicatore Q-125	Q-sonica	Q125-110
Colonna Sephadex G-25 M			colonna spin desaliante preconfezionata con resina G-25
Lettore di micropiastre SpectraMax M2	Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GL	Cytiva	29091596	mezzo di filtrazione su agarosio reticolato
Pacchetto rotore fisso TLA-100.3	Beckman Coulter	349490
Rotore fisso Tipo 50.2 Ti	Beckman Coulter	337901
Acqua Milli-Q (MQ)			acqua ultrapura
Malvern Zetasizer ZS Spettroscopia di Correlazione della Luce Dinamica (DLS)	Malvern Paranytical
Sistema Hansatech Oxygraph+	Hansatech Instruments
Sistema PELCO easiGlow di pulizia a scarica al plasma	TED PELLA, INC
Sistema Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific		il congelatore per immersione
Griglie di rame Quantifoil R 1.2/1.3 da 300 mesh con 2 nm di carbonio	TED PELLA, INC	668-300-Cu-100	forate con rivestimento di carbonio
Miniestrusore Avanti	Avanti Lipids	610000