Questo studio presenta un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione che combina il prelievo e la lavorazione standardizzati del liquido di lavaggio broncoalveolare, un pannello a sette marcatori per citometria a flusso, un saggio multiplex per 13 analiti citochinici e una pipeline unificata di analisi.
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Articolo di ricerca
Visualizzazione integrata del reclutamento dei neutrofili e della profilazione delle citochine infiammatorie nel liquido di lavaggio broncoalveolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è la matrice di campionamento più direttamente accessibile per lo studio dell'infiammazione delle vie aeree inferiori, tuttavia le analisi convenzionali si basano su citometria a flusso a singolo marcatore combinata a saggio immunoenzimatico (ELISA) da marcatore a marcatore, un approccio che limita la densità informativa e oscura l'accoppiamento cellula-fattore. Questo studio presenta un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione che associa raccolta e pre-elaborazione standardizzate a un pannello citofluorimetrico a sette marcatori per neutrofili e monociti, a un saggio multiplex di citochine a 13 analiti e a una pipeline analitica unificata basata sull'approssimazione uniforme della varietà e sulla proiezione (UMAP), meta-clustering FlowSOM, clustering gerarchico, reti di correlazione di Spearman e analisi delle componenti principali (PCA).
Il flusso di lavoro è stato applicato a una coorte prospettica monocentrica di 112 adulti sottoposti a broncoscopia, composta da 64 pazienti con infezione polmonare confermata microbiologicamente e 48 controlli senza infezione. Gli esiti citologici e citometrici hanno rivelato un netto spostamento da un profilo alveolare dominato da macrofagi a uno dominato da neutrofili durante l'infezione, con la percentuale di neutrofili che aumentava da una mediana del 3,2% al 68,4% e la concentrazione assoluta di neutrofili che cresceva di circa 50 volte. Il profilo multiplex ha evidenziato una risposta coordinata di tre moduli di citochine, con i moduli chemochinico, proinfiammatorio e regolatorio tutti sovraespressi, mentre CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α e G-CSF mostravano la migliore capacità discriminatoria singola all'interno della coorte dello studio (area sotto la curva [AUC] da 0,89 a 0,94). La visualizzazione integrata mediante PCA, una matrice di correlazione e un grafo di rete ha rivelato un asse neutrofilo–chemochina strettamente accoppiato a livello individuale, con il conteggio di neutrofili nel lavaggio broncoalveolare che emergeva come nodo centrale della rete.
Il flusso di lavoro utilizza esclusivamente materiale ottenuto di routine dal lavaggio broncoalveolare indicato a scopo clinico, non richiede un volume aggiuntivo di campione e fornisce un quadro ricco di informazioni per risolvere l'infiammazione delle vie aeree nelle infezioni respiratorie, che potrebbe essere realizzabile nei laboratori di terzo livello dotati di citometria a flusso multiparametrica e piattaforme a matrice di microsferette multiplex, estendendosi a studi longitudinali, a livello di singola cellula e di valutazione terapeutica. Un'adozione clinica più ampia di singoli analiti come biomarcatori richiederà una validazione prospettica in coorti indipendenti multicentriche.
Introduzione
Le morti per infezioni delle basse vie respiratorie rimangono una causa significativa di mortalità globale, nonostante i progressi compiuti nelle strategie vaccinali e nelle modalità di trattamento; ciò continua a essere particolarmente vero tra le popolazioni pediatriche e anziane1. I neutrofili sono le cellule principali coinvolte nelle prime fasi della risposta immunitaria innata nel sistema respiratorio colpito, un processo fondamentale per eliminare il patogeno invasore; tuttavia, un'infiammazione neutrofila non controllata provoca la rottura della barriera capillare alveolare, danni ossidativi ai tessuti e lo sviluppo della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)2,3. I neutrofili nello spazio aereo polmonare mostrano inoltre cinetiche di reclutamento, schemi di ritenzione e comportamenti effetori diversi rispetto ad altri tessuti, e queste differenze influenzano se l'infezione si risolve o progredisce verso una polmonite grave4.
Il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è un'importante fonte di informazioni sull'ambiente microalveolare e offre la rappresentazione più accurata dell'immunità clinica in questo distretto5. Il chemochina CXCL8 svolge un ruolo essenziale nel reclutamento dei neutrofili nei polmoni attraverso i suoi recettori, CXCR1 e CXCR2, insieme ad altre chemochine, tra cui CXCL1, CXCL2 e CXCL56. Le citochine IL-1β, IL-6 e TNF-α potenziano ulteriormente questo processo, mentre l'IL-10 agisce come citochina antagonista. È stato dimostrato che i livelli di queste molecole nel BALF correlano con la gravità delle infezioni polmonari e con lo sviluppo di complicanze polmonari dovute a polmoniti batteriche, virali e atipiche7, e i profili multiplex dei biomarcatori nel BALF stanno venendo adottati per una diagnosi precoce e la discriminazione dei patogeni nelle infezioni del tratto respiratorio inferiore8.
I test standard dei LBA solitamente non riescono a comprendere appieno la biologia sottostante l'analisi. Il conteggio cellulare può essere stimato mediante differenziazione manuale delle cellule in campioni ottenuti con citocentrifuga, mentre i mediatori solubili vengono misurati utilizzando saggistica ELISA (saggio immunoenzimatico) individuali e presentati sotto forma di istogramma. Chemochine, citochine e ciascun tipo cellulare vengono valutati separatamente, senza stabilire alcuna correlazione tra un particolare gradiente di concentrazione di chemochina e le popolazioni cellulari che essa influenza nel campione. La combinazione di moduli di citochine, relazioni dose-risposta tra chemochine e neutrofili, e sottopopolazioni di pazienti con specifiche firme infiammatorie viene spesso trascurata in assenza di un'analisi multivariata9.
I progressi nel calcolo rendono un approccio così olistico sempre più realistico. Combinare la citometria a flusso multiparametrica e la citometria a flusso spettrale con metodi di riduzione della dimensionalità, come l'incorporamento stocastico di vicini distribuiti in modo t (t-SNE) o l'approssimazione uniforme della proiezione della varietà (UMAP), permette la mappatura di fenotipi immunitari ad alta dimensionalità in uno spazio bidimensionale, con UMAP che dimostra una migliore conservazione della topologia globale e una maggiore riproducibilità quando applicato ai dati di citometria10. Pannelli multianalita di citochine, seguiti da clustering gerarchico e reti di correlazione, aiutano a identificare firme correlate alla gravità non rilevabili con approcci basati su singole citochine11. Nonostante i progressi nel campo, nessun flusso di lavoro finora ha integrato questi metodi per studiare il reclutamento dei neutrofili e le firme citochiniche a partire dagli stessi campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) nelle infezioni respiratorie. Questo studio descrive un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione dell'analisi del reclutamento dei neutrofili mediante citologia e citometria a flusso multiparametrica, seguito da analisi UMAP e delle firme citochiniche tramite saggio immunoanalitico multiplex, con clustering gerarchico, matrici di correlazione e analisi delle componenti principali. Il flusso di lavoro produce una visualizzazione integrata che comprende letture immunitarie cellulari e solubili delle vie aeree in un unico grafico, utilizzando campioni di BALF ottenuti di routine durante broncoscopia clinicamente indicata in caso di infezione del tratto respiratorio inferiore.
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Protocollo
Popolazione dello studio ed etica
Questo è stato uno studio osservazionale prospettico monocentrico condotto in un ospedale universitario terziario tra gennaio 2026 e aprile 2026. Il protocollo è stato approvato con il numero di autorizzazione 2026HL-038, e il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni partecipante prima di qualsiasi procedura dello studio.
Sono stati reclutati consecutivamente adulti di età compresa tra 18 e 75 anni sottoposti a broncoscopia flessibile diagnostica con lavaggio broncoalveolare (BAL) nell'ambito dell'assistenza clinica di routine e assegnati a un gruppo di infezione o a un gruppo di controllo senza infezione in base alla diagnosi clinica e microbiologica finale. Una panoramica del flusso di lavoro integrato per la visualizzazione, dal reclutamento dei pazienti fino ai risultati visivi integrati, è mostrata in Figura 1.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro integrato di visualizzazione per il profilo basato sul BALF del reclutamento dei neutrofili e delle risposte infiammatorie delle citochine. Le cinque fasi riassumono, da sinistra a destra, il reclutamento prospettico dei gruppi di infezione e di controllo mediante broncoscopia e lavaggio broncoalveolare (BAL), la pre-elaborazione del BALF in un pellet cellulare e una frazione di supernatante, le misurazioni parallele cellulari (citologia con colorazione di Wright–Giemsa e citometria a flusso multiparametrica) e solubili (saggio immunoanalitico multiplex a 13 parametri basato su microsfere), la pipeline unificata di visualizzazione (UMAP con meta-clustering FlowSOM, mappa termica gerarchica, analisi delle componenti principali e rete di correlazione di Spearman) e l'output visivo integrato. Abbreviazioni: BAL = lavaggio broncoalveolare; BALF = liquido del lavaggio broncoalveolare; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I criteri di inclusione per il gruppo di infezione erano i seguenti: (1) pazienti diagnosticati con polmonite acquisita in comunità (CAP), polmonite acquisita in ospedale (HAP) o polmonite associata a ventilazione meccanica (VAP), secondo le linee guida della Infectious Diseases Society of America (IDSA) e dell'American Thoracic Society (ATS); (2) rilevamento di uno o più patogeni mediante coltura del lavaggio broncoalveolare (BALF) con ≥104 unità formanti colonie (CFU)/mL, reazione a catena della polimerasi (PCR) respiratoria multiplex, sequenziamento metagenomico di nuova generazione del BALF o test specifici per antigeni/anticorpi effettuati su campioni accoppiati di materiale respiratorio e siero.
I criteri per il gruppo di controllo erano i seguenti: (1) motivi non infettivi per la broncoscopia, costituiti dalla valutazione di un nodulo polmonare indeterminato, risultati radiologici anomali non suggestivi di infezione o esame per tosse cronica; (2) assenza di infezione polmonare acuta dimostrata da risultati negativi nei test microbiologici e mancanza di qualsiasi segno di infiammazione o infezione sistemica al momento della broncoscopia; e (3) assenza di assunzione di antibiotici nei 30 giorni precedenti la partecipazione. I controlli sono stati reclutati tra i pazienti sottoposti a broncoscopia per altre condizioni polmonari clinicamente motivate, piuttosto che tra volontari sani, riflettendo la popolazione da cui abitualmente si ottiene il BAL clinicamente indicato presso il centro dello studio.
I criteri di esclusione includevano: (1) neoplasia e/o chemioterapia citotossica nei sei mesi precedenti; (2) sieropositività per HIV; (3) trapianto di organo solido o di cellule staminali ematopoietiche; (4) terapia immunosoppressiva protratta che preveda una dose giornaliera di prednisone equivalente a > 0,3 mg/kg per più di 3 settimane; (5) donne in stato di gravidanza o in allattamento; (6) anamnesi di diatesi emorragica o di qualsiasi controindicazione alla broncoscopia flessibile; (7) malattia respiratoria cronica grave preesistente (malattia polmonare ostruttiva cronica [COPD] stadio III/IV secondo la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], fibrosi polmonare idiopatica, asma persistente grave o bronchiectasie clinicamente significative); (8) tubercolosi attiva; (9) partecipazione a un altro studio interventistico negli ultimi 30 giorni. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato eseguito durante la prima broncoscopia, entro 72 h dal ricovero per infezioni e entro 48 h dall'intubazione nei pazienti sottoposti a ventilazione meccanica con infezioni.
I calcoli della dimensione del campione si sono concentrati sull'esito cellulare primario: il numero di neutrofili nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) tra i gruppi. Considerando una dimensione dell'effetto prevista di 0,6 DS tra vie aeree infette e non infette, e tenendo conto di una tolleranza del 15% per le perdite, era necessaria una dimensione minima del campione di 45 soggetti per gruppo, con α bilaterale = 0,05 e potenza statistica dell'80%. Su 156 candidati idonei, 27 non soddisfacevano i requisiti di inclusione (18 non hanno soddisfatto i criteri di inclusione, principalmente a causa dell'impossibilità di identificare un agente patogeno responsabile della loro malattia entro il periodo stabilito o per mancato consenso alla procedura stessa; 9 non hanno rispettato i criteri di esclusione, principalmente a causa di neoplasia attiva o storia di somministrazione di chemioterapia, uso cronico di corticosteroidi, grave malattia polmonare cronica preesistente o diatesi emorragica). I restanti 129 partecipanti sono stati sottoposti a broncoscopia. Successivamente, 17 soggetti sono stati esclusi dallo studio (7 a causa di resa inadeguata di BALF < 40%; 4 per ritiro del consenso durante l'ospedalizzazione; e 6 per riclassificazione dei soggetti dopo la valutazione microbiologica finale – 4 candidati di controllo ai quali è stata diagnosticata un'infezione occulta in base ai risultati della coltura; e 2 candidati con infezione nei quali non è stata riscontrata evidenza di infezione dopo l'analisi colturale). Il gruppo finale di soggetti dello studio comprendeva 112 partecipanti: 64 con infezione e 48 senza.
Raccolta e pretrattamento del lavato broncoalveolare (BALF)
La broncoscopia è stata eseguita da operatori esperti seguendo il protocollo istituzionale standard, conforme alle raccomandazioni tecniche pubblicate per il lavaggio broncoalveolare12. È stata utilizzata lidocaina in modo topico e i pazienti hanno ricevuto una sedazione endovenosa moderata, con somministrazione di ossigeno supplementare per mantenere la saturazione di ossigeno (SpO₂) >92%. Il broncoscopio flessibile è stato inserito e posizionato nel segmento broncopolmonare che presentava anomalie radiologiche. Nei casi in cui le anomalie radiologiche erano diffuse o non localizzabili, sono stati scelti il segmento del lobo medio destro o del linguale sinistro. Dopo ogni instillazione, è stata effettuata un'aspirazione manuale delicata con pressione negativa < 100 mmHg. Sono state somministrate complessivamente da tre a cinque instillazioni di soluzione salina sterile a 37 °C, ciascuna da 20–40 mL, per un volume totale di 100–150 mL. Il rapporto di recupero è stato calcolato come volume recuperato rispetto al volume instillato; solo i campioni con un recupero ≥40% sono stati considerati idonei all'analisi.
I campioni raccolti dal secondo lavaggio in poi sono stati uniti in un unico pool al fine di ridurre la contaminazione bronchiale e ottenere un campione arricchito in alveoli. Il pool di fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è stato mantenuto sul ghiaccio ed elaborato entro 2 ore dalla raccolta, considerando i recenti dati riguardanti le variazioni nella composizione cellulare e nei conteggi differenziali dopo un prolungato stoccaggio e il riscaldamento di campioni umani di BALF13. Dopo la filtrazione attraverso una maglia sterile di nylon con pori da 70 micron per rimuovere il muco, effettuata esclusivamente mediante passaggio meccanico senza l’aggiunta di agenti mucolitici o anticonglomeranti come il ditiotreitolo, poiché test preliminari avevano dimostrato che questo metodo era sufficiente per eliminare i grumi di muco senza una perdita misurabile dell’integrità degli epitopi superficiali nelle analisi successive, il fluido è stato sottoposto a centrifugazione a 400 × g per 10 minuti a 4 °C. Il soprannatante è stato decantato e suddiviso in aliquote in crioprovette a bassa adesione proteica per l’analisi delle citochine, mentre le cellule sono state sospese in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) contenente 0,5% di albumina sierica bovina e 2 mM di etilendiamminotetraacido (EDTA), con una parte di queste riservata per citologia e citometria a flusso. I campioni per le citochine sono stati congelati in azoto liquido, conservati a –80 °C e sottoposti a non più di un singolo ciclo di congelamento-scongelamento prima dell’uso.
Citologia dei neutrofili e quantificazione mediante citometria a flusso
Per quanto riguarda la citopatologia, 100 µL di sospensione cellulare di LBA sono stati applicati su un vetrino utilizzando un citocentrifugo (vedere la Tabella dei Materiali) a 300 ×g per 5 minuti, lasciati asciugare all'aria e colorati con Wright-Giemsa. Il conteggio differenziale è stato effettuato da un tecnologo specializzato in ematologia, ignaro delle condizioni cliniche del paziente, che ha contato un minimo di 400 cellule per vetrino e calcolato le percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili ed eosinofili. Le percentuali di neutrofili nel LBA sono state considerate la misura principale dell'esito citopatologico, data l'evidenza attuale che ne suggerisce l'utilità nel distinguere le malattie polmonari infettive da quelle non infettive nei pazienti con infiltrati polmonari14.
Il protocollo di quantificazione mediante citometria a flusso si è basato su una recente validazione del protocollo di differenziazione dei leucociti nel lavaggio broncoalveolare (BALF) a quattro colori15 e ha incluso marcatori aggiuntivi per identificare i neutrofili. In particolare, circa 5 × 105 cellule isolate dal BALF sono state bloccate con un reagente per il blocco dei recettori Fc umani (vedere Tabella dei Materiali) per 10 min a 4 °C, quindi marcate per 20 min a 4 °C con anticorpi contro CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD11b (clone ICRF44), CD14 (clone M5E2) e HLA-DR (clone L243), oltre a un colorante vitalizio fissabile (vedere Tabella dei Materiali). Per la lisi dei globuli rossi, è stata utilizzata una soluzione commerciale per la lisi degli eritrociti (vedere Tabella dei Materiali) per 10 min a temperatura ambiente. Dopo la lisi degli eritrociti, le cellule sono state lavate due volte con PBS integrato con il 2% di siero fetale bovino e risospese nel buffer per citometria a flusso, quindi analizzate mediante un citometro a flusso multicolore (vedere Tabella dei Materiali). La compensazione è stata effettuata utilizzando perline di compensazione marcate singolarmente (vedere Tabella dei Materiali), e per ogni pannello sono stati inclusi campioni con fluorescenza meno uno e campioni non marcati.
Sono stati acquisiti almeno 1 × 105 eventi CD45⁺ per ogni campione. Sono stati innanzitutto selezionati i singoletti nel grafico FSC-A/FSC-H, seguiti dai leucociti CD45⁺ vitali (negativi al colorante di vitalità), quindi è stata eseguita l'esclusione dei monociti-macrofagi CD14⁺HLA-DR⁺ per selezionare i granulociti CD66b⁺ ad alto scattering laterale. I neutrofili sono stati quindi definiti all'interno della popolazione di granulociti come eventi CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. Questa prima finestra di selezione dei granulociti CD66b⁺ è stata tracciata in modo ampio attorno a tutti gli eventi ad alto scattering laterale, senza limitarsi al confine CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, in modo da mantenere all'interno del conteggio automatizzato totale dei neutrofili anche i neutrofili attivati CD16-dim e CD11b-alto e altre forme granulocitarie meno mature; la definizione più rigorosa CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ è stata applicata solo per caratterizzare il sottoinsieme di neutrofili maturi riportato separatamente nelle analisi di clustering successive. Il conteggio dei neutrofili nel LBA (cellule/µL) è stato stimato in base alla percentuale di neutrofili e al conteggio totale delle cellule nucleate determinato mediante un analizzatore ematologico automatico (vedere Tabella dei Materiali). Le matrici di compensazione, la strategia di gating e i rapporti di controllo qualità individuali dei campioni sono stati archiviati, e gli analisti sono rimasti ciechi rispetto alle assegnazioni dei gruppi dei partecipanti durante tutta la fase di acquisizione e analisi.
Profilazione multiplex delle citochine infiammatorie
I soprannatanti del lavaggio broncoalveolare sono stati scongelati una volta su ghiaccio fondente, seguiti da un breve vortexaggio e da una chiarificazione mediante centrifugazione a 10.000 × g per 5 min a 4 °C immediatamente prima del saggio. La misurazione di 13 analiti in tre categorie funzionali è stata effettuata utilizzando una piattaforma di saggio immunoanalitico multiplex basata su microsfere con un pannello personalizzato di microsfere magnetiche (vedere Tabella dei materiali). Il gruppo pro-infiammatorio comprendeva IL-1β, IL-6, IL-17A e TNF-α; il gruppo chemiotattico comprendeva CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 e CCL3/MIP-1α; e il gruppo regolatorio comprendeva IL-10, IFN-γ, IL-1RA e G-CSF. La scelta degli analiti si è basata su quelli più comunemente riportati come informativi nelle analisi multiplex di citochine nel liquido di lavaggio broncoalveolare o nel siero in studi su polmonite/infezioni respiratorie gravi.7,11. Il fattore di diluizione (1:2 nel buffer del saggio) è stato determinato da un esperimento pilota condotto su un sottoinsieme rappresentativo di campioni infetti e di controllo per garantire che >Il 90% delle misurazioni è risultato entro la curva standard.
Le curve standard sono state determinate utilizzando diluizioni seriali a sette punti degli standard ricombinanti del produttore, preparate in duplicato su ogni piastra, inclusa una pozzetta vuota per sottrarre il fondo. L'adattamento della curva è stato effettuato mediante regressione logistica a cinque parametri (5PL) tramite il software proprietario dello strumento per l'acquisizione e l'analisi (vedere Tabella dei Materiali). Il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) è stato calcolato come la quantità minima di standard che produce un recupero di retro-quantificazione compreso tra l'80% e il 120% e un coefficiente di variazione intrarun (CV) ≤ 20%. I valori al di sotto del LLOQ sono stati sostituiti con LLOQ/√2. Due campioni di controllo qualitativo di fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), ciascuno proveniente da un paziente infetto rappresentativo e da un soggetto non colpito, sono stati aliquotati e aggiunti a ogni piastra per monitorare le prestazioni nel lungo periodo. Gli standard di assicurazione qualitativa si basavano su raccomandazioni basate sulle migliori pratiche derivanti da un programma pluriennale (12 anni) di valutazione dell'abilità in saggi multiplex basati su microsfere in più sedi16, inclusi i requisiti per un CV intra-saggio ≤ 10% in pozzette duplicate, un CV inter-piastra ≤ 20% per il controllo qualità e un conteggio minimo di microsfere ≥ 50 per analita per pozzetta. Le piastre che non soddisfacevano i criteri sopra indicati sono state ripetute. L'analisi è stata eseguita in un unico lotto entro quattro settimane, utilizzando un unico lotto di kit, con un'intercalazione casuale dei campioni di infezione e dei controlli.
Pipeline di analisi per la visualizzazione
I file Flow Cytometry Standard (FCS) sono stati inizialmente analizzati utilizzando un software commerciale per la citometria a flusso (vedi Tabella dei Materiali) per compensare e selezionare i singoletti vitali CD45⁺, quindi esportati per un'analisi imparziale in R v4.4. Per ogni campione, sono stati sottocampionati 10.000 eventi CD45⁺ e concatenati, e le intensità del segnale sono state trasformate mediante la funzione arcsinh con un coefficiente di 150. La riduzione dimensionale e le proiezioni UMAP sono state effettuate utilizzando il pacchetto uwot con 15 vicini più prossimi e una distanza minima di 0,1, insieme a embedding t-SNE paralleli utilizzando il pacchetto Rtsne con perplessità 3010I cluster fenotipici sono stati identificati utilizzando FlowSOM con 100 nodi della mappa auto-organizzante e ulteriormente suddivisi in 12-15 cluster mediante meta-clustering, tramite un approccio basato sull'ottimizzazione recentemente validato per dati citometrici ad alta dimensione.17Ogni cluster è stato annotato in base all'espressione mediana dei marcatori di linea e di attivazione e confrontato con i gate manuali.
Per l'analisi dei dati multiplex delle citochine, i valori grezzi sono stati prima trasformati in log₁₀ e poi standardizzati tra gli analiti mediante z-score prima di ulteriori analisi. Sia gli analiti che i pazienti sono stati sottoposti a clustering gerarchico utilizzando la distanza euclidea e il collegamento Ward.D2; i risultati sono stati visualizzati in una mappa termica con cluster per righe e colonne. Tale approccio è stato utilizzato per identificare moduli di citochine co-espressi e classificare sottogruppi di pazienti in coorti infiammatorie multiplex9. Sono state generate matrici di correlazione per tutti i biomarcatori cellulari e solubili utilizzando correlazioni di rango di Spearman pairwise. Le mappe termiche delle matrici di correlazione sono state rappresentate accanto a una rete in cui i nodi corrispondono ai biomarcatori e gli archi indicano correlazioni che hanno superato la correzione per confronti multipli mediante il metodo di Benjamini–Hochberg (BH). La larghezza degli archi è stata scalata in base all'entità del coefficiente di correlazione |ρ|, e gli archi sono stati inclusi solo se |ρ| ≥ 0,30 e p < 0,05 dopo la correzione. L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita sulla matrice standardizzata contenente cellule e citochine utilizzando la funzione prcomp() con scala di varianza unitaria. I partecipanti sono stati proiettati sulle prime due componenti principali, con i gruppi di infezione e controllo sovrapposti. Un campionamento ridotto e una standardizzazione costanti di tutte le analisi hanno garantito la confrontabilità tra i risultati dei biomarcatori cellulari e solubili in tutte le visualizzazioni.
Analisi statistica
Le variabili continue sono state descritte mediante la mediana (intervallo interquartile, IQR) quando non normali secondo il test di Shapiro–Wilk, e la media (deviazione standard, SD) in caso contrario. Le variabili categoriche sono state descritte mediante frequenze e proporzioni. I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando il test di Mann–Whitney U test quando le variabili continue presentavano distribuzioni non normali, il test di Welch t-test quando le variabili continue erano distribuite normalmente, e test del chi-quadrato/test esatto di Fisher quando applicabile per le variabili categoriali. Le associazioni tra le variabili continue sono state valutate mediante il coefficiente di correlazione dei ranghi di Spearman. Per tenere conto del tasso di falsa scoperta (FDR) nelle analisi multiplex delle citochine e nelle analisi di correlazione, i valori-p sono stati corretti utilizzando il metodo di Benjamini–Hochberg con una soglia di q < 0,05. A due code p < Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo in tutte le analisi primarie. Ove possibile, i casi con dati mancanti per singole variabili sono stati mantenuti e analizzati mediante analisi dei casi completi per la variabile interessata, mentre sono state effettuate imputazioni multiple mediante equazioni concatenate (m = 20) per condurre analisi di sensibilità. Sono state generate curve ROC (receiver operating characteristic) e l'area corrispondente sotto la curva (AUC) per singole citochine utilizzando il pacchetto pROC nell'intero coorte dello studio; non è stato utilizzato un coorte separato di validazione esterna. Analisi di sensibilità predefinite hanno ripetuto i confronti tra i gruppi principali escludendo i partecipanti che avevano ricevuto antibiotici entro 72 ore prima della broncoscopia e stratificando il gruppo con infezione in base allo stato di ventilazione meccanica e al sottotipo di polmonite (acquisita in comunità, acquisita in ospedale o associata a ventilazione). Le analisi sono state eseguite utilizzando i pacchetti rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC e mice in R v4.4. Le figure sono state generate utilizzando software commerciale per grafici scientifici (vedere Tabella dei Materiali).
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Risultati
Caratteristiche della popolazione studiata e del campione
Nella coorte di analisi finale erano inclusi 112 soggetti, di cui 64 nel gruppo con infezione e 48 nel gruppo di controllo senza infezione. Le caratteristiche demografiche basali erano simili tra i gruppi, mentre i parametri di laboratorio correlati all'infezione risultavano più elevati nel gruppo con infezione, come mostrato nella Tabella 1. Le infezioni erano principalmente causate da batteri Gram-neg...
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Discussione
La robustezza di questo protocollo dipende da alcune decisioni prese prima e durante l'analisi. Stabilire una soglia minima di recupero del 40% e combinare la seconda aliquota e quelle successive è stata una scelta intenzionale, poiché la prima aliquota contiene un arricchimento maggiore di materiale delle vie aeree bronchiali, mentre la percentuale di recupero varia sistematicamente con l'età, il sesso, la storia del fumo e il bronco bersaglio18. È fondamentale bloccare i recettori Fc e titolare ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo sinceramente tutti i pazienti e i volontari che hanno partecipato a questo studio per la loro preziosa collaborazione. Riconosciamo con gratitudine il Comitato Etico per l'approvazione etica (Numero di approvazione 2026HL-038) e per le indicazioni normative fornite durante l'intero processo di ricerca.
Ringraziamo il personale medico del Dipartimento di Pneumologia, del Centro di Broncoscopia e del Laboratorio Clinico per il supporto nella raccolta dei campioni clinici, nell'elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare e nel rilevamento microbiologico. Apprezziamo inoltre il supporto tecnico fornito dal laboratorio centrale dell'ospedale per gli esperimenti di citometria a flusso ad alta dimensione e di profilazione multiplex delle citochine.
Questa ricerca non ha ricevuto alcun contributo specifico da agenzie di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro.
Ringraziamo tutti i ricercatori, tecnici e personale infermieristico coinvolti in questo progetto per i loro sforzi nella selezione dei pazienti, gestione dei campioni, esecuzione degli esperimenti e organizzazione dei dati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-umano CD11b, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marcatore di attivazione dei neutrofili; canale laser violetto URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD14, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marcatore di esclusione monocita-macrofago; canale laser rosso URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD15, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marcatore di linea neutrofila; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD16, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marcatore di maturazione dei neutrofili e delle cellule NK; canale laser violetto URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD45, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Marcatore pan-leucocitario; canale laser blu URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anticorpo anti-umano CD66b, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Marcatore dei granulociti; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marcatore delle cellule presentanti l'antigene; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Analizzatore ematologico automatico (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Strumento (modello XN-1000) | Utilizzato per determinare il conteggio assoluto delle cellule nucleate per il calcolo dei neutrofili assoluti URL: https://www.sysmex.com |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Utilizzata nel tampone di colorazione per citofluorimetria (0,5% p/v in PBS con 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| Pacchetto ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Progetto Bioconductor | v2.20 (open-source) | Utilizzato per realizzare heatmap di clustering gerarchico dei dati multiplex delle citochine URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Citocentrifuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Utilizzata per preparare vetrini citologici dalla sospensione cellulare di lavaggio broncoalveolare (BALF) URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Soluzione emolitica per eritrociti (BD FACS Lysing Solution, concentrato 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Utilizzata per la lisi degli eritrociti dopo la colorazione superficiale URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Utilizzato nel tampone di colorazione per citofluorimetria alla concentrazione di 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Colorante vitalizio fissabile (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Esclusione di cellule morte prima del gating; canale laser rosso URL: https://www.biolegend.com |
| Endoscopio video flessibile | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Strumento (modello BF-1TQ290) | Utilizzato per il lavaggio broncoalveolare (BAL) sotto sedazione moderata URL: https://www.olympus-global.com |
| Citometro a flusso multicolore (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Strumento (modello CytoFLEX LX, configurazione a sei laser) | Utilizzato per l'acquisizione del pannello citofluorimetrico a sette marcatori per neutrofili/monociti URL: https://www.beckman.com |
| Software di analisi citofluorimetrica (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Utilizzato per la compensazione e il gating manuale dei file FCS URL: https://www.flowjo.com |
| Pacchetto FlowSOM (R/Bioconductor) | Progetto Bioconductor | v2.12 (open-source) | Utilizzato per il clustering con mappa auto-organizzante e il meta-clustering dei dati citofluorimetrici URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (software di grafica statistica) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Utilizzato per generare le figure finali URL: https://www.graphpad.com |
| Reagente bloccante per recettori Fc umani (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Blocco dei recettori Fc prima della colorazione con anticorpi URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| Pacchetto igraph (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | Utilizzato per costruire e visualizzare il grafico della rete di correlazione URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Vasetti criogenici da 2,0 mL a bassa adesione proteica | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Utilizzati per aliquote del supernatante di BALF destinate all'analisi delle citochine URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Piattaforma per saggio immunoanalitico multiplex basato su microsfere (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Strumento (modello MAGPIX) | Utilizzata per l'acquisizione del saggio multiplex delle citochine URL: https://www.luminexcorp.com |
| Soluzione di colorazione di May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Utilizzata per il conteggio differenziale cellulare su citospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| Pacchetto mice (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | Utilizzato per l'imputazione multipla mediante equazioni concatenate nell'analisi di sensibilità URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Pannello multiplex magnetico per citochine/chemochine (13-plex, personalizzato; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Pannello personalizzato per la misurazione dei 13 analiti descritti nella Sezione 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| Setaccio in nylon per cellule, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Utilizzato per la filtrazione meccanica del BALF per rimuovere grumi di muco URL: https://www.corning.com |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Tampone di base per la risospensione e la colorazione cellulare URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Pacchetto pROC (R) | CRAN | v1.18 (open-source) | Utilizzato per generare curve ROC e valori AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (ambiente di calcolo statistico) | Team R Core | v4.4 (open-source) | Piattaforma per analisi statistiche e visualizzazioni URL: https://www.r-project.org |
| Pacchetto rstatix (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | Utilizzato per confronti tra gruppi e analisi statistiche di correlazione URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Pacchetto Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | Utilizzato per le rappresentazioni t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Microsfere di compensazione monocolorate (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Utilizzate come controlli di compensazione monocromatica URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Soluzione di cloruro di sodio per iniezione, 0,9% (soluzione salina sterile) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Utilizzata per l'instillazione nel lavaggio broncoalveolare (100–150 mL, aliquote da 20–40 mL a 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| Pacchetto uwot (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | Utilizzato per la riduzione dimensionale UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software per l'acquisizione e l'adattamento delle curve nei saggi multiplex) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Software proprietario dello strumento per l'adattamento delle curve standard a 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
Riferimenti
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.
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