Questo protocollo descrive un sistema di gabbie personalizzato per la raccolta volontaria, favorevole al benessere, simultanea e individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo.
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Articolo metodologico
Raccolta volontaria di campioni fecali compatibili in gruppi in topi utilizzando un sistema di gabbie su misura
In questo articolo
Sommario
Abstract
La misurazione affidabile dei metaboliti fecali del corticosterone richiede campioni fecali che possano essere assegnati a singoli animali e raccolti entro una finestra temporale definita. Questo è una sfida nei topi alloggiati in gruppo, dove i campioni in gabbia domestica non permettono l'assegnazione individuale, e la separazione temporanea può interferire con il benessere animale e i risultati degli studi. L'obiettivo di questo protocollo è presentare un sistema di gabbie semplice ed economico che consenta la raccolta volontaria, simultanea e individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo. Il sistema consiste in una gabbia domestica in policarbonato con tettolo di filo collegata a tre singole scatole di raccolta. Dopo l'abitudine e l'addestramento, i topi entrano volontariamente nelle scatole per ricevere una piccola ricompensa alimentare. Le porte possono quindi essere chiuse senza inseguire, maneggiare o forzare il trasferimento. I pellet fecali vengono raccolti separatamente da ogni scatola, permettendo di assegnare campioni a singoli animali mantenendo al contempo un alloggio sociale al di fuori del periodo di campionamento. Questo protocollo supporta il campionamento longitudinale non invasivo ed è adatto per studi che misurano metaboliti del corticosterone fecale o altri biomarcatori fecali. Il design è facile da realizzare con materiale standard per gabbie e vetro acrilico, può essere smontato per la pulizia e permette di campionare in parallelo diverse gabbie. Riducendo i disturbi legati alla gestione e migliorando la standardizzazione della finestra di campionamento, il metodo fornisce un perfezionamento pratico per il monitoraggio endocrino nei topi alloggiati in gruppo.
Introduzione
Una delle principali difficoltà nella valutazione delle concentrazioni plasmatiche di corticosterone è che la procedura di campionamento stessa può indurre un aumento acuto del corticosterone, confondendo così la misurazione e potenzialmente influenzando l'interpretazione dei risultati dellostudio 1,2,3. La misurazione dei metaboliti del corticosterone fecale (FCM) offre un'alternativa non invasiva, poiché le concentrazioni di FCM riflettono i livelli circolanti di glucocorticoidi diverse ore prima del campionamento, a seconda della specie, dello stirpo, del sesso e del tempo di passaggiointestinale 4,5. Tuttavia, un'analisi affidabile della FCM nei topi alloggiati in gruppo rimane una sfida. I campioni fecali raccolti dalla gabbia di casa non possono essere assegnati a singoli animali e possono mostrare alta variabilità a causa di differenze interindividuali nella secrezione di glucocorticoidi e incertezza nella finestra di campionamento esatta. Separare gli animali per lunghi periodi può interferire con gli obiettivi dello studio, mentre la separazione a breve termine per la raccolta individuale di campioni è laboriosa, limita la produttività e può a sua volta indurre stress2.
Per consentire la raccolta individuale di campioni fecali da topi alloggiati in gruppo con una gestione minima, è stata sviluppata una gabbia di raccolta fecali su misura (Figura 1A-E). Il progetto è stato adattato da una gabbia di raccolta fecale precedentemente descritta per topispinosi 6 e modificato per l'uso con topi da laboratorio. Il sistema consiste in una gabbia standard in policarbonato tipo III collegata a tre singole cassette di raccolta, a cui gli animali possono accedere volontariamente e chiudere tramite porte scorrevoli. Questa configurazione consente di raccogliere campioni fecali da singoli topi senza maneggiamento diretto durante il periodo di campionamento e consente di campionare simultaneamente più animali. La gabbia, quindi, offre un approccio pratico per il campionamento FCM non invasivo e attribuibile individualmente nei topi alloggiati in gruppo.
Il protocollo seguente descrive un sistema di campionamento fecale che consente la raccolta e l'identificazione di campioni fecali da singoli topi mantenendo un ambiente di alloggio di gruppo, utilizzando gabbie personalizzate per il campionamento senza contatto delle feci.
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Protocollo
Il comitato responsabile per l'etica animale dell'Università Medica di Vienna è stato consultato prima dello studio e ha informato che non era richiesta alcuna licenza formale per l'esperimentazione animale; pertanto, non è disponibile alcun numero di approvazione o di protocollo. Lo studio ha coinvolto solo pratiche di allevamento e riproduzione consolidate, insieme alla raccolta di campioni fecali non invasivi. Non sono state eseguite procedure invasive. In conformità con la Direttiva 2010/63/UE, il carico previsto per gli animali è stato valutato come inferiore alla soglia di dolore, sofferenza, disagio o danno duraturo equivalente o superiore a quello causato dall'introduzione di un ago, in conformità con una buona pratica veterinaria. Tutti gli animali venivano ospitati e curati secondo gli standard istituzionali di benessere animale.
1. Costruzione delle gabbie (vedi elenco dei materiali)
- Taglia le parti 1-4 da plexiglass/vetro acrilico da 5 mm secondo i modelli mostrati nella Figura 2A-C.
NOTA: I modelli con dimensioni esatte possono essere stampati in formato DIN A3 (Figura Supplementare 1 e Figura Supplementare 2). - Taglia il fondo della gabbia in policarbonato tipo II (PTII) come indicato nella Figura 2D. Questa parte servirà poi come copertura superiore delle scatole di raccolta fecali.
- Forare i fori e le fessure nell'ex fondo della gabbia PTII come indicato nella Figura 2D.
NOTA: Le dimensioni esatte sono fornite nella Figura Supplementare 3. - Forare il lato anteriore e il lato corto della gabbia PTIII come indicato nella Figura 2E.
NOTA: Le dimensioni esatte sono fornite nella Figura Supplementare 4. - Usa la parte 2 come modello per segnare i corrispondenti fori di trapano sul lato corto della gabbia PTIII e sul lato lungo della gabbia PTII.
- Forare i fori segnati e fissare la gabbia PTIII, la gabbia PTII e la parte 2 usando le viti filettate, come mostrato nella Figura 2F.
- Inserisci la parte 1 come parte inferiore della gabbia PTII. Posiziona le parti 4a e 4b in modo che tengano ferme la parte 1 e dividi la gabbia di campionamento in scatole di raccolta separate. Usa la pistola di colla calda per fissarle in posizione.
- Fai scorrere le sporgenze inferiori delle parti 4a e 4b nelle fessure della parte 1. Queste sporgenze formano le gambe delle scatole di raccolta.
- Fai scorrere le sporgenze superiori delle parti 4a e 4b attraverso la copertura superiore, l'ex parte inferiore della gabbia PTII, per tenerla in posizione.
- Infila le bacchette o le aste di legno attraverso i fori delle sporgenze, usando una barra in alto e due in basso, per stabilizzare e fissare la costruzione.
NOTA: I materiali in legno dovrebbero essere usati nel vivario solo se sono usa e getta, poiché non sono pulibili. Se non è così, dovrebbero essere utilizzate aste di composizione alternativa. - Chiudi gli spazi residui o le piccole imprecisioni usando una pistola per colla calda. Usa le parti 3a, 3b e 3c (Figura 2B) come porte scorrevoli tra la gabbia di casa e le scatole di raccolta.
NOTA: Assicurati che non siano accessibili agli animali spigoli taglienti, residui di colla o materiale sporgente. I componenti in vetro acrilico/plexiglass utilizzati in questo prototipo non sono adatti alla sterilizzazione con autoclave a vapore. Pertanto, se il sistema viene utilizzato in strutture SPF che richiedono materiale sterilizzato correlato alla gabbia, dovrebbe essere utilizzata una procedura di disinfezione non autoclave approvata dall'istituzione, oppure i componenti in acrilico dovrebbero essere sostituiti con materiale autoclavabile mantenendo le stesse dimensioni.
2. Preparazione e alloggio degli animali
- Ottenere il numero richiesto di topi del ceppo o ceppi appropriati per lo studio.
NOTA: I dati rappresentativi sono stati ottenuti da 30 topi C57BL/6J di otto settimane, composti da 20 femmine e 10 maschi. I topi erano privi di patogeni specifici secondo gli standard FELASA e furono ottenuti dai Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germania. - Animali da casa in condizioni convenzionali in gabbie di policarbonato adattato tipo III con un massimo di tre topi adulti per gabbia.
NOTA: I maschi separati sono stati ospitati in gabbie standard in policarbonato tipo II per questo studio. - Mantieni la stanza degli animali a 22 ± 2 °C e 55 ± 10% di umidità relativa durante un ciclo di 12 ore di luce e scuro con le luci accese alle 6:00.
- Fornisci una dieta di mantenimento standard e acqua ad libitum.
- Aggiungi biancheria da letto in legno di tremolo, un rotolo di carta igienica, una cassa rossa trasparente in plastica e carta assorbente come materiale da nido a ogni gabbia.
- Identifica i topi principalmente tramite i segni naturali della coda. Applicare temporaneamente i segni a penna sugli animali con marcature simili sulla coda durante la pesata, se necessario.
3. Abituazione e addestramento degli animali
NOTA: La gabbia completata consiste in una gabbia domestica, PTIII, collegata a una gabbia di campionamento con tre scatole di raccolta separate, PTII. Le gabbie domestiche possono essere utilizzate come le tradizionali, con lettiera, arricchimento della gabbia, un coperchio di filo metallico senza fissaggi esterni e fornendo cibo e acqua. Il sistema può essere smontato per il lavaggio e può essere utilizzato solo durante le settimane di campionamento. Durante le settimane senza campionamento, gli animali possono essere ospitati in gabbie standard PTIII.
- Inserire gli animali nel sistema di gabbie almeno due settimane prima della prima sessione di campionamento programmata.
- Abitua gli animali alle cassette di raccolta rimuovendo le porte scorrevoli per una notte, permettendo loro di esplorare liberamente le cassette.
- Esegui tre sessioni di addestramento prima della prima sessione di campionamento. Condurre l'addestramento nelle stesse condizioni di luce e alla stessa ora della giornata previsto per un campionamento successivo, idealmente sotto luce rossa poco dopo l'inizio della fase buia.
- Applica una piccola quantità di premio, come crema di nocciole, burro di arachidi, pasta di malto o un alimento simile appetibile, sulla parete opposta all'ingresso di ogni scatola di raccolta.
- Il primo giorno di addestramento, lascia le porte aperte e lascia che gli animali scoprano e consumino volontariamente la ricompensa.
- Il secondo giorno di addestramento, aspetta che un animale entri in una cassetta di raccolta e inizi a leccare la ricompensa. Chiudi con attenzione la porta scorrevole dietro l'animale e lasciala andare dopo 10 minuti.
- Il terzo giorno di addestramento, ripeti la procedura e allunga gradualmente il tempo in cui gli animali restano nelle cassette di raccolta.
NOTA: L'addestramento dovrebbe essere calmo e costante. Evita di inseguire gli animali nelle casse, poiché ciò potrebbe aumentare lo stress e ridurre la partecipazione volontaria alle sessioni di campionamento successive.
4. Raccolta di campioni fecali
- Tempistica della raccolta del campione
- Pianifica il tempo di campionamento in base alla domanda biologica e al ritardo previsto tra l'escrezione plasmatica del corticosterone e del metabolita del corticosterone fecale. Nei topi, i metaboliti del corticosterone fecale riflettono tipicamente i livelli circolanti di glucocorticoidi circa 8-10 ore prima del campionamento.
NOTA: Se il tempismo preciso è critico, esegui uno studio pilota per determinare il decorso temporale dell'escrezione della FCM nella specifica ceppa, sesso e condizioni sperimentali utilizzate. Questo pilota può essere combinato con le sessioni di addestramento. - Programma il campionamento durante un periodo di alta produzione fecale. Il campionamento è solitamente più efficiente all'inizio della fase scura e attiva.
- Eseguire tutte le sessioni di campionamento alla stessa ora della giornata durante lo studio per ridurre la variazione causata dal ritmo diurno dei livelli di FCM.
NOTA: Secondo la nostra esperienza, gli eventi che avvengono al mattino intorno alle 10:00 sono ben riflessi quando il campionamento è programmato tra le 18:00 e le 20:00, a seconda del programma di luce della stanza degli animali.
- Pianifica il tempo di campionamento in base alla domanda biologica e al ritardo previsto tra l'escrezione plasmatica del corticosterone e del metabolita del corticosterone fecale. Nei topi, i metaboliti del corticosterone fecale riflettono tipicamente i livelli circolanti di glucocorticoidi circa 8-10 ore prima del campionamento.
- Procedura di campionamento e consigli pratici
- Segna gli animali singolarmente prima di campionare. Usa segni per le orecchie o singoli segni sulla coda.
NOTA: Le marcature sulle dita e i codici colore possono essere difficili da riconoscere all'interno delle scatole sotto la luce rossa. - Prepara le scatole di raccolta durante la fase di luce applicando la ricompensa sulla parete posteriore di ogni scatola.
NOTA: Preparare le scatole durante il giorno migliora la visibilità per l'esperante e permette agli animali di annusare la ricompensa prima del campionamento. - Al momento previsto per il campionamento, apri le scatole di raccolta e attendi che gli animali entrino volontariamente.
- Una volta che un topo è entrato in una cassetta di recupero, chiudi con cura la porta scorrevole dietro di essa.
- Dopo che tutti gli animali sono entrati in una scatola, registra l'identità e la posizione di ogni topo in un foglio di campionamento preparato.
- Se vengono campionati più di 10 gabbie in una sola sessione, coinvolgi un secondo sperimentatore per supportare l'identificazione degli animali, la gestione delle porte e la documentazione.
- Conservare gli animali nelle scatole di raccolta per la durata prevista del campionamento, tipicamente da 30 minuti a 2 ore, a seconda dell'output fecale previsto e del disegno dello studio.
NOTA: Escludere i campioni se l'identità individuale non può essere assegnata con certezza, se i pellet fecali sono contaminati da urina, lettiera o feci di un altro animale, se la durata del campionamento si discosta sostanzialmente dalla finestra temporale pianificata, o se la quantità di materiale fecale è insufficiente per l'analisi FCM.
NOTA: L'uso di 50 mg è il nostro protocollo standard, e questa quantità è stata utilizzata in tutte le validazioni e in tutti gli altriarticoli 5,7,8. Normalmente, può essere facilmente ottenuto. - Al termine del periodo di campionamento, apri le porte scorrevoli e lascia che i topi tornino nella gabbia di casa.
- Chiudi le scatole di raccolta immediatamente dopo che i topi sono usciti per evitare il rientro e la contaminazione incrociata dei campioni.
- Rimuovi i pellet fecali da ogni scatola di raccolta usando una lunga pinza e trasferiscili in tubi di raccolta etichettati singolarmente.
- Conservare i campioni a -20 °C fino a una nuova preparazione del saggio FCM.
NOTA: Se le scatole sono ben chiuse e non possono essere rientrate dai topi, la raccolta dei pellet fecali può essere posticipata fino alla successiva fase di luce. Tuttavia, questo dovrebbe essere fatto in modo coerente all'interno di uno studio. - Tieni gli animali nella parte della gabbia domestica (PTIII) fino al prossimo cambio di gabbia. Poi possono essere smontati e lavati in una normale lavatrice a gabbia.
- Segna gli animali singolarmente prima di campionare. Usa segni per le orecchie o singoli segni sulla coda.
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Risultati
I metaboliti del corticosterone fecale (FCM) sono stati quantificati con successo da campioni raccolti con gabbie di campionamento fecali personalizzate in uno studio longitudinale che ha confrontato topi allevati in modo permanente e intermittente. L'analisi rappresentativa della FCM includeva 30 animali: gruppo permanentemente riprodotto, n = 15 animali in 5 gaibbie; gruppo riprodotto a intermittenza, n = 10 animali in 5 gabbie, con 5 maschi alloggiati da soli tranne che per 3 eventi r...
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Discussione
Questo protocollo descrive un semplice sistema di gabbie per raccogliere campioni fecali assegnabili individualmente da topi alloggiati in gruppo. Il principale vantaggio del metodo è che combina l'attribuzione individuale di campioni con il mantenimento di aspetti chiave dell'edilizia sociale, in particolare il contatto visivo e olfattivo con i compagni di gabbia. Questo è rilevante perché l'alloggio di gruppo è spesso necessario per il benessere animale e può anche far parte del disegn...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Prof. Pollak per aver sostenuto la pubblicazione di questo articolo.
Katharina Tillmann ringrazia con gratitudine il sostegno del suo defunto nonno, Bruno Wochner, che, a 99 anni, contribuì alla pianificazione del sistema di gabbia, mise a disposizione la sua officina di legno e aiutò nella carteggiatura e nella costruzione. Il suo entusiasmo per l'artigianato e la costruzione è stato una fonte duratura di ispirazione ed è ricordato con gratitudine qui.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Punta per trapano 5 mm | Craftomat | 22380487 | Diametro 5mm; Quantità 1 |
| Punta per trapano 60 mm | Bosch | 32064647 | Diametro 60 mm; Quantità 1 |
| Punta per trapano 7 mm | Craftomat | 22380520 | Diametro 7 mm; Quantità 1 |
| Trapano | Makita | 25730054 | Trapano standard portatile o da banco; Quantità 1 |
| Pistola per colla a caldo | Einhell | 29051207 | Per l'assemblaggio della gabbia; Quantità 1 |
| Bastoncini per colla a caldo | Einhell | 29049664 | Compatibili con la pistola per colla a caldo; Quantità 5-10 |
| Gabbia in Makrolon | Animalab | 31200129 | Gabbia standard Tipo II; Quantità 1 |
| Gabbia in Makrolon | Animalab | 31200256 | Gabbia standard Tipo III; Quantità 1 |
| Plexiglass / vetro acrilico | Bauhaus | 29122352 | Circa 0,25 m² totali; 5 mm di spessore; Quantità 2 fogli DIN A3 |
| Sega o dispositivo di fresatura | Scheppach | 32079641 | Piccola sega a nastro, seghetto o fresa CNC; Quantità 1 |
| Viti filettate | Profi Depot | 10807533 | 20 mm × 3 mm; Quantità 4 |
| Bacchette / aste di legno | Ikea | 903.429.71 | Aste di legno tonde; Quantità 3 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
