Raccolta volontaria di campioni fecali compatibili in gruppi in topi utilizzando un sistema di gabbie su misura

Sommario

Questo protocollo descrive un sistema di gabbie personalizzato per la raccolta volontaria, favorevole al benessere, simultanea e individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo.

Abstract

La misurazione affidabile dei metaboliti fecali del corticosterone richiede campioni fecali che possano essere assegnati a singoli animali e raccolti entro una finestra temporale definita. Questo è una sfida nei topi alloggiati in gruppo, dove i campioni in gabbia domestica non permettono l'assegnazione individuale, e la separazione temporanea può interferire con il benessere animale e i risultati degli studi. L'obiettivo di questo protocollo è presentare un sistema di gabbie semplice ed economico che consenta la raccolta volontaria, simultanea e individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo. Il sistema consiste in una gabbia domestica in policarbonato con tettolo di filo collegata a tre singole scatole di raccolta. Dopo l'abitudine e l'addestramento, i topi entrano volontariamente nelle scatole per ricevere una piccola ricompensa alimentare. Le porte possono quindi essere chiuse senza inseguire, maneggiare o forzare il trasferimento. I pellet fecali vengono raccolti separatamente da ogni scatola, permettendo di assegnare campioni a singoli animali mantenendo al contempo un alloggio sociale al di fuori del periodo di campionamento. Questo protocollo supporta il campionamento longitudinale non invasivo ed è adatto per studi che misurano metaboliti del corticosterone fecale o altri biomarcatori fecali. Il design è facile da realizzare con materiale standard per gabbie e vetro acrilico, può essere smontato per la pulizia e permette di campionare in parallelo diverse gabbie. Riducendo i disturbi legati alla gestione e migliorando la standardizzazione della finestra di campionamento, il metodo fornisce un perfezionamento pratico per il monitoraggio endocrino nei topi alloggiati in gruppo.

Introduzione

Una delle principali difficoltà nella valutazione delle concentrazioni plasmatiche di corticosterone è che la procedura di campionamento stessa può indurre un aumento acuto del corticosterone, confondendo così la misurazione e potenzialmente influenzando l'interpretazione dei risultati dello^{studio 1,2,3}. La misurazione dei metaboliti del corticosterone fecale (FCM) offre un'alternativa non invasiva, poiché le concentrazioni di FCM riflettono i livelli circolanti di glucocorticoidi diverse ore prima del campionamento, a seconda della specie, dello stirpo, del sesso e del tempo di passaggio^{intestinale 4,5}. Tuttavia, un'analisi affidabile della FCM nei topi alloggiati in gruppo rimane una sfida. I campioni fecali raccolti dalla gabbia di casa non possono essere assegnati a singoli animali e possono mostrare alta variabilità a causa di differenze interindividuali nella secrezione di glucocorticoidi e incertezza nella finestra di campionamento esatta. Separare gli animali per lunghi periodi può interferire con gli obiettivi dello studio, mentre la separazione a breve termine per la raccolta individuale di campioni è laboriosa, limita la produttività e può a sua volta indurre stress².

Per consentire la raccolta individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo con una gestione minima, è stata sviluppata una gabbia di raccolta fecali su misura (Figura 1A-E). Il progetto è stato adattato da una gabbia di raccolta fecale precedentemente descritta per topi^{spinosi 6} e modificato per l'uso con topi da laboratorio. Il sistema consiste in una gabbia standard in policarbonato tipo III collegata a tre singole cassette di raccolta, a cui gli animali possono accedere volontariamente e chiudere tramite porte scorrevoli. Questa configurazione consente di raccogliere campioni fecali da singoli topi senza maneggiamento diretto durante il periodo di campionamento e consente di campionare simultaneamente più animali. La gabbia, quindi, offre un approccio pratico per il campionamento FCM non invasivo e attribuibile individualmente nei topi alloggiati in gruppo.

Il protocollo seguente descrive un sistema di campionamento fecale che consente la raccolta e l'identificazione di campioni fecali da singoli topi mantenendo un ambiente di alloggio di gruppo, utilizzando gabbie personalizzate per il campionamento senza contatto delle feci.

Protocollo

Il comitato responsabile per l'etica animale dell'Università Medica di Vienna è stato consultato prima dello studio e ha informato che non era richiesta alcuna licenza formale per l'esperimentazione animale; pertanto, non è disponibile alcun numero di approvazione o di protocollo. Lo studio ha coinvolto solo pratiche di allevamento e riproduzione consolidate, insieme alla raccolta di campioni fecali non invasivi. Non sono state eseguite procedure invasive. In conformità con la Direttiva 2010/63/UE, il carico previsto per gli animali è stato valutato come inferiore alla soglia di dolore, sofferenza, disagio o danno duraturo equivalente o superiore a quello causato dall'introduzione di un ago, in conformità con una buona pratica veterinaria. Tutti gli animali venivano ospitati e curati secondo gli standard istituzionali di benessere animale.

1. Costruzione delle gabbie (vedi elenco dei materiali)

1. Taglia le parti 1-4 da plexiglass/vetro acrilico da 5 mm secondo i modelli mostrati nella Figura 2A-C.
   NOTA: I modelli con dimensioni esatte possono essere stampati in formato DIN A3 (Figura Supplementare 1 e Figura Supplementare 2).
2. Taglia il fondo della gabbia in policarbonato tipo II (PTII) come indicato nella Figura 2D. Questa parte servirà poi come copertura superiore delle scatole di raccolta fecali.
3. Forare i fori e le fessure nell'ex fondo della gabbia PTII come indicato nella Figura 2D.
   NOTA: Le dimensioni esatte sono fornite nella Figura Supplementare 3.
4. Forare il lato anteriore e il lato corto della gabbia PTIII come indicato nella Figura 2E.
   NOTA: Le dimensioni esatte sono fornite nella Figura Supplementare 4.
5. Usa la parte 2 come modello per segnare i corrispondenti fori di trapano sul lato corto della gabbia PTIII e sul lato lungo della gabbia PTII.
6. Forare i fori segnati e fissare la gabbia PTIII, la gabbia PTII e la parte 2 usando le viti filettate, come mostrato nella Figura 2F.
7. Inserisci la parte 1 come parte inferiore della gabbia PTII. Posiziona le parti 4a e 4b in modo che tengano ferme la parte 1 e dividi la gabbia di campionamento in scatole di raccolta separate. Usa la pistola di colla calda per fissarle in posizione.
8. Fai scorrere le sporgenze inferiori delle parti 4a e 4b nelle fessure della parte 1. Queste sporgenze formano le gambe delle scatole di raccolta.
9. Fai scorrere le sporgenze superiori delle parti 4a e 4b attraverso la copertura superiore, l'ex parte inferiore della gabbia PTII, per tenerla in posizione.
10. Infila le bacchette o le aste di legno attraverso i fori delle sporgenze, usando una barra in alto e due in basso, per stabilizzare e fissare la costruzione.
    NOTA: I materiali in legno dovrebbero essere usati nel vivario solo se sono usa e getta, poiché non sono pulibili. Se non è così, dovrebbero essere utilizzate aste di composizione alternativa.
11. Chiudi gli spazi residui o le piccole imprecisioni usando una pistola per colla calda. Usa le parti 3a, 3b e 3c (Figura 2B) come porte scorrevoli tra la gabbia di casa e le scatole di raccolta.
    NOTA: Assicurati che non siano accessibili agli animali spigoli taglienti, residui di colla o materiale sporgente. I componenti in vetro acrilico/plexiglass utilizzati in questo prototipo non sono adatti alla sterilizzazione con autoclave a vapore. Pertanto, se il sistema viene utilizzato in strutture SPF che richiedono materiale sterilizzato correlato alla gabbia, dovrebbe essere utilizzata una procedura di disinfezione non autoclave approvata dall'istituzione, oppure i componenti in acrilico dovrebbero essere sostituiti con materiale autoclavabile mantenendo le stesse dimensioni.

2. Preparazione e alloggio degli animali

1. Ottenere il numero richiesto di topi del ceppo o ceppi appropriati per lo studio.
   NOTA: I dati rappresentativi sono stati ottenuti da 30 topi C57BL/6J di otto settimane, composti da 20 femmine e 10 maschi. I topi erano privi di patogeni specifici secondo gli standard FELASA e furono ottenuti dai Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germania.
2. Animali da casa in condizioni convenzionali in gabbie di policarbonato adattato tipo III con un massimo di tre topi adulti per gabbia.
   NOTA: I maschi separati sono stati ospitati in gabbie standard in policarbonato tipo II per questo studio.
3. Mantieni la stanza degli animali a 22 ± 2 °C e 55 ± 10% di umidità relativa durante un ciclo di 12 ore di luce e scuro con le luci accese alle 6:00.
4. Fornisci una dieta di mantenimento standard e acqua ad libitum.
5. Aggiungi biancheria da letto in legno di tremolo, un rotolo di carta igienica, una cassa rossa trasparente in plastica e carta assorbente come materiale da nido a ogni gabbia.
6. Identifica i topi principalmente tramite i segni naturali della coda. Applicare temporaneamente i segni a penna sugli animali con marcature simili sulla coda durante la pesata, se necessario.

3. Abituazione e addestramento degli animali

NOTA: La gabbia completata consiste in una gabbia domestica, PTIII, collegata a una gabbia di campionamento con tre scatole di raccolta separate, PTII. Le gabbie domestiche possono essere utilizzate come le tradizionali, con lettiera, arricchimento della gabbia, un coperchio di filo metallico senza fissaggi esterni e fornendo cibo e acqua. Il sistema può essere smontato per il lavaggio e può essere utilizzato solo durante le settimane di campionamento. Durante le settimane senza campionamento, gli animali possono essere ospitati in gabbie standard PTIII.

1. Inserire gli animali nel sistema di gabbie almeno due settimane prima della prima sessione di campionamento programmata.
2. Abitua gli animali alle cassette di raccolta rimuovendo le porte scorrevoli per una notte, permettendo loro di esplorare liberamente le cassette.
3. Esegui tre sessioni di addestramento prima della prima sessione di campionamento. Condurre l'addestramento nelle stesse condizioni di luce e alla stessa ora della giornata previsto per un campionamento successivo, idealmente sotto luce rossa poco dopo l'inizio della fase buia.
4. Applica una piccola quantità di premio, come crema di nocciole, burro di arachidi, pasta di malto o un alimento simile appetibile, sulla parete opposta all'ingresso di ogni scatola di raccolta.
5. Il primo giorno di addestramento, lascia le porte aperte e lascia che gli animali scoprano e consumino volontariamente la ricompensa.
6. Il secondo giorno di addestramento, aspetta che un animale entri in una cassetta di raccolta e inizi a leccare la ricompensa. Chiudi con attenzione la porta scorrevole dietro l'animale e lasciala andare dopo 10 minuti.
7. Il terzo giorno di addestramento, ripeti la procedura e allunga gradualmente il tempo in cui gli animali restano nelle cassette di raccolta.
   NOTA: L'addestramento dovrebbe essere calmo e costante. Evita di inseguire gli animali nelle casse, poiché ciò potrebbe aumentare lo stress e ridurre la partecipazione volontaria alle sessioni di campionamento successive.

4. Raccolta di campioni fecali

1. Tempistica della raccolta del campione
   1. Pianifica il tempo di campionamento in base alla domanda biologica e al ritardo previsto tra l'escrezione plasmatica del corticosterone e del metabolita del corticosterone fecale. Nei topi, i metaboliti del corticosterone fecale riflettono tipicamente i livelli circolanti di glucocorticoidi circa 8-10 ore prima del campionamento.
      NOTA: Se il tempismo preciso è critico, esegui uno studio pilota per determinare il decorso temporale dell'escrezione della FCM nella specifica ceppa, sesso e condizioni sperimentali utilizzate. Questo pilota può essere combinato con le sessioni di addestramento.
   2. Programma il campionamento durante un periodo di alta produzione fecale. Il campionamento è solitamente più efficiente all'inizio della fase scura e attiva.
   3. Eseguire tutte le sessioni di campionamento alla stessa ora della giornata durante lo studio per ridurre la variazione causata dal ritmo diurno dei livelli di FCM.
      NOTA: Secondo la nostra esperienza, gli eventi che avvengono al mattino intorno alle 10:00 sono ben riflessi quando il campionamento è programmato tra le 18:00 e le 20:00, a seconda del programma di luce della stanza degli animali.
2. Procedura di campionamento e consigli pratici
   1. Segna gli animali singolarmente prima di campionare. Usa segni per le orecchie o singoli segni sulla coda.
      NOTA: Le marcature sulle dita e i codici colore possono essere difficili da riconoscere all'interno delle scatole sotto la luce rossa.
   2. Prepara le scatole di raccolta durante la fase di luce applicando la ricompensa sulla parete posteriore di ogni scatola.
      NOTA: Preparare le scatole durante il giorno migliora la visibilità per l'esperante e permette agli animali di annusare la ricompensa prima del campionamento.
   3. Al momento previsto per il campionamento, apri le scatole di raccolta e attendi che gli animali entrino volontariamente.
   4. Una volta che un topo è entrato in una cassetta di recupero, chiudi con cura la porta scorrevole dietro di essa.
   5. Dopo che tutti gli animali sono entrati in una scatola, registra l'identità e la posizione di ogni topo in un foglio di campionamento preparato.
   6. Se vengono campionati più di 10 gabbie in una sola sessione, coinvolgi un secondo sperimentatore per supportare l'identificazione degli animali, la gestione delle porte e la documentazione.
   7. Conservare gli animali nelle scatole di raccolta per la durata prevista del campionamento, tipicamente da 30 minuti a 2 ore, a seconda dell'output fecale previsto e del disegno dello studio.
      NOTA: Escludere i campioni se l'identità individuale non può essere assegnata con certezza, se i pellet fecali sono contaminati da urina, lettiera o feci di un altro animale, se la durata del campionamento si discosta sostanzialmente dalla finestra temporale pianificata, o se la quantità di materiale fecale è insufficiente per l'analisi FCM.
      NOTA: L'uso di 50 mg è il nostro protocollo standard, e questa quantità è stata utilizzata in tutte le validazioni e in tutti gli altri^{articoli 5,7,8}. Normalmente, può essere facilmente ottenuto.
   8. Al termine del periodo di campionamento, apri le porte scorrevoli e lascia che i topi tornino nella gabbia di casa.
   9. Chiudi le scatole di raccolta immediatamente dopo che i topi sono usciti per evitare il rientro e la contaminazione incrociata dei campioni.
   10. Rimuovi i pellet fecali da ogni scatola di raccolta usando una lunga pinza e trasferiscili in tubi di raccolta etichettati singolarmente.
   11. Conservare i campioni a -20 °C fino a una nuova preparazione del saggio FCM.
       NOTA: Se le scatole sono ben chiuse e non possono essere rientrate dai topi, la raccolta dei pellet fecali può essere posticipata fino alla successiva fase di luce. Tuttavia, questo dovrebbe essere fatto in modo coerente all'interno di uno studio.
   12. Tieni gli animali nella parte della gabbia domestica (PTIII) fino al prossimo cambio di gabbia. Poi possono essere smontati e lavati in una normale lavatrice a gabbia.

Risultati

I metaboliti del corticosterone fecale (FCM) sono stati quantificati con successo da campioni raccolti con gabbie di campionamento fecali personalizzate in uno studio longitudinale che ha confrontato topi allevati in modo permanente e intermittente. L'analisi rappresentativa della FCM includeva 30 animali: gruppo permanentemente riprodotto, n = 15 animali in 5 gaibbie; gruppo riprodotto a intermittenza, n = 10 animali in 5 gabbie, con 5 maschi alloggiati da soli tranne che per 3 eventi riproduttivi, dove venivano ospitati insieme alle femmine. I campioni sono stati raccolti in 19 punti orari bisettimanali nei giorni di cambio gabbia così come nei fine settimana. Il tempo medio fino all'ingresso della maggior parte degli animali nella scatola era di 7,5 minuti (DS = 3,07), con la maggior parte degli animali che costituiva una media di 27,6 (DS = 1,44) e un totale di 30 topi. Tutti i topi erano entrati nella scatola dopo una media di 11,69 min (SD = 3,29). La durata media del confinamento per tutti i topi era di 24,56 min (SD = 15,51), e il tempo medio dal primo topo che entra nella scatola fino all'inizio del rilascio è stato di 43,14 min (SD = 8,51). La durata media del rilascio è stata di 14,86 min (DS = 22,82), e la durata media dell'intera procedura è stata di 68,00 min (SD = 11,87). Da 19 campionamenti (3 prove + 16 normali), aspettandosi 480 campioni, mancavano due campioni perché i topi non defecavano durante il partorio, tre campioni non potevano essere raccolti perché i topi erano molto gravi o poco dopo la nascita, e 5 topi necessitavano di un supporto delicato per entrare. Il peso medio dei campioni raccolti dai primi tre campionamenti era di 51,16 mg (SD = 25,39). Di tutti i campioni raccolti (475), 473 sono stati analizzati e hanno prodotto risultati.

I singoli animali erano considerati repliche biologiche. I campioni fecali ripetuti raccolti dagli stessi animali durante il periodo di otto settimane di studio sono stati trattati come misurazioni longitudinali ripetute e non come repliche biologiche indipendenti. L'analisi è stata effettuata utilizzando un modello lineare a effetti misti con sesso, gruppo di riproduzione, giorno di campionamento e numero di topi per gabbia come effetti fissi, e gabbia come intercettazione casuale. Nel modello sono state incluse le interazioni tra sesso, gruppo di riproduzione e giorno di campionamento. Il numero di topi per gabbia è stato incluso come effetto fisso aggiuntivo ma non è stato testato in termini di interazione, perché questa variabile era in parte confusa con il disegno sperimentale, in particolare nei maschi aproducenti a intermittenza.

Il modello ha mostrato un chiaro effetto del sesso sulle concentrazioni di FCM (Figura 3A-D). Le femmine avevano concentrazioni di FCM più elevate rispetto ai maschi in condizioni riproduttive e giorni di campionamento, stima = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. I confronti post hoc hanno confermato questa differenza di sesso sia all'interno di entrambi i gruppi di riproduzione sia nei giorni di campionamento. Negli animali riprodotti permanentemente, le femmine avevano concentrazioni di FCM più elevate rispetto ai maschi la domenica, stima = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, e il mercoledì stima = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Lo stesso schema è stato osservato negli animali riprodotti a intervalli la domenica, stima = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, e il mercoledì stima = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Il modello ha anche indicato un effetto principale significativo del gruppo di riproduzione, stima = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Tuttavia, i confronti post hoc aggiustati da Tukey non hanno rivelato differenze significative tra animali riprodotti in modo permanente e intermittente all'interno delle singole combinazioni sesso/giorno. Nelle femmine, gli animali riprodotti in modo permanente e intermittente non differivano significativamente la domenica, stima = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, o il mercoledì, stima = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Analogamente, nei maschi non è stata rilevata una differenza significativa tra i gruppi di riproduzione la domenica, stima = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, oppure il mercoledì, stima = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. L'effetto principale significativo del gruppo riproduttivo dovrebbe quindi essere interpretato come un effetto complessivo a livello di modello, mentre i confronti post hoc più specifici e aggiustati da Tukey all'interno del sesso e del giorno di campionamento non hanno identificato una differenza robusta tra gruppi coppie.

L'assenza di una significativa differenza tra i maschi tra i gruppi di riproduzione è particolarmente importante, poiché i maschi erano sempre in una sola casa la domenica. Pertanto, il confronto domenicale nei maschi mostra che il metodo di campionamento stesso non aumenta le concentrazioni di FCM, almeno nei topi maschi. Le gabbie di campionamento fecale sono state utilizzate anche per un altro studio che ha confrontato le FCM in topi sentinella con lettiera sporca rispetto ai^{controlli 9}.

Figura 1: Panoramica della gabbia di campionamento fecale su misura. Il sistema di gabbia consente di raccogliere campioni fecali da singoli topi ospitati in una gabbia di gruppo senza una gestione diretta durante il campionamento. (A) Sistema di gabbie completamente assemblato composto da una gabbia domestica e una gabbia di prelievo fecale attaccata. (B) Vista laterale della gabbia di campionamento attaccata. (C) Vista dall'alto che mostra i tre ingressi separati alle singole scatole di raccolta. (D) Vista dall'interno della gabbia verso gli ingressi delle scatole di campionamento. (E) Ha aperto la gabbia di campionamento, permettendo l'accesso alle scatole di raccolta per la rimozione e la pulizia dei pellet fecali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Piano di costruzione e assemblaggio della gabbia per il campionamento fecale. (A-C) Parti in vetro acrilico vengono utilizzate per costruire il pavimento, le pareti laterali, le porte scorrevoli e i divisori della gabbia di campionamento. (D) Modifica della gabbia in policarbonato tipo II rimuovendo il fondo e forando fori e fessure per la copertura della scatola di raccolta. (E) Modifica della gabbia domestica in policarbonato tipo III forando tre fori d'ingresso nella parte anteriore. (F) Vista laterale schematica del sistema di gabbie assemblato, che mostra la gabbia domestica in policarbonato tipo III collegata alla gabbia di campionamento in policarbonato tipo II modificata e il posizionamento delle parti 1, 2 e 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dati rappresentativi FCM ottenuti dopo la raccolta del campione fecale utilizzando la gabbia personalizzata. I metaboliti fecali del corticosterone (FCM) sono stati misurati in campioni fecali raccolti singolarmente da topi alloggiati in gruppo utilizzando la gabbia di campionamento fecale personalizzata. I valori sono mostrati in otto punti settimanali di campionamento per topi riprodotti in modo permanente e intermittente. I campioni venivano raccolti nei giorni di cambio gabbia o nei fine settimana. I punti e le linee di collegamento rappresentano i mezzi di gruppo in ogni punto temporale. Barre di errore e nastri ombreggiati indicano la deviazione media ± standard (SD). (A) Femmine campionate nei giorni di cambio gabbia. (B) Femmine campionate durante i fine settimana. (C) Maschi campionati nei giorni di cambio gabbia. (D) Maschi campionati durante i fine settimana. La figura illustra che il metodo ha prodotto concentrazioni misurabili di FCM in tutti i gruppi e nei momenti temporali. Le femmine generalmente mostravano concentrazioni di FCM più elevate rispetto ai maschi, mentre le differenze tra i gruppi riproduttivi erano meno costanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Modelli per componenti in vetro acrilico 1-3. Modelli per tagliare le Parti 1, 2 e 3a-c da vetro acrilico/plexiglass da 5 mm per la costruzione della gabbia di campionamento fecale. La Parte 1 funge da inserto inferiore della gabbia di policarbonato modificato tipo II. La Parte 2 viene utilizzata per collegare la gabbia in policarbonato tipo III alla gabbia in policarbonato tipo II e per segnare i corrispondenti fori di perforazione. Le parti 3a-c formano i divisori interni/elementi strutturali del sistema di raccolta. Le marcature circolari bianche indicano fori d'aria, mentre quelle più piccole indicano fori per viti. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 2: Modelli per i componenti in vetro acrilico 4a e 4b. Modelli per tagliare le Parti 4a e 4b da vetro acrilico/plexiglass da 5 mm. Queste parti vengono inserite nella Parte 1 per tenere in posizione l'inserto inferiore e per dividere la gabbia di campionamento in scatole separate per la raccolta fecali. Le sporgenze inferiori formano le gambe delle scatole di raccolta, mentre quelle superiori passano attraverso la copertura superiore e sono fissate con aste di legno o bacchette per stabilizzare la costruzione. I cerchi bianchi indicano le aperture per le aste o i fori d'aria. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 3: Modifica della gabbia in policarbonato tipo II. Modello schematico per modificare la gabbia in policarbonato tipo II. Il fondo della gabbia viene tagliato come indicato e successivamente utilizzato come copertura superiore delle scatole di raccolta fecali. Fori e fessure sono praticati nella sezione inferiore rimossa per permettere l'inserimento e la fissazione delle Parti 4a e 4b. I fori per le viti sono utilizzati per fissare la gabbia in policarbonato tipo II, quella in policarbonato tipo III e la Parte 2. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 4: Modifica della parte anteriore della gabbia in policarbonato tipo III. Modello schematico per forare la parte anteriore della gabbia in policarbonato tipo III. Tre aperture circolari sono praticate nel lato corto della gabbia per consentire l'accesso tra la gabbia domestica e quella per il campionamento fecale. Fori aggiunti per le viti vengono utilizzati per la fissazione alla Parte 2 e alla gabbia in policarbonato tipo II. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Questo protocollo descrive un semplice sistema di gabbie per raccogliere campioni fecali assegnabili individualmente da topi alloggiati in gruppo. Il principale vantaggio del metodo è che combina l'attribuzione individuale di campioni con il mantenimento di aspetti chiave dell'edilizia sociale, in particolare il contatto visivo e olfattivo con i compagni di gabbia. Questo è rilevante perché l'alloggio di gruppo è spesso necessario per il benessere animale e può anche far parte del disegno^{sperimentale 10}. A differenza del campionamento in gabbia domestica in pool, il sistema consente di assegnare valori FCM a singoli animali, evitando però un alloggio prolungato prima o durante la raccolta del campione.

Gli approcci comunemente utilizzati per la raccolta di campioni fecali nei topi da laboratorio includono campionamento in gabbie domestiche in pool, alloggio temporaneo individuale in gabbie pulite, gabbie metaboliche e raccolta diretta dopo la manipolazione o il trasferimento. I campioni di gabbie domestiche in pool sono facili da ottenere, non invasivi, economici e compatibili con il campionamento parallelo di molte gabbie, ma non permettono l'attribuzione individuale negli animali alloggiati in gruppo. L'alloggio individuale temporaneo o il trasferimento in gabbie pulite consente l'assegnazione individuale di campioni, ma allontana gli animali dal loro gruppo sociale e può introdurre uno stress acuto a causa della manipolazione, della novità o della separazione sociale. Questo è particolarmente rilevante per l'analisi FCM, poiché le misure correlate al corticosterone sono sensibili allo stress causato dalla procedura di campionamento stessa¹¹. Le gabbie metaboliche forniscono una raccolta controllata di campioni e permettono la separazione di feci e urina, ma richiedono attrezzature specializzate, sono meno compatibili con la gestione abitativa e solitamente coinvolgono alloggiamenti individuali. La raccolta basata sulla manipolazione diretta può anche fornire campioni attribuibili individualmente, ma richiede una manipolazione o manipolazione ripetuta degli animali e può quindi influenzare le letture legate allo stress.

Rispetto a questi approcci esistenti, il sistema attuale è stato progettato come un raffinamento compatibile con l'alloggio di gruppo per campionamenti fecali individuali ripetuti e non invasivi. Dopo l'abituazione e l'addestramento, i topi entrano volontariamente nelle scatole di campionamento in risposta a una piccola ricompensa alimentare. I campioni possono quindi essere raccolti senza inseguire, maneggiare o trasferirsi forzatamente in una gabbia separata. Il sistema non dovrebbe essere interpretato come dimostrato come un miglioramento del benessere o una riduzione dello stress in senso strettamente sperimentale, poiché misure dirette di welfare non sono state incluse nel presente studio. Tuttavia, è stato progettato per ridurre il grado di separazione sociale durante la raccolta dei campioni e potrebbe quindi essere meno dirompente rispetto ai metodi convenzionali di raccolta individuale. Inoltre, diversi animali e diverse gabbie possono essere campionati in parallelo, aiutando a standardizzare la finestra di campionamento, cosa importante perché le concentrazioni di FCM dipendono dal ritmo circadiano e riflettono la secrezione di glucocorticoidi diverse ore prima del^{campionamento 5,12}.

I risultati rappresentativi dimostrano che il sistema è adatto per la raccolta di campioni fecali che possono essere analizzati per le concentrazioni di FCM. Sono state ottenute concentrazioni misurabili di FCM tra gruppi e momenti temporali, e il metodo ha rilevato la chiara differenza tra i sessi attesa, con concentrazioni di FCM più elevate nelle femmine rispetto ai maschi. Lo studio includeva anche un confronto interno con le abitazioni convenzionali singole nei maschi. La domenica, i maschi del gruppo di riproduzione intermittente venivano abitati in una sola casa, mentre i maschi riprodotti permanentemente venivano campionati utilizzando il nuovo sistema di raccolta sviluppato. Le concentrazioni di FCM non differivano significativamente tra questi gruppi la domenica. Ciò suggerisce che l'ingresso volontario nella gabbia di campionamento e la permanenza a breve termine nella cassetta di raccolta non hanno aumentato notevolmente le concentrazioni di FCM rispetto alla raccolta convenzionale con un singolo alloggio. Tuttavia, questo confronto era limitato agli uomini e non era stato progettato come uno studio dedicato di equivalenza o validazione crossover. Ulteriori studi dovrebbero quindi confrontare il sistema con approcci consolidati di abitazione individuale o gabbia metabolica in condizioni sperimentali equilibrate e includere indicatori comportamentali di stress acuto durante il campionamento.

Oltre alla valutazione dei metaboliti fecali del corticosterone, il sistema può essere utile anche per altre applicazioni che richiedono la raccolta a breve termine di singoli campioni fecali. Le potenziali applicazioni includono esami parassitologici, analisi del microbiota, studi digestionali o altri saghi sui biomarcatori fecali. Con modifiche tecniche minori, il sistema potrebbe potenzialmente essere adattato anche per la raccolta delle urine, ad esempio introducendo un pavimento perforato e un vassoio adatto sotto l'animale. Per queste applicazioni, la possibilità di mantenere la vicinanza ai compagni di gabbia durante la raccolta del campione può essere vantaggiosa rispetto agli approcci convenzionali individuali o metabolici di gabbia. Tuttavia, l'idoneità del sistema dovrebbe essere validata per ogni tipo specifico di campione e per ogni analisi a valle, in particolare quando contaminazione, volume di campione, tempi di raccolta o condizioni di stoccaggio sono critici.

In generale, gli animali dovrebbero essere abituati alle scatole prima della prima sessione di campionamento, le singole marcature devono essere chiaramente visibili nelle condizioni di illuminazione utilizzate e il campionamento deve essere effettuato nello stesso momento della giornata durante lo studio. I campioni devono essere esclusi se l'identità individuale è incerta, se i pellet sono contaminati, se la durata del campionamento differisce sostanzialmente dalla finestra temporale prevista o se il materiale fecale è insufficiente per l'analisi¹³. Diversi fattori pratici possono influenzare l'applicabilità del sistema di campionamento, tra cui gerarchie di dominanza, interazioni aggressive, variabilità nella motivazione alimentare, differenze di varietà e mobilità ridotta o comportamenti alterati in animali obesi, anziani, in gravidanza, post-partum o in altro modo compromessi. Tuttavia, nell'attuale coorte, l'ingresso volontario e il successo nel campionamento sono stati elevati. Dei 480 campioni regolari attesi, due mancavano perché i topi non defecavano durante il confinamento, e tre non potevano essere raccolti perché gli animali erano molto gravidi o poco dopo il parto. Così sono stati raccolti 475 campioni, di cui 473 hanno prodotto risultati analizzabili. Questi dati indicano che il rifiuto di entrare nelle scatole e il mancato prelievo di campioni erano rari nelle condizioni utilizzate in questo studio. Tuttavia, possono essere necessari ulteriori aggiustamenti di abituazione o protocollo per altre ceppi, gruppi più grandi o animali con mobilità, condizione corporea, stato di salute o comportamento sociale alterati. Ulteriori limitazioni sono che il metodo richiede addestramento ed è attualmente progettato per piccoli gruppi di tre topi, e che i componenti in vetro acrilico/plexiglass non sono autoclavabili a vapore.

La gabbia è economica, facile da costruire con materiale standard e vetro acrilico, e non richiede componenti elettronici. Il suo design consente lo smontaggio, la pulizia e l'integrazione nelle routine regolari di cambio gabbia, rendendolo adatto a campionamenti longitudinali ripetuti. Nel complesso, il sistema rappresenta un approccio pratico e compatibile con l'alloggio di gruppi per il campionamento fecale non invasivo e assegnabile individualmente nei topi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punta per trapano 5 mm	Craftomat	22380487	Diametro 5mm; Quantità 1
Punta per trapano 60 mm	Bosch	32064647	Diametro 60 mm; Quantità 1
Punta per trapano 7 mm	Craftomat	22380520	Diametro 7 mm; Quantità 1
Trapano	Makita	25730054	Trapano standard portatile o da banco; Quantità 1
Pistola per colla a caldo	Einhell	29051207	Per l'assemblaggio della gabbia; Quantità 1
Bastoncini per colla a caldo	Einhell	29049664	Compatibili con la pistola per colla a caldo; Quantità 5-10
Gabbia in Makrolon	Animalab	31200129	Gabbia standard Tipo II; Quantità 1
Gabbia in Makrolon	Animalab	31200256	Gabbia standard Tipo III; Quantità 1
Plexiglass / vetro acrilico	Bauhaus	29122352	Circa 0,25 m² totali; 5 mm di spessore; Quantità  2 fogli DIN A3
Sega o dispositivo di fresatura	Scheppach	32079641	Piccola sega a nastro, seghetto o fresa CNC; Quantità 1
Viti filettate	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Quantità 4
Bacchette / aste di legno	Ikea	903.429.71	Aste di legno tonde; Quantità 3