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Articolo metodologico

Uno strumento di agopuntura meccanica per la stimolazione vibratoria riproducibile dei punti di agopuntura nei ratti

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DOI:

10.3791/72266

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25 agosto 2026

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1KM Science Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, 2Department of Acupuncture, Moxibustion and Acupoint, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Daegu, 3Department of Physiology, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato di agopuntura meccanica che utilizza un dispositivo di stimolazione vibratoria per fornire una stimolazione dell'ago riproducibile nel punto di agopuntura HT7 in ratti. Validato in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina, questo metodo fornisce una piattaforma quantitativa e riproducibile per lo studio dei meccanismi neurofisiologici periferici e centrali alla base degli effetti mediati dall'agopuntura.

Abstract

Sebbene l'agopuntura manuale sia ampiamente utilizzata nella ricerca sperimentale e clinica, la sua applicazione è limitata da una scarsa riproducibilità causata dalla variabilità dipendente dall'operatore nella manipolazione dell'ago. Per superare tale limitazione, è stato sviluppato uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) in grado di erogare una stimolazione vibratoria controllata attraverso un ago da agopuntura inserito, senza l'uso di corrente elettrica. Questo articolo presenta un protocollo standardizzato per l'applicazione della stimolazione con MAI nel punto di agopuntura HT7 in ratti, inclusi il preparazione dell'animale, la localizzazione del punto di agopuntura, l'inserimento dell'ago, la configurazione dei parametri di stimolazione e la valutazione comportamentale. Studi rappresentativi di validazione hanno mostrato che la stimolazione con MAI in HT7 riduce l'attività locomotoria indotta dalla cocaina e attiva in modo preferenziale le vie delle fibre A associate ai meccanocettori. Ulteriori studi hanno confermato il coinvolgimento degli afferenti periferici ulnari, della via del cordone posteriore e della circuitazione della ricompensa mesolimbica nella mediazione di questi effetti. I risultati rappresentativi presentati in questo articolo si basano su studi di validazione precedentemente pubblicati che utilizzano la piattaforma MAI. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e quantitativo per indagare i meccanismi neurofisiologici della stimolazione dell'agopuntura in modelli animali sperimentali.

Introduzione

L'agopuntura manuale è un metodo tradizionale di stimolazione basato sull'uso di aghi che eroga un input meccanico dinamico ai tessuti periferici attraverso la manipolazione diretta dell'ago ed è stata ampiamente utilizzata sia in ambito clinico che sperimentale1,2. A differenza dell'elettroagopuntura (EA), l'agopuntura manuale genera una stimolazione meccanica complessa, comprendente la deformazione dei tessuti e l'attivazione dei meccanocettori periferici, mediante la manipolazione fisica dell'ago inserito2. Si ritiene che questi componenti meccanici contribuiscano in modo significativo agli effetti fisiologici caratteristici dell'agopuntura e che attivino le vie afferenti somatosensoriali in modo diverso rispetto alla stimolazione elettrica3,4.

Nonostante la sua rilevanza fisiologica e l'ampio utilizzo, l'applicazione sperimentale dell'agopuntura manuale rimane limitata da una scarsa riproducibilità2. Gli effetti terapeutici dell'agopuntura manuale dipendono in larga misura da fattori legati all'operatore, tra cui le tecniche di manipolazione dell'ago, l'intensità, la frequenza e la durata della stimolazione, che possono variare notevolmente tra i diversi praticanti e le condizioni sperimentali1. Questa variabilità rappresenta un ostacolo significativo per gli studi meccanicistici volti a stabilire relazioni causali tra la stimolazione dell'agopuntura e gli esiti neurofisiologici.

Per superare queste limitazioni, l'elettroacupuntura (EA) è stata spesso adottata come metodo alternativo poiché consente un controllo preciso dei parametri di stimolazione come frequenza, ampiezza e durata. Tuttavia, l'EA introduce un input elettrico che potrebbe attivare vie neurali diverse da quelle reclutate dalla stimolazione manuale5. Di conseguenza, rimane difficile isolare e valutare il contributo specifico della stimolazione meccanica, che rappresenta un componente fondamentale dell'agopuntura manuale tradizionale. È quindi necessario un metodo riproducibile in grado di erogare una stimolazione meccanica controllata senza interferenze elettriche per la ricerca meccanicistica sull'agopuntura.

Per affrontare questa limitazione, nel 2013 è stato sviluppato uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) in grado di riprodurre una stimolazione meccanica basata sulle vibrazioni, consentendo al contempo un controllo quantitativo dei parametri di stimolazione3,5. Questo dispositivo eroga una stimolazione vibratoria controllata direttamente all'ago da agopuntura inserito, standardizzando così l'input meccanico applicato al tessuto. Mediante questo approccio, studi precedenti hanno dimostrato che l'agopuntura meccanica modula circuiti neurali somatosensoriali, legati alla ricompensa e autonomi, in diversi modelli sperimentali4,6,7,8. Ad esempio, la stimolazione meccanica nei punti di agopuntura HT7 ha attenuato le risposte comportamentali indotte dalla cocaina e la dipendenza da alcol mediante la modulazione del circuito dopaminergico mesolimbico, delle vie oppioidi endogene e dei circuiti di rilè somatosensoriali6,7. Inoltre, una stimolazione combinata meccanica ed elettrica applicata a punti neurogeni ha soppresso l'ipertensione attraverso meccanismi mediati dagli oppioidi in regioni centrali del sistema autonomo5. Nel complesso, circa 30 studi condotti con questa piattaforma hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi d'azione dell'agopuntura in relazione alla dipendenza, alla regolazione autonoma e ad altre condizioni sperimentali.

A differenza dei sistemi generali di stimolazione basati solo sulle vibrazioni, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro integrato per l’agopuntura meccanica, non elettrica, accoppiata a un ago, eseguita su ratti svegli. Il protocollo combina l’assemblaggio del dispositivo, l’accoppiamento ago-motore, la standardizzazione della profondità di inserimento, la calibrazione basata su accelerometro, la localizzazione dei punti di agopuntura e una validazione comportamentale rappresentativa mediante stimolazione di HT7 in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina nei ratti. Pertanto, questo articolo fornisce un protocollo sperimentale riproducibile per la stimolazione controllata di agopuntura meccanica, piuttosto che presentare un nuovo dispositivo terapeutico.

L'output standardizzato e quantitativamente controllato del MAI potrebbe inoltre fornire una piattaforma utile per l'integrazione futura con approcci analitici basati sui dati. Poiché i parametri di stimolazione come la frequenza delle vibrazioni, l'accelerazione, la profondità di inserzione e la durata della stimolazione possono essere definiti e riprodotti con precisione, queste variabili potrebbero fungere da input strutturati per la modellizzazione computazionale. Studi recenti hanno dimostrato che approcci basati sull'apprendimento automatico, sull'apprendimento profondo e sull'apprendimento per trasferimento possono migliorare l'estrazione di caratteristiche, la classificazione dei segnali, il riconoscimento di pattern e l'ottimizzazione in complessi insiemi di dati provenienti da immagini biomedicali e da segnali basati sulle vibrazioni9,10,11,12. Approcci simili potrebbero potenzialmente essere applicati alla ricerca sull'agopuntura basata sul MAI integrando i parametri di stimolazione con dati comportamentali, neurofisiologici e sull'output delle vibrazioni, al fine di supportare l'analisi dei segnali, la classificazione comportamentale, l'ottimizzazione dei parametri di stimolazione e la previsione delle risposte correlate all'agopuntura. Pertanto, futuri studi che combinino la stimolazione basata sul MAI con metodologie di apprendimento automatico potrebbero ulteriormente aumentare la precisione, la riproducibilità e l'interpretazione meccanicistica della ricerca sull'agopuntura.

È importante notare che i dati di validazione rappresentativi presentati in questo articolo sono riprodotti, adattati o riassunti da studi precedentemente pubblicati che utilizzano la piattaforma MAI. L'obiettivo principale di questo articolo non è riportare nuovi risultati sperimentali, bensì fornire un protocollo dettagliato, passo dopo passo, per l'applicazione riproducibile di stimolazioni standardizzate di agopuntura meccanica in modelli animali sperimentali.

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Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali descritti in questo articolo sono stati approvati dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Daegu Haany University (DHU2012-008, DHU2022-12) e della Yonsei University College of Medicine (# 2023-0006) e sono stati condotti in conformità con la Guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.

1. Preparazione dello strumento per agopuntura meccanica

  1. Assemblare lo strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) (Figura 1).
    1. Preparare uno strumento meccanico per l'agopuntura (MAI) costituito da un'unità di controllo su misura e da un vibratore meccanico collegato a un ago da agopuntura (Figura 1D). Utilizzare l'unità di controllo per regolare l'intensità della stimolazione, la frequenza di vibrazione e la durata della stimolazione3,4,13.
    2. Utilizzare un ago da agopuntura sterile con un diametro di 0,10 mm, un fusto lungo 10 mm e un manico lungo 10 mm. Fissare un tappo di gomma al fusto dell'ago a una distanza di 3 mm dalla punta per standardizzare la profondità di inserimento.
    3. Collegare il motore vibrante all'ago da agopuntura mediante un connettore stabile di tipo clip. Verificare che l'ago non scivoli durante la vibrazione e che il tappo rimanga fissato durante la stimolazione.
  2. Configurare i parametri di stimolazione.
    1. Impostare la condizione di stimolazione su vibrazione continua a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, che genera forme d'onda di accelerazione stabili durante la stimolazione (Figura 1E).
      ​NOTA: Esperimenti di validazione precedenti13 hanno mostrato che l'agopuntura manuale genera frequenze di vibrazione di circa 70–90 Hz e valori di accelerazione medi di circa 1,3 m/s2 (Figura 1A,B). Sulla base di queste misurazioni, il MAI è stato configurato per erogare una stimolazione vibrante a 85 Hz e 1,3 m/s2, che approssima da vicino le caratteristiche meccaniche dell'agopuntura manuale fornendo al contempo un'uscita stabile e riproducibile. La durata di stimolazione di 20 s è stata adottata da studi pubblicati in precedenza sull'ottimizzazione dei parametri13 in un modello di attività locomotoria indotta da cocaina nel ratto, in cui diverse durate di stimolazione e intensità di accelerazione sono state confrontate per identificare una condizione di stimolazione efficace e ben tollerata. In questo protocollo, il termine "frequenza" si riferisce al componente di frequenza dominante della vibrazione della punta dell'ago misurato dal segnale dell'accelerometro. Questo valore riflette la vibrazione trasmessa alla punta dell'ago durante la manipolazione manuale della manopola piuttosto che il ritmo più lento dei movimenti ripetuti della mano dell'operatore.
    2. Applicare la condizione a 85 Hz e 1,3 m/s2 per generare un modello di vibrazione stabile e riproducibile paragonabile alla manipolazione manuale dell'ago (Figura 1E).
  3. Verificare l'uscita della vibrazione.
    1. Per verificare l'uscita stabile della vibrazione, fissare saldamente la punta dell'ago all'accelerometro in modo che la vibrazione meccanica proveniente dal motore venga trasmessa direttamente dall'ago al sensore.
    2. Registrare il segnale di accelerazione durante il periodo di stimolazione utilizzando un sistema di acquisizione dati e analizzare il segnale con software LabVIEW o equivalente.
    3. Definire il valore di accelerazione come l'accelerazione stabile della punta dell'ago misurata durante la fase di plateau della stimolazione, dopo la risposta transitoria iniziale, e calcolare la frequenza di vibrazione dominante dal segnale di accelerazione.
    4. Eseguire la calibrazione prima di ogni sessione sperimentale e ogni volta che il motore, il connettore, l'ago o l'accoppiamento ago-motore vengono sostituiti o regolati.
    5. Procedere con gli esperimenti sugli animali solo quando la frequenza dominante e l'accelerazione misurate rimangono stabili durante la fase di plateau e rientrano in un intervallo accettabile rispetto ai parametri di stimolazione target, come ad esempio circa ±10% di 85 Hz e 1,3 m/s2.
      NOTA: Nelle Figura 1B,E sono riportati esempi di tracce di accelerazione generate durante l'agopuntura manuale e la stimolazione con MAI.

2. Preparazione degli animali e modello di attività locomotoria indotta da cocaina

  1. Preparare gli animali sperimentali.
    1. Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 270–320 g per gli esperimenti sull'attività locomotoria indotta dalla cocaina3,4,5. Allevare gli animali in un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
    2. Assegnare 6–8 animali a ciascun gruppo sperimentale, salvo diversa indicazione.
  2. Abituare gli animali.
    1. Abituare ogni ratto alle procedure sperimentali un giorno prima del test. Eseguire una manipolazione delicata e una simulazione di agopuntura senza inserimento dell'ago per 2–3 minuti.
    2. Posizionare gli animali nella camera per l'attività locomotoria per 90 minuti per ridurre le risposte comportamentali legate allo stress durante le procedure di stimolazione in stato di veglia.
    3. Prima dell'esperimento di agopuntura, abituare i ratti quotidianamente alla manipolazione manuale delicata e al contenimento leggero per la stessa durata prevista per la procedura di agopuntura.
    4. Durante la stimolazione, trattenere delicatamente l'animale a mano per stabilizzare il corpo e l'arto anteriore senza esercitare pressione eccessiva. Trattenere allo stesso modo e per la stessa durata anche gli animali del gruppo di controllo senza agopuntura, senza inserire l'ago, per controllare gli effetti generalizzati dovuti allo stress da immobilizzazione.
      NOTA: Gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per eseguire in modo costante il contenimento, l'inserimento dell'ago e la stimolazione.
    5. Se si osservano resistenza persistente, vocalizzazioni, tentativi di fuga o altre risposte di stress eccessive, interrompere la procedura e fornire un'ulteriore abituazione prima del test.
      NOTA: Eseguire tutte le procedure di stimolazione dell'agopuntura su animali svegli sottoposti a contenimento manuale leggero.

3. Localizzazione dei punti di agopuntura

  1. Individuare i punti di agopuntura HT7 e LI5.
    1. Individuare i punti di agopuntura utilizzando il metodo trasposizionale, in cui la posizione del punto di agopuntura umano viene mappata sul corrispondente sito anatomico nell'animale.
    2. Identificare HT7 (Shenmen) al livello della piega trasversale del polso della zampa anteriore, in posizione radiale rispetto al tendine del muscolo flessore del carpo ulnare3,4,5,8.
      ​NOTA: questa posizione corrisponde anatomicamente alla regione del tunnel ulnare/canale di Guyon, vicino al nervo ulnare. Al contrario, LI5 si trova all'estremità radiale della faccia dorsale del polso, tra i tendini del muscolo estensore del pollice lungo e del muscolo estensore breve del pollice. LI5 è posizionato sul lato opposto rispetto a HT7 e dista circa 5 mm (Figura 1F). Questi punti di riferimento anatomici sono stati utilizzati per garantire una localizzazione riproducibile dei punti di agopuntura14.
  2. Individuare i punti di controllo di agopuntura.
    1. Utilizzare LI5 come punto di controllo vicino al polso. Localizzare LI5 a circa 5 mm da HT7, in prossimità dell'estremità distale del radio, tra i tendini del muscolo palmare lungo e del muscolo flessore del carpo radiale.

4. Procedura di stimolazione meccanica

  1. Eseguire esperimenti sull'attività locomotoria.
    1. Posizionare il ratto nella camera del campo aperto e consentire 60 minuti di abituazione. Registrare l'attività locomotoria di base per 30 minuti.
    2. Somministrare cocaina per via intraperitoneale a 15 mg/kg per indurre l'attivazione locomotoria3,4,5. Trattenere leggermente l'animale 1 minuto dopo l'iniezione di cocaina.
    3. Per standardizzare la profondità di inserzione, montare un tappo di gomma sullo stelo dell'ago in un punto situato a 3 mm dalla punta dell'ago (Figura 1D). Assicurarsi che il tappo sia fissato saldamente in modo da rimanere stabile durante l'inserimento e la vibrazione.
    4. Durante l'inserimento dell'ago, avanzare l'ago fino a quando il tappo tocca delicatamente la superficie della pelle, evitando una compressione eccessiva della pelle che potrebbe alterare la profondità effettiva di inserzione.
  2. Applicare stimolazione meccanica.
    1. Applicare una stimolazione vibratoria continua a 85 Hz e 1,3 m/s2 per 20 s, la condizione di stimolazione ottimizzata identificata negli esperimenti di validazione dei parametri (Figura 2A–C). Mantenere l'ago in posizione per 1 minuto dopo l'inserimento, quindi ritirarlo.
    2. Continuare la registrazione dell'attività locomotoria fino a 60 minuti dopo l'iniezione di cocaina. Analizzare l'attività locomotoria in intervalli di 10 minuti o come distanza totale percorsa in 60 minuti (Figura 1C).
    3. Applicare una stimolazione di 20 s come condizione standard poiché questa durata ha prodotto una marcata inibizione dell'attività locomotoria indotta dalla cocaina negli esperimenti di validazione precedenti (Figura 2A–C).
      NOTA: Una stimolazione continua di 40 s ha indotto comportamenti simili allo stress, inclusi vocalizzazioni e risposte di evitamento, ed è stata pertanto esclusa dalle condizioni standard di stimolazione.
  3. Eseguire esperimenti di validazione dei parametri dello stimolo.
    1. Confrontare durate di stimolazione di 0 s, 10 s, 20 s e 40 s oppure confrontare diversi valori di accelerazione, come 0,7 e 1,3 m/s2, per validare i parametri di stimolazione (Figura 2).
    2. Applicare una stimolazione a 50 Hz come condizione selettiva per i corpuscoli di Meissner e una stimolazione a 200 Hz come condizione selettiva per i corpuscoli di Pacini negli esperimenti relativi ai meccanocettori, come descritto in precedenza4,8.

5. Acquisizione dei dati e analisi statistica

  1. Misurare l'attività locomotoria utilizzando un sistema di tracciamento video posizionato sopra l'apparato. Posizionare gli animali in una camera quadrata aperta (40 cm × 40 cm × 45 cm) e quantificare la distanza totale percorsa mediante software di tracciamento video.
  2. Registrare le tracce di accelerazione-tempo dall'uscita dell'accelerometro durante esperimenti di calibrazione delle vibrazioni. Riportare la frequenza dominante, l'ampiezza dell'accelerazione e la durata della vibrazione stabile (Figura 1D,E).
  3. Valutare la distribuzione dei dati per verificarne la normalità prima di effettuare analisi statistiche parametriche. Quando i dati soddisfano le assunzioni di normalità, analizzare le differenze tra gruppi mediante analisi della varianza a una o due vie, seguita da opportuni confronti post hoc.
  4. Eseguire il tracciamento e l'analisi del comportamento da parte di ricercatori ciechi rispetto all'assegnazione sperimentale ai gruppi, ogni volta che possibile.
  5. Esprimere i dati comportamentali e fisiologici come media ± errore standard della media (SEM). Analizzare l'attività locomotoria mediante analisi della varianza a una o due vie con misure ripetute (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey.
    NOTA: Le dimensioni campionarie sono state scelte sulla base di studi precedenti che utilizzavano lo stesso modello di attività locomotoria indotta da cocaina nei ratti e lo stesso protocollo di stimolazione meccanica dell'agopuntura. Per garantire un'adeguata potenza statistica, sono stati utilizzati 6–8 ratti per gruppo. Gli animali sono stati esclusi dall'analisi solo in caso di problemi tecnici o procedurali predeterminati, inclusi localizzazione errata dei punti di agopuntura, malfunzionamento del dispositivo, uscita instabile delle vibrazioni durante la calibrazione o mancato tracciamento video.

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Risultati

Convalida della stimolazione meccanica riproducibile

La configurazione rappresentativa del dispositivo e la validazione dell'output di vibrazione mostrate in Figura 1 sono state generate per il presente manoscritto, mentre gli intervalli di riferimento quantitativi per i parametri di vibrazione derivati dall'agopuntura manuale sono stati riassunti da studi di validazione precedenti.

L'MAI è stato convalidato confrontand...

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Discussione

Questo studio presenta un protocollo standardizzato per l'applicazione dell'agopuntura meccanica mediante un dispositivo di stimolazione vibratoria che consente la somministrazione riproducibile di stimolazione meccanica basata sulle vibrazioni. Fornendo un controllo quantitativo della frequenza di stimolazione, dell'intensità di accelerazione e della durata, questo approccio supera una limitazione fondamentale dell'agopuntura manuale tradizionale, che dipende intrinsecamente dalla tecnica dell'operatore ed è difficile d...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto o conflitti di interessi relativi a questo studio.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Coreano di Medicina Orientale (KIOM) con il contributo n. KSN2512011, dalla Korea Health Technology R&Progetto #38;D attraverso l'Istituto di Sviluppo dell'Industria Sanitaria della Corea (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute & Welfare, Repubblica di Corea (RS-2024-00443893) e dal finanziamento del National Research Foundation of Korea (NRF) concesso dal governo della Corea (RS-2024-00349070). Desideriamo esprimere la nostra sincera gratitudine al gruppo di ricerca sui punti di agopuntura presso l'Istituto Coreano di Medicina Orientale, al Dipartimento di Studi sui Meridiani e sui Punti di Agopuntura della Daegu Haany University e al Dipartimento di Fisiologia della Yonsei University College of Medicine per il loro prezioso sostegno e per le stimolanti discussioni relative allo sviluppo e alla validazione dello strumento meccanico per l'agopuntura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AccelerometroPCB PiezotronicsPO-AXA-12-01Utilizzato per la misurazione delle vibrazioni
Ago da agopuntura (0.10 mm × 10 mm)Dongbang Acupuncture Inc.DB102Ago da agopuntura sterile monouso
Connettore a coccodrilloN/AN/AUtilizzato per collegare il vibratore all'ago da agopuntura
Bupivacaina cloridrato (0,5%)Huons Pharm, KoreaHIRA Code (199502333)Utilizzato per esperimenti di anestesia locale
Cocaina cloridratoMacfarlan Smith Ltd 53-21-4 Utilizzato per esperimenti sul movimento indotto dalla cocaina
Unità di controlloProdotto su misuraN/AUtilizzato per regolare la frequenza di stimolazione, l'intensità dell'accelerazione e la durata
Software di acquisizione datiLabVIEWLabVIEW 7 Express (7.0)Utilizzato per l'analisi del segnale di vibrazione
Sistema di acquisizione datiNational InstrumentsDAQ-NI USB-6200Utilizzato per la digitalizzazione del segnale
Strumento meccanico per agopuntura (MAI)Prodotto su misuraN/ADispositivo costruito su misura composto da un'unità di controllo, un motore vibrante, un connettore a clip, un ago da agopuntura e un tappo di gomma
Camera per l'analisi locomotoria in campo apertoProdotto su misurascatola quadrata per campo aperto
(40 cm × 40 cm× 45 cm)
realizzata in acrilico nero. 		Utilizzato per l'analisi dell'attività locomotoria
Tappo di gommaN/AN/AMontato a 3 mm dalla punta dell'ago per standardizzare la profondità di inserzione
Ratti Sprague-DawleyOrient BioCrl:CD(SD)IGSMaschi, 270–320 g
Motore vibranteMotor BankMB-0412V Utilizzato per la stimolazione vibrante meccanica
Software di tracciamento videoEthoVision XTEthovision 3.1Utilizzato per il tracciamento locomotorio

Riferimenti

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Agopuntura HT7Modello di rattoValutazione comportamentaleInserimento dell'agoRicompensa mesolimbicaVie delle fibre AAfferenze ulnari

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