Articolo di ricerca
Utilizzando bioinformatica, machine learning e validazione qPCR, questo studio ha identificato cinque biomarcatori candidati associati alla SUMOilazione e alla disfunzione mitocondriale nell'insufficienza cardiaca. Questi risultati migliorano la comprensione dei meccanismi dell'insufficienza cardiaca e suggeriscono possibili direzioni per future ricerche diagnostiche.
L'insufficienza cardiaca (IC) rappresenta una sfida clinica persistente. Sebbene la SUMOilazione e la funzione mitocondriale siano vitali per la salute dei cardiomiociti, la loro influenza combinata sull'IC rimane sfuggente. Due dataset relativi all'HF sono stati scaricati da GEO. I geni sovrapposti sono stati ottenuti da tutti i geni del set di addestramento, dai geni correlati al SUMO e dai geni legati al mitocondriale. Sono stati applicati tre algoritmi di machine learning per identificare geni chiave diagnostici. Successivamente, sono stati costruiti e valutati modelli diagnostici basati su questi geni. Inoltre, il microambiente immunitario nell'IC rispetto ai controlli sani è stato valutato utilizzando CIBERSORT, MCP-counter e ssGSEA. Sono state analizzate le differenze nell'infiltrazione immunitaria tra IC e controlli sani. Sono state effettuate previsioni di farmaci e agganciamento molecolare per identificare potenziali candidati farmaci che prendevano di mira questi geni. Infine, la qPCR è stata impiegata per validare i livelli di espressione genica nei campioni clinici. Sono stati identificati in totale 113 geni comuni con un notevole arricchimento nella regolazione mitocondriale. Cinque geni chiave, ovvero NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 e FKBP4, sono stati identificati da tre algoritmi di machine learning. Le analisi di arricchimento funzionale collegavano questi geni alla risposta immunitaria, al processamento dell'RNA e alla regolazione del ciclo cellulare. Inoltre, il profiling dell'infiltrazione immunitaria ha rivelato che l'infiltrazione dei neutrofili contribuisce a risposte immunitarie disregolate nell'HF. L'aggancio molecolare ha rivelato che il farmaco a piccole molecole IMX-942 ha un'affinità di legame favorevole con SQSTM1 (-5,8 kcal/mol). La validazione qPCR supportava i risultati della bioinformatica. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 e FKBP4 sono stati identificati come geni chiave che collegano la SUMOilazione e la funzione mitocondriale nell'IC. Questi risultati forniscono nuove intuizioni sulla fisiopatologia dell'IC e possono contribuire allo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche.
L'insufficienza cardiaca (IC), stadio finale di varie malattie cardiovascolari, è caratterizzata da una funzione cardiaca compromessa che non soddisfa le esigenze metaboliche delcorpo. Questa condizione debilitante rappresenta minacce significative per la salute dei pazienti, portando a una diminuzione della qualità della vita e a tassi di mortalitàelevati 2. Le attuali modalità diagnostiche per l'IC includono principalmente la rilevazione dei marcatoribiochimici 3,4, l'ecocardiografia e l'imagingradiologico 5. Sebbene i trattamenti disponibili comprendano agenti farmacologici, interventi basati su dispositivi e procedure chirurgiche, gli esiti clinici rimangonoinsoddisfacenti 6. Limitazioni come reazioni avverse ai farmaci, applicabilità limitata dei dispositivi, rigetto immunitario e altre complicazioni ostacolano frequentemente l'efficacia terapeutica 7,8,9,10,11. Pertanto, è urgente chiarire i meccanismi sottostanti dell'IC, identificare biomarcatori diagnostici precoci e precisi e sviluppare strategie terapeutiche più efficaci e sicure.
Piccole proteine modificatrici simili all'ubiquitina (SUMO) vengono coniugate covalentemente ai residui di lisina delle proteine del substrato attraverso un processo dinamico e reversibile, regolando la struttura e la funzione delle proteine delsubstrato 12. La SUMOilazione, una modifica post-traduzionale critica, funge da regolatore chiave di vari processicellulari 13,14. Le mitocondrie, in quanto centro energetico-metabolismo delle cellule, sono coinvolte in modo critico nella patogenesi dell'IC. Nel processo patologico dell'IC, la disfunzione mitocondriale, come la produzione insufficiente di ATP, la rottura delle specie reattive di ossigeno (ROS) e lo squilibrio dell'omeostasi Ca2+, contribuisce in modo significativo allaprogressione 15,16,17,18. In particolare, le evidenze emergenti suggeriscono una possibile interazione tra SUMOilazione e funzione mitocondriale. Lo stress mitocondriale può innescare vie correlate alla SUMOilazione, mentre le proteine SUMO e le loro proteasi specifiche sono essenziali per mantenere l'omeostasi mitocondriale 19,20,21. Studi recenti hanno ulteriormente evidenziato l'importanza del controllo della qualità mitocondriale e della dinamica mitocondriale nelle malattie cardiovascolari e della progressione dell'IC22,23. Tuttavia, l'effetto sinergico della SUMOilazione e della regolazione mitocondriale sullo sviluppo dell'IC rimane poco chiaro, soprattutto a livello genico.
In questo studio, abbiamo indagato sistematicamente i geni all'intersezione tra SUMOilazione e disfunzione mitocondriale nell'HF, due processi biologici chiave che sono stati individualmente implicati nell'HF ma non ancora completamente integrati. I geni sovrapposti sono stati identificati tramite geni differenzialmente espressi e intersecati legati all'HF, geni correlati alla SUMOilazione e geni correlati ai mitocondri. I geni chiave sono stati poi selezionati utilizzando algoritmi di machine learning e utilizzati per costruire un modello diagnostico. Sono state inoltre effettuate analisi di arricchimento funzionale e infiltrazione immunitaria per esplorare i loro potenziali ruoli biologici nell'IC. Questo approccio integrato potrebbe fornire un quadro sistematico per esplorare la comunicazione tra SUMOilazione e disfunzione mitocondriale nell'IC.
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Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico del Terzo Ospedale dell'Università Medica di Hebei (W2025-065-1) nel novembre 2024. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio.
Sorgente dei dati e preelaborazione
Sono stati raccolti dati RNA-seq associati all'HF, inclusi due dataset di microarray dal Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Sono stati selezionati due dataset di microarray del sangue periferico: GSE59867 (34 campioni di HF e 30 controlli) è stato utilizzato come dataset di addestramento; GSE57338 (177 campioni HF e 136 controlli) è stato utilizzato come dataset di validazione. Le informazioni cliniche disponibili per GSE57338, inclusi età, genere e stato patologico, sono state recuperate da GEO e sono riassunte nella Tabella Supplementare 1. Inoltre, un totale di 3.893 geni correlati alla SUMOilazione (SRG) sono stati ottenuti dal database dbPTM (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (Tabella Supplementare 2), mentre 2.030 geni correlati ai mitocondri (MRG) sono stati raccolti sulla base di uno studioprecedente 24 (Tabella Supplementare 3). Successivamente, il pacchetto R GEOquery (v 2.72.0)25 è stato utilizzato per scaricare dataset dal database GEO, estrarre la matrice di espressione e ottenere le informazioni sul fenotipo campionario. L'annotazione veniva eseguita mappando il file di annotazione e abbinando gli ID dei geni. Le identificazioni geniche invalide sono state rimosse e le sonde più espresse sono state mantenute.
Selezione dei geni chiave tramite apprendimento automatico
È stato utilizzato un approccio a più fasi per selezionare i geni correlati all'HF, alla SUMOilazione e ai mitocondri. Innanzitutto, i geni comuni tra il dataset di addestramento, gli SRG e i MRG sono stati identificati tramite analisi di intersezione. La funzione potenziale dei geni comuni è stata identificata tramite l'analisi di arricchimento da Gene Ontology (GO) e dalla Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando il pacchetto R ClusterProfiler (v 4.12.6)26. Successivamente, sono stati impiegati tre approcci di apprendimento automatico, ovvero regressione LASSO, XGBoost e foresta casuale (RF), per filtrare ulteriormente i geni. Nella regressione LASSO, il parametro ottimale di regolarizzazione λ è stato selezionato tramite validazione incrociata per identificare le caratteristiche genetiche con il valore predittivo più alto. I geni con coefficienti diversi da zero sono stati selezionati per analisi successive. Successivamente, sono stati utilizzati algoritmi XGBoost e RF per calcolare i punteggi di importanza delle caratteristiche e selezionare i primi 20 geni.
Costruzione e valutazione di modelli diagnostici
È stato costruito un modello diagnostico utilizzando la regressione logistica basato sul dataset GSE59867. Il modello è stato poi applicato per prevedere lo stato della malattia e calcolare i punteggi di probabilità. Per convalidare il modello, gli stessi geni chiave sono stati estratti dal dataset GSE57338, normalizzati per corrispondere al dataset di addestramento e utilizzati per previsioni esterne. Le prestazioni del modello sono state valutate utilizzando curve Receiver Operating Characteristic (ROC), matrice di confusione, curva di calibrazione e analisi della curva decisionale (DCA).
Analisi dell'arricchimento dei set genici (GSEA) e localizzazione subcellulare
L'analisi di correlazione di Spearman è stata utilizzata per identificare geni correlati per ciascun gene chiave. L'analisi GSEA è stata effettuata utilizzando il pacchetto R ClusterProfiler (v 4.12.6) sui geni correlati ai geni chiave. Nel frattempo, per determinare la localizzazione subcellulare precisa dei geni chiave all'interno della cellula, la loro localizzazione subcellulare è stata determinata utilizzando il database GeneCards (https://www.genecards.org/).
Associazione gene-malattia e previsione dei farmaci
Per valutare la rilevanza clinica dei geni chiave identificati, sono state effettuate analisi sistematiche di associazione alla malattia e interazione farmacologica. Le associazioni malattia-gene sono state esaminate utilizzando il Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/), con i risultati classificati sia per punteggi di inferenza sia per il conteggio dei riferimenti (le prime 10 associazioni riportate). I dati di interazione gene-farmaco per geni chiave sono stati ottenuti dal database Drug-Gene Interaction (DGIdb), mentre i farmaci sono stati esclusi sulla base di un punteggio di interazione < 0,5. Successivamente, abbiamo scaricato le strutture 3D delle proteine corrispondenti ai geni chiave dal database PDB (https://www.rcsb.org/) e le strutture molecolari dei potenziali farmaci da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Successivamente, è stata effettuata un'analisi di aggancio molecolare utilizzando CB-Dock227 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) per calcolare i punteggi di legame tra i potenziali farmaci e le proteine. Un'energia libera di legame più bassa indica un'interazione più stabile, suggerendo che il composto possa avere un potenziale di puntamento maggiore.
Analisi dell'infiltrazione immunitaria
L'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata valutata utilizzando tre metodi complementari: Microenvironment Cell Populations-counter (MCP-counter)28, identificazione dei tipi cellulari stimando sottoinsiemi relativi di trascritti di RNA (CIBERSORT)29 e analisi di arricchimento a campione singolo (ssGSEA)30. L'analisi MCP-counter e CIBERSORT veniva eseguita utilizzando il pacchetto R IOBR (v 0.99.0)31. Il contatore MCP è stato utilizzato per stimare l'abbondanza delle cellule immunitarie e stromali, mentre CIBERSORT è stato impiegato per quantificare le proporzioni relative di 22 tipi di cellule immunitarie. ssGSEA è stato eseguito utilizzando il package GSVA (v1.52.3)32 per valutare l'arricchimento a livello campione dei sottotipi di cellule immunità.
Costruzione della rete regolatoria concorrente dell'RNA endogeno (ceRNA)
Per indagare i potenziali ruoli regolatori miRNA–lncRNA associati ai geni chiave precedentemente identificati, è stata costruita una rete regolatoria per ceRNA. Il pacchetto R multiMiR (v 1.26.0)33 è stato utilizzato per prevedere potenziali interazioni microRNA (miRNA)–mRNA per geni chiave, integrando dati da PITA (https://omictools.com/pita-tool/) e dal database miRDB (https://mirdb.org/). Sono state selezionate coppie miRNA–mRNA con alta fiducia e coerenza. Successivamente, le interazioni lncRNA–miRNA sono state recuperate dal database StarBase (https://rnasysu.com/encori/) e filtrate per le interazioni supportate da ≥ 10 esperimenti CLIP-seq e categorizzate come lincRNA. Una rete ceRNA è stata costruita integrando interazioni lncRNA-miRNA-mRNA.
Validazione qPCR
Per validare l'espressione dei geni chiave, sono stati raccolti campioni di sangue da pazienti con IC e controlli sani dalla coorte clinica (n = 6 per gruppo) presso il Terzo Ospedale della Hebei Medical University (W2025-065-1) secondo protocolli approvati e consenso informato. L'RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente TRIzol in combinazione con cloroformio e isopropanolo. Dopo l'estrazione, l'RNA veniva sciolto in acqua trattata con DEPC, e la sua concentrazione e purezza venivano valutate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Per l'analisi trascrizionale, l'RNA è stato trascritto inversamente in cDNA utilizzando il Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix per RT (con dsDNase). Successivamente è stata eseguita una PCR quantitativa utilizzando il Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. Le sequenze specifiche di primer sono dettagliate nella Tabella dei Materiali. I livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCT , con la normalizzazione appropriata.
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software R e GraphPad Prism. Confronti statistici tra due gruppi indipendenti sono stati effettuati utilizzando il test t di Student o il test U di Mann-Whitney, a seconda della distribuzione dei dati. Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato indicativo di significatività statistica.
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Identificazione e arricchimento funzionale dei geni intersecanti
Per identificare geni coinvolti nella SUMOilazione e nella funzione mitocondriale nell'IC, il controllo qualità è stato eseguito inizialmente sul set di addestramento GSE59867 (Figura Supplementare 1A). È stata condotta un'analisi di intersezione a tre vie tra tutti i geni del set di addestramento, SRG e MRG, identificando 113 geni sovrapposti (
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L'IC, uno stadio progressivo e terminale di varie malattie cardiovascolari, è caratterizzato da meccanismi fisiopatologici altamente complessi emultifattoriali 17,34. Sebbene sia la SUMOilazione che la disfunzione mitocondriale siano state individualmente implicate nell'IC, i loro potenziali ruoli sinergici restano insufficientemente esplorati, soprattutto a livello genico. Nel presente studio, abbiamo identificato cinque geni ch...
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Medical Science Research Project of Hebei (numero della borsa: 20250084).
Gli Autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostituito del cloroformio | Servicebio | G3014-02 | reagente qPCR |
| Acqua trattata con DEPC | Biosharp | BL510A | reagente qPCR |
| Mix di sintesi di primo strand cDNA rapido per RT (con dsDNase) | Albatross Biology | 500-101 | reagente qPCR |
| Mix SYBR Green Fast Taq qPCR | Albatross Biology | 500-102 | reagente qPCR |
| Primeri FKBP4 | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Inversa: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’ |
| Isopropanolo | Hushi | 80109218 | reagente qPCR |
| Primeri MYEF2 | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Inversa: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’ |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000C | reagente qPCR |
| Primeri NFKB1 | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Inversa: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’ |
| Primeri NSUN2 | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Inversa: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’ |
| Primeri SQSTM1 | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Inversa: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’ |
| Reagente TRIzol | Vazyme | R401-01 | reagente qPCR |
| Primeri β-actina | Tsingke | N/A | Direzione: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Inversa: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’ |
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