Questo studio presenta un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione che combina il prelievo e la lavorazione standardizzati del liquido di lavaggio broncoalveolare, un pannello a sette marcatori per citometria a flusso, un saggio multiplex per 13 analiti citochinici e una pipeline unificata di analisi.
Articolo di ricerca
Visualizzazione integrata del reclutamento dei neutrofili e della profilazione delle citochine infiammatorie nel liquido di lavaggio broncoalveolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è la matrice di campionamento più direttamente accessibile per lo studio dell'infiammazione delle vie aeree inferiori, tuttavia le analisi convenzionali si basano su citometria a flusso a singolo marcatore combinata a saggio immunoenzimatico (ELISA) da marcatore a marcatore, un approccio che limita la densità informativa e oscura l'accoppiamento cellula-fattore. Questo studio presenta un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione che associa raccolta e pre-elaborazione standardizzate a un pannello citofluorimetrico a sette marcatori per neutrofili e monociti, a un saggio multiplex di citochine a 13 analiti e a una pipeline analitica unificata basata sull'approssimazione uniforme della varietà e sulla proiezione (UMAP), meta-clustering FlowSOM, clustering gerarchico, reti di correlazione di Spearman e analisi delle componenti principali (PCA).
Il flusso di lavoro è stato applicato a una coorte prospettica monocentrica di 112 adulti sottoposti a broncoscopia, composta da 64 pazienti con infezione polmonare confermata microbiologicamente e 48 controlli senza infezione. Gli esiti citologici e citometrici hanno rivelato un netto spostamento da un profilo alveolare dominato da macrofagi a uno dominato da neutrofili durante l'infezione, con la percentuale di neutrofili che aumentava da una mediana del 3,2% al 68,4% e la concentrazione assoluta di neutrofili che cresceva di circa 50 volte. Il profilo multiplex ha evidenziato una risposta coordinata di tre moduli di citochine, con i moduli chemochinico, proinfiammatorio e regolatorio tutti sovraespressi, mentre CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α e G-CSF mostravano la migliore capacità discriminatoria singola all'interno della coorte dello studio (area sotto la curva [AUC] da 0,89 a 0,94). La visualizzazione integrata mediante PCA, una matrice di correlazione e un grafo di rete ha rivelato un asse neutrofilo–chemochina strettamente accoppiato a livello individuale, con il conteggio di neutrofili nel lavaggio broncoalveolare che emergeva come nodo centrale della rete.
Il flusso di lavoro utilizza esclusivamente materiale ottenuto di routine dal lavaggio broncoalveolare indicato a scopo clinico, non richiede un volume aggiuntivo di campione e fornisce un quadro ricco di informazioni per risolvere l'infiammazione delle vie aeree nelle infezioni respiratorie, che potrebbe essere realizzabile nei laboratori di terzo livello dotati di citometria a flusso multiparametrica e piattaforme a matrice di microsferette multiplex, estendendosi a studi longitudinali, a livello di singola cellula e di valutazione terapeutica. Un'adozione clinica più ampia di singoli analiti come biomarcatori richiederà una validazione prospettica in coorti indipendenti multicentriche.
Introduzione
Le morti per infezioni delle basse vie respiratorie rimangono una causa significativa di mortalità globale, nonostante i progressi compiuti nelle strategie vaccinali e nelle modalità di trattamento; ciò continua a essere particolarmente vero tra le popolazioni pediatriche e anziane1. I neutrofili sono le cellule principali coinvolte nelle prime fasi della risposta immunitaria innata nel sistema respiratorio colpito, un processo fondamentale per eliminare il patogeno invasore; tuttavia, un'infiammazione neutrofila non controllata provoca la rottura della barriera capillare alveolare, danni ossidativi ai tessuti e lo sviluppo della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)2,3. I neutrofili nello spazio aereo polmonare mostrano inoltre cinetiche di reclutamento, schemi di ritenzione e comportamenti effetori diversi rispetto ad altri tessuti, e queste differenze influenzano se l'infezione si risolve o progredisce verso una polmonite grave4.
Il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è un'importante fonte di informazioni sull'ambiente microalveolare e offre la rappresentazione più accurata dell'immunità clinica in questo distretto5. Il chemochina CXCL8 svolge un ruolo essenziale nel reclutamento dei neutrofili nei polmoni attraverso i suoi recettori, CXCR1 e CXCR2, insieme ad altre chemochine, tra cui CXCL1, CXCL2 e CXCL56. Le citochine IL-1β, IL-6 e TNF-α potenziano ulteriormente questo processo, mentre l'IL-10 agisce come citochina antagonista. È stato dimostrato che i livelli di queste molecole nel BALF correlano con la gravità delle infezioni polmonari e con lo sviluppo di complicanze polmonari dovute a polmoniti batteriche, virali e atipiche7, e i profili multiplex dei biomarcatori nel BALF stanno venendo adottati per una diagnosi precoce e la discriminazione dei patogeni nelle infezioni del tratto respiratorio inferiore8.
I test standard dei LBA solitamente non riescono a comprendere appieno la biologia sottostante l'analisi. Il conteggio cellulare può essere stimato mediante differenziazione manuale delle cellule in campioni ottenuti con citocentrifuga, mentre i mediatori solubili vengono misurati utilizzando saggistica ELISA (saggio immunoenzimatico) individuali e presentati sotto forma di istogramma. Chemochine, citochine e ciascun tipo cellulare vengono valutati separatamente, senza stabilire alcuna correlazione tra un particolare gradiente di concentrazione di chemochina e le popolazioni cellulari che essa influenza nel campione. La combinazione di moduli di citochine, relazioni dose-risposta tra chemochine e neutrofili, e sottopopolazioni di pazienti con specifiche firme infiammatorie viene spesso trascurata in assenza di un'analisi multivariata9.
I progressi nel calcolo rendono un approccio così olistico sempre più realistico. Combinare la citometria a flusso multiparametrica e la citometria a flusso spettrale con metodi di riduzione della dimensionalità, come l'incorporamento stocastico di vicini distribuiti in modo t (t-SNE) o l'approssimazione uniforme della proiezione della varietà (UMAP), permette la mappatura di fenotipi immunitari ad alta dimensionalità in uno spazio bidimensionale, con UMAP che dimostra una migliore conservazione della topologia globale e una maggiore riproducibilità quando applicato ai dati di citometria10. Pannelli multianalita di citochine, seguiti da clustering gerarchico e reti di correlazione, aiutano a identificare firme correlate alla gravità non rilevabili con approcci basati su singole citochine11. Nonostante i progressi nel campo, nessun flusso di lavoro finora ha integrato questi metodi per studiare il reclutamento dei neutrofili e le firme citochiniche a partire dagli stessi campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) nelle infezioni respiratorie. Questo studio descrive un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione dell'analisi del reclutamento dei neutrofili mediante citologia e citometria a flusso multiparametrica, seguito da analisi UMAP e delle firme citochiniche tramite saggio immunoanalitico multiplex, con clustering gerarchico, matrici di correlazione e analisi delle componenti principali. Il flusso di lavoro produce una visualizzazione integrata che comprende letture immunitarie cellulari e solubili delle vie aeree in un unico grafico, utilizzando campioni di BALF ottenuti di routine durante broncoscopia clinicamente indicata in caso di infezione del tratto respiratorio inferiore.
Protocollo
Popolazione in studio e aspetti etici
Questo è stato uno studio osservazionale prospettico monocentrico condotto in un ospedale universitario terziario tra gennaio 2026 e aprile 2026. Il protocollo è stato approvato con il numero di autorizzazione 2026HL-038, e il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni partecipante prima di qualsiasi procedura dello studio.
Sono stati reclutati consecutivamente adulti di età compresa tra 18 e 75 anni sottoposti a broncoscopia flessibile diagnostica con lavaggio broncoalveolare (BAL) nell'ambito delle cure cliniche di routine e assegnati a un gruppo di infezione o a un gruppo di controllo senza infezione in base alla diagnosi clinica e microbiologica finale. Una panoramica del flusso di lavoro integrato per la visualizzazione, dal reclutamento dei pazienti fino agli output visivi integrati, è mostrata in Figura 1.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro integrato per la visualizzazione del profilo basato sul BALF relativo al reclutamento dei neutrofili e alle risposte citochiniche infiammatorie. Le cinque fasi riassumono, da sinistra a destra, il reclutamento prospettico dei gruppi di infezione e di controllo mediante broncoscopia e lavaggio broncoalveolare (BAL), la pre-elaborazione del BALF in un pellet cellulare e una frazione di supernatante, le analisi parallele a livello cellulare (citologia con colorazione Wright-Giemsa e citometria a flusso multiparametrica) e solubile (saggio immunoanalitico multiplex a base di microsfere 13-plex), la pipeline unificata di visualizzazione (UMAP con meta-clustering FlowSOM, mappa termica gerarchica, analisi delle componenti principali e rete di correlazione di Spearman) e l'output visivo integrato. Abbreviazioni: BAL = lavaggio broncoalveolare; BALF = fluido di lavaggio broncoalveolare; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I criteri di inclusione per il gruppo di infezione erano i seguenti: (1) pazienti diagnosticati con polmonite acquisita in comunità (CAP), polmonite acquisita in ospedale (HAP) o polmonite associata a ventilazione meccanica (VAP) secondo le linee guida della Infectious Diseases Society of America (IDSA) e dell'American Thoracic Society (ATS); (2) rilevamento di uno o più patogeni mediante coltura del lavaggio broncoalveolare (BALF) con almeno ≥104 unità formanti colonie (CFU)/mL, reazione a catena della polimerasi (PCR) respiratoria multiplex, sequenziamento metagenomico di nuova generazione del BALF o test specifici per antigeni/anticorpi su campioni respiratori/serici accoppiati.
I criteri per il gruppo di controllo erano i seguenti: (1) motivi non infettivi per la broncoscopia, costituiti dalla valutazione di un nodulo polmonare indeterminato, risultati radiologici anomali non suggestivi di infezione o esame per tosse cronica; (2) assenza di infezione polmonare acuta dimostrata da risultati negativi nei test microbiologici e mancanza di qualsiasi segno di infiammazione o infezione sistemica al momento della broncoscopia; e (3) assenza di assunzione di antibiotici nei 30 giorni precedenti la partecipazione. I controlli sono stati reclutati tra pazienti sottoposti a broncoscopia per altre condizioni polmonari clinicamente motivate, piuttosto che tra volontari sani, riflettendo la popolazione da cui abitualmente si ottiene il BAL clinicamente indicato presso il centro dello studio.
I criteri di esclusione includevano: (1) neoplasia e/o chemioterapia citotossica nei sei mesi precedenti; (2) sieropositività per HIV; (3) trapianto di organo solido o di cellule staminali ematopoietiche; (4) terapia immunosoppressiva protratta che preveda una dose giornaliera equivalente di prednisone > 0,3 mg/kg per più di 3 settimane; (5) donne in stato di gravidanza o in allattamento; (6) anamnesi di diatesi emorragica o di qualsiasi controindicazione alla broncoscopia flessibile; (7) malattia respiratoria cronica preesistente grave (malattia polmonare ostruttiva cronica [COPD] stadio III/IV secondo l’iniziativa globale per la malattia polmonare ostruttiva cronica [GOLD], fibrosi polmonare idiopatica, asma grave persistente o bronchiectasie clinicamente significative); (8) tubercolosi attiva; (9) partecipazione a un altro studio interventistico negli ultimi 30 giorni. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato eseguito durante la prima broncoscopia, entro 72 ore dall’ammissione per infezioni e entro 48 ore dall’intubazione nei pazienti sottoposti a ventilazione meccanica con infezioni.
I calcoli della dimensione del campione si sono concentrati sull'esito cellulare primario: il numero di neutrofili nel lavaggio broncoalveolare (BALF) tra i gruppi. Considerando un effetto atteso di 0,6 DS tra vie aeree infette e non infette, e prevedendo una tolleranza del 15% per le perdite, era necessaria una dimensione minima del campione di 45 soggetti per gruppo, con α bilaterale = 0,05 e potenza statistica dell'80%. Su 156 candidati idonei, 27 non soddisfacevano i requisiti di inclusione (18 non hanno soddisfatto i criteri di inclusione, principalmente a causa dell'impossibilità di identificare un agente patogeno responsabile della malattia entro il periodo stabilito o per mancato consenso alla procedura stessa; 9 non hanno rispettato i criteri di esclusione, principalmente per presenza di neoplasia attiva o storia di somministrazione di chemioterapia, uso cronico di corticosteroidi, grave malattia polmonare cronica preesistente o diatesi emorragica). I restanti 129 partecipanti sono stati sottoposti a broncoscopia. Successivamente, 17 soggetti sono stati esclusi dallo studio (7 a causa di resa inadeguata di BALF < 40%; 4 per ritiro del consenso durante il ricovero; e 6 per riclassificazione dei soggetti dopo la valutazione microbiologica finale – 4 candidati del gruppo di controllo ai quali è stata diagnosticata un'infezione occulta in base ai risultati della coltura; e 2 candidati del gruppo infetto nei quali non è stata riscontrata evidenza di infezione dopo l'analisi colturale). Il campione finale di soggetti dello studio comprendeva 112 partecipanti: 64 con infezione e 48 senza.
Raccolta e preelaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF)
La broncoscopia è stata eseguita da operatori esperti seguendo il protocollo istituzionale standard, conforme alle raccomandazioni tecniche pubblicate per il lavaggio broncoalveolare12. È stata utilizzata lidocaina in modo topico e ai pazienti è stata somministrata una sedazione endovenosa moderata, fornendo ossigeno supplementare per mantenere la saturazione di ossigeno (SpO₂) >92%. Il broncoscopio flessibile è stato inserito e posizionato nel segmento broncopolmonare con anomalie radiologiche. Nei casi in cui le anomalie radiologiche erano diffuse o non localizzabili, sono stati scelti il lobo medio destro o i segmenti linguali sinistri. Dopo ogni instillazione, è stata effettuata un'aspirazione manuale delicata con una pressione negativa < 100 mmHg. Sono state somministrate complessivamente da tre a cinque instillazioni di soluzione salina sterile a 37 °C, ciascuna di 20–40 mL, per un volume totale di 100–150 mL. Il rapporto di recupero è stato calcolato come volume recuperato rispetto al volume instillato e solo i campioni con un recupero ≥40% sono stati considerati per l'analisi.
I campioni raccolti dai secondi e successivi lavaggi sono stati combinati per ridurre la contaminazione bronchiale e ottenere un campione arricchito in alveoli. Il pool di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) è stato mantenuto sul ghiaccio ed elaborato entro 2 h dalla raccolta, considerando le recenti evidenze riguardo ai cambiamenti nella composizione cellulare e nei conteggi differenziali dopo un prolungato stoccaggio e riscaldamento di campioni umani di BALF13. Dopo la filtrazione mediante una maglia sterile di nylon con una dimensione dei pori di 70 micrometri per rimuovere il muco, effettuata esclusivamente mediante passaggio meccanico senza aggiunta di agenti mucolitici o anticonglomeranti come il dithiotreitolo, poiché test preliminari avevano dimostrato che ciò era sufficiente per rimuovere i grumi di muco senza una perdita misurabile dell'integrità degli epitopi superficiali nelle fasi successive, il fluido è stato sottoposto a centrifugazione a 400 × g per 10 min a 4 °C. Il soprannatante è stato decantato e suddiviso in aliquote in crioprovette a bassa adesione proteica per l'analisi delle citochine, mentre le cellule sono state sospese in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) contenente albumina sierica bovina allo 0,5% e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), con una parte conservata per citologia e citometria a flusso. I campioni per l'analisi delle citochine sono stati congelati in azoto liquido, mantenuti a –80 °C e sottoposti a non più di un ciclo di congelamento-scongelamento prima dell'uso.
Citologia dei neutrofili e quantificazione mediante citometria a flusso
Per quanto riguarda la citopatologia, 100 µL della sospensione cellulare del LBA sono stati applicati su un vetrino utilizzando un citocentrifugo (vedere Tabella dei Materiali) a 300 ×g per 5 minuti, essiccati all'aria e colorati con Wright-Giemsa. Il conteggio differenziale è stato eseguito da un tecnologo ematologo a conoscenza non del quadro clinico del paziente, il quale ha contato un minimo di 400 cellule per vetrino e calcolato le percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili ed eosinofili. Le percentuali di neutrofili nel LBA sono state considerate la misura principale dell'esito citopatologico, alla luce delle attuali evidenze che ne suggeriscono l'utilità nel distinguere le malattie polmonari infettive da quelle non infettive nei pazienti con infiltrati polmonari14.
Il protocollo di quantificazione mediante citometria a flusso si basava su una recente validazione del protocollo di differenziazione dei leucociti nel lavaggio broncoalveolare (BALF) a quattro colori15 ed includeva marcatori aggiuntivi per identificare i neutrofili. In particolare, circa 5 × 105 cellule isolate dal BALF sono state bloccate con un reagente bloccante per il recettore Fc umano (vedere Tabella dei Materiali) per 10 min a 4 °C, quindi marcate per 20 min a 4 °C con anticorpi diretti contro CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD11b (clone ICRF44), CD14 (clone M5E2) e HLA-DR (clone L243), oltre a un colorante vitalizio fissabile (vedere Tabella dei Materiali). Per la lisi dei globuli rossi, è stata utilizzata una soluzione commerciale per la lisi degli eritrociti (vedere Tabella dei Materiali) per 10 min a temperatura ambiente. Dopo la lisi eritrocitaria, le cellule sono state lavate due volte con PBS integrato con siero fetale bovino al 2% e sospese nel buffer per citometria a flusso, quindi analizzate mediante un citometro a flusso multicolore (vedere Tabella dei Materiali). La compensazione è stata effettuata utilizzando perline di compensazione singolarmente marcate (vedere Tabella dei Materiali), e per ogni pannello sono stati inclusi tubi con fluorescenza meno uno e tubi non marcati.
Almeno 1 × 105 CD45⁺ gli eventi sono stati acquisiti per ogni campione. Sono stati innanzitutto selezionati i singoletti nel grafico FSC-A/FSC-H, seguiti dai campioni vitali (colorante per la vitalità)⁻CD45⁺ leucociti, dopo di che esclusione di CD14⁺HLA-DR⁺ monociti-macrofagi è stato eseguito per selezionare gli scatter laterali alti CD66b⁺ granulociti. I neutrofili sono stati quindi definiti all'interno della popolazione di granulociti come CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ eventi. Questo CD66b primario⁺ la finestra dei granulociti è stata tracciata in modo ampio attorno a tutti gli eventi con elevata diffusione laterale, invece di essere limitata al CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ limite, in modo che i neutrofili attivati CD16-dim, CD11b-alto e altre forme granulocitarie meno mature rimanessero inclusi nel conteggio totale automatizzato dei neutrofili; il più rigoroso CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ la definizione è stata applicata solo per caratterizzare il sottoinsieme di neutrofili maturi riportato separatamente nelle analisi di clustering successive. Il conteggio dei neutrofili nel LBA (cellule/µL) è stato stimato in base alla percentuale di neutrofili e al conte totale di cellule nucleate determinato mediante un analizzatore ematologico automatico (vedi Tabella dei materiali). Le matrici di compensazione, la strategia di gating e i rapporti di controllo qualità dei singoli campioni sono stati archiviati, e gli analisti sono rimasti ciechi rispetto all'assegnazione dei gruppi dei partecipanti durante tutta la fase di acquisizione e analisi.
Profilazione multiplex delle citochine infiammatorie
I supernatanti del BALF sono stati scongelati una volta su ghiaccio umido, seguiti da un breve vortexaggio e da una chiarificazione mediante centrifugazione a 10.000 × g per 5 min a 4 °C immediatamente prima del saggio. La misurazione di 13 analiti in tre categorie funzionali è stata effettuata utilizzando una piattaforma di saggio immunoanalitico multiplex basata su microsferette con un pannello personalizzato di microsferette magnetiche (vedere Tabella dei materiali). Il gruppo pro-infiammatorio comprendeva l'IL-1β, IL-6, IL-17A e TNF-α; il gruppo delle chemochine comprendeva CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 e CCL3/MIP-1α; e il gruppo regolatorio comprendeva IL-10, IFN-γ, IL-1RA e G-CSF. La scelta degli analiti si è basata su quelli più comunemente riportati come informativi nelle analisi multiplex di citochine nel LBA o nel siero negli studi su polmonite/infezioni respiratorie gravi7,11. Il fattore di diluizione (1:2 nel buffer del saggio) è stato determinato da un esperimento pilota condotto su un sottoinsieme rappresentativo di campioni infetti e di controllo per assicurare che >Il 90% delle misurazioni è risultato entro la curva standard.
Le curve standard sono state determinate utilizzando diluizioni seriali a sette punti degli standard ricombinanti del produttore, preparate in duplicato su ogni piastra, inclusa una pozzetta vuota per sottrarre il fondo. L'adattamento della curva è stato effettuato mediante regressione logistica a cinque parametri (5PL) tramite il software proprietario di acquisizione e analisi dello strumento (vedere Tabella dei Materiali). Il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) è stato calcolato come la quantità minima di standard che produceva un recupero mediante back-fit compreso tra l'80% e il 120% e un coefficiente di variazione intrarun (CV) ≤ 20%. I valori inferiori all'LLOQ sono stati sostituiti con LLOQ/√2. Due campioni di controllo qualità di fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) raggruppati, ciascuno proveniente da un paziente infetto rappresentativo e da un soggetto non colpito, sono stati aliquotati e aggiunti a ogni piastra per monitorare le prestazioni a lungo termine. Gli standard di controllo qualità si basavano su raccomandazioni basate sulle migliori pratiche derivanti da un programma di competenza pluriennale (12 anni) multicentrico per saggi multiplex basati su microsfere16, inclusi i requisiti di CV intra-saggio ≤ 10% in pozzette duplicate, CV inter-piastra ≤ 20% per il controllo qualità e un conteggio minimo di microsfere di ≥ 50 per analita per pozzetta. Le piastre che non soddisfacevano i criteri sopra indicati sono state ripetute. L'analisi è stata eseguita in un singolo lotto entro quattro settimane, utilizzando un unico lotto di kit, con un'intercalazione casuale dei campioni di infezione e dei controlli.
Pipeline di analisi per la visualizzazione
I file Flow Cytometry Standard (FCS) sono stati inizialmente analizzati mediante software commerciale per la citometria in flusso (vedere Tabella dei materiali) per effettuare la compensazione e selezionare i singoletti vitali CD45⁺, quindi esportati per un'analisi imparziale in R v4.4. Per ogni campione, sono stati sottocampionati 10.000 eventi CD45⁺ e concatenati, e le intensità del segnale sono state trasformate utilizzando la funzione arcsinh con un cofattore di 150. La riduzione della dimensionalità e le proiezioni UMAP sono state eseguite utilizzando il pacchetto uwot con 15 vicini più prossimi e una distanza minima di 0,1, insieme a embedding t-SNE paralleli utilizzando il pacchetto Rtsne con una perplessità di 3010. I cluster fenotipici sono stati identificati utilizzando FlowSOM con 100 nodi della mappa auto-organizzante e ulteriormente suddivisi in 12–15 cluster tramite meta-clustering, mediante un approccio basato sull'ottimizzazione recentemente validato per dati citometrici ad alta dimensionalità17. Ogni cluster è stato annotato in base all'espressione mediana dei marcatori di linea e di attivazione ed esaminato rispetto alle selezioni manuali.
Per l'analisi dei dati multiplex delle citochine, i valori grezzi sono stati prima trasformati in log₁₀ e poi standardizzati tra gli analiti mediante z-score prima di ulteriori analisi. Sia gli analiti che i pazienti sono stati sottoposti a clustering gerarchico utilizzando la distanza euclidea e il collegamento Ward.D2; i risultati sono stati visualizzati in una mappa termica con cluster per righe e colonne. Tale approccio è stato utilizzato per identificare moduli di citochine co-espressi e classificare sottogruppi di pazienti in coorti infiammatorie multiplex9. Sono state generate matrici di correlazione per tutti i biomarcatori cellulari e solubili utilizzando correlazioni di rango di Spearman pairwise. Le mappe termiche delle matrici di correlazione sono state rappresentate insieme a una rete in cui i nodi corrispondono ai biomarcatori e gli archi indicano correlazioni che hanno superato la correzione per confronti multipli mediante il metodo di Benjamini–Hochberg (BH). La larghezza degli archi è stata proporzionata all'entità del coefficiente di correlazione |ρ|, e gli archi sono stati inclusi solo se |ρ| ≥ 0,30 e p < 0,05 dopo la correzione. L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita sulla matrice standardizzata contenente cellule e citochine utilizzando la funzione prcomp() con scala di varianza unitaria. I partecipanti sono stati proiettati sulle prime due componenti principali, con i gruppi di infezione e di controllo sovrapposti. Un campionamento ridotto e una standardizzazione costanti di tutte le analisi hanno garantito la confrontabilità tra i risultati dei biomarcatori cellulari e solubili in tutte le visualizzazioni.
Analisi statistica
Le variabili continue sono state descritte mediante mediana (intervallo interquartile, IQR) quando non normali secondo il test di Shapiro–Wilk, e media (deviazione standard, SD) negli altri casi. Le variabili categoriche sono state descritte mediante frequenze e proporzioni. I confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test di Mann–Whitney U test quando le variabili continue presentavano distribuzioni non normali, il test di Welch t-test quando le variabili continue erano distribuite normalmente, e il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher quando applicabile per le variabili categoriali. Le associazioni tra le variabili continue sono state valutate mediante il coefficiente di correlazione rank di Spearman. Per tenere conto del tasso di falsa scoperta (FDR) nelle analisi multiplex delle citochine e nelle analisi di correlazione, i valori-p sono stati corretti utilizzando il metodo di Benjamini–Hochberg con una soglia di q < 0,05. Bilaterale p < Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo in tutte le analisi primarie. Ove possibile, i casi con dati mancanti per singole variabili sono stati mantenuti e analizzati mediante analisi dei casi completi per la variabile interessata, mentre sono state effettuate imputazioni multiple mediante equazioni concatenate (m = 20) per condurre analisi di sensibilità. Sono state generate curve ROC (receiver operating characteristic) e l'area corrispondente sotto la curva (AUC) per singole citochine utilizzando il pacchetto pROC nell'intero coorte di studio; non è stato utilizzato un coorte esterno di validazione separato. Analisi di sensibilità predefinite hanno ripetuto i confronti primari tra gruppi escludendo i partecipanti che avevano ricevuto antibiotici entro 72 ore prima della broncoscopia e stratificando il gruppo con infezione in base allo stato di ventilazione meccanica e al sottotipo di polmonite (acquisita in comunità, acquisita in ospedale o associata a ventilazione). Le analisi sono state eseguite utilizzando i pacchetti rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC e mice in R v4.4. Le figure sono state realizzate mediante software commerciale per grafici scientifici (vedere Tabella dei materiali).
Risultati
Caratteristiche della popolazione in studio e del campione
Nella coorte di analisi finale erano inclusi 112 soggetti, di cui 64 nel gruppo con infezione e 48 nel gruppo di controllo senza infezione. Le caratteristiche demografiche basali erano simili tra i gruppi, mentre i parametri di laboratorio correlati all'infezione erano più elevati nel gruppo con infezione, come mostrato nella Tabella 1. Le infezioni erano principalmente causate da batteri Gram-negativi, con i principali agenti patogeni batterici rappresentati da Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. Altri agenti patogeni includevano Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, agenti atipici, virus e infezioni miste.
I tassi di recupero del BALF hanno soddisfatto la soglia prestabilita di ≥40% per tutti i campioni inclusi, con valori leggermente inferiori nel gruppo infetto rispetto al gruppo di controllo (mediana 48,3% rispetto a 53,3%, p = 0,03), in accordo con un aumento dell'infiammazione delle vie aeree e del congestionamento della mucosa nelle vie aeree infette. Poiché anche il volume recuperato differiva tra i gruppi (58 mL rispetto a 64 mL, p = 0,04), tutte le concentrazioni di citochine riportate potrebbero essere influenzate da una modesta differenza tra i gruppi nel fattore di diluizione; un'analisi di sensibilità prestabilita, limitata ai campioni con tasso di recupero ≥50% (n = 42 infetto, n = 34 controllo), ha confermato direzione e entità di ogni confronto tra gruppi (la maggiore variazione nell'effetto era < 8%), indicando che un bias dovuto alla diluizione difficilmente spiega le differenze osservate. Il tempo tra il prelievo e l'elaborazione è stato di 65 minuti per il gruppo infetto e di 62 minuti per il gruppo di controllo, entro la finestra di 2 ore. I criteri di controllo qualità (QC) a livello di campione hanno indicato risultati di alta qualità. I conteggi differenziali citologici sono stati ottenuti analizzando ≥400 cellule in tutti i 112/112 campioni (100%). Le acquisizioni di citometria a flusso hanno soddisfatto il criterio prestabilito di ≥1 × 105 eventi CD45⁺ in tutti i 112/112 campioni (100%), con una mediana di vitalità delle cellule vive pari all'89,4% (IQR 85,6–92,8%). Tutte le piastre per la multiplexazione delle citochine hanno soddisfatto i criteri QC dopo un unico ripetuto test. Per tutti e 13 gli analiti, il coefficiente di variazione intra-saggio (CV) è stato del 4,7% (2,1–9,3%, tutti <10%), il CV inter-piastra dei campioni QC pooled è stato dell'11,2% (6,8–18,4%, tutti <20%), e il numero mediano di microsfere è stato di 78 eventi/analita/pozzetto (53–142, tutti ≥ 50).
| Variabile | Infezione (n = 64) | Controllo (n = 48) | valore p |
| Età, anni, mediana [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Maschio, n (%) | 38 (59,4) | 26 (54,2) | 0,59 |
| IMC, kg/m2, mediana [IQR] | 23,8 [21,4–26,2] | 23,5 [21,6–25,7] | 0,66 |
| Anamnesi tabagica, n (%) | 0,52 | ||
| Mai fumato | 28 (43,8) | 25 (52,1) | |
| Ex fumatore | 22 (34,4) | 16 (33,3) | |
| Fumatore attuale | 14 (21,9) | 7 (14,6) | |
| Ipertensione, n (%) | 27 (42,2) | 18 (37,5) | 0,62 |
| Diabete mellito, n (%) | 17 (26,6) | 10 (20,8) | 0,49 |
| Malattia coronarica, n (%) | 11 (17,2) | 6 (12,5) | 0,51 |
| Malattia renale cronica, n (%) | 5 (7,8) | 3 (6,3) | 0,76 |
| Indicazione alla broncoscopia, n (%) | — | ||
| Polmonite acquisita in comunità | 35 (54,7) | — | |
| Polmonite acquisita in ospedale | 19 (29,7) | — | |
| Polmonite associata a ventilazione meccanica | 10 (15,6) | — | |
| Nodulo polmonare indeterminato | — | 23 (47,9) | |
| Anomalia radiografica persistente | — | 15 (31,3) | |
| Valutazione di tosse cronica | — | 10 (20,8) | |
| Agente patogeno causale, n (%) | — | ||
| Batteri Gram-negativi | 28 (43,8) | ||
| Batteri Gram-positivi | 16 (25,0) | ||
| Patogeni atipici | 7 (10,9) | ||
| Virus respiratori | 8 (12,5) | ||
| Infezione mista | 5 (7,8) | ||
| Ventilazione meccanica al momento del BAL, n (%) | 14 (21,9) | 0 (0) | <0,001 |
| Esposizione ad antibiotici entro 72 h prima del BAL, n (%) | 41 (64,1) | 0 (0) | <0,001 |
| Volume instillato, mL, mediana [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0,84 |
| Volume recuperato, mL, mediana [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0,04 |
| Tasso di recupero del BALF, %, mediana [IQR] | 48,3 [42,5–55,6] | 53,3 [46,2–60,5] | 0,03 |
| Tempo di lavorazione, min, mediana [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0,55 |
| GB nel sangue, × 10⁹/L, mediana [IQR] | 11,8 [8,6–14,5] | 6,4 [5,3–7,8] | <0,001 |
| Neutrofili nel sangue, %, mediana [IQR] | 78,5 [70,2–86,4] | 60,3 [54,6–66,8] | <0,001 |
| Proteina C reattiva, mg/L, mediana [IQR] | 78,5 [42,6–128,4] | 4,2 [1,8–8,6] | <0,001 |
| Procalcitonina, ng/mL, mediana [IQR] | 0,86 [0,32–2,45] | 0,05 [0,03–0,08] | <0,001 |
Tabella 1: Caratteristiche demografiche, cliniche e di elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) della coorte dello studio. Le caratteristiche demografiche di base, le comorbidità, le indicazioni alla broncoscopia, i patogeni eziologici, i parametri procedurali e i valori ematici periferici di laboratorio sono stati confrontati tra i 64 partecipanti del gruppo con infezione e i 48 del gruppo di controllo senza infezione. Le variabili continue sono riportate come mediana [intervallo interquartile] e confrontate mediante il test di Mann-Whitney U test; le variabili categoriche sono riportate come n (%) e confrontate mediante il test chi-quadro o il test esatto di Fisher, quando applicabile. Abbreviazioni: BAL = lavaggio broncoalveolare; BALF = liquido di lavaggio broncoalveolare; BMI = indice di massa corporea; IQR = intervallo interquartile; WBC = conta dei globuli bianchi.
Visualizzazione del reclutamento dei neutrofili nel LBA
È stato osservato un chiaro spostamento del rapporto da una popolazione dominata da macrofagi a una dominata da neutrofili tra i soggetti infetti, come mostrato in Figura 2. I preparati ottenuti con citocentrifuga sono stati colorati mediante la tecnica di Wright-Giemsa, e la colorazione ha evidenziato una chiara distinzione tra i due gruppi: il gruppo di controllo presentava un maggior numero di macrofagi alveolari, alcuni linfociti e pochi neutrofili, mentre il gruppo infetto era dominato da neutrofili con batteri intracellulari frequenti, nuclei degenerati e granulazioni tossiche. I conteggi differenziali, basati su almeno 400 cellule enumerate, sono stati utilizzati per confermare le differenze: il rapporto dei neutrofili è aumentato da un valore mediano del 3,2% (IQR: 1,8–5,6%) nel gruppo di controllo al 68,4% (IQR: 49,2–82,5%) nel gruppo infetto (p < 0,001), mentre quello dei macrofagi alveolari è diminuito dall'88,2% (IQR: 82,4–92,5%) al 22,6% (IQR: 12,3–38,5%) (p < 0,001). Le percentuali di linfociti erano simili tra i gruppi (7,4% [4,8–11,3%] contro 6,5% [3,4–11,2%], p = 0,42).
Le analisi di gating e di riduzione della dimensionalità hanno confermato ed ampliato i fenotipi cellulari osservati mediante microscopia. Dopo l'esclusione di detriti, doppietti e cellule morte, i granulociti CD45⁺CD66b⁺ rappresentavano una mediana del 65,8% (IQR: 46,2–79,4%) dei leucociti CD45⁺ nel gruppo infetto rispetto al 4,1% (IQR: 2,3–6,8%) nel gruppo di controllo (p < 0,001). All'interno della popolazione di granulociti, i neutrofili maturi CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ costituivano il 92,4% (IQR: 87,5–95,8%) di tutti i granulociti nel gruppo infetto rispetto all'88,6% (IQR: 82,3–93,5%) nel gruppo di controllo, indicando che il pool di neutrofili reclutati era composto principalmente da cellule mature e completamente differenziate piuttosto che da precursori precoci. Le proiezioni UMAP e t-SNE basate sulla matrice di proteine di superficie trasformata con arcsinh mostravano topologie quasi identiche, in cui i casi di infezione occupavano un'isola prominente di neutrofili maturi CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ scarsamente popolata nei campioni di controllo, mentre l'isola di macrofagi alveolari HLA-DR⁺CD14⁺ mostrava il pattern opposto, densamente popolata nei controlli e scarsamente nei casi infetti. Il meta-clustering mediante FlowSOM ha identificato 13 sottopopolazioni, tra cui una sottopopolazione di neutrofili maturi (38,4% [22,6–56,2%] vs 2,8% [1,5–4,6%], p < 0,001) e un cluster di neutrofili attivati CD16-dim CD11b-alto (22,6% [11,4–32,5%] vs 0,4% [0,1–1,2%], p < 0,001) hanno mostrato le maggiori espansioni tra i gruppi.
Per quanto riguarda il conteggio assoluto dei neutrofili, si è osservato un aumento di circa 50 volte dei neutrofili nel LBA nel gruppo infetto rispetto al gruppo di controllo. Il numero totale di cellule nucleate per µL di LBA è aumentato da 156 cellule/µL (IQR 88–232) nel gruppo di controllo a 384 cellule/µL (IQR 180–712) nel gruppo infetto (p < 0,001), e il conteggio dei neutrofili è aumentato da 5 cellule/µL (IQR 2–13) nel gruppo di controllo a 262 cellule/µL (IQR 89–578) nel gruppo infetto (p < 0,001). Le differenze pairwise nei valori percentuali e nel conteggio assoluto dei neutrofili tra i gruppi sono rimaste altamente significative dopo la correzione di Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0,001).
Figura 2: Visualizzazione del reclutamento dei neutrofili nel LBA. Campi rappresentativi di citospin colorati con Wright-Giemsa provenienti da un partecipante di controllo e da un partecipante infetto illustrano il passaggio da un profilo cellulare del LBA predominato da macrofagi a uno predominato da neutrofili. Una strategia di gating in quattro passaggi mediante citometria a flusso (singoletti FSC → leucociti vitali CD45⁺ → granulociti CD66b⁺ dopo esclusione di CD14⁺HLA-DR⁺ → neutrofili maturi CD15⁺CD16⁺CD11b⁺), un'incorporazione UMAP di dati di citometria a flusso trasformati con arcsinh con sovrapposizione dei metacluster FlowSOM 13 colorata in base all'annotazione biologica e grafici a scatola con percentuale di neutrofili nel LBA e concentrazione assoluta di neutrofili (cellule/µL, scala logaritmica) sono mostrati fianco a fianco per consentire un confronto diretto dei fenotipi cellulari identificati nei gruppi infetto e di controllo. Abbreviazioni: LBA = liquido di lavaggio broncoalveolare; FSC = diffusione in avanti; UMAP = approssimazione e proiezione uniforme della varietà. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Visualizzazione dei profili delle citochine infiammatorie nel LBA
Un modello di risposte coordinate attraverso diversi assi citochinici ha distinto il gruppo infetto dal gruppo di controllo, e le citochine sono state raggruppate in tre moduli funzionali coerenti, come mostrato in Figura 3. Il raggruppamento gerarchico delle concentrazioni citochiniche trasformate in log₁₀ e normalizzate, effettuato con il metodo Ward.D2, ha prodotto un chiaro dendrogramma a due gruppi, in cui i campioni del gruppo infetto e quelli di controllo occupavano estremità opposte del dendrogramma, con soltanto sette partecipanti classificati in modo errato (sei controlli si sono aggregati con i campioni infetti, principalmente casi di tosse cronica con lieve infiammazione neutrofila delle vie aeree, e un campione infetto si è aggregato con i controlli, rappresentante una polmonite atipica precoce). Il dendrogramma degli analiti ha definito tre cluster di citochine. Il cluster di chemochine, composto da CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 e CCL3, ha mostrato la maggiore variazione di espressione tra i gruppi infetto e di controllo e la più elevata correlazione all'interno del modulo. Il cluster pro-infiammatorio, contenente IL-1β, IL-6, IL-17A e TNF-α, ha mostrato aumenti simili nella stessa direzione, sebbene leggermente meno marcati. Il cluster regolatorio, comprendente IL-10, IL-1RA, IFN-γ e G-CSF, era anch'esso aumentato nei campioni infetti, indicando che la risposta non era puramente pro-infiammatoria, ma coinvolgeva contemporaneamente anche branche contro-regolatorie e antivirali.
Le mediane (IQR) di tutti gli analiti testati erano più elevate nel gruppo infetto rispetto al gruppo di controllo, e il valore p aggiustato era inferiore a 0,001 per tutti e 13 gli analiti dopo la correzione per il tasso di falsa scoperta basata su BH (BH-FDR). Tra gli analiti, CXCL8/IL-8 presentava la concentrazione più alta e la variazione di fold maggiore (da 68 [32–142] pg/mL nel gruppo di controllo a 2.485 [842–6.520] pg/mL nel gruppo infetto, un aumento di circa 36 volte). Un andamento parallelo è stato osservato per CXCL1/GRO-α, con un aumento di circa 21 volte (78 [36–148] contro 1.672 [524–3.890] pg/mL). IL-1β ha mostrato un aumento di circa 13 volte (5,8 [2,6–11,4] contro 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA e G-CSF hanno mostrato aumenti da 13 a 16 volte (16,4 [7,8–30,5] contro 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] contro 1.748 [658–3.964] pg/mL; 24 [10–52] contro 384 [125–912] pg/mL, rispettivamente). Altri aumenti minori includevano TNF-α (~8 volte), CXCL10/IP-10 (~9 volte), CCL2/MCP-1 (~8 volte), CCL3/MIP-1α (~10 volte), IL-10 (~10 volte), IFN-γ (~6 volte) e IL-17A (~4 volte).
L'analisi della caratteristica operativa del ricevitore all'interno del gruppo ha identificato IL-8 (AUC 0,94), IL-1β (AUC 0,92), IL-6 (AUC 0,91), CXCL1 (AUC 0,91) e G-CSF (AUC 0,89) come gli analiti con la maggiore capacità discriminatoria singola tra i gruppi con infezione e controllo; questi valori di AUC riassumono la capacità discriminatoria all'interno del gruppo analizzato, in assenza di un set di validazione esterna separato. L'analisi di sensibilità mediante imputazione multipla tramite equazioni concatenate (m = 20) ha prodotto stime entro il 5% delle mediane ottenute dai casi completi per ciascun analita e non ha modificato l'ordine gerarchico delle dimensioni dell'effetto.
Analisi di sensibilità predefinite sono state utilizzate per valutare l'influenza dell'esposizione precedente ad antibiotici e del sottotipo di polmonite sulle differenze osservate nei citochine. Quando i confronti principali tra gruppi sono stati ripetuti escludendo i 41 partecipanti del gruppo di infezione (64,1%) che avevano ricevuto antibiotici entro 72 ore prima della lavanda broncoalveolare (BAL), tutti e 13 gli analiti sono rimasti significativamente più elevati nei restanti 23 casi di infezione rispetto ai controlli dopo la correzione BH-FDR (aggiustato p < 0,001 per i cinque principali discriminanti), con stime puntuali leggermente superiori piuttosto che inferiori alle mediane dell'intero coorte (ad esempio, CXCL8/IL-8 2.860 [980–7.110] pg/mL e IL-1β 92 [34–210] pg/mL), coerente con un parziale attenuazione delle citochine delle vie aeree dovuta all'esposizione antibiotica pre-BAL. La stratificazione del gruppo di infezione per sottotipo di polmonite ha mostrato lo stesso ordine di grandezza per chemochine e citochine pro-infiammatorie nei casi di polmonite acquisita in comunità (n = 35), polmonite acquisita in ospedale (n = 19) e polmonite associata a ventilazione meccanica (n = 10), con il sottogruppo di polmonite associata a ventilazione meccanica che presentava i livelli mediani più elevati di CXCL8, CXCL1, IL-6 e G-CSF; lo stato di ventilazione meccanica non ha modificato la direzione di alcun confronto tra gruppi.
Figura 3: Visualizzazione dei profili di citochine infiammatorie nel BALF. Mappa termica con raggruppamento gerarchico dei livelli log₁₀-trasformati e standardizzati con z-score dei 13 analiti misurati in tutti i 112 partecipanti, con barre di annotazione colorate sopra la mappa termica che indicano l'assegnazione al gruppo (controllo, infezione), il sottotipo di polmonite (polmonite acquisita in comunità, acquisita in ospedale o associata a ventilazione) e la categoria di patogeno causale (Gram-negativi, Gram-positivi, atipici, virali o infezione mista). I diagrammi a scatola (box plot) dei principali citochine differenzialmente abbondanti (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF e TNF-α; scala log₁₀, pg/mL) confrontano i gruppi con infezione e di controllo. *** p < 0,001 dopo correzione del tasso di falsa scoperta BH. Abbreviazioni: BALF = liquido di lavaggio broncoalveolare; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = polmonite acquisita in comunità; HAP = polmonite acquisita in ospedale; VAP = polmonite associata a ventilazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Visualizzazione accoppiata del reclutamento dei neutrofili e dei profili delle citochine
L'accoppiamento dei compartimenti cellulare e solubile ha rivelato un forte collegamento biologico tra il reclutamento dei neutrofili e il sistema delle chemochine, come mostrato in Figura 4. Una rappresentazione bidimensionale è stata ottenuta mediante l'analisi delle componenti principali (PCA) della matrice standardizzata di cellule e citochine, in cui la PC1 spiega il 51,1% della varianza totale e la PC2 un ulteriore 12,7%, per un totale cumulativo del 63,8%. La PC1 separa il gruppo con infezione dai controlli, caratterizzandosi per elevati pesi positivi nei confronti dei neutrofili nel lavaggio broncoalveolare (BALF), CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β e G-CSF, e per elevati pesi negativi nei confronti dei macrofagi. La PC2 distingue tra un andamento ricco di chemochine (pesi positivi elevati per CXCL8 e CXCL1) e un andamento ricco di fattori regolatori (pesi positivi per IL-10, IL-1RA e IFN-γ), in modo che all'interno del gruppo con infezione i partecipanti tendano a separarsi in base alla gravità, con i casi di polmonite associata al ventilatore che richiedono ventilazione meccanica posizionati nel quadrante ad alto contenuto di chemochine.
Le correlazioni di Spearman a coppie tra 17 caratteristiche cellulari e solubili hanno rivelato una forte correlazione positiva tra il conteggio dei neutrofili nel lavaggio broncoalveolare (BALF) e l'asse chemochinico complessivo (CXCL8 ρ = 0,78; CXCL1 ρ = 0,74; CCL3 ρ = 0,69; CCL2 ρ = 0,61; CXCL10 ρ = 0,54; tutti i valori di p aggiustati < 0,001). Un secondo livello di correlazioni significative è stato osservato tra il conteggio dei neutrofili e l'asse pro-infiammatorio (G-CSF ρ = 0,65; IL-1β ρ = 0,62; IL-6 ρ = 0,58; TNF-α ρ = 0,51), seguito da correlazioni moderate e positive con l'asse regolatorio (IL-10 ρ = 0,45; IL-1RA ρ = 0,48). La percentuale di macrofagi ha mostrato una correlazione negativa speculare con entrambi gli assi chemochinico e pro-infiammatorio, di intensità simile. Le correlazioni all'interno di ciascun asse sono risultate sostanzialmente più forti rispetto a quelle tra assi diversi (mediana |ρ| all'interno dell'asse = 0,68 rispetto a mediana |ρ| tra assi = 0,33), sostenendo l'ipotesi di comuni vie regolatorie a monte che controllano gli assi chemochinico, pro-infiammatorio e regolatorio.
La rete di correlazione ha rappresentato questa associazione in un grafo in cui i neutrofili del lavaggio broncoalveolare (BALF) costituivano il nodo centrale più importante, con tutti e 13 i collegamenti ai citochine che superavano la correzione BH per test multipli. Delle 136 possibili connessioni a coppie tra le 17 caratteristiche, 99 soddisfacevano il criterio congiunto di |ρ| ≥ 0,30 e p corretto con BH < 0,05 ed è stato pertanto mantenuto. Il grafo della rete di correlazione mostrava una chiara architettura modulare a tre blocchi, che riproduceva i cluster ottenuti dal clustering gerarchico: le connessioni più dense e forti erano tra il modulo delle chemochine e il conteggio percentuale di neutrofili nel BALF, connessioni di peso intermedio collegavano il modulo pro-infiammatorio sia ai neutrofili sia al modulo delle chemochine, mentre connessioni sottili provenienti dal modulo regolatorio collegavano i blocchi delle chemochine e pro-infiammatorio. Il nodo relativo alla percentuale di macrofagi si trovava opposto al blocco neutrofili–chemochine ed era collegato ad esso tramite un ventaglio di archi con pesi negativi. Nel complesso, l'analisi delle componenti principali (PCA), la matrice di correlazione e il grafo della rete hanno rivelato un modello coerente in cui l'infiltrazione di neutrofili nel BALF e la risposta delle chemochine sono fortemente associate a livello individuale, mentre i percorsi pro-infiammatori e regolatori costituiscono moduli ben definiti ma interconnessi attorno a questo asse neutrofili–chemochine.
Figura 4: Visualizzazione accoppiata del reclutamento dei neutrofili e dei profili delle citochine infiammatorie. Biplot dell'analisi delle componenti principali della matrice standardizzata di cellule e citochine, con i partecipanti colorati per gruppo, mappa termica della correlazione di Spearman e grafico a rete di tutte e 17 le caratteristiche cellulari e solubili (nodi dimensionati in base al grado, archi dimensionati in base a |ρ| e filtrati per p corretto con Benjamini–Hochberg < 0,05 e |ρ| ≥ 0,30), che evidenzia l'hub neutrofili-chemochine. Abbreviazioni: BH = Benjamini–Hochberg; PC = componente principale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Il set di dati a livello di partecipante con informazioni anonime e il codice di analisi in R utilizzati in questo studio sono forniti come Tabella Supplementare S1 e File Supplementare 1. Altri dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole.
Tabella supplementare S1: set di dati del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF). Cliccare qui per scaricare il file.
File Supplementare 1: Un file ZIP contenente i codici di analisi. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussione
La robustezza di questo protocollo dipende da alcune decisioni prese prima e durante l'analisi. Stabilire una soglia minima di recupero del 40% e combinare la seconda aliquota e quelle successive è stata una scelta intenzionale, poiché la prima aliquota contiene un arricchimento maggiore di materiale delle vie aeree bronchiali, mentre la percentuale di recupero varia sistematicamente con l'età, il sesso, la storia del fumo e il bronco bersaglio18. È fondamentale bloccare i recettori Fc e titolare gli anticorpi contro singole linee cellulari per definire correttamente i confini di gating tra i neutrofili maturi CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ e i macrofagi alveolari CD14⁺HLA-DR⁺ (le cellule dominanti nel campione di BALF con la più elevata fluorescenza non specifica e fondo autofluorescente) al fine di mantenere la coerenza tra i due gruppi19,20. Neanche il limite del ciclo di congelamento-scongelamento e l'intervallo di 2 ore per l'analisi multiplex sono casuali. Dati ottenuti da BALF umano hanno mostrato una riduzione significativa della percentuale di neutrofili tra le 6 e le 24 ore, anche quando i campioni sono conservati a 4 °C, mentre le percentuali di macrofagi e linfociti sono rimaste costanti13. I parametri per gli algoritmi t-SNE e UMAP, così come quelli per la griglia FlowSOM da 100 nodi e per 12–15 metacluster, sono stati determinati in anticipo rispetto all'analisi dei gruppi, per evitare aggiustamenti a posteriori, una delle cause note di irreproducibilità delle procedure di citometria16. Gli identificatori dell'operatore e della piastra/run possono comunque essere conservati per ogni evento cellulare, per applicare in futuro metodi di correzione del batch in analisi su larga scala21.
Esistono diversi modi comuni di fallimento che non richiedono modifiche al protocollo. Un recupero basso (<40%) è tipicamente dovuto a un posizionamento insufficiente del cuneo o a un'aspirazione eccessiva; questo problema può essere risolto regolando la posizione del broncoscopio e riducendo l'aspirazione a <100 mmHg prima di aspirare un altro aliquota. L'autofluorescenza eccessiva proveniente dai macrofagi alveolari, il principale fattore di confondimento nell'analisi citofluorimetrica delle cellule polmonari, può essere ridotta includendo controlli di cellule polmonari non colorate in ogni lotto e definendo chiaramente la finestra dei macrofagi ad alta diffusione laterale, invece di fare affidamento esclusivamente sui coloranti vitali19. I pannelli multiplex sono spesso compromessi da un numero basso di microsfere e da valori anomali elevati. Eseguire una curva preliminare di diluizione per un sottoinsieme di campioni infetti e di controllo prima di fissare una diluizione 1:2 permette di evitare la saturazione del segnale di CXCL8, CXCL1 e G-CSF, localizzati nella parte più alta della curva standard per i campioni di polmonite, a causa del noto effetto matrice in campioni di LBA22. Il protocollo può essere ulteriormente adattato in base alle caratteristiche della coorte. Quando i campioni contengono prevalentemente un singolo tipo di patogeno, ridurre il pannello principale includendo solo chemochine e mediatori pro-infiammatori preserverebbe un'adeguata potenza statistica. Nel caso di una popolazione mista contenente batteri, virus e patogeni atipici, sarà comunque utile misurare anche i mediatori regolatori, poiché è stato recentemente dimostrato l'esistenza di una firma specifica per il patogeno nei neutrofili e nei macrofagi alveolari23, e una combinazione di citochine pro-infiammatorie e regolatorie nel LBA si è rivelata in grado di riflettere la gravità della malattia nella polmonite acquisita in comunità24.
Il contributo del presente flusso di lavoro non risiede nell'osservazione individuale dell'afflusso neutrofilico o dell'aumento di chemochine e citochine pro-infiammatorie nelle infezioni respiratorie, entrambi ampiamente documentati, ma nell'accoppiamento di un pannello a sette marcatori per la citometria a flusso di neutrofili e monociti e di un saggio immunoanalitico multiplex a 13 analiti a una pipeline di visualizzazione condivisa applicata allo stesso campione di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF). L'implementazione di un pannello a sette marcatori mirato a neutrofili e monociti, insieme a un saggio immunoanalitico multiplex a 13 analiti, cattura la complessità fenotipica e citochinica; senza questo approccio, l'analisi richiederebbe diversi test indipendenti con un volume di BALF molto maggiore di quanto ottenibile da un campione normale di broncoscopia. Il primo approccio è in linea con studi precedenti che dimostrano come la citometria a flusso multicolore sia affidabile quanto la microscopia manuale per l'identificazione dei tipi cellulari nei campioni di BALF15, mentre i criteri di accettazione per il secondo riflettono le migliori pratiche di un riconosciuto programma multicentrico di valutazione dell'abilità nei saggi multiplex basati su microsferette16. In particolare, l'insieme di mappa termica, grafico a rete e analisi delle componenti principali (PCA), costruiti utilizzando identici input standardizzati, rivela relazioni tra i tipi cellulari e i fattori ad essi associati che in precedenza potevano essere dedotte soltanto sommando istogrammi indipendenti. Questo è rilevante perché le chemochine derivate dal BALF, CXCL8, CCL2 e CCL3, agiscono insieme per reclutare neutrofili e monociti da un letto circolatorio condiviso, e la loro struttura congiunta contiene informazioni che non possono essere ottenute da letture singole e indipendenti per ciascun analita9,10. Il BALF viene già routine prelevato a scopi clinici e non richiede volume aggiuntivo, pertanto il flusso di lavoro può essere considerato un'integrazione traslazionale ai servizi esistenti di broncoscopia piuttosto che una procedura diagnostica autonoma.
Il tempo effettivo di completamento dell'intero flusso di lavoro, che comprende il trasporto del campione, la colorazione, l'acquisizione mediante citometria a flusso, l'incubazione e la lettura del saggio multiplex e la successiva analisi computazionale, è nell'ordine delle 24 ore in condizioni di laboratorio di ricerca. Il flusso di lavoro si posiziona quindi come uno strumento di fenotipizzazione approfondita per la caratterizzazione meccanicistica e il monitoraggio della risposta al trattamento, piuttosto che come un saggio di triage immediato al letto del paziente per decisioni critiche dal punto di vista temporale, come la distinzione immediata tra polmonite associata al ventilatore e sindrome da distress respiratorio acuto sterile, per le quali saggi microbiologici e biomarcatori a singolo marcatore più rapidi rimangono lo standard di cura.
Esistono diversi limiti che devono essere menzionati. Il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) viene raccolto dallo spazio aereo e rappresenta le interazioni superficiali immediate di tale compartimento, ma non contiene le cellule localizzate nella parete alveolare e nei setti, dove si trovano molti macrofagi attivati e linfociti residenti nel tessuto. Pertanto, non esiste una corrispondenza uno-a-uno tra lo stato immunitario dello spazio aereo e quello del parenchima, in accordo con dati precedentemente pubblicati25. La rilevazione multiplex basata su microsfere è soggetta a cross-reattività degli anticorpi e a effetti di matrice, particolarmente evidenti nell'ambiente ricco di mucine e surfattante del BALF rispetto al siero sanguigno; inoltre, il processo di diluizione del liquido di rivestimento epiteliale con soluzione salina non può essere corretto mediante alcun marcatore endogeno, come l'urea, in linea con critiche recentemente pubblicate26. Il volume di lavaggio recuperato è stato, in media, di 6 mL inferiore nel gruppo con infezione rispetto ai controlli; pertanto, le concentrazioni assolute riportate sono influenzate da una modesta differenza intergruppi nel fattore di diluizione, e non è stato utilizzato alcun marcatore endogeno di diluizione. L'esposizione pregressa ad antibiotici in 41 dei 64 partecipanti del gruppo infetto (64,1%) potrebbe attenuare le concentrazioni di citochine nelle vie aeree e il recupero di patogeni. È importante sottolineare che il protocollo rappresenta un'istantanea in un singolo momento temporale durante una broncoscopia clinicamente indicata, impedendo così l'analisi della cinetica del reclutamento dei neutrofili, della massima secrezione di chemochine e della loro risoluzione nei singoli pazienti. I valori di AUC per singolo analita sono stati ottenuti dalla stessa coorte utilizzata per l'identificazione dei biomarcatori, in assenza di una coorte indipendente per la validazione, e devono essere interpretati come misure di discriminazione all'interno della coorte piuttosto che come prestazioni diagnostiche validate esternamente; l'adozione di qualsiasi cutoff basato su un singolo marcatore nella pratica clinica richiederebbe una validazione prospettica in una coorte multicentrica indipendente. Analisi di sensibilità prestabilite, limitate ai campioni con recupero più elevato, ai partecipanti senza esposizione ad antibiotici e stratificate in base allo stato di ventilazione meccanica e al sottotipo di polmonite (acquisita in comunità, acquisita in ospedale o associata a ventilazione) non hanno modificato la direzione dei confronti intergruppi.
In futuro, queste limitazioni potranno essere superate aggiungendo sequenziamento dell'RNA a singola cellula o CITE-seq agli stessi pellet di LBA utilizzati per la quantificazione proteica e cellulare, tecniche già applicate con successo in ampie coorti di polmonite batterica e di polmonite pediatrica da Mycoplasma pneumoniae, per rivelare neutrofili alveolari e sottogruppi di macrofagi non distinguibili mediante citometria a flusso tradizionale27,28. L’integrazione delle informazioni ottenute tramite analisi degli spazi aerei con quelle fornite dalla citometria di massa con imaging o dalla trascrittomica spaziale di biopsie appaiate o addirittura di materiale autoptico permetterebbe di contestualizzare tali dati29. Collegare campionamenti longitudinali di LBA alla valutazione di antagonisti di CXCR1/CXCR2 e di bloccanti del recettore per l'IL-6, entrambi associati a benefici in termini di sopravvivenza o supporto d'organo nella polmonite grave e nel distress respiratorio acuto (ARDS), consentirebbe inoltre di testare l’asse neutrofili-chemochine evidenziato da questo flusso di lavoro come strumento decisionale terapeutico30,31.
In conclusione, questo studio descrive un flusso di lavoro integrato per la visualizzazione, costituito da procedure standardizzate di raccolta e preparazione del lavaggio broncoalveolare (BALF), un pannello a sette marcatori per la citometria a flusso che quantifica la composizione neutrofili-monoctiti, un saggio multiplex di citochine per la misurazione di 13 citochine e una piattaforma comune di visualizzazione comprendente analisi UMAP, clustering gerarchico, rete di correlazione e analisi PCA. Applicando il flusso di lavoro a una coorte prospettica di 112 adulti sottoposti a broncoscopia clinicamente indicata, l'analisi ha identificato una marcata transizione nella composizione delle cellule immunitarie alveolari, da macrofagi a neutrofili nei pazienti con infezione, ha rilevato un modello di risposta citochinica a tre moduli e ha evidenziato un asse neutrofili-chemochine fortemente accoppiato, non osservabile mediante misurazioni basate su singoli marcatori. La procedura si basa esclusivamente sul materiale raccolto durante la diagnosi clinica, non richiede ulteriore volume di campione ed è potenzialmente fattibile in laboratori di terzo livello dotati di strumentazione per citometria a flusso multiparametrica e analisi con array multiplex a microsfera. Un'adozione più ampia e l'utilizzo di singoli analiti come biomarcatori diagnostici richiederanno una validazione prospettica in coorti indipendenti multicentriche. Lo studio presenta quindi una metodologia riproducibile e ricca di dati per la caratterizzazione dell'infiammazione delle vie aeree nelle infezioni respiratorie e fornisce una base per lo sviluppo ulteriore verso studi longitudinali, analisi a singola cellula e analisi spaziali, nonché per la valutazione terapeutica dell'immunomodulazione mirata all'asse neutrofili-chemochine.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo sinceramente tutti i pazienti e i volontari che hanno partecipato a questo studio per la loro preziosa collaborazione. Riconosciamo con gratitudine il Comitato Etico per l'approvazione etica (Numero di approvazione 2026HL-038) e per le indicazioni normative fornite durante l'intero processo di ricerca.
Ringraziamo il personale medico del Dipartimento di Pneumologia, del Centro di Broncoscopia e del Laboratorio Clinico per il supporto nella raccolta dei campioni clinici, nell'elaborazione del liquido di lavaggio broncoalveolare e nel rilevamento microbiologico. Apprezziamo inoltre il supporto tecnico fornito dal laboratorio centrale dell'ospedale per gli esperimenti di citometria a flusso ad alta dimensione e di profilazione multiplex delle citochine.
Questa ricerca non ha ricevuto alcun contributo specifico da agenzie di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro.
Ringraziamo tutti i ricercatori, tecnici e personale infermieristico coinvolti in questo progetto per i loro sforzi nella selezione dei pazienti, gestione dei campioni, esecuzione degli esperimenti e organizzazione dei dati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-umano CD11b, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marcatore di attivazione dei neutrofili; canale laser violetto URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD14, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marcatore di esclusione monocita-macrofago; canale laser rosso URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD15, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marcatore di linea neutrofila; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD16, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marcatore di maturazione dei neutrofili e delle cellule NK; canale laser violetto URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano CD45, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Marcatore pan-leucocitario; canale laser blu URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anticorpo anti-umano CD66b, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Marcatore dei granulociti; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorpo anti-umano HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marcatore delle cellule presentanti l'antigene; canale laser blu URL: https://www.biolegend.com |
| Analizzatore ematologico automatico (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Strumento (modello XN-1000) | Utilizzato per determinare il conteggio assoluto delle cellule nucleate per il calcolo dei neutrofili assoluti URL: https://www.sysmex.com |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Utilizzata nel tampone di colorazione per citofluorimetria (0,5% p/v in PBS con 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| Pacchetto ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Progetto Bioconductor | v2.20 (open-source) | Utilizzato per realizzare heatmap di clustering gerarchico dei dati multiplex delle citochine URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Citocentrifuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Utilizzata per preparare vetrini citologici dalla sospensione cellulare di lavaggio broncoalveolare (BALF) URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Soluzione emolitica per eritrociti (BD FACS Lysing Solution, concentrato 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Utilizzata per la lisi degli eritrociti dopo la colorazione superficiale URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Utilizzato nel tampone di colorazione per citofluorimetria alla concentrazione di 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Colorante vitalizio fissabile (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Esclusione di cellule morte prima del gating; canale laser rosso URL: https://www.biolegend.com |
| Endoscopio video flessibile | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Strumento (modello BF-1TQ290) | Utilizzato per il lavaggio broncoalveolare (BAL) sotto sedazione moderata URL: https://www.olympus-global.com |
| Citometro a flusso multicolore (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Strumento (modello CytoFLEX LX, configurazione a sei laser) | Utilizzato per l'acquisizione del pannello citofluorimetrico a sette marcatori per neutrofili/monociti URL: https://www.beckman.com |
| Software di analisi citofluorimetrica (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Utilizzato per la compensazione e il gating manuale dei file FCS URL: https://www.flowjo.com |
| Pacchetto FlowSOM (R/Bioconductor) | Progetto Bioconductor | v2.12 (open-source) | Utilizzato per il clustering con mappa auto-organizzante e il meta-clustering dei dati citofluorimetrici URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (software di grafica statistica) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Utilizzato per generare le figure finali URL: https://www.graphpad.com |
| Reagente bloccante per recettori Fc umani (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Blocco dei recettori Fc prima della colorazione con anticorpi URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| Pacchetto igraph (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | Utilizzato per costruire e visualizzare il grafico della rete di correlazione URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Vasetti criogenici da 2,0 mL a bassa adesione proteica | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Utilizzati per aliquote del supernatante di BALF destinate all'analisi delle citochine URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Piattaforma per saggio immunoanalitico multiplex basato su microsfere (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Strumento (modello MAGPIX) | Utilizzata per l'acquisizione del saggio multiplex delle citochine URL: https://www.luminexcorp.com |
| Soluzione di colorazione di May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Utilizzata per il conteggio differenziale cellulare su citospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| Pacchetto mice (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | Utilizzato per l'imputazione multipla mediante equazioni concatenate nell'analisi di sensibilità URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Pannello multiplex magnetico per citochine/chemochine (13-plex, personalizzato; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Pannello personalizzato per la misurazione dei 13 analiti descritti nella Sezione 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| Setaccio in nylon per cellule, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Utilizzato per la filtrazione meccanica del BALF per rimuovere grumi di muco URL: https://www.corning.com |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Tampone di base per la risospensione e la colorazione cellulare URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Pacchetto pROC (R) | CRAN | v1.18 (open-source) | Utilizzato per generare curve ROC e valori AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (ambiente di calcolo statistico) | Team R Core | v4.4 (open-source) | Piattaforma per analisi statistiche e visualizzazioni URL: https://www.r-project.org |
| Pacchetto rstatix (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | Utilizzato per confronti tra gruppi e analisi statistiche di correlazione URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Pacchetto Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | Utilizzato per le rappresentazioni t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Microsfere di compensazione monocolorate (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Utilizzate come controlli di compensazione monocromatica URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Soluzione di cloruro di sodio per iniezione, 0,9% (soluzione salina sterile) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Utilizzata per l'instillazione nel lavaggio broncoalveolare (100–150 mL, aliquote da 20–40 mL a 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| Pacchetto uwot (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | Utilizzato per la riduzione dimensionale UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software per l'acquisizione e l'adattamento delle curve nei saggi multiplex) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Software proprietario dello strumento per l'adattamento delle curve standard a 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
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