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Articolo metodologico

Sistema ottico per la valutazione della meccanica atriale e ventricolare in cuori di topo perfusi secondo il metodo di Langendorff

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DOI:

10.3791/72264

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14 agosto 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la procedura per l'estrazione e la cannullazione del cuore di topo, nonché la preparazione e la configurazione del sistema di perfusione retrograda di Langendorff. L'allestimento sperimentale è abbinato a un sistema ottico ad alta risoluzione progettato per valutare le risposte meccaniche delle atria e dei ventricoli mantenendone la dinamica naturale.

Abstract

Il cuore di topo rappresenta un modello ampiamente utilizzato nella ricerca cardiovascolare, grazie ai progressi nelle tecnologie ingegneristiche. Tuttavia, la valutazione della contrattilità atriale e ventricolare rimane difficoltosa a causa delle piccole dimensioni del cuore di topo. Questo studio presenta una nuova metodologia per valutare la contrattilità e la frequenza cardiaca in un cuore isolato e integro. L'uso di un cuore di topo perfuso con il metodo di Langendorff in combinazione con un sistema ottico ad alta risoluzione consente di valutare la contrattilità atriale e ventricolare. L'allestimento sperimentale affronta le difficoltà legate alle piccole dimensioni del cuore e alle elevate frequenze di contrazione, pur acquisendo segnali ad alta risoluzione. La sincronizzazione tra la frequenza dello stimolo e la frequenza di contrazione cardiaca nell'intervallo compreso tra 420 e 660 battiti al minuto (bpm) è risultata coerente con i risultati ottenuti con il metodo auxotonico. Inoltre, le misurazioni dell'accorciamento ventricolare e dei segnali dinamici atriali permettono di determinare la contrazione atrioventricolare. Questo metodo è adatto per valutare la contrattilità e la frequenza cardiaca in un cuore isolato e integro, senza influenze farmacologiche o sistemiche. Questi risultati dimostrano che il sistema ottico consente di misurare le risposte di accorciamento ventricolare e atriale.

Introduzione

C'è molto da scoprire nella fisiologia cardiaca; processi chiave, come la generazione del ritmo cardiaco e l'accoppiamento eccitazione-contrazione, rappresentano principi fondamentali oggetto di continue ricerche1. Sebbene gli effetti del rumore biologico sulla contrattilità cardiaca2 e sull'attività di generazione del ritmo siano ancora poco compresi1, nuovi metodi di imaging ottico hanno permesso di formulare nuovi paradigmi3,4.

Due metodologie sperimentali che utilizzano il sistema di Langendorff hanno fornito contributi inestimabili alla misurazione della funzione cardiaca. In primo luogo, il metodo di contrazione isovolumica, in cui un segnale viene ottenuto mediante un piccolo palloncino inserito nel ventricolo sinistro5,6,7. In secondo luogo, il metodo di registrazione auxotonica, in cui un segnale viene ottenuto cucendo un'estremità di un filo all'apice del cuore e l'altra estremità a un dispositivo meccanico di registrazione per misurare le contrazioni auxotoniche lungo l'asse del cuore2,8. Tuttavia, valutare la contrattilità atriale e ventricolare nel cuore del topo è difficoltoso a causa delle sue ridotte dimensioni. Inoltre, la preparazione richiede un certo grado di delicatezza, poiché il cuore è suscettibile a lesioni9,10,11,12,13.

Il sistema ottico per la valutazione della dinamica meccanica dei cuori di topo presenta diverse caratteristiche e vantaggi innovativi. Innanzitutto, questo metodo è adatto per valutare la contrattilità e la frequenza cardiaca in un cuore isolato e integro, in assenza di influenze farmacologiche o sistemiche. Il protocollo potrebbe inoltre essere impiegato efficacemente in esperimenti volti a studiare il danno da ischemia-riperfusione durante l'analisi di trattamenti farmacologici, di rigenerazione cellulare o basati sulla terapia ossigenica.

In questo articolo, presentiamo un protocollo per la registrazione di parametri biofisici della funzione contrattile del cuore di topo mediante un sistema ottico ad alta risoluzione. Questo metodo consente di valutare la contrattilità e la frequenza cardiaca in un cuore isolato e integro. Inoltre, permette di analizzare la contrattilità atriale e ventricolare. La preparazione del cuore di topo secondo Langendorff presenta un perfezionamento che include una leggera modifica per minimizzare la perdita di temperatura del perfusato e gli artefatti dovuti al movimento, senza inibire le contrazioni muscolari.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le normative federali per la sperimentazione e la cura degli animali e sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali del CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Messico). In questo studio, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J, del peso di 28–34 g e di età compresa tra 8 e 14 settimane. Tutti i materiali e l'attrezzatura utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. I File Supplementari 1–11 forniscono diagrammi illustrativi, guide software, programmi di analisi, dati di stimolazione e file applicativi per il protocollo.

1. Preparazione delle soluzioni madri

  1. Preparare in anticipo due soluzioni stock e conservarle in frigorifero a 4 °C: (1) Soluzione Stock I, 1 L (in acqua deionizzata; in g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) e (2) Soluzione Stock II, 0,1 L (in acqua deionizzata; in g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    NOTA: Le soluzioni possono essere utilizzate fino a 30 giorni dopo la preparazione. Conservarle a 4 °C.

2. Collegamento al sistema Langendorff e pulizia

  1. Collegare il serbatoio (1), il bagno termico del serbatoio (2), la pompa di perfusione (3), il serpentina (4), il ricircolatore della serpentina (5), il sistema di monitoraggio (6) e il sistema di drenaggio (8), come mostrato in Figura 1A.
    NOTA: Il collegamento tra il sistema di monitoraggio e il sistema di drenaggio è mostrato in maggiore dettaglio nel File Supplementare 1.
  2. Riempire il sistema Langendorff con 1 L di acqua deionizzata a 50 °C, quindi avviare le pompe di perfusione e drenaggio (File Supplementare 1, sistema di drenaggio). Dopo circa 20–30 min, rimuovere il liquido dal sistema, quindi procedere al passaggio successivo.
    NOTA: Verificare che non vi siano perdite o cali di pressione nel sistema. In caso contrario, non proseguire con l'esperimento.
  3. Riempire il sistema con 1 L di acido acetico al 1% (disciolto in acqua deionizzata), quindi spegnere le pompe di perfusione e drenaggio e attendere 60 min, quindi riaccendere le pompe per rimuovere il liquido.
  4. Ripetere il passaggio 2.2 due volte.
  5. Riempire il sistema con etanolo al 70% (disciolto in acqua deionizzata) per prevenire l'adesione dei componenti della soluzione.
    NOTA: Il sistema di perfusione Langendorff deve essere pulito ogni dieci esperimenti o mensilmente. Il protocollo di pulizia prima dell'esperimento è descritto nella sezione 4. Il protocollo di pulizia dopo l'esperimento è dettagliato nella sezione 8.

3. Preparazione della soluzione di Tyrode durante l'esperimento

  1. Preparare 1 L di soluzione in mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucosio, 10 HEPES, aggiustando il pH a 7,35 ± 0,05 con NaOH.
    1. Mescolare 100 mL della Soluzione Stock I con 700 mL di acqua deionizzata sotto costante agitazione, quindi aumentare la temperatura della soluzione a 37 °C; mantenere l'ossigenazione della soluzione collegando la bombola di O2 alla pietra porosa come mostrato in Figura 1A (1).
    2. Aggiungere 3,6 mL della Soluzione Stock II e 96,4 mL di acqua deionizzata per ottenere 1,8 mM di CaCl2(2H2O), quindi aggiungere NaOH per aggiustare il pH a 7,35 ± 0,05.
    3. Portare a volume con acqua deionizzata fino a ottenere 1 L di soluzione di Tyrode.
      NOTA: Si raccomanda di conservare 100 mL della soluzione in frigorifero a 4 °C; questo volume sarà necessario successivamente al passaggio 6.

4. Preparazione del sistema Langendorff

NOTA: Se il sistema Langendorff non è stato riempito con etanolo nel giorno dell'esperimento, non è consigliabile proseguire con la procedura; in tal caso, ripetere sezione 2.

  1. Accendere le pompe di perfusione e drenaggio. Impostare la portata della pompa di perfusione a 3 mL/min e quella della pompa di drenaggio a 10 mL/min. Svuotare il sistema.
  2. Riempire il sistema con 1 L di acqua deionizzata a 37 °C, quindi eliminare l'acqua.
  3. Riempire il sistema con la soluzione di Tyrode preparata in passaggio 3 e mantenere la soluzione a temperatura fisiologica e con ossigenazione costante.
  4. Accendere i bagni termici del serbatoio e il ricircolatore serpentino. Impostare la temperatura del serbatoio (Figura 1A (2)) a 38 °C per mantenere la soluzione in condizioni fisiologiche. Impostare la temperatura del serpentina (Figura 1A (5)) a 40 °CCiò compensa la perdita di temperatura nella soluzione del sistema Langendorff.
    NOTA: Se la temperatura della soluzione di Tyrode all'uscita del sistema non è fisiologica (37 ± 0.5 °C), regolare la temperatura del ricircolatore serpentino. Non è consigliabile procedere al passaggio 6 finché la temperatura non ha raggiunto un valore stabile appropriato.
  5. Accendere il monitor della pressione (File Supplementare 1, sistema di monitoraggio) e tarare nell'intervallo da 0 a 200 mmHg. È disponibile un'applicazione per il monitoraggio e il pacing che consente di tarare il sistema (File Supplementare 3 e File Supplementare 11).
    NOTA: È essenziale verificare che non vi siano perdite di pressione né bolle nel sistema. Se nel sistema sono presenti bolle, bloccare temporaneamente l'uscita inferiore del serpentina e aprire la valvola superiore; ciò provocherà il riempimento della colonna, consentendo alle bolle di fuoriuscire all'esterno. Non è consigliabile proseguire con l'esperimento finché questa condizione non è stata verificata.

5. Sistema ottico14

  1. Assemblare la fotocamera CMOS (Figura 1A, 10), l'obiettivo regolabile della fotocamera (LC) e il sistema di illuminazione.
    NOTA: Il sistema di illuminazione è composto da due LED (Figura 1A, 9), due lenti di illuminazione piano-convesse (LI), un controllo dell'illuminazione (Figura 1A, 11), una scheda di acquisizione (File Supplementare 1, sistema di monitoraggio) e pezzi di supporto progettati in 3D (File Supplementare 1).
  2. Posizionare un oggetto di riferimento con un volume di circa 1.000 mm3 a una distanza di 100–200 mm dall'obiettivo della fotocamera (centro della Figura 1A).
    NOTA: L'oggetto deve essere posizionato nella posizione del cuore nel sistema Langendorff. Questa posizione può essere osservata nella Figura 1B, in particolare al centro dell'immagine dove i fasci luminosi incidono.
  3. Avviare il software di acquisizione della fotocamera, quindi impostare la fotocamera con un sottocampionamento di 4x (4 pixel = 1 sottopixel). Impostare una regione di interesse (ROI) di 200 x 200 sottopixel (File Supplementare 2).
    NOTA: Con questa configurazione, è possibile ottenere una risoluzione temporale di 750 fotogrammi al secondo (fps).
  4. Accendere il sistema di illuminazione (File Supplementare 1), regolare i fasci luminosi in modo da focalizzarli sull'oggetto di riferimento e ottenere un'illuminazione omogenea (Figura 1B).
  5. Regolare l'intensità della luce sull'oggetto di riferimento per evitare un'eccessiva esposizione dell'immagine.
    NOTA: L'immagine deve apparire come nella Figura 2A (o nella Figura 1C, PC del controller). I riflessi sulla superficie dell'oggetto (cuore) devono essere ridotti al minimo senza perdere la definizione del suo contorno. Questo può essere ottenuto regolando la potenza del controllo dell'illuminazione o riducendo il tempo di esposizione nelle impostazioni della fotocamera.
  6. Mettere a fuoco l'obiettivo della fotocamera per ottenere un'immagine nitida dell'oggetto di riferimento (Figura 1C, PC del controller). Assicurarsi che l'oggetto di riferimento occupi l'80% del campo visivo (Figura 2A) per ottenere una scala di conversione di circa 61 µm per sottopixel.
    NOTA: Il sistema ottico attiva automaticamente il sistema di illuminazione quando la fotocamera è impostata in modalità acquisizione (Figura 1A e File Supplementare 2). Si raccomanda di mantenere la fotocamera in modalità standby in modo che il sistema di illuminazione rimanga spento, attivandolo solo durante i periodi di raccolta dei dati sperimentali per evitare surriscaldamento.

6. Procedure chirurgiche e di cannulazione

  1. Iperizzazione e anestesia
    1. Preparare una miscela anestetica contenente tiletamina-zolazepam (40 mg/kg di peso corporeo del topo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo del topo), quindi diluire fino a 200 µL con soluzione fisiologica.
    2. Somministrare la miscela anestetica per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27 G. Attendere che il topo raggiunga un’anestesia profonda.
      NOTA: Verificare l’assenza di riflessi in risposta a uno stimolo agli arti o alla coda (di solito sono sufficienti 10 minuti).
    3. Somministrare 200 UI di eparina non frazionata per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27 G e attendere circa 5 minuti prima di proseguire con l’esperimento.
  2. Estrazione e cannullazione
    1. Posizionare il topo in posizione supina, rimuovere il pelo e la pelle dalla zona toracica con forbici chirurgiche.
    2. Eseguire un’incisione addominale al di sotto del diaframma, avendo cura di mantenerne l’integrità.
    3. Proseguire con un’incisione trasversale del diaframma ed eseguire rapidamente una toracotomia bilaterale ascendente attraverso le costole, quindi rimuovere la parete costale.
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il cuore. Se il cuore risulta compromesso o danneggiato durante la procedura, si raccomanda di non proseguire l’esperimento.
    4. Trattenere delicatamente le strutture superiori del cuore utilizzando pinzette fini, l’arco aortico e i vasi adiacenti. Sollevare delicatamente per effettuare un taglio al di sotto e verso l’alto, quindi rimuovere insieme cuore e polmoni.
    5. Trasferire rapidamente il cuore in una piastra Petri contenente 50 mL di soluzione di Tyrode a 4 °C per un lavaggio iniziale.
      NOTA: Dal momento dell’incisione del diaframma, l’animale inizierà a manifestare distress respiratorio; da questo punto in poi, vi è una finestra temporale di 60 secondi per eseguire i passaggi 6.2.3–6.2.6. Superare questo limite temporale potrebbe indurre danni ischemici.
    6. Rimuovere i polmoni e il tessuto adiposo in eccesso per esporre l’arco aortico, utilizzando un microscopio stereoscopico e forbici fini.
      NOTA: Durante la pulizia del tessuto, assicurarsi che l’arco aortico non venga danneggiato. Se l’aorta viene recisa al di sotto dell’arteria brachiocefalica, la cannullazione risulterà difficoltosa, con possibili perdite di pressione.
    7. Trasferire il cuore nella base appositamente realizzata per la cannullazione contenente 50 mL di tampone Tyrode a 4 °C e inserire l’estremità aortica nella cannula realizzata su misura da un ago da 20 G (Supplementary File 1).
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la valvola aortica. Se la valvola risulta compromessa, il cuore si gonfierà e la circolazione coronarica non verrà adeguatamente lavata.
    8. Fare due nodi di cannullazione utilizzando sutura in seta 4/0: il primo nell’incavo distale rispetto alla punta della cannula e il secondo prima del tronco brachiocefalico (Supplementary File 1).
    9. Applicare lentamente la soluzione di Tyrode utilizzando una siringa da 1 mL riempita con tampone a temperatura ambiente. Verificare che il tessuto coronarico si schiarisca per confermare una buona cannullazione.
    10. Rimuovere il tessuto adiposo per consentire l’accesso ai ventricoli e alle atria.
      NOTA: Evitare di superare i 5 minuti di cannullazione per preservare la vitalità del cuore.
    11. Trasferire il cuore in un sistema Langendorff e lasciarlo stabilizzare per 30 minuti.
      NOTA: Il cuore viene posizionato al centro del sistema (Figure 1A,B), sospeso verticalmente. Durante l’applicazione del cuore, prestare la massima attenzione per evitare la formazione di bolle d’aria. In caso contrario, la pressione aumenterà oltre i 140 mmHg, il cuore inizierà a gonfiarsi e non sarà più vitale.
      NOTA: Il montaggio Langendorff è completo quando il cuore mostra una risposta meccanicamente stabile, una frequenza di oscillazione naturale di circa 360 battiti al minuto (BPM) e una pressione di perfusione compresa tra 60 e 110 mmHg.

7. Protocollo di stimolazione e registrazione video

  1. Viabilità del cuore
    1. Verificare che la pressione coronarica sia compresa tra 60 e 110 mmHg con una pompa di perfusione da 3 mL/min. Se la pressione di perfusione coronarica scende al di sotto di 60 mmHg, aumentare leggermente la portata della pompa di perfusione (una pressione troppo bassa renderà il cuore pallido e flaccido). Al contrario, se la pressione supera i 110 mmHg, ridurre leggermente la portata della pompa (una pressione eccessiva indurrà edema tissutale e un aumento progressivo della pressione fino all'arresto cardiaco).}
      NOTA: Mantenere la pressione di perfusione al di fuori del range ottimale sopra indicato per un periodo prolungato comprometterà irreversibilmente la viabilità del cuore.
    2. Posizionare il cuore in posizione frontale in modo da ottenere una vista completa frontalmente attraverso la telecamera. Regolare la posizione in modo che entrambi gli atri siano visibili nell'immagine (Figura 2A).
    3. Posizionare delicatamente gli elettrodi in platino in superficie sulla parte superiore dell'atrio destro, in corrispondenza del nodo del pacemaker. Utilizzare l'immagine della telecamera come guida per portare gli elettrodi nel campo visivo. Posizionare l'elettrodo in modo che non ostruisca l'atrio destro. Monitorando in tempo reale l'immagine della telecamera, avanzare lentamente l'elettrodo fino al contatto con il tessuto atriale, avendo cura di non esercitare una compressione eccessiva (che appiattirebbe l'atrio destro nell'immagine).
      NOTA: Se eseguito correttamente, la vista della telecamera sarà simile alla Figura 2A.
    4. Avviare l'applicazione di monitoraggio e stimolazione (File Supplementare 11) e accendere la scheda di acquisizione (Figura 1A (6)). Impostare i parametri dello stimolo: ampiezza a 2 V, frequenza a 420, 540 e 720 impulsi al minuto (PPM) con un impulso quadrato di duty cycle di 7 ms (insetto della Figura 2A).
    5. Applicare le stimolazioni di viabilità partendo dalla frequenza più bassa, utilizzando una durata di stimolazione di 20 s seguita da un periodo di recupero di 20 s (tempo di riposo) tra un evento e l'altro.
      NOTA: Valutare la viabilità del cuore mediante monitoraggio con telecamera. Se l'organo è fisiologicamente funzionale, si osserverà una sincronizzazione tra lo stimolo applicato e la risposta cardiaca, accompagnata da un'adeguata coordinazione tra i camere cardiache. Al contrario, una mancanza di viabilità si manifesterà con la perdita della coordinazione tra le camere o con la presenza esclusiva di contrazioni atriali isolate.
    6. Chiudere la porta della camera poiché l'esperimento è sensibile alla luce ambientale e alle fluttuazioni termiche (Figura 1C).
      NOTA: La porta della camera deve rimanere chiusa per tutta la durata dell'esperimento. Monitorare la viabilità del cuore mediante telecamera e pressione di perfusione.
  2. Registrazione dei dati
    1. Applicare il protocollo di stimolazione, costituito da treni di impulsi quadrati della durata di 30 s, seguiti da 30 s senza segnale. Impostare i parametri dello stimolo in ciascun treno di stimolazione: ampiezza a 2 V, duty cycle di 7 ms e frequenza compresa tra 360 e 720 PPM.
      NOTA: Il protocollo di stimolazione inizia a 360 PPM e aumenta di 60 PPM a ogni punto temporale (insetto della Figura 2A).
    2. Registrare continuamente i video della dinamica della vista frontale del cuore in formato .avi utilizzando il software di acquisizione della telecamera (File Supplementare 2). Effettuare una registrazione video di 20 s per ogni treno di stimolazione. Registrare il segmento di 20 s a partire da 5 s dopo l'inizio della stimolazione. Un esempio di registrazione grezza è fornito nel Filmato Supplementare 1.
      NOTA: Un computer registra contemporaneamente il treno di stimolazione applicato (.xls, File Supplementare 9) per ogni video registrato (.avi), generati rispettivamente dall'applicazione di monitoraggio e stimolazione e dal software di acquisizione della telecamera (File Supplementare 2 e File Supplementare 3).
    3. Verificare la viabilità del cuore confrontando il primo video, registrato prima di iniziare il protocollo di stimolazione, con il secondo video, registrato dopo l'applicazione del protocollo (Figura 2B).

8. Pulizia del sistema di perfusione di Langendorff al termine dell'esperimento

  1. Rimuovere lo stimolo e gli elettrodi in platino per l'ECG. Rimuovere il cuore dal sistema e svuotare tutte le soluzioni residue di Tyrode.
  2. Spegnere il sistema ottico e chiudere la valvola dell'O2.
  3. Sciacquare il sistema con 1 L di acqua deionizzata a 37 °C, quindi svuotare il sistema.
  4. Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5.
  5. Spegnere tutti i sistemi e l'attrezzatura.

9. Elaborazione del video

  1. Importare innanzitutto ciascun video in un software informatico e applicare una funzione di normalizzazione del video15.
  2. Selezionare un'area di interesse (ROI) che comprenda la zona cardiaca. Eseguire la segmentazione dell'immagine per rimuovere il rumore di fondo, gli elettrodi e la cannula (File Supplementare 4).
    NOTA: Per selezionare correttamente l'area dell'immagine da rimuovere, consultare il File Supplementare 10.
  3. Eseguire un'analisi globale della dinamica meccanica (File Supplementare 5). Esempi di variabilità e segnali di supporto sono mostrati in Figura Supplementare S1, Figura Supplementare S2 e Figura Supplementare S3.
    1. Applicare operatori morfologici a ciascun fotogramma del video per rilevare il perimetro cardiaco, quindi applicare un algoritmo di riempimento del fotogramma per generare una maschera15.
    2. Contare i pixel all'interno dell'area segmentata in ciascun fotogramma, quindi normalizzare questo valore rispetto al numero totale di pixel nell'immagine per produrre un segnale dinamico (inset in Figura 2B e Figura Supplementare S3).
    3. Applicare un filtro di Butterworth bidirezionale del 5° ordine tra 3 e 100 Hz al segnale ottenuto per sopprimere il rumore ad alta frequenza e gli artefatti dovuti alle gocce di perfusione15.
    4. Normalizzare i segnali in tutti i video utilizzando i valori massimo e minimo registrati.
    5. Determinare la frequenza cardiaca calcolando l'intervallo tra due valori di ampiezza massima (IAA (s)) per ciascun segnale dinamico e di stimolo.
    6. Ottenere la frequenza in BPM con la seguente formula:
      Equazione di calcolo della frequenza che mostra la frequenza cardiaca in BPM pari a 60 diviso IAA.
    7. Generare mappe di Poincaré dai dati IAA per illustrare la variabilità su periodi brevi e lunghi16,17,18 (Figura Supplementare S1 e Figura Supplementare S2).
      NOTE: Per informazioni più dettagliate, consultare il File Supplementare 10.
  4. Eseguire un'analisi segmentale della dinamica meccanica ventricolare (File Supplementare 6).
    1. Applicare la binarizzazione dell'immagine. Utilizzare operatori morfologici per delimitare l'area ventricolare, adattandola a una geometria ellittica senza compromettere l'ROI15.
    2. Adattare un'ellisse minima all'area ventricolare in ciascun fotogramma. Estrarre le coordinate di un insieme di punti distali in un fotogramma. Utilizzare un insieme di 10–20 punti in ciascuna estremità lungo l'asse Y (Figura 3A). Un esempio rappresentativo dell'output della stima dell'ellisse è fornito in Filmato Supplementare 2.
    3. Calcolare l'accorciamento ventricolare come distanza media tra i punti estremi lungo l'asse Y in ciascun video19.
    4. Applicare un filtro di Butterworth bidirezionale del 5° ordine tra 3 e 100 Hz al segnale ottenuto per sopprimere il rumore ad alta frequenza e gli artefatti dovuti alle gocce di perfusione15.
    5. Normalizzare il segnale di accorciamento ventricolare rispetto a tutti i video ottenuti per ciascun pacing e calcolare la frequenza cardiaca e il ritardo come nei passaggi 9.3.5–9.3.6.
      NOTE: Vengono ottenuti parametri come durata del ciclo ventricolare (DVE), durata del rilassamento (DVW), intervallo interventricolare (IVV) e ampiezza ventricolare (VA) (Figura 3A).
      NOTE: Per informazioni più dettagliate, consultare il File Supplementare 10.
  5. Eseguire un'analisi segmentale della dinamica meccanica degli atri (File Supplementare 7).
    1. Utilizzare due ROI per delimitare gli atri (Figura 3C).
    2. Analizzare ciascun atrio singolarmente.
      1. Utilizzare operatori morfologici per delineare gli atri, regolandoli senza compromettere l'ROI15. Utilizzare un algoritmo di aumento del contrasto per delineare ciascun atrio20,21.
      2. Applicare la binarizzazione dell'immagine e quantificare il numero di pixel diversi da zero per fotogramma per ottenere un segnale dinamico atriale.
      3. Applicare un filtro di Butterworth bidirezionale del 5° ordine tra 3 e 100 Hz ai segnali ottenuti per sopprimere il rumore ad alta frequenza e gli artefatti dovuti alle gocce di perfusione15.
      4. Calcolare la media dei due segnali atriali (Figura 3D).
    3. Normalizzare il segnale di accorciamento atriale rispetto a tutti i video ottenuti per ciascun pacing e calcolare la frequenza cardiaca e il ritardo come nei passaggi 9.3.5–9.3.6.
      NOTE: Vengono ottenuti parametri come durata del ciclo atriale (DAE), intervallo atrio-atriale (IAT) e ampiezza atriale (AA) (Figura 3D). Per informazioni più dettagliate, consultare il File Supplementare 10.
  6. Eseguire un'analisi elettromeccanica13,22 (File Supplementare 8).
    1. Confrontare i dati di pacing con i segnali atriali e ventricolari (Figura 3D).
    2. Calcolare il tempo di propagazione nel sistema di conduzione cardiaco, ottenendo il ritardo tra gli eventi atriali e ventricolari (AVD), assumendo lo stimolo applicato come riferimento.

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Risultati

Gli esperimenti sulla funzione meccanica cardiaca vengono eseguiti utilizzando l'apparato di Langendorff, come mostrato in Figura 1A (in alto). I sistemi di monitoraggio e ottico permettono la registrazione video quando viene attivato il controllo dell'illuminazione, come mostrato in Figura 1A (in basso). Figura 1C illustra la vista esterna dell'armadio a controllo termostatico, progettato per mante...

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Discussione

Il cuore del mouse è molto sensibile alle variazioni di temperatura2,9,10,11,22. In questo esperimento, il cuore perfuso è stato posizionato verticalmente. È stata inclusa una leggera modifica per ridurre al minimo la perdita di temperatura del perfusato e gli artefatti di movimento nel metodo di perfusione Langendorff. È stata aggiunta una pompa di ricircolaz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un contributo della Segreteria della Scienza, delle Scienze Umane, della Tecnologia e dell'Innovazione (SECIHTI) finanziato con il numero LN-2025-C-23.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLBD Plastipak302485Procedura chirurgica
Ago da 20 GNIPROAH-2032Canula aortica
Lente regolabile da 25 mm con ingrandimento 8x-100xGenericoN/ALente della telecamera del sistema ottico; citata genericamente come lente regolabile per telecamera
Ago da 27 GBD PrecisionGlide302358Procedura chirurgica
Componenti di supporto personalizzati progettati in 3DCINVESTAVN/AComponenti di supporto personalizzati progettati in 3D
Filo di sutura in seta 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901Canula aortica
Alimentatore 40-ASTERENPRL-25Alimentatore per LED
Pietra aeranteN/AN/AOssigenazione della soluzione di Tyrode
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Soluzione di Tyrode
D-GlucosioJ.T. Baker1916-01Soluzione di Tyrode
Pompa di drenaggioCINVESTAVN/APompa di drenaggio personalizzata; citata genericamente come pompa di drenaggio
Lente piano-convessa F = 25,4 mmTHORLABSLA1951-ALente di illuminazione del sistema ottico; citata genericamente come lente di illuminazione piano-convessa
Acido acetico glacialeSigma-Aldrich695092Pulizia del sistema Langendorff
EparinaPiSA060M91Anticoagulante
HEPESSigma-AldrichH3375Soluzione di Tyrode
LED ad alta potenzaLuminiusCBT-90-G-L11-C12Sorgente luminosa a LED
Sistema di illuminazioneCINVESTAVN/ASistema di illuminazione personalizzato; citato genericamente come sistema di illuminazione
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Soluzione di Tyrode
Software LabVIEW versione 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/ASoftware utilizzato per eseguire l'applicazione di monitoraggio e stimolazione; citato genericamente come applicazione di monitoraggio e stimolazione
Software MATLABThe MathWorksN/ASoftware computazionale per programmi di normalizzazione, segmentazione e analisi video; citato genericamente come software computazionale
Ossigeno medicaleGRUPO INFRAN/AOssigenazione della soluzione di Tyrode
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Soluzione di Tyrode
Mini-pompa a flusso variabileCONTROL COMPANY3385Pompa di perfusione
Kit chirurgico per topiKent ScientificINSMOUSEKITProcedura chirurgica
NaClSigma-AldrichS5886Soluzione di Tyrode
NaH2PO4DEQDEQF290400250Soluzione di Tyrode
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108Regolazione del pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Scheda di acquisizione
Elettrodi in platino, diam. 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elettrodi per stimolazione elettrica
Alimentatore (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AAlimentatore per ricircolatore
Monitor di pressioneCINVESTAVN/AMonitor di pressione personalizzato; citato genericamente come monitor di pressione
Trasduttore di pressioneLA BOUVETB17295Monitor di pressione per sistema Langendorff
Alcol etilico puroSigma-Aldrich493511Etilene per la pulizia del sistema
Bagno termico ricircolante (LXC)PolyScienceL113A0412Ricircolatore del serbatoio
Soluzione salinaPiSA111848Soluzione allo 0,9% di cloruro di sodio (NaCl)
Bagno termico serpentinoCINVESTAVN/ARicircolatore/bagno termico serpentino personalizzato
StereomicroscopioN/AN/AProcedura chirurgica
Illuminazione dello stereomicroscopioN/AN/AProcedura chirurgica
Software uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/ASoftware di acquisizione della telecamera; citato genericamente come software di acquisizione della telecamera
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Telecamera CMOS ad alta velocità; citata genericamente come telecamera CMOS
XilazinaPiSA4001211Anestetico
Zoletil 100Virbac83048907Miscela anestetica di tiletamina-zolazepam; citata genericamente come miscela anestetica

Riferimenti

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

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