Questo protocollo descrive un metodo standardizzato di agopuntura meccanica che utilizza un dispositivo di stimolazione vibratoria per fornire una stimolazione dell'ago riproducibile nel punto di agopuntura HT7 in ratti. Validato in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina, questo metodo fornisce una piattaforma quantitativa e riproducibile per lo studio dei meccanismi neurofisiologici periferici e centrali alla base degli effetti mediati dall'agopuntura.
Articolo metodologico
Uno strumento di agopuntura meccanica per la stimolazione vibratoria riproducibile dei punti di agopuntura nei ratti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sebbene l'agopuntura manuale sia ampiamente utilizzata nella ricerca sperimentale e clinica, la sua applicazione è limitata da una scarsa riproducibilità causata dalla variabilità dipendente dall'operatore nella manipolazione dell'ago. Per superare tale limitazione, è stato sviluppato uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) in grado di erogare una stimolazione vibratoria controllata attraverso un ago da agopuntura inserito, senza l'uso di corrente elettrica. Questo articolo presenta un protocollo standardizzato per l'applicazione della stimolazione con MAI nel punto di agopuntura HT7 in ratti, inclusi il preparazione dell'animale, la localizzazione del punto di agopuntura, l'inserimento dell'ago, la configurazione dei parametri di stimolazione e la valutazione comportamentale. Studi rappresentativi di validazione hanno mostrato che la stimolazione con MAI in HT7 riduce l'attività locomotoria indotta dalla cocaina e attiva in modo preferenziale le vie delle fibre A associate ai meccanocettori. Ulteriori studi hanno confermato il coinvolgimento degli afferenti periferici ulnari, della via del cordone posteriore e della circuitazione della ricompensa mesolimbica nella mediazione di questi effetti. I risultati rappresentativi presentati in questo articolo si basano su studi di validazione precedentemente pubblicati che utilizzano la piattaforma MAI. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e quantitativo per indagare i meccanismi neurofisiologici della stimolazione dell'agopuntura in modelli animali sperimentali.
Introduzione
L'agopuntura manuale è un metodo tradizionale di stimolazione basato sull'uso di aghi che eroga un input meccanico dinamico ai tessuti periferici attraverso la manipolazione diretta dell'ago ed è stata ampiamente utilizzata sia in ambito clinico che sperimentale1,2. A differenza dell'elettroagopuntura (EA), l'agopuntura manuale genera una stimolazione meccanica complessa, comprendente la deformazione dei tessuti e l'attivazione dei meccanocettori periferici, mediante la manipolazione fisica dell'ago inserito2. Si ritiene che questi componenti meccanici contribuiscano in modo significativo agli effetti fisiologici caratteristici dell'agopuntura e che attivino le vie afferenti somatosensoriali in modo diverso rispetto alla stimolazione elettrica3,4.
Nonostante la sua rilevanza fisiologica e l'ampio utilizzo, l'applicazione sperimentale dell'agopuntura manuale rimane limitata da una scarsa riproducibilità2. Gli effetti terapeutici dell'agopuntura manuale dipendono in larga misura da fattori legati all'operatore, tra cui le tecniche di manipolazione dell'ago, l'intensità, la frequenza e la durata della stimolazione, che possono variare notevolmente tra i diversi praticanti e le condizioni sperimentali1. Questa variabilità rappresenta un ostacolo significativo per gli studi meccanicistici volti a stabilire relazioni causali tra la stimolazione dell'agopuntura e gli esiti neurofisiologici.
Per superare queste limitazioni, l'elettroacupuntura (EA) è stata spesso adottata come metodo alternativo poiché consente un controllo preciso dei parametri di stimolazione come frequenza, ampiezza e durata. Tuttavia, l'EA introduce un input elettrico che potrebbe attivare vie neurali diverse da quelle reclutate dalla stimolazione manuale5. Di conseguenza, rimane difficile isolare e valutare il contributo specifico della stimolazione meccanica, che rappresenta un componente fondamentale dell'agopuntura manuale tradizionale. È quindi necessario un metodo riproducibile in grado di erogare una stimolazione meccanica controllata senza interferenze elettriche per la ricerca meccanicistica sull'agopuntura.
Per affrontare questa limitazione, nel 2013 è stato sviluppato uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) in grado di riprodurre una stimolazione meccanica basata sulle vibrazioni, consentendo al contempo un controllo quantitativo dei parametri di stimolazione3,5. Questo dispositivo eroga una stimolazione vibratoria controllata direttamente all'ago da agopuntura inserito, standardizzando così l'input meccanico applicato al tessuto. Mediante questo approccio, studi precedenti hanno dimostrato che l'agopuntura meccanica modula circuiti neurali somatosensoriali, legati alla ricompensa e autonomi, in diversi modelli sperimentali4,6,7,8. Ad esempio, la stimolazione meccanica nei punti di agopuntura HT7 ha attenuato le risposte comportamentali indotte dalla cocaina e la dipendenza da alcol mediante la modulazione del circuito dopaminergico mesolimbico, delle vie oppioidi endogene e dei circuiti di rilè somatosensoriali6,7. Inoltre, una stimolazione combinata meccanica ed elettrica applicata a punti neurogeni ha soppresso l'ipertensione attraverso meccanismi mediati dagli oppioidi in regioni centrali del sistema autonomo5. Nel complesso, circa 30 studi condotti con questa piattaforma hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi d'azione dell'agopuntura in relazione alla dipendenza, alla regolazione autonoma e ad altre condizioni sperimentali.
A differenza dei sistemi generali di stimolazione basati solo sulle vibrazioni, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro integrato per l’agopuntura meccanica, non elettrica, accoppiata a un ago, eseguita su ratti svegli. Il protocollo combina l’assemblaggio del dispositivo, l’accoppiamento ago-motore, la standardizzazione della profondità di inserimento, la calibrazione basata su accelerometro, la localizzazione dei punti di agopuntura e una validazione comportamentale rappresentativa mediante stimolazione di HT7 in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina nei ratti. Pertanto, questo articolo fornisce un protocollo sperimentale riproducibile per la stimolazione controllata di agopuntura meccanica, piuttosto che presentare un nuovo dispositivo terapeutico.
L'output standardizzato e quantitativamente controllato del MAI potrebbe inoltre fornire una piattaforma utile per l'integrazione futura con approcci analitici basati sui dati. Poiché i parametri di stimolazione come la frequenza delle vibrazioni, l'accelerazione, la profondità di inserzione e la durata della stimolazione possono essere definiti e riprodotti con precisione, queste variabili potrebbero fungere da input strutturati per la modellizzazione computazionale. Studi recenti hanno dimostrato che approcci basati sull'apprendimento automatico, sull'apprendimento profondo e sull'apprendimento per trasferimento possono migliorare l'estrazione di caratteristiche, la classificazione dei segnali, il riconoscimento di pattern e l'ottimizzazione in complessi insiemi di dati provenienti da immagini biomedicali e da segnali basati sulle vibrazioni9,10,11,12. Approcci simili potrebbero potenzialmente essere applicati alla ricerca sull'agopuntura basata sul MAI integrando i parametri di stimolazione con dati comportamentali, neurofisiologici e sull'output delle vibrazioni, al fine di supportare l'analisi dei segnali, la classificazione comportamentale, l'ottimizzazione dei parametri di stimolazione e la previsione delle risposte correlate all'agopuntura. Pertanto, futuri studi che combinino la stimolazione basata sul MAI con metodologie di apprendimento automatico potrebbero ulteriormente aumentare la precisione, la riproducibilità e l'interpretazione meccanicistica della ricerca sull'agopuntura.
È importante notare che i dati di validazione rappresentativi presentati in questo articolo sono riprodotti, adattati o riassunti da studi precedentemente pubblicati che utilizzano la piattaforma MAI. L'obiettivo principale di questo articolo non è riportare nuovi risultati sperimentali, bensì fornire un protocollo dettagliato, passo dopo passo, per l'applicazione riproducibile di stimolazioni standardizzate di agopuntura meccanica in modelli animali sperimentali.
Protocollo
Tutti i protocolli sugli animali descritti in questo articolo sono stati approvati dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Daegu Haany University (DHU2012-008, DHU2022-12) e della Yonsei University College of Medicine (# 2023-0006) e sono stati condotti in conformità con la Guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.
1. Preparazione dello strumento per agopuntura meccanica
- Assemblare lo strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) (Figura 1).
- Preparare uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) costituito da un'unità di controllo su misura e da un vibratore meccanico collegato a un ago da agopuntura (Figura 1D). Utilizzare l'unità di controllo per regolare l'intensità della stimolazione, la frequenza di vibrazione e la durata della stimolazione3,4,13.
- Utilizzare un ago da agopuntura sterile con un diametro di 0,10 mm, un fusto lungo 10 mm e un manico lungo 10 mm. Fissare un tappo di gomma al fusto dell'ago a una distanza di 3 mm dalla punta per standardizzare la profondità di inserimento.
- Collegare il motore vibrante all'ago da agopuntura mediante un connettore stabile di tipo clip. Verificare che l'ago non scivoli durante la vibrazione e che il tappo rimanga fissato durante la stimolazione.
- Configurare i parametri di stimolazione.
- Impostare la condizione di stimolazione su vibrazione continua a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, che genera forme d'onda di accelerazione stabili durante la stimolazione (Figura 1E).
NOTA: Esperimenti di validazione precedenti13 hanno mostrato che l'agopuntura manuale genera frequenze di vibrazione di circa 70–90 Hz e valori di accelerazione medi di circa 1,3 m/s2 (Figura 1A,B). Sulla base di queste misurazioni, il MAI è stato configurato per erogare una stimolazione vibrante a 85 Hz e 1,3 m/s2, che approssima da vicino le caratteristiche meccaniche dell'agopuntura manuale fornendo al contempo un'uscita stabile e riproducibile. La durata di stimolazione di 20 s è stata adottata da studi pubblicati in precedenza sull'ottimizzazione dei parametri13 in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina nel ratto, in cui diverse durate di stimolazione e intensità di accelerazione sono state confrontate per identificare una condizione di stimolazione efficace e ben tollerata. In questo protocollo, il termine "frequenza" si riferisce al componente di frequenza dominante della vibrazione della punta dell'ago misurato dal segnale dell'accelerometro. Questo valore riflette la vibrazione trasmessa alla punta dell'ago durante la manipolazione manuale della manopola piuttosto che il ritmo più lento dei movimenti ripetuti della mano dell'operatore. - Applicare la condizione a 85 Hz e 1,3 m/s2 per generare un modello di vibrazione stabile e riproducibile paragonabile alla manipolazione manuale dell'ago (Figura 1E).
- Impostare la condizione di stimolazione su vibrazione continua a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, che genera forme d'onda di accelerazione stabili durante la stimolazione (Figura 1E).
- Verificare l'uscita della vibrazione.
- Per verificare l'uscita stabile della vibrazione, fissare saldamente la punta dell'ago all'accelerometro in modo che la vibrazione meccanica proveniente dal motore venga trasmessa direttamente dall'ago al sensore.
- Registrare il segnale di accelerazione durante il periodo di stimolazione utilizzando un sistema di acquisizione dati e analizzare il segnale con software LabVIEW o equivalente.
- Definire il valore di accelerazione come l'accelerazione stabile della punta dell'ago misurata durante la fase di plateau della stimolazione, dopo la risposta transitoria iniziale, e calcolare la frequenza di vibrazione dominante dal segnale di accelerazione.
- Eseguire la calibrazione prima di ogni sessione sperimentale e ogni volta che il motore, il connettore, l'ago o l'accoppiamento ago-motore vengono sostituiti o regolati.
- Procedere con gli esperimenti sugli animali solo quando la frequenza dominante e l'accelerazione misurate rimangono stabili durante la fase di plateau e rientrano in un intervallo accettabile rispetto ai parametri di stimolazione target, come ad esempio circa ±10% di 85 Hz e 1,3 m/s2.
NOTA: Nelle Figura 1B,E sono riportati esempi di tracce di accelerazione generate durante l'agopuntura manuale e la stimolazione con MAI.
2. Preparazione degli animali e modello di attività locomotoria indotta da cocaina
- Preparare gli animali sperimentali.
- Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 270–320 g per gli esperimenti sull'attività locomotoria indotta dalla cocaina3,4,5. Allevare gli animali in un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
- Assegnare 6–8 animali a ciascun gruppo sperimentale, salvo diversa indicazione.
- Abituare gli animali.
- Abituare ogni ratto alle procedure sperimentali un giorno prima del test. Eseguire una manipolazione delicata e una simulazione di agopuntura senza inserimento dell'ago per 2–3 minuti.
- Posizionare gli animali nella camera per l'attività locomotoria per 90 minuti per ridurre le risposte comportamentali legate allo stress durante le procedure di stimolazione in stato di veglia.
- Prima dell'esperimento di agopuntura, abituare i ratti quotidianamente alla manipolazione manuale delicata e al contenimento leggero per la stessa durata prevista per la procedura di agopuntura.
- Durante la stimolazione, trattenere delicatamente l'animale a mano per stabilizzare il corpo e l'arto anteriore senza esercitare pressione eccessiva. Trattenere allo stesso modo e per la stessa durata anche gli animali del gruppo di controllo senza agopuntura, senza inserire l'ago, per controllare gli effetti generalizzati dovuti allo stress da immobilizzazione.
NOTA: Gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per eseguire in modo costante il contenimento, l'inserimento dell'ago e la stimolazione. - Se si osservano resistenza persistente, vocalizzazioni, tentativi di fuga o altre risposte di stress eccessive, interrompere la procedura e fornire un'ulteriore abituazione prima del test.
NOTA: Eseguire tutte le procedure di stimolazione dell'agopuntura su animali svegli sottoposti a contenimento manuale leggero.
3. Localizzazione dei punti di agopuntura
- Individuare i punti di agopuntura HT7 e LI5.
- Individuare i punti di agopuntura utilizzando il metodo trasposizionale, in cui la posizione del punto di agopuntura umano viene mappata sul corrispondente sito anatomico nell'animale.
- Identificare HT7 (Shenmen) al livello della piega trasversale del polso della zampa anteriore, in posizione radiale rispetto al tendine del muscolo flessore del carpo ulnare3,4,5,8.
NOTA: questa posizione corrisponde anatomicamente alla regione del tunnel ulnare/canale di Guyon, vicino al nervo ulnare. Al contrario, LI5 si trova all'estremità radiale della faccia dorsale del polso, tra i tendini del muscolo estensore del pollice lungo e del muscolo estensore breve del pollice. LI5 è posizionato sul lato opposto rispetto a HT7 e dista circa 5 mm (Figura 1F). Questi punti di riferimento anatomici sono stati utilizzati per garantire una localizzazione riproducibile dei punti di agopuntura14.
- Individuare i punti di controllo di agopuntura.
- Utilizzare LI5 come punto di controllo vicino al polso. Localizzare LI5 a circa 5 mm da HT7, in prossimità dell'estremità distale del radio, tra i tendini del muscolo palmare lungo e del muscolo flessore del carpo radiale.
4. Procedura di stimolazione meccanica
- Eseguire esperimenti sull'attività locomotoria.
- Posizionare il ratto nella camera del campo aperto e consentire 60 minuti di abituazione. Registrare l'attività locomotoria di base per 30 minuti.
- Somministrare cocaina per via intraperitoneale a 15 mg/kg per indurre l'attivazione locomotoria3,4,5. Trattenere leggermente l'animale 1 minuto dopo l'iniezione di cocaina.
- Per standardizzare la profondità di inserzione, montare un tappo di gomma sullo stelo dell'ago in un punto situato a 3 mm dalla punta dell'ago (Figura 1D). Assicurarsi che il tappo sia fissato saldamente in modo da rimanere stabile durante l'inserimento e la vibrazione.
- Durante l'inserimento dell'ago, avanzare l'ago fino a quando il tappo tocca delicatamente la superficie della pelle, evitando una compressione eccessiva della pelle che potrebbe alterare la profondità effettiva di inserzione.
- Applicare stimolazione meccanica.
- Applicare una stimolazione vibratoria continua a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, la condizione di stimolazione ottimizzata identificata negli esperimenti di validazione dei parametri (Figura 2A–C). Mantenere l'ago in posizione per 1 minuto dopo l'inserimento, quindi ritirarlo.
- Continuare la registrazione dell'attività locomotoria fino a 60 minuti dopo l'iniezione di cocaina. Analizzare l'attività locomotoria in intervalli di 10 minuti o come distanza totale percorsa in 60 minuti (Figura 1C).
- Applicare una stimolazione di 20 s come condizione standard poiché questa durata ha prodotto una marcata inibizione dell'attività locomotoria indotta dalla cocaina negli esperimenti di validazione precedenti (Figura 2A–C).
NOTA: Una stimolazione continua di 40 s ha indotto comportamenti simili allo stress, inclusi vocalizzazioni e risposte di evitamento, ed è stata pertanto esclusa dalle condizioni standard di stimolazione.
- Eseguire esperimenti di validazione dei parametri dello stimolo.
- Confrontare durate di stimolazione di 0 s, 10 s, 20 s e 40 s oppure confrontare diversi valori di accelerazione, come 0,7 e 1,3 m/s2, per validare i parametri di stimolazione (Figura 2).
- Applicare una stimolazione a 50 Hz come condizione selettiva per i corpuscoli di Meissner e una stimolazione a 200 Hz come condizione selettiva per i corpuscoli di Pacini negli esperimenti relativi ai meccanocettori, come descritto in precedenza4,8.
5. Acquisizione dei dati e analisi statistica
- Misurare l'attività locomotoria utilizzando un sistema di tracciamento video posizionato sopra l'apparato. Posizionare gli animali in una camera quadrata aperta (40 cm × 40 cm × 45 cm) e quantificare la distanza totale percorsa mediante software di tracciamento video.
- Registrare le tracce di accelerazione-tempo dall'uscita dell'accelerometro durante esperimenti di calibrazione delle vibrazioni. Riportare la frequenza dominante, l'ampiezza dell'accelerazione e la durata della vibrazione stabile (Figura 1D,E).
- Valutare la distribuzione dei dati per verificarne la normalità prima di effettuare analisi statistiche parametriche. Quando i dati soddisfano le assunzioni di normalità, analizzare le differenze tra gruppi mediante analisi della varianza a una o due vie, seguita da opportuni confronti post hoc.
- Eseguire il tracciamento e l'analisi del comportamento da parte di ricercatori ciechi rispetto all'assegnazione sperimentale ai gruppi, ogni volta che possibile.
- Esprimere i dati comportamentali e fisiologici come media ± errore standard della media (SEM). Analizzare l'attività locomotoria mediante analisi della varianza a una o due vie con misure ripetute (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey.
NOTA: Le dimensioni campionarie sono state scelte sulla base di studi precedenti che utilizzavano lo stesso modello di attività locomotoria indotta da cocaina nei ratti e lo stesso protocollo di stimolazione meccanica dell'agopuntura. Per garantire un'adeguata potenza statistica, sono stati utilizzati 6–8 ratti per gruppo. Gli animali sono stati esclusi dall'analisi solo in caso di problemi tecnici o procedurali predeterminati, inclusi localizzazione errata dei punti di agopuntura, malfunzionamento del dispositivo, uscita instabile delle vibrazioni durante la calibrazione o mancato tracciamento video.
Risultati
Convalida della stimolazione meccanica riproducibile
La configurazione rappresentativa del dispositivo e la validazione dell'output di vibrazione mostrate in Figura 1 sono state generate per il presente manoscritto, mentre gli intervalli di riferimento quantitativi per i parametri di vibrazione derivati dall'agopuntura manuale sono stati riassunti da studi di validazione precedenti.
L'MAI è stato convalidato confrontando l'output meccanico generato durante la manipolazione manuale dell'agopuntura con quello prodotto da una stimolazione guidata da dispositivo (Figura 1). La manipolazione manuale di un ago da agopuntura ha prodotto picchi improvvisi e irregolari di accelerazione alla punta dell'ago, con una variabilità considerevole tra operatori13. Nello studio originale di convalida, i valori di accelerazione variavano da 0,1 m/s2 a 2,9 m/s2, con un valore medio di circa 1,3 m/s2, e sono state rilevate frequenze dominanti di vibrazione di circa 70–90 Hz durante la manipolazione manuale dell'ago (Figura 1A,B)3,13.
Sulla base di queste misurazioni, il MAI è stato configurato per erogare una stimolazione vibratoria riproducibile a 85 Hz e 1,3 m/s2. In queste condizioni, il dispositivo ha generato forme d'onda di accelerazione stabili e continue durante la stimolazione, dimostrando che la vibrazione manuale dell'ago può essere convertita in un input meccanico quantificabile e riproducibile (Figura 1D,E).
Questa osservazione rappresenta una validazione meccanica diretta dell'output del dispositivo, piuttosto che un'interpretazione comportamentale o meccanicistica. Questi risultati confermano la capacità della piattaforma MAI di standardizzare la stimolazione meccanica dell'agopuntura mantenendo le caratteristiche vibratorie paragonabili a quelle della manipolazione manuale dell'agopuntura.
Validazione comportamentale in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina
I dati comportamentali mostrati nella Figura 2 sono presentati come dati rappresentativi di convalida da studi precedenti con MAI, utilizzando un modello di attività locomotoria indotta da cocaina in ratto, salvo diversa indicazione nella legenda della figura.
L'efficacia biologica del protocollo è stata valutata utilizzando un modello di attività locomotoria indotta da cocaina (Figura 2). L'amministrazione di cocaina ha notevolmente aumentato l'attività locomotoria, mentre la stimolazione MAI in HT7 ha attenuato in modo significativo l'iperlocomozione indotta dalla cocaina4,5,7,8,13. Questi esperimenti sono stati generalmente condotti con 6–8 ratti per gruppo, e la significatività statistica è stata determinata mediante confronti basati sull'ANOVA come riportato negli studi originali. L'effetto inibitorio dipendeva dalla durata della stimolazione ed è risultato più marcato dopo 20 s di stimolazione a 85 Hz e 1,3 m/s2 (Figura 2A–C).
Esperimenti di ottimizzazione dei parametri di stimolazione hanno ulteriormente dimostrato che l'effetto inibitorio dipendeva dall'intensità della stimolazione e dalla localizzazione del punto di agopuntura. La stimolazione meccanica applicata in HT7 ha ridotto significativamente le risposte locomotorie indotte dalla cocaina, mentre la stimolazione del punto di controllo vicino LI5 in condizioni identiche non è riuscita a sopprimere l'attività locomotoria4,13. Pertanto, l'osservazione comportamentale diretta è stata che la stimolazione di HT7 riduceva l'attività locomotoria indotta dalla cocaina, mentre la stimolazione di LI5 non produceva lo stesso effetto inibitorio in condizioni di stimolazione equivalenti (Figura 2D,E). Questi risultati indicano che l'effetto comportamentale era specifico del punto di agopuntura, piuttosto che una conseguenza aspecifica del contenimento o della stimolazione del polso.
Evidenze di validazione precedenti per i percorsi periferici e centrali coinvolti nella stimolazione dell'MAI
I risultati di questa sezione sono riassunti da precedenti studi di validazione meccanicistica. Esperimenti di validazione periferica e centrale hanno ulteriormente confermato la specificità del protocollo MAI (Figura 3). L'effetto inibitorio della stimolazione di HT7 è risultato significativamente ridotto dopo l'iniezione di anestetico locale e abolito dalla sezione del nervo ulnare, indicando che un segnale afferente periferico ulnare integro è necessario per gli effetti comportamentali della stimolazione dell'agopuntura meccanica3,13. Al contrario, la sezione del nervo radiale o mediano non ha abolito l'effetto inibitorio della stimolazione di HT7, confermando la specificità anatomica del percorso afferente ulnare. Questi esperimenti sono stati eseguiti con dimensioni dei gruppi riportate negli studi originali, tipicamente 6–8 ratti per gruppo, salvo diversamente specificato.
Le registrazioni rappresentative hanno dimostrato che la stimolazione MAI attiva in modo preferenziale le vie dei grandi fibre mielinizzate di tipo A associate ai meccanocettori, inclusi i corpuscoli di Pacini e di Meissner, mentre risposte relativamente più deboli sono state osservate nella via nocicettiva delle fibre C/Aδ5,13. Questa affermazione si riferisce a osservazioni elettrofisiologiche dirette delle risposte afferenti. L'interpretazione secondo cui queste risposte riflettono una segnalazione associata ai meccanocettori è presentata come un'inferenza a livello di via, basata su studi di validazione precedenti. Inoltre, la stimolazione meccanica ulnare ha attivato la via del corno dorsale–nucleo cuneato, e l'interruzione di questa via ha impedito l'effetto inibitorio sulle risposte locomotorie indotte dalla cocaina3. Studi successivi hanno ulteriormente dimostrato il coinvolgimento dell'ipotalamo laterale, della via tra corteccia prefrontale mediale e habenula laterale, del nucleo tegmentale rostromediale e della circuitazione dopaminergica mesolimbica nella soppressione mediata da MAI delle risposte comportamentali legate alla cocaina (Figura 4)3,4,7,8,13,15. Questi studi sulle vie centrali hanno incluso approcci di interruzione o inibizione delle vie, come lesione elettrolitica, lesione chimica indotta dall'acido ibotenico e inibizione optogenetica mediata da alogenodopsina, per verificare se tali circuiti fossero necessari per gli effetti comportamentali della stimolazione di HT7. Poiché questi esperimenti implicano manipolazioni specializzate a livello di circuito, sono qui riassunti come evidenze di validazione precedenti piuttosto che presentati come procedure sperimentali passo dopo passo.
Nel complesso, questi risultati rappresentativi dimostrano che la stimolazione basata su MAI fornisce un protocollo di agopuntura meccanica riproducibile e quantificabile, in grado di attivare vie periferiche definite di meccanocettori e di modulare circuiti neurali e risposte comportamentali legati alla ricompensa.
Figura 1Sviluppo e validazione dello strumento meccanico per l'agopuntura (MAI). (AIllustrazione schematica che mostra la variabilità nella manipolazione dell'agopuntura manuale tra diversi operatori.B) Tracce rappresentative di accelerazione generate durante la manipolazione dell'agopuntura manuale. (C) Effetto dell'agopuntura manuale in HT7 eseguita da quattro operatori diversi sull'attività locomotoria indotta dalla cocaina, che illustra la variabilità tra operatori negli effetti comportamentali della stimolazione manuale. (DImmagine annotata del MAI assemblato che mostra l'ago, la pinza a coccodrillo, il motore vibrante e il tappo di gomma utilizzato per standardizzare la profondità di inserzione di 3 mm.EForma d'onda dell'accelerazione rappresentativa generata dal MAI a 85 Hz e 1,3 m/s2, dimostrando una stimolazione meccanica stabile e riproducibile. (FImmagini rappresentative che mostrano le localizzazioni anatomiche di HT7 e LI5 nella zampa anteriore del ratto. I punti rossi indicano le posizioni dei punti di agopuntura utilizzate per l'inserzione dell'ago. HT7 è stato identificato al livello della piega trasversale del polso in prossimità del tendine del flessore del carpo ulnare, mentre LI5 è stato individuato sul lato radiale della superficie dorsale del polso, tra i tendini dell'estensore del pollice lungo e dell'estensore del pollice breve, fornendo punti di riferimento anatomici riproducibili per la localizzazione dei punti di agopuntura. La figura è stata adattata con autorizzazione da Kim et al.13. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione dei parametri di stimolazione meccanica nel modello di attività locomotoria indotta da cocaina. (A–C) Effetti della durata della stimolazione, dell'intensità della stimolazione e della profondità di inserimento dell'ago sull'attività locomotoria indotta da cocaina. (A) La stimolazione HT7-MAI è stata applicata per 0, 10, 20 o 40 s a 85 Hz e 1,3 m/s2. (B) La stimolazione HT7-MAI è stata applicata per 20 s a diverse intensità di accelerazione. (C) La stimolazione HT7-MAI è stata applicata a diverse profondità di inserimento dell'ago. (D) Tracce rappresentative del movimento durante il test dell'attività locomotoria dopo somministrazione di soluzione fisiologica, cocaina, cocaina più stimolazione HT7 o cocaina più stimolazione LI5. (E) La stimolazione meccanica di agopuntura in HT7, ma non in LI5, applicata a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, ha attenuato significativamente il potenziamento dell'attività locomotoria indotta da cocaina. I dati sono espressi come media ± SEM. *p < 0,05 rispetto al controllo trattato con cocaina. Questa figura è stata adattata con autorizzazione da Kim et al.13. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Validazione degli effetti dell’agopuntura mediata da MAI suiafferenti periferici e sui meccanocettori. (A) Diagramma schematizzato della segnalazione periferico-centrale indotta dall’agopuntura meccanica. La stimolazione vibratoria in HT7 attiva i meccanocettori, inclusi i corpuscoli di Meissner e di Pacini, nei tessuti cutanei e sottocutanei. Questi segnali vengono trasmessi attraverso afferenti mielinizzate di grosso calibro (fibre A) del nervo ulnare ai segmenti midollari C8–T1 e successivamente influenzano il sistema dopaminergico mesolimbico. (B) Effetto dell’iniezione di anestetico locale sull’effetto inibitorio della stimolazione HT7-MAI. L’iniezione di bupivacaina intorno a HT7 ha ridotto l’effetto soppressivo della stimolazione HT7 sull’attività locomotoria indotta dalla cocaina, indicando il coinvolgimento della segnalazione afferente periferica locale. (C–H) Risposte afferenti somatiche delle fibre associate ai corpuscoli di Pacini e di Meissner durante la stimolazione MAI in HT7. (I–N) Risposte delle fibre A e delle fibre C durante la stimolazione MAI in HT7. La stimolazione MAI ha attivato in modo robusto gli afferenti delle fibre A e ha prodotto risposte più deboli nelle fibre C. I dati sono espressi come media ± SEM. *p < 0,05 rispetto al valore basale o al controllo trattato con cocaina, secondo i casi. Questa figura è stata adattata con autorizzazione da Kim et al.13. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Presunta via neurale periferico-centrale alla base della modulazione mediata da MAI delle risposte indotte dalla cocaina e del sistema dopaminergico mesolimbico. La stimolazione di MAI sulla cute attiva i nervi sensoriali periferici e trasmette segnali somatosensoriali attraverso vie ascendenti spinali. Questi segnali vengono trasmessi a circuiti cerebrali che coinvolgono la mPFC, LHb, RMTg, VTA e NAc. L'attivazione del percorso mPFC–LHb–RMTg potrebbe potenziare l'inibizione GABAergica dei neuroni dopaminergici della VTA, riducendo così il rilascio di dopamina nell'NAc e sopprimendo l'attivazione psicomotoria indotta dalla cocaina. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
Questo studio presenta un protocollo standardizzato per l'applicazione dell'agopuntura meccanica mediante un dispositivo di stimolazione vibratoria che consente la somministrazione riproducibile di stimolazione meccanica basata sulle vibrazioni. Fornendo un controllo quantitativo della frequenza di stimolazione, dell'intensità di accelerazione e della durata, questo approccio supera una limitazione fondamentale dell'agopuntura manuale tradizionale, che dipende intrinsecamente dalla tecnica dell'operatore ed è difficile da standardizzare.
Uno dei principali punti di forza di questo protocollo è la capacità di isolare e standardizzare la componente meccanica della stimolazione dell'agopuntura. A differenza dell'agopuntura manuale, che varia notevolmente tra operatori diversi, il MAI genera una stimolazione vibratoria stabile e riproducibile direttamente attraverso l'ago da agopuntura inserito. Questa riproducibilità è particolarmente importante per studi meccanicistici volti a indagare le basi neurali e fisiologiche degli effetti dell'agopuntura.
Rispetto all'elettroagopuntura (EA), il presente protocollo consente di studiare la stimolazione meccanica senza introdurre una corrente elettrica esterna. Questa distinzione è importante perché la stimolazione elettrica può depolarizzare direttamente le fibre nervose periferiche in base all'eccitabilità elettrica, alla configurazione dell'elettrodo, all'intensità della corrente e all'impedenza dei tessuti16,17. Al contrario, l'MAI genera principalmente una deformazione meccanica dei tessuti cutanei e sottocutanei locali circostanti l'ago inserito. Pertanto, questo protocollo riproduce in modo più fedele la componente fisica dell'agopuntura manuale, consentendo al contempo un controllo quantitativo dei parametri di stimolazione.
Studi precedenti di validazione hanno dimostrato che la stimolazione di MAI in HT7 sopprime l'attività locomotoria indotta dalla cocaina attraverso meccanismi afferenti periferici13. L'effetto inibitorio è stato bloccato dall'anestesia locale in corrispondenza di HT7 ed abolito dalla sezione del nervo ulnare, indicando che un segnale afferente ulnare integro è necessario per gli effetti comportamentali della stimolazione dell'agopuntura meccanica. In modo importante, l'effetto inibitorio non è stato prevenuto dal blocco delle vie delle fibre C/Aδ ed è stato riprodotto dalla stimolazione nocicettiva selettiva, suggerendo che la stimolazione di MAI attiva principalmente vie di fibre A mielinizzate di grande calibro piuttosto che afferenti nocicettivi.
La natura basata sui meccanocettori di questo protocollo distingue ulteriormente la stimolazione MAI dall'EA. La frequenza di stimolazione qui descritta rappresenta la frequenza dominante della vibrazione oscillante trasmessa alla punta dell'ago, non il ritmo dei movimenti manuali ripetuti. Studi precedenti hanno dimostrato che le frequenze di vibrazione associate all'attivazione dei corpuscoli di Meissner e di Pacini sopprimono efficacemente le risposte locomotorie indotte dalla cocaina5,18. Questi risultati sostengono l'interpretazione secondo cui l'agopuntura meccanica basata sulla vibrazione attiva afferenti associati a meccanocettori a bassa soglia nei tessuti superficiali e profondi e trasmette i segnali attraverso le vie delle fibre A di grosso calibro del nervo ulnare3,13. Pertanto, il MAI rappresenta un modello sperimentale intermedio tra l'agopuntura manuale e l'EA, mantenendo il componente meccanico basato sull'ago dell'agopuntura manuale e consentendo al contempo di standardizzare e quantificare la stimolazione.
La validità biologica di questo protocollo è ulteriormente supportata da evidenze a livello di pathway. La stimolazione meccanica ulnare attiva il pathway del nucleo cuneato della colonna dorsale, e l'interruzione di questo pathway abolisce l'effetto inibitorio sull'attività locomotoria indotta dalla cocaina3. Al contrario, lesioni del tratto spino-talamico non impediscono l'effetto comportamentale, suggerendo che sono coinvolti i pathway somatosensoriali per la sensibilità tattile innocua e vibrazionale, piuttosto che la segnalazione nocicettiva. Da un punto di vista meccanicistico, questi studi precedenti indicano che la stimolazione HT7 basata su MAI attiva un pathway periferico-centrale che collega le afferenze di fibre mielinizzate di grosso calibro (fibre A) del nervo ulnare alla regolazione della dopamina mesolimbica. Questi segnali somatosensoriali vengono trasmessi attraverso il pathway della colonna dorsale–nucleo cuneato e successivamente reclutano circuiti modulatori mesolimbici a valle, inclusi il pathway mPFC–LHb–RMTg–VTA–NAc. Tale pathway potrebbe contribuire alla soppressione dell'attività locomotoria indotta dalla cocaina e delle risposte comportamentali correlate alla dopamina4,6,7,8. Nel complesso, questi risultati indicano che il protocollo MAI fornisce una piattaforma sperimentale riproducibile per studiare come una stimolazione meccanica periferica definita moduli i circuiti neurali centrali e i comportamenti legati alla ricompensa.
Diversi passaggi critici devono essere considerati per l'applicazione corretta di questo protocollo. In primo luogo, la localizzazione del punto di agopuntura deve essere anatomicamente precisa. Per la stimolazione del punto HT7 nei roditori, la piega trasversale del polso e il tendine del muscolo flessore ulnare del carpo rappresentano punti di riferimento anatomici essenziali13,19. In secondo luogo, la profondità di inserzione deve essere standardizzata mediante l'uso dello stopper, poiché una variazione non controllata della profondità di inserzione potrebbe aumentare la variabilità sperimentale20. In terzo luogo, è necessario garantire un accoppiamento stabile tra ago e motore per assicurare una trasmissione accurata delle vibrazioni alla punta dell'ago. Infine, va evitata una stimolazione eccessiva. Studi precedenti di validazione hanno mostrato che una stimolazione continua prolungata, come vibrazioni di 40 s, induceva risposte comportamentali simili allo stress, mentre una stimolazione di 20 s produceva effetti comportamentali robusti con una migliore tollerabilità13.
Nonostante questi vantaggi, è necessario riconoscere diverse limitazioni. La stimolazione generata dall'MAI rappresenta solo un sottoinsieme delle tecniche di agopuntura manuale e non riproduce completamente le manipolazioni multidirezionali effettuate da operatori esperti. Inoltre, la maggior parte delle validazioni di questo protocollo è stata condotta su modelli animali, e la sua applicabilità diretta in contesti clinici umani deve ancora essere ulteriormente investigata.
L'MAI non riproduce la piena complessità multidimensionale dell'agopuntura manuale tradizionale, inclusi i movimenti di sollevamento-spinta, rotazione, deformazione bidirezionale dei tessuti e il feedback tattile dipendente dal terapista. Pertanto, la stimolazione vibratoria erogata dall'MAI non deve essere interpretata come una rappresentazione completa dell'agopuntura manuale. Al contrario, questo protocollo standardizza la componente meccanica basata sulle vibrazioni trasmessa alla punta dell'ago durante la manipolazione manuale con movimenti rapidi del manico.
Sebbene questo protocollo sia stato convalidato principalmente utilizzando la stimolazione dell'HT7 in ratti maschi Sprague-Dawley in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina, l'IAI può essere adattato ad altri punti di agopuntura e modelli sperimentali. Tuttavia, potrebbe essere necessaria una nuova ottimizzazione dei parametri poiché la profondità dei tessuti, l'anatomia locale, la distribuzione dei meccanocettori e la composizione dei nervi afferenti possono variare in base ai diversi punti di agopuntura, specie, ceppi, sessi e condizioni patologiche.
Applicazioni future di questo approccio potrebbero includere la sua integrazione in piattaforme standardizzate di ricerca sulla neuromodulazione e la sua adattabilità a studi traslazionali e clinici sull'agopuntura. Un'ulteriore ottimizzazione del dispositivo potrebbe consentire un controllo più preciso dei modelli di stimolazione e favorire un'applicazione più ampia in diversi modelli di malattia. In definitiva, questo protocollo potrebbe aiutare a colmare il divario tra la pratica tradizionale dell'agopuntura e le moderne neuroscienze, permettendo indagini riproducibili e quantificabili sui meccanismi fisiologici mediati dall'agopuntura.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto o conflitti di interessi relativi a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Coreano di Medicina Orientale (KIOM) con il contributo n. KSN2512011, dalla Korea Health Technology R&Progetto #38;D attraverso l'Istituto di Sviluppo dell'Industria Sanitaria della Corea (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute & Welfare, Repubblica di Corea (RS-2024-00443893) e dal finanziamento del National Research Foundation of Korea (NRF) concesso dal governo della Corea (RS-2024-00349070). Desideriamo esprimere la nostra sincera gratitudine al gruppo di ricerca sui punti di agopuntura presso l'Istituto Coreano di Medicina Orientale, al Dipartimento di Studi sui Meridiani e sui Punti di Agopuntura della Daegu Haany University e al Dipartimento di Fisiologia della Yonsei University College of Medicine per il loro prezioso sostegno e per le stimolanti discussioni relative allo sviluppo e alla validazione dello strumento meccanico per l'agopuntura.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accelerometro | PCB Piezotronics | PO-AXA-12-01 | Utilizzato per la misurazione delle vibrazioni |
| Ago da agopuntura (0.10 mm × 10 mm) | Dongbang Acupuncture Inc. | DB102 | Ago da agopuntura sterile monouso |
| Connettore a coccodrillo | N/A | N/A | Utilizzato per collegare il vibratore all'ago da agopuntura |
| Bupivacaina cloridrato (0,5%) | Huons Pharm, Korea | HIRA Code (199502333) | Utilizzato per esperimenti di anestesia locale |
| Cocaina cloridrato | Macfarlan Smith Ltd | 53-21-4 | Utilizzato per esperimenti sul movimento indotto dalla cocaina |
| Unità di controllo | Prodotto su misura | N/A | Utilizzato per regolare la frequenza di stimolazione, l'intensità dell'accelerazione e la durata |
| Software di acquisizione dati | LabVIEW | LabVIEW 7 Express (7.0) | Utilizzato per l'analisi del segnale di vibrazione |
| Sistema di acquisizione dati | National Instruments | DAQ-NI USB-6200 | Utilizzato per la digitalizzazione del segnale |
| Strumento meccanico per agopuntura (MAI) | Prodotto su misura | N/A | Dispositivo costruito su misura composto da un'unità di controllo, un motore vibrante, un connettore a clip, un ago da agopuntura e un tappo di gomma |
| Camera per l'analisi locomotoria in campo aperto | Prodotto su misura | scatola quadrata per campo aperto (40 cm × 40 cm× 45 cm) realizzata in acrilico nero. | Utilizzato per l'analisi dell'attività locomotoria |
| Tappo di gomma | N/A | N/A | Montato a 3 mm dalla punta dell'ago per standardizzare la profondità di inserzione |
| Ratti Sprague-Dawley | Orient Bio | Crl:CD(SD)IGS | Maschi, 270–320 g |
| Motore vibrante | Motor Bank | MB-0412V | Utilizzato per la stimolazione vibrante meccanica |
| Software di tracciamento video | EthoVision XT | Ethovision 3.1 | Utilizzato per il tracciamento locomotorio |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
