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Articolo di ricerca

Liuwei Dihuang Wan inibisce l'osteoclastogenesi e la perdita ossea indotta dall'ovaricomia sopprimendo la segnalazione NF-κB

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DOI:

10.3791/72270

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28 luglio 2026

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1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha dimostrato che Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) sopprime la differenziazione degli osteoclasti e la perdita ossea indotta dall'ovaricomia inibindo la via di segnalazione NF-κB, come rivelato dall'analisi LC-MS/MS, dalla farmacologia di reti e dalla validazione in vivo e in vitro.

Abstract

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), una formula classica di medicina tradizionale cinese, è ampiamente utilizzata per trattare varie malattie associate alla carenza renale e ha dimostrato un'efficacia clinica soddisfacente nell'osteoporosi postmenopausale (PMOP). Tuttavia, i suoi meccanismi farmacologici rimangono poco chiari. Per affrontare questo problema, abbiamo prima analizzato i componenti chimici del LWDHW utilizzando LC-MS/MS, che ne ha identificati 1.615 componenti. La farmacologia di rete ha poi previsto che l'infiammazione e la via di segnalazione NF-κB siano potenziali meccanismi terapeutici alla base degli effetti di LWDHW sul PMOP. Successivamente, 27 femmine di topi C57BL/6J sono state assegnate casualmente ai gruppi Sham, Model e LWDHW. I topi degli ultimi due gruppi hanno subito un'ovaiectomia bilaterale (OVX), mentre quelli del gruppo LWDHW hanno ricevuto LWDHW orale a 9,75 g/kg/giorno per 8 settimane. Sono stati raccolti campioni di siero e femore per il Saggio Immunosorbente Legato agli Enzimi (ELISA), la Tomografia Microcomputerizzata (μCT), l'esame istologico e l'immunoistochimica (IHC). I macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMM) sono stati trattati con LWDHW e poi sottoposti a colorazione TRAP e qRT-PCR. Nei topi OVX, LWDHW ha alleviato significativamente la perdita ossea e il deterioramento della microarchitettura ossea, accompagnati da una riduzione dei livelli sierici di β-CTX e di una diminuzione dei numeri di osteoclasti nei tessuti femori. La colorazione con IHC ha rivelato un'espressione notevolmente più bassa di TNF-α, IL-1β e p-P65 nei tessuti femorali dei topi trattati con LWDHW rispetto al gruppo modello. In vitro, la colorazione TRAP ha dimostrato che LWDHW inibiva la differenziazione osteoclastica indotta da RANKL/M-CSF delle BMM e riduceva l'espressione di Ctsk, MMP9 e Nfatc1. L'analisi Western blot ha inoltre mostrato che i livelli proteici di P65, p-P65, IκBα e p-IκBα sono diminuiti significativamente nelle BMM dopo il trattamento con LWDHW. Collettivamente, LWDHW allevia l'osteoporosi postmenopausale, possibilmente sopprimendo l'osteoclastogenesi mediata dalla segnalazione di NF-κB.

Introduzione

L'osteoporosi postmenopausale (PMOP) è una malattia metabolica ossea diffusa caratterizzata da perdita di massa ossea e deterioramento della microarchitetturaossea 1. Con l'invecchiamento della popolazione in crescita, l'aumento dell'incidenza del PMOP è diventato un problema globale di salute pubblica che minaccia seriamente la salute delle donne inpostmenopausa 2. In Cina, la prevalenza complessiva del PMOP raggiunge il 32,1%. Gli individui colpiti sono più suscettibili a complicazioni gravi come mal di schiena cronico, deformità spinali e fratture dafragilità. Attualmente, i farmaci approvati dalla FDA per l'osteoporosi includono bisfosfonati6, ormoneparatiroideo6 7 e denosumab8, ampiamente utilizzati nella pratica clinica. Tuttavia, la loro applicazione a lungo termine è spesso limitata da vari effetti avversi9. Pertanto, è urgente sviluppare agenti terapeutici più sicuri ed efficaci per il PMOP. Tra le possibili alternative, le erbe cinesi hanno attirato sempre più attenzione grazie alla loro efficacia riconosciuta e al profilo di sicurezzafavorevole 10.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) è una formula classica della medicina tradizionale cinese (MTC), documentata per la prima volta nell'antico testo Chiave per la Terapia delle Malattie Infantili durante la dinastia Song. Per migliaia di anni, il LWDHW è stato ampiamente utilizzato nella pratica clinica per trattare varie malattie attribuite a carenzarenale 11,12,13,14. Secondo la teoria della MTC del "rene che governa le ossa", la perdita di massa ossea e il deterioramento osseo nei pazienti PMOP sono principalmente causati da una nutrizione insufficiente dall'essenzarenale 15. Di conseguenza, LWDHW è comunemente applicato nella gestione clinica della PMOP e ha dimostrato un'efficacia terapeuticadefinita 16,17. Tuttavia, sebbene studi su animali e clinici abbiano rivelato che LWDHW esercita molteplici effetti farmacologici, tra cuiantiossidativo 18,antinfiammatorio 19 e attivitàantifibrotiche 14, il suo meccanismo sottostante contro la PMOP rimane in gran parte sconosciuto.

L'omeostasi ossea si basa sull'equilibrio tra il riassorbimento osseo da parte degli osteoclasti e la formazione ossea da parte degliosteoblasti 20. Questo equilibrio viene compromesso poiché la differenziazione e l'attività degli osteoclasti aumentano in condizioni infiammatorie, portando a un riassorbimento osseoaccelerato 21. In questo processo, il percorso NF-κB funge da regolatore centrale. Fattori infiammatori come TNF-α e IL-1β possono indurre la fosforilazione e la degradazione di IκBα, scatenando la traslocazione nucleare di p65 fosforilato (p-P65)22. Di conseguenza, i geni specifici osteoclasti a valle, inclusi Ctsk, Mmp9 e Nfatc1, vengono attivati per promuovere l'osteoclastogenesi23,24.

La farmacologia delle reti è un campo interdisciplinare che integra informatica, farmacologia ebioinformatica 25. Mostra vantaggi distinti nell'esplorare in modo completo i meccanismi farmacologici alla base degli effetti terapeutici delle erbecinesi 26. Nel presente studio, è stata impiegata la farmacologia di rete per prevedere i potenziali processi biologici e le vie di segnalazione coinvolti negli effetti anti-osteoporotici della LWDHW. Contemporaneamente, i componenti chimici di LWDHW sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS. Inoltre, sono state condotte validazioni in vivo utilizzando un modello murino OVX e esperimenti in vitro con macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMM) per approfondire il meccanismo farmacologico del LWDHW contro il PMOP. Il flusso di lavoro è presentato nella Figura 1.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dal Comitato di Etica Animale dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang (IACUC-202402-07).

Preparazione e analisi LC-MS/MS del LWDHW

La formula LWDHW è composta da sei erbe cinesi: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae opposte (Thunb.), Poria cocos (Schw.) e Alisma orientale (Sam.). Informazioni dettagliate su queste erbe sono elencate nella Tabella 1. Tutte le erbe crude venivano fornite dal Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang (Hangzhou, Cina) e bollite in acqua purificata con un rapporto erba-acqua di 0,1 kg/L. L'estratto acquoso risultante è stato filtrato e concentrato in una soluzione operativa a 0,5 g/mL per successive analisi LC-MS/MS e esperimenti sugli animali. Inoltre, la soluzione di lavoro veniva trasformata in polvere liofilizzata per esperimenti cellulari.

Nell'analisi LC-MS/MS, le condizioni della cromatografia liquida erano le seguenti: la fase mobile A (acquosa) e la fase mobile B (organica) consistevano rispettivamente nello 0,1% di acido formico in acqua e acetonitrile per la modalità ionica positiva, oppure 5 mM di formatiato ammoniaco in acqua e acetonitrile, rispettivamente, per la modalità ionica negativa. Il tempo di funzionamento totale era di 8 minuti, con una portata di 0,3 mL/min, una temperatura di colonna di 40 °C e un volume di iniezione di 2 μL. Per la spettrometria di massa, i dati venivano acquisiti in modalità Full MS-ddMS2, con tensioni di spruzzatura impostate a +3,50 kV (positivo) e –2,50 kV (negativo).

Ingredienti bioattivi e obiettivi di previsione del LWDHW

I nomi individuali di sei erbe costituenti sono stati inseriti nel database del Sistema di Medicina Tradizionale Cinese (TCMSP) per ottenere l'elenco completo degli ingredienti per LWDHW. Successivamente sono stati selezionati i principi bioattivi utilizzando i parametri farmacocinetici della biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e della somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18, 27,28,29,30. Le proteine corrispondenti degli ingredienti bioattivi sono state identificate e inviate a UniProt per recuperare i nomi genetici standardizzati, che sono stati definiti come obiettivi genici finali di LWDHW.

Obiettivi sovrapposti tra LWDHW e PMOP

I bersagli genici associati al PMOP sono stati recuperati cercando la parola chiave "postmenopausal osteoporosis" sia nei database GeneCards che DisGeNET il 2 ottobre 2024. I target sono stati filtrati usando soglie di punteggio di >0,1 in DisGeNET e >10 in GeneCards, e le voci duplicate sono state rimosse per ottenere un insieme non ridondante di geni correlati al PMOP. Successivamente, i bersagli derivati dalle erbe di LWDHW e quelli associati al PMOP sono stati importati nello strumento online Venny per generare un diagramma di Venn che raffigura i bersagli sovrapposti tra LWDHW e PMOP.

Ontologia genica (GO) e analisi dell'arricchimento delle vie di segnalazione

I target sovrapposti tra LWDHW e PMOP sono stati soggetti ad analisi di arricchimento GO utilizzando il database DAVID. I termini GO recuperati sono stati classificati in tre categorie, tra cui componente cellulare, funzione molecolare e processo biologico (BP). Dopo aver filtrato FDR < 0,01, i primi 30 termini BP sono stati elencati in un diagramma a bolle in ordine decrescente di arricchimento della piegatura.

Successivamente, i target sovrapposti sono stati inseriti nella Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e nei database Metascape per l'analisi dell'arricchimento delle vie di segnalazione. I percorsi arricchiti provenienti dai database KEGG e Metascape sono stati classificati in base al numero di target corrispondenti in ordine decrescente, e i primi 25 percorsi di ciascun database sono stati visualizzati come grafici a barre.

Costruzione della rete

Le reti "Formula-Erbe-Ingredienti-Targetti-Malattie" e "Targets-Pathways" sono state costruite in Cytoscape per visualizzare le interrelazioni tra i componenti. Una rete di interazione proteina-proteina (PPI) è stata generata inserendo i bersagli sovrapposti nel database STRING. Gli obiettivi hub all'interno della rete sono stati identificati tramite screening basandosi su caratteristiche topologiche, tra cui centralità di grado (DC), centralità tra le parti (BC) e centralità di vicinanza (CC).

Raggruppamento animale, modello di osteoporosi indotta da OVX e intervento farmacologico

Un totale di 27 femmine di topi C57BL/6J (2 mesi, con un peso di 22 ± 2 g) sono stati forniti dal Centro di Esperimenti Animali dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang). Tutti gli animali sono stati ospitati in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) con un ciclo di 12 ore luce/buio, temperatura ambiente mantenuta a 25 °C e umidità compresa tra il 40% e il 60%, con libero accesso a cibo e acqua. Dopo 1 settimana di alimentazione adattativa, i topi sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (n = 9 per gruppo) utilizzando una tabella dei numeri casuali: Sham, Model e LWDHW. I topi dei gruppi Model e LWDHW hanno subito un'ovaiectomia bilaterale (OVX) per stabilire il modello PMOP, mentre il gruppo Sham ha subito una procedura sham che prevedeva la resezione di un volume equivalente di tessuto adiposo periovarico. A partire da due giorni dall'intervento, i topi del gruppo LWDHW hanno ricevuto una quantità giornaliera di soluzione lavorativa LWDHW a una dose di 9,75 g/kg/giorno (convertita dalla dose equivalente umana in base alla superficie corporea), mentre i gruppi Model e Sham hanno ricevuto un volume uguale di soluzione salina. I campioni biologici, inclusi tessuti sierici e femorali, sono stati raccolti 8 settimane dopo la somministrazione per analisi successive. Non si sono verificate morti o mortalità inaspettate in nessuno dei gruppi durante il periodo sperimentale.

Saggio immunoenzimatico legato a enzimi sierici (ELISA)

Il sangue intero veniva raccolto dal plesso retro-orbitale e centrifugato a 1000 x g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il siero. Le concentrazioni seroniche di osteocalcina (OCN) e telopeptide terminale β-C del collagene di tipo I (β-CTX) sono state misurate utilizzando i corrispondenti kit ELISA secondo i protocolli del produttore.

μCT e analisi biomeccanica

I campioni femorali sono stati scansionati utilizzando un'apparecchiatura di micro-computazione ad alta risoluzione (μCT) a una risoluzione isotropa di 10 μm. La microstruttura tridimensionale (3D) del femore distale è stata ricostruita a partire dalle immagini acquisite utilizzando il software NRecon. Successivamente, i seguenti parametri della microarchitettura ossea, tra cui la densità minerale ossea (BMD, g/mm 3), la frazione volumetrica ossea (BV/TV, %), lo spessore trabecolare (Tb.Th, mm) e il numero trabecolare (Tb.N, 1/mm), sono stati quantificati all'interno della regione di interesse (ROI) del femore distale.

Le proprietà biomeccaniche dei campioni femorali (n = 3 per gruppo) sono state valutate tramite un test di flessione a tre punti utilizzando un sistema di prova di fatica a torsione assiale. Un carico compressivo veniva applicato alla diafisi media a un tasso costante di spostamento di 2 mm/min fino al cedimento strutturale. Il carico massimo (N) veniva registrato automaticamente dal software del sistema.

Colorazione di istomorfologia, immunoistochimica (IHC) e immunofluorescenza (IF)

Dopo la fissazione con paraformaldeide al 4%, la decalcificazione in soluzione EDTA al 14% e la disidratazione tramite una serie di etanolo graduato, i campioni femorali sono stati processati in sezioni di paraffina spesse 3 μm come descrittoin precedenza 31. Le sezioni sono state colorate con Alcian Blue Hematoxylin (ABH)/Orange G per la valutazione morfologica. L'analisi quantitativa dell'area dell'osso trabecolare nella metafisi distale del femore è stata effettuata utilizzando il software OsteoMetrics.

I campioni di fegato e reni sono stati fissati, inseriti in paraffina e tagliati in sezioni da 4 μm. Dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione di routine, le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina. L'esame istologico è stato eseguito al microscopio ottico.

I test IHC e IF venivano eseguiti su sezioni immerse in paraffina secondo procedure consolidate. In breve, il prelievo antigenico è stato effettuato incubando sezioni in tampone di citrato 0,01 M a 60 °C per 4 ore. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari tra cui ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) e p-P65 (1:300). Dopo l'incubazione con i corrispondenti anticorpi secondari per 20 minuti, le sezioni sono state sottoposte a soluzione di diaminobenzidina (DAB) e controcolorazione di ematossilina per IHC o colorate con DAPI per la marcatura nucleare in IF. Per la quantificazione positiva della colorazione, sono stati catturati quattro campi selezionati casualmente da ciascuna delle tre sezioni di tessuto per campione. Nella colorazione IHC, la densità ottica media è stata definita come il rapporto tra la densità ottica integrata (IOD) e l'area cavitaria corrispondente, come determinato tramite il software Image-Pro Plus. Nella colorazione IF, l'area positiva di colorazione veniva normalizzata all'area del campo ed espressa in percentuale, e la quantificazione veniva eseguita con lo stesso software.

Coltura primaria dei macrofagi del midollo osseo (BMM) e test di conteggio cellulare

Le cellule del midollo osseo sono state rimosse dai femori e dalle tibie dei topi C57BL/6 di 2 mesi con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La sospensione a celle risultante fu filtrata attraverso un colone da 70 μm e centrifugata a 200 x g per 5 minuti. Il pellet cellulare è stato risospeso in un mezzo completo α-MEM contenente il 10% di siero bovino fetale. Dopo 24 ore di incubazione a 37 °C in un'atmosfera al 5% di CO₂, le cellule non aderenti sono state rimosse. Per indurre la differenziazione dei macrofagi, le cellule aderenti sono state coltivate in un mezzo contenente 50 ng/mL fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) e 40 ng/mL di RANKL per 5–7 giorni fino all'osservazione di BMM maturi.

I BMM venivano placcati a 3 x 104 celle per pozzo in piastre da 96 pozzi. Dopo 24 ore di trattamento con concentrazioni gradienti di LWDHW, le BMM sono state incubate con soluzione operativa al 10% del Kit di Conteggio Cellulare-8 (CCK-8) a 37 °C per 1 ora. L'assorbenza di ciascun pozzo veniva misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

Analisi quantitativa dell'espressione genica sui BMM primari

I BMM sono stati seminati in piatti da 6 cm a una densità di 3 x 106 cellule per piatto. Dopo il trattamento con 500 e 1.000 μg/mL LWDHW per 24 ore, l'RNA totale è stato estratto dai BMM utilizzando il kit di purificazione rapida RNA-Quick secondo le istruzioni del produttore. Dopo la quantificazione tramite spettrofotometria, 500 ng di RNA totale sono stati trascritti inversamente in cDNA. La PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) è stata eseguita utilizzando primer specifici per geni (Tabella 2), e le condizioni di ciclazione PCR sono state le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi. I livelli di espressione genica sono stati analizzati utilizzando il metodo 2ΔΔCt , con GAPDH come gene di riferimento interno.

Analisi del western blot sui BMM primari

Dopo essere stati impiattati a 3 x 106 cellule per piastra in piastre da 6 cm, i BM sono stati trattati con vari interventi e poi lisati su ghiaccio con il tampone di lisi RIPA. La proteina totale è stata raccolta e quantificata con un Kit di Analisi Proteica BCA. I campioni proteici (30 μg per corsia) sono stati separati da SDS-PAGE su gel di poliacrilammide al 12,5% e trasferiti su membrane PVDF a 0,2 μm. Dopo un blocco per 20 minuti, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) e β-actin (1:1000). Il giorno successivo, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un ECL Chemiluminescence Detection Kit e catturate con un Sistema Automatico di Analisi delle Immagini di Chimiluminescenza.

Colorazione del TRAP dei tessuti femorali e dei BMM

Sezioni di tessuto femorale e BMM placcate in piastre da 24 pozzi a 1 x 105 cellule/pozzo sono state colorate utilizzando un kit di colorazione con fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) seguendo il protocollo del produttore. La superficie dell'osso trabecolare coperta da osteoclasti (Oc.S/BS) nelle sezioni tissutali e l'area di formazione dell'osteoclasto nelle colture BMM sono state quantificate utilizzando il software Image-Pro Plus.

Analisi statistica

Tutti i dati sono stati presentati come deviazione media ± standard. Un'ANOVA unidirezionale seguita dal test di Dunnett è stata utilizzata per l'analisi statistica in SPSS. *p < 0,05 e **p < 0,01 sono stati considerati statisticamente significativi.

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Risultati

Componenti chimici di LWDHW analizzati tramite LC-MS/MS

Il profilo chimico della soluzione acquosa LWDHW è stato caratterizzato dall'analisi LC-MS/MS. Sono stati identificati in totale 1615 componenti, di cui 968 rilevati in modalità ionizzazione positiva e 647 in modalità ionizzazione negativa (Figura 2A). I dettagli dei 10 componenti principali di ciascuna modalità di ionizzazione sono elencati...

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Discussione

Con l'invecchiamento della popolazione globale, il PMOP è diventato un serio problema sanitario a livello mondiale, colpendo milioni di donne ognianno 36. Considerando gli effetti collaterali associati agli attuali farmaci anti-osteoporotici, è fondamentale sviluppare strategie terapeutiche più sicure ed efficaci. LWDHW è una formula classica per tonificare i reni nella MTC e funge da medicina alternativa per il trattamento di varie malattie ossee

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (ZCLQN25H2701).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.01 M citrate bufferSolarbioC1010Per il recupero dell'antigene di sezioni femorali per colorazione IHC e IF nel Protocollo Passo 10
0.2 μm PVDF membranes BioRad1620177Per l'elettrotrasferimento di proteine da SDS-PAGE alla membrana nel Protocollo Passo 13
12.5% gel di poliacrilammideEpizyme BiotechPG113Per la separazione SDS-PAGE delle proteine nel Protocollo Passo 13
Anticorpo ALP ARIGOARG57422Per la rilevazione IHC nelle sezioni femorali nel Protocollo Passo 10
Sistema di Analisi Immagini Chemiluminescenza Automatico Tanon 5200Per la visualizzazione delle bande Western blot nel Protocollo Passo 13
Sistema di Test di Fatica Assile-Torsionale Instronmodel 5569R1412Per il test biomeccanico dei campioni femorali nel Protocollo Passo 9
Kit di Dosaggio Proteico BCABeyotimeP0010SPer la quantificazione delle proteine prima del Western blot nel Protocollo Passo 13
CCK-8BeyotimeC0039Per la misurazione della vitalità cellulare di BMMs nel Protocollo Passo 11
CytoscapeNon applicabileNon applicabileVersione 3.8.0
Database DAVIDNon applicabileNon applicabileVersione 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
Database DisGeNETNon applicabileNon applicabilehttps://www.disgenet.org/
Kit di Rilevazione Chemiluminescenza ECLVazymeE411-04Per il rilevamento chemiluminescente dei segnali Western blot nel Protocollo Passo 13
Kit ELISA per OCNMEIMIANMM-0551M1Per la misurazione dei livelli di osteocalcina sierica nel Protocollo Passo 8
Kit ELISA per β-CTXMEIMIANMM-44858M1Per la misurazione dei livelli di β-CTX sierico nel Protocollo Passo 8
Database GeneCardsNon applicabileNon applicabilehttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830APer l'amplificazione qRT-PCR nel Protocollo Passo 12
Attrezzatura per micro-tomografia computerizzata ad alta risoluzione (μCT)BrukerSkyscan 1176Per l'imaging μCT ad alta risoluzione della microstruttura ossea femorale nel Protocollo Passo 9
Anticorpo IL-1β BIOSSbs6319RPer la rilevazione IHC nelle sezioni femorali nel Protocollo Passo 10
Anticorpo IκBαCST4812Per la rilevazione Western blot nel Protocollo Passo 13
Database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Non applicabileNon applicabilehttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Per l'induzione della differenziazione dei BMMs nel Protocollo Passo 11
Database MetascapeNon applicabileNon applicabilehttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531Per l'analisi LC-MS/MS di LWDHW nel Protocollo Passo 2
Anticorpo P65CST8242Per la rilevazione Western blot nel Protocollo Passo 13
Anticorpo p-IκBαCST2859Per la rilevazione Western blot nel Protocollo Passo 13
Anticorpo p-P65CST3033SPer la rilevazione Western blot nel Protocollo Passo 13
Anticorpo p-P65Suzhou Ruiying RLP0187Per la rilevazione IHC nelle sezioni femorali nel Protocollo Passo 10
PrimeScript RT Reagent Kit TakaraRR047APer la retrotrascrizione dell'RNA totale nei BMMs per l'analisi qRT-PCR nel Protocollo Passo 12
Sistema QuantStudio 5Applied BiosystemsA28573Per l'analisi qRT-PCR dei geni marcatori degli osteoclasti nel Protocollo Passo 12
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Per l'induzione della differenziazione dei BMMs nel Protocollo Passo 11
Buffer di lisi RIPAEpizyme BiotechPC101Per l'estrazione delle proteine totali dai BMMs nel Protocollo Passo 13
Kit di Purificazione Rapida dell'RNA TransGen BiotechER501-01-V2Per l'estrazione dell'RNA totale nei BMMs nel Protocollo Passo 12
Software SPSS IBMversione 26Per l'analisi statistica dei dati sperimentali nel Protocollo Passo 15
Database STRING Non applicabileNon applicabilehttps://string-db.org/
Kit di colorazione per Fosfatasi Acida Resistente al Tartrato (TRAP)AMIZONAAMK1001-S1Per la colorazione TRAP per identificare e quantificare gli osteoclasti nel Protocollo Passo 14
Sistema UPLC Thermo VanquishThermo Fisher ScientificTSLC-002Per l'analisi LC-MS/MS di LWDHW nel Protocollo Passo 2
Anticorpo TNF-αSuzhou Ruiying RLM3472Per la rilevazione IHC nelle sezioni femorali nel Protocollo Passo 10
Database della Farmacologia del Sistema della Medicina Tradizionale Cinese (TCMSP) Non applicabileNon applicabilehttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
Database UniProt Non applicabileNon applicabilehttps://www.uniprot.org/
Colonna UPLCWatersACQUITY HSS T3Per l'analisi LC-MS/MS di LWDHW nel Protocollo Passo 2
Strumento online Venny Non applicabileNon applicabilehttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
Anticorpo β-actinaAbcamab8227Per la rilevazione Western blot nel Protocollo Passo 13

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