MiR-93-5p bersaglia direttamente il recettore Toll-like 4 (TLR4) nella polmonite pediatrica da Mycoplasma pneumoniae (MPP). La sua downregolazione potrebbe contribuire alla progressione della malattia e al danno associato al sistema digerente. Questi risultati suggeriscono che miR-93-5p potrebbe fungere da biomarcatore diagnostico potenziale per la MPP e per la MPP con danno del sistema digerente.
Articolo di ricerca
Valutazione del ruolo del miR-93-5p nei bambini infettati da Mycoplasma pneumoniae con lesione del sistema digerente
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato dimostrato che miR-93-5p modula il danno polmonare acuto, ma il suo ruolo e il suo valore diagnostico nella polmonite pediatrica da Mycoplasma pneumoniae (MPP) associata a lesione del sistema digerente rimangono poco chiari. Questo studio ha valutato il ruolo di miR-93-5p come possibile biomarcatore diagnostico per la MPP e le complicanze digestive associate nei bambini. Sono stati raccolti campioni clinici da pazienti pediatrici affetti da MPP e da controlli sani. L'espressione di miR-93-5p è stata quantificata mediante PCR quantitativa a trascrizione inversa. Cellule A549 infettate da Mycoplasma pneumoniae (MP) sono state utilizzate per stabilire un modello cellulare di MPP al fine di valutare le variazioni della vitalità cellulare e dei citochine pro-infiammatorie. L'interazione tra miR-93-5p e il recettore Toll-like 4 (TLR4) è stata valutata mediante saggio del reporter luciferasico. Le prestazioni diagnostiche sono state analizzate mediante curve ROC (caratteristica operativa del ricevitore). I livelli di miR-93-5p erano significativamente ridotti nei pazienti con MPP rispetto ai controlli sani (P < 0,001) e ulteriormente diminuiti nei pazienti con MPP e lesione del sistema digerente rispetto a quelli con sola MPP. L'infezione da MP ha ridotto la vitalità cellulare e aumentato i livelli di IL-6 e TNF-α, mentre l'overespressione di miR-93-5p ha attenuato tali effetti. L'espressione di TLR4 è risultata aumentata dopo l'infezione da MP ed è stata negativamente regolata da miR-93-5p. Dal punto di vista clinico, la lesione del sistema digerente nei pazienti con MPP era associata a livelli più bassi di miR-93-5p. Le analisi delle curve ROC hanno mostrato prestazioni diagnostiche favorevoli nel distinguere i pazienti con MPP dai controlli sani e i pazienti con MPP e lesione del sistema digerente da quelli con sola MPP. MiR-93-5p lega direttamente TLR4 nella MPP pediatrica e la sua downregolazione potrebbe contribuire alla progressione della malattia e alle lesioni associate del sistema digerente. Questi risultati suggeriscono che miR-93-5p potrebbe rappresentare un possibile biomarcatore diagnostico per la MPP e per la MPP con lesione del sistema digerente.
Introduzione
Mycoplasma pneumoniae (MP) è un patogeno predominante responsabile della polmonite nei bambini1, spesso causa una significativa morbosità respiratoria a livello mondiale. Sebbene MP provochi principalmente infezioni polmonari, può anche causare complicanze extrapulmonari che coinvolgono diversi sistemi organici2Durante l'infezione da M. pneumoniae, i sintomi gastrointestinali più frequentemente riportati includono nausea, vomito, diarrea e dolore addominale3. È stata inoltre identificata una serie di condizioni e manifestazioni gastrointestinali come parte di M. pneumoniae- malattie extrapolmonari correlate (MPEPDs)2. Pazienti pediatrici con polmonite da M. pneumoniae (MPP) complicata da lesione del sistema digerente presenta sfide cliniche che possono aggravare la gravità della malattia e complicarne la gestione4. Evidenze emergenti indicano un'interazione tra infezione polmonare e disfunzione intestinale, che potrebbe essere alla base di questa associazione5,6. La disregolazione delle risposte immunitarie durante l'infezione da MP può essere associata anche a lesioni del sistema digerente7.
Nonostante i progressi nelle modalità diagnostiche8, l'identificazione precoce e accurata della MPP rimane una sfida a causa delle manifestazioni cliniche sovrapposte ad altre infezioni respiratorie e del coinvolgimento extrapulmonare variabile9. Il polmone e l'intestino sono componenti chiave del sistema immunitario mucosale comune, e questi organi possono influenzare reciprocamente la propria funzione, come evidenziato dai disturbi intestinali durante le malattie polmonari e dagli effetti reciproci, un fenomeno noto come crosstalk polmone-intestino10. Inoltre, l'assistenza infermieristica pediatrica si concentra principalmente sulla gestione dei sintomi respiratori11, mentre le manifestazioni gastrointestinali potrebbero non essere adeguatamente riconosciute o essere attribuite agli effetti collaterali del trattamento. Questa lacuna evidenzia la necessità di una valutazione completa che integri sia la valutazione polmonare che quella gastrointestinale per ottimizzare gli interventi infermieristici di supporto12. Recenti studi molecolari hanno messo in luce regolatori delle vie di segnalazione infiammatoria coinvolte sia nella patologia polmonare che nell'infiammazione intestinale nella MPP12,13.
È stato dimostrato che miR-93-5p è implicato nella patogenesi del danno polmonare acuto, dove la sua downregolazione si correla con un alterato funzionamento polmonare e con risposte infiammatorie aggravate14,15. Sulla base di questi risultati, si è ipotizzato che miR-93-5p fosse analogamente downregolato nel siero di bambini con MPP. Un'analisi bioinformatica effettuata mediante il database TargetScan ha identificato il recettore Toll-like 4 (TLR4) come un possibile bersaglio diretto di miR-93-5p. È stato riportato che TLR4 svolge un ruolo importante nella modulazione dell'asse polmone-intestino16,17 ed è stato pertanto considerato potenzialmente associato a complicanze gastrointestinali nella MPP. Di conseguenza, questo studio ha indagato il coinvolgimento di miR-93-5p in pazienti pediatrici con MPP complicata da danno del sistema digerente.
Protocollo
Lo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Yangzhou (Numero di approvazione: 2023-YKL01-(16); 17 gennaio 2023). Da ogni partecipante sono stati prelevati campioni di sangue venoso periferico per gli opportuni saggi di laboratorio. Prima della partecipazione, è stato ottenuto il consenso informato dai tutori legali di tutti i partecipanti. I reagenti, l'equipaggiamento e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Raccolta del campione clinico
Un totale di 108 bambini di età compresa tra 2 e 14 anni è stato arruolato presso l'Ospedale Affiliato dell'Università di Yangzhou tra febbraio 2023 e dicembre 2024. Tutti i 108 bambini sono stati diagnosticati con PPM, confermato da immagini toraciche e test di reazione a catena della polimerasi (PCR) per il DNA di MP su campioni nasofaringei. Il DNA di MP nei tamponi nasofaringei è stato rilevato mediante PCR quantitativa in tempo reale mirata al gene dell'adesina P1 specifico per MP.
I pazienti sono stati classificati in base allo stato della malattia in due gruppi: MPP senza DSI (n = 60) e MPP con DSI (n = 48). Il DSI è stato definito dalla presenza di almeno un sintomo gastrointestinale, tra cui diarrea (≥3 evacuazioni molli o acquose al giorno per una durata di >24 h), nausea, vomito o dolore addominale persistente con o senza dolore di rimbalzo, accompagnato da almeno un parametro di laboratorio alterato e/o un reperto di imaging addominale confermativo. I parametri di laboratorio alterati includevano un aumento delle transaminasi sieriche, dell'amilasi o della lipasi e/o un incremento dei marcatori della permeabilità intestinale, come il D-lattato e l'endotossina. I reperti di imaging addominale confermativi includevano un ispessimento della parete intestinale, linfonodi mesenterici ingranditi o effusione peritoneale rilevati mediante ecografia o tomografia computerizzata. Inoltre, 60 bambini sani sottoposti a esami di routine sono stati utilizzati come controllo.
- Criteri di inclusione
I pazienti che presentavano sintomi gastrointestinali insieme ad anomalie di laboratorio o di imaging venivano classificati nel gruppo DSI. - Criteri di esclusione
I criteri di esclusione includevano polmonite virale o batterica, tubercolosi, storia di allergia ai farmaci oggetto dello studio, disturbi immunitari, malnutrizione, disfunzione renale, malformazioni gastrointestinali e trattamento antibiotico precedente al ricovero.
2. Coltura cellulare e modello MPP
Mycoplasma pneumoniae ceppo standard ATCC 15531 è stato coltivato in brodo PPLO. Le cellule epiteliali alveolari umane A549 sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 contenente il 10% di siero bovino fetale in condizioni umidificate a 37 °C con 5% di CO₂.
Per stabilire un modello in vitro di MPP, le cellule A549 sono state infettate con sospensioni di M. pneumoniae a un rapporto di infezione (MOI) di 1:10018. Dopo l'infezione, i batteri non legati sono stati rimossi sostituendo il mezzo di coltura. L'efficienza dell'infezione è stata confermata mediante rilevamento con qPCR del DNA di MP nei supernatanti di coltura dopo l'infezione.
3. Costruzione del plasmide e trasfezione
I mimici di MiR-93-5p, i plasmidi per la sovraespressione di TLR4 (oe-TLR4) e i relativi controlli negativi sono stati sintetizzati commercialmente. Le cellule A549 infettate da MP sono state trasfettate utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica. L'efficienza di trasfezione è stata valutata 48 h dopo la trasfezione mediante PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR).
4. Analisi di RT-qPCR
L'RNA totale è stato estratto da cellule A549 raccolte al termine degli esperimenti. Le cellule sono state lisate e omogeneizzate utilizzando soluzione salina fosfato (PBS). L'RNA totale è stato purificato utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA a base di fenolo. Un kit di trascrizione inversa è stato utilizzato per la trascrizione inversa di miR-93-5p, mentre il DNA complementare per l'analisi dell'mRNA è stato sintetizzato utilizzando un reagente di trascrizione inversa disponibile in commercio. L'analisi RT-qPCR è stata eseguita utilizzando la chimica SYBR Green.
5. Saggio MTT
Le cellule A549 trasfettate di ciascun gruppo sperimentale sono state raccolte e seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 2 × 103 cellule per pozzetto. Successivamente, sono stati aggiunti 20 µL di reagente bromuro di metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) in ogni pozzetto. Dopo un'ulteriore incubazione di 2 h a 37 °C, i soprannatanti sono stati rimossi con attenzione. I cristalli di formazano risultanti, formati dalle cellule metabolicamente attive, sono stati solubilizzati seguendo le istruzioni del saggio. La vitalità cellulare è stata quantificata indirettamente misurando la densità ottica (OD) a 490 nm mediante un lettore per micropiastre.
6. Saggio immunoenzimatico
Kit commerciali per saggio immunoenzimatico (ELISA) sono stati utilizzati per misurare i livelli di interleuchina-6 (IL-6) e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α). I saggi sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. Le misurazioni sono state effettuate in triplicato in due replicati sperimentali indipendenti per garantire accuratezza e riproducibilità.
7. Saggio del reporter dual-luciferasi
I siti di legame per miR-93-5p nella regione non tradotta 3′ (UTR) di TLR4 sono stati predetti utilizzando il database TargetScan. Frammenti contenenti le sequenze di tipo selvaggio (WT) o mutate (MUT) sono stati clonati in un vettore reporter di luciferasi. Le cellule A549 sono state co-trasfettate con 500 ng del costrutto WT o MUT insieme a mimici di miR-93-5p o controlli, utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica. Dopo 48 h, l'attività della luciferasi è stata misurata mediante un saggio reporter a doppia luciferasi. L'attività della luciferasi di lucerna è stata normalizzata rispetto all'attività della luciferasi Renilla per tenere conto dell'efficienza di trasfezione.
8. Saggio di immunoblotting
Per la Western blot, i lisati cellulari sono stati mescolati con buffer di caricamento e centrifugati a 10.000 × g per 3 min. I soprannatanti sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio e le proteine sono state trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene. Le membrane sono state bloccate con albumina sierica bovina (BSA) al 5% per 1 h a temperatura ambiente e quindi incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e l'inibitore kappa B alfa (IκBα) in un rapporto di diluizione 1:1000 in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 e BSA al 5%. Dopo tre lavaggi, le membrane sono state incubate con IgG di capra anti-coniglio coniugata con perossidasi (HRP) (1:500) per 1 h a temperatura ambiente. Dopo ulteriori lavaggi, le bande proteiche sono state visualizzate mediante un substrato chemiluminescente migliorato e acquisite con un sistema di imaging chemiluminescente. Le intensità delle bande delle proteine bersaglio e di GAPDH sono state quantificate a partire da tre esperimenti indipendenti utilizzando un software di analisi delle immagini.
9. Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un software di analisi statistica. La normalità dei dati misurati è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk. I dati con distribuzione normale sono presentati come media ± deviazione standard e sono stati confrontati utilizzando il test t per campioni indipendenti per due gruppi o l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) per più gruppi. Quando l'ANOVA ha indicato una differenza complessiva significativa, è stato utilizzato il test post hoc di Tukey per i confronti a coppie. I dati senza distribuzione normale sono stati analizzati mediante il test U di Mann-Whitney. Le variabili categoriche sono state espresse come frequenze assolute e percentuali e confrontate mediante test del chi-quadrato. L'analisi della curva ROC (receiver operating characteristic) è stata utilizzata per valutare il potenziale diagnostico di miR-93-5p nella previsione di MPP o di MPP con DSI. Per identificare i fattori predittivi associati a MPP con DSI, è stata eseguita una regressione logistica multivariata. Le variabili incluse nel modello sono state: età, sesso, durata della febbre, durata dell'uso di antibiotici ed espressione di miR-93-5p dicotomizzata al valore mediano. Un valore di P bilaterale <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Il miR-93-5p è ridotto nella MPP pediatrica
Le prestazioni diagnostiche del miR-93-5p sono state valutate per esplorarne il potenziale come biomarcatore nella MPP pediatrica. Come mostrato in Figura 1A, l'espressione del miR-93-5p era significativamente ridotta nei pazienti pediatrici con MPP rispetto ai controlli sani. Le caratteristiche demografiche e ematologiche dei due gruppi sono riassunte in Tabella 1. Non sono state osservate differenze statisticamente significative nell'età o nella distribuzione per sesso tra i gruppi (P > 0,05). Tuttavia, il conteggio periferico dei globuli bianchi (WBC), la percentuale di neutrofili (Net%) e i livelli di proteina C-reattiva (PCR) erano significativamente aumentati nel gruppo MPP rispetto ai controlli sani (P < 0,001).
È stata eseguita un'analisi della curva ROC (receiver operating characteristic) per valutare ulteriormente le prestazioni diagnostiche di miR-93-5p nel distinguere i pazienti con MPP dai bambini sani (Figura 1B). L'area sotto la curva (AUC) era pari a 0,9009 [intervallo di confidenza al 95% (CI): 0,8537–0,9482], con una sensibilità dell'80,56% e una specificità dell'88,33%. Questi risultati indicano che livelli sierici ridotti di miR-93-5p erano associati alla MPP pediatrica.
Effetto di miR-93-5p sui modelli cellulari di MPP
È stata condotta una serie di esperimenti in vitro per valutare l'effetto di miR-93-5p nel modello cellulare di MPP. Rispetto alle cellule di controllo, l'espressione di miR-93-5p era ridotta nel modello cellulare di MPP (Figura 2A). L'infezione da MP era inoltre associata a una diminuzione della vitalità delle cellule A549 (Figura 2B). Inoltre, i livelli delle citochine pro-infiammatorie IL-6 e TNF-α erano aumentati nel modello di MPP rispetto ai controlli (Figura 2C).
Per valutare ulteriormente l'effetto funzionale del miR-93-5p, è stato stabilito un modello di sovraespressione del miR-93-5p in cellule A549 infettate da MP (Figura 2D). La sovraespressione del miR-93-5p ha aumentato significativamente la vitalità cellulare rispetto al modello MPP senza sovraespressione del miR-93-5p (Figura 2E). In accordo con questi risultati, un'espressione aumentata del miR-93-5p è stata accompagnata da una ridotta produzione di IL-6 e TNF-α (Figura 2F). Questi risultati indicano che una ridotta espressione del miR-93-5p era associata a una diminuzione della vitalità cellulare e a un aumento delle risposte infiammatorie durante l'infezione da MP, mentre la sovraespressione del miR-93-5p ha attenuato tali modifiche.
MiR-93-5p targetizza TLR4
Per chiarire la relazione regolatoria tra miR-93-5p e TLR4, un'analisi bioinformatica ha identificato un sito di legame predetto per miR-93-5p all'interno della regione non tradotta 3′ (UTR) dell'mRNA di TLR4 (Figura 3A). L'espressione di TLR4 era aumentata nel modello cellulare MP rispetto ai controlli (Figura 3B). L'interazione predetta è stata successivamente valutata mediante un saggio con reporter luciferasico. La co-trasfezione con mimici di miR-93-5p ha ridotto l'attività luciferasica del costrutto di tipo selvaggio, indicando un legame specifico al sito predetto (Figura 3C).
L'iperespressione di miR-93-5p nelle cellule infette da MP ha ridotto l'espressione di TLR4 rispetto ai controlli infetti non trattati con il mimico (Figura 3D). Per indagare ulteriormente gli effetti a valle associati alla modulazione di TLR4, sono stati generati modelli di cellule A549 con iperespressione di TLR4 (Figura 3E). L'analisi mediante Western blot ha mostrato un aumento dei livelli di IκBα in seguito all'iperespressione di TLR4 (Figura 3F).
L'overespressione di TLR4 ha notevolmente ridotto la vitalità cellulare dopo l'infezione da MP rispetto alle cellule di controllo, mentre l'overespressione simultanea di miR-93-5p ha invertito tale riduzione (Figura 3G). La misurazione dei citochine infiammatori ha inoltre mostrato che l'overespressione di TLR4 aumentava i livelli di mediatori pro-infiammatori, mentre l'overespressione di miR-93-5p attenuava questi cambiamenti anche in presenza di overespressione di TLR4 (Figura 3H). Questi risultati indicano che miR-93-5p regola negativamente l'espressione di TLR4 e attenua le alterazioni cellulari associate all'infezione da MP.
Valore diagnostico di miR-93-5p nella MPP e nella MPP con lesione del sistema digerente
Resoconti precedenti hanno descritto il coinvolgimento di TLR4 nei tessuti polmonari e colici16. L'associazione potenziale tra miR-93-5p e danno del sistema digerente nella MPP è stata pertanto valutata clinicamente. Come mostrato in Figura 4A, l'espressione di miR-93-5p era ridotta nel gruppo MPP+DSI rispetto al gruppo MPP.
Le caratteristiche demografiche ed ematologiche sono riassunte nella Tabella 2. Non sono state osservate differenze significative per età o sesso tra i gruppi. Tuttavia, la durata della febbre e l'uso di antibiotici sono risultate significativamente più lunghe nei pazienti con infezione da streptococco in corso (P < 0,05).
Il valore diagnostico di miR-93-5p per distinguere i casi di MPP con DSI da quelli senza DSI è stato valutato mediante analisi della curva ROC. L'AUC era di 0,7866 (IC 95%: 0,6889–0,8843) (Figura 4B), con una sensibilità del 85,71% e una specificità del 57,45%.
L'analisi di regressione logistica multivariata ha identificato una bassa espressione di miR-93-5p, una durata prolungata della febbre e un uso prolungato di antibiotici come fattori associati a lesioni del sistema digerente durante l'infezione da MP (Tabella 3; P < 0,05).
Figura 1: Espressione e valore diagnostico di miR-93-5p nei controlli sani (n = 60) e nei pazienti con MPP (n = 108). (A) L'espressione di miR-93-5p era ridotta nei pazienti con MPP. (B) Analisi della curva ROC di miR-93-5p. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetti funzionali di miR-93-5p nel modello cellulare infettato da MP. (A) L'espressione di miR-93-5p era ridotta nel modello infettato da MP. (B) La vitalità cellulare era ridotta nel modello infettato da MP. (C) I livelli di TNF-α e IL-6 erano aumentati nel modello infettato da MP. (D) Efficacia della trasfezione del mimico di miR-93-5p. (E) La vitalità cellulare era aumentata a seguito della sovraespressione di miR-93-5p. (F) I livelli di TNF-α e IL-6 erano diminuiti a seguito della sovraespressione di miR-93-5p. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: MiR-93-5p lega direttamente TLR4. (A) Sito di legame previsto tra miR-93-5p e TLR4. (B) Espressione di TLR4 nel modello infettato da MP. (C) Saggio con reporter a doppia luciferasi. (D) Regolazione negativa di TLR4 da parte di miR-93-5p. (E) Efficacia dell'overespressione di TLR4. (F) Analisi mediante Western blot di IκBα. (G) Vitalità cellulare. (H) Livelli di TNF-α e IL-6. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Espressione e valore diagnostico di miR-93-5p in pazienti con MPP (n = 60) e pazienti con MPP con DSI (n = 48). (A) Espressione di miR-93-5p nel gruppo MPP+DSI. (B) Analisi mediante curva ROC di miR-93-5p. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Variabile | Sani (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| età (anni) | 6,81± 3,14 | 7,12 ± 3,55 | 0,559 |
| sesso (maschio/femmina) | 28/32 | 49/59 | 0,872 |
| GB ( × 109/L) | 7,27 ± 0,89 | 9,86 ± 1,36 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | 2,35 ± 0,17 | 11,53 ± 2,01 | <0,001 |
| Net % | 42,55 ± 5,62 | 56,51 ± 15,40 | <0,001 |
Tabella 1: Confronto delle caratteristiche demografiche e dei parametri ematici di routine tra controlli sani e pazienti con MPP. Questa tabella riassume le caratteristiche demografiche e i parametri ematologici di routine di soggetti sani e pazienti con MPP, inclusi età, sesso, globuli bianchi (WBC), percentuale di neutrofili, percentuale di eosinofili, percentuale di basofili e proteina C reattiva (CRP). Sono riportati i confronti tra i gruppi e i corrispondenti valori di P.
| Variabile | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| età (anni) | 6,88 ± 3,87 | 7,42 ± 3,11 | 0,441 |
| sesso (maschio/femmina) | 31/29 | 28/20 | 0,494 |
| GB ( × 109/L) | 8,9 ± 0,89 | 11,05 ± 0,76 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | 10,94 ± 1,62 | 12,27 ± 2,22 | <0,001 |
| Neutrofili % | 55,87 ± 14,75 | 57,32 ± 16,29 | 0,629 |
| Durata della febbre (giorno) | 4,60 ± 1,83 | 7,26 ± 1,04 | <0,001 |
| Durata dell'uso di antibiotici (giorno) | 4,65 ± 1,147 | 6,29 ± 0,771 | <0,001 |
Tabella 2: Confronto delle caratteristiche demografiche e dei parametri ematici di routine tra i pazienti con MPP e i pazienti con MPP+DSI. Questa tabella confronta le caratteristiche demografiche, i parametri ematologici di routine e le caratteristiche cliniche rilevanti tra i pazienti con MPP da solo e quelli con MPP complicato da DSI. Sono riportati i confronti tra i gruppi e i corrispondenti valori di P.
| Variabile | OR | IC 95% | Valore p | |
| inferiore | superiore | |||
| miR-93-5p (Basso vs Alto) | 6,702 | 1,487 | 30,211 | 0,013 |
| età | 1,126 | 0,286 | 4,437 | 0,866 |
| sesso | 1,071 | 0,27 | 4,248 | 0,923 |
| Durata della febbre | 73,416 | 15,018 | 358,895 | <0,001 |
| Durata dell'uso di antibiotici | 7,921 | 1,877 | 33,421 | 0,005 |
Tabella 3: Analisi di regressione logistica su bambini con infezione da MP complicata da lesione del sistema digerente. Questa tabella presenta i risultati dell'analisi di regressione logistica volta a valutare i fattori associati alle lesioni del sistema digerente nei bambini con infezione da MP. L'analisi include l'OR, l'intervallo di confidenza al 95% e il valore P per ciascuna variabile.
Abbreviazioni: Baso%, percentuale di basofili; CI, intervallo di confidenza; CRP, proteina C reattiva; DSI, danno del sistema digestivo; Eos%, percentuale di eosinofili; IκBα, inibitore kappa B alfa; IL-6, interleuchina-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, polmonite da Mycoplasma pneumoniae; NC, controllo negativo; Net%, percentuale di neutrofili; oe-TLR4, sovraespressione di TLR4; OR, rapporto di probabilità; ROC, caratteristica operativa del ricevitore; TLR4, recettore Toll-simile 4; TNF-α, fattore di necrosi tumorale-α; WBC, conta dei globuli bianchi.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati numerici grezzi alla base delle figure e delle tabelle sono forniti come Tabella Supplementare 1.
Tabella supplementare 1: Dati numerici grezzi per le figure e le tabelle. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussione
Sebbene sia considerato principalmente un agente patogeno polmonare, l'infezione da MP può causare diverse complicanze extrapulmonari che interessano multipli sistemi organici oltre ai polmoni19,20. Evidenze emergenti suggeriscono un'interazione lungo l'asse polmone-intestino, in cui mediatori infiammatori rilasciati durante la patologia polmonare alterano l'equilibrio della flora intestinale21 e la funzione intestinale22. Questo reciproco scambio evidenzia l'importanza di una valutazione clinica completa del paziente, che consideri sia i sintomi respiratori sia la salute gastrointestinale. I biomarcatori sierici circolanti hanno quindi attirato crescente attenzione come strumenti minimamente invasivi con potenziale valore diagnostico o prognostico23,24. Le miRNA si sono affermate come candidati promettenti grazie alla loro stabilità e al loro ruolo nella regolazione di vie di segnalazione associate all'infiammazione coinvolte nella patogenesi del MP25,26,27. Questo studio ha esplorato in modo sistematico il ruolo e l'importanza clinica di miR-93-5p nella MPP pediatrica, in particolare quando complicata da danno del sistema digerente. I livelli di miR-93-5p risultavano ridotti nei bambini affetti da MPP rispetto ai controlli sani ed erano ulteriormente diminuiti nei soggetti con lesione del sistema digerente. Questi risultati indicano un possibile coinvolgimento della disregolazione di miR-93-5p nella patologia polmonare e il suo potenziale come biomarcatore per le manifestazioni extrapulmonari.
Gli miRNA hanno dimostrato un valore diagnostico nella polmonite grave, con sensibilità, specificità e accuratezza diagnostica complessiva promettenti28,29. Dal punto di vista clinico, i bambini con MPP complicata da DSI hanno presentato una durata più lunga della febbre e un trattamento antibiotico prolungato rispetto a quelli senza complicanze digestive. Livelli più bassi di miR-93-5p erano indipendentemente associati al coinvolgimento del sistema digerente, insieme a questi parametri clinici, in un'analisi di regressione logistica multivariata. Inoltre, l'analisi della curva ROC ha mostrato una buona performance diagnostica del miR-93-5p sierico nel distinguere i pazienti con MPP con DSI da quelli senza DSI. Pertanto, la misurazione del miR-93-5p potrebbe fornire un valore aggiuntivo per l'identificazione precoce e la stratificazione del rischio nell'infezione da MP pediatrica.
Per quanto riguarda le prestazioni diagnostiche del miR-93-5p circolante rispetto ai marcatori infiammatori clinici di routine, i risultati suggeriscono che il miR-93-5p potrebbe fornire un valore complementare piuttosto che sostituire gli indicatori convenzionali. La proteina C reattiva (PCR) e la procalcitonina (PCT) rimangono biomarcatori comunemente utilizzati nella pratica clinica per valutare la gravità dell'infezione e guidare la terapia antibiotica, e metanalisi hanno dimostrato che la PCT presenta un'accuratezza diagnostica leggermente superiore rispetto alla PCR nella polmonite batterica30. Tuttavia, questi reagenti della fase acuta sono in gran parte aspecifici poiché rispondono a diversi stimoli infiammatori e non riescono a distinguere in modo affidabile l'infezione da Mycoplasma pneumoniae (MP) da altri patogeni respiratori, né a riflettere specificamente il rischio di complicanze extrapulmonari. Al contrario, il miR-93-5p, essendo una molecola regolatrice associata alla via di segnalazione TLR4/fattore nucleare kappa B (NF-κB), potrebbe fornire informazioni fisiopatologiche distinte che integrano i marcatori convenzionali. È stato riportato che la correlazione tra miR-93-5p e PCR è relativamente debole (r di Pearson = 0,2698), suggerendo che il miR-93-5p potrebbe riflettere un aspetto diverso della risposta infiammatoria rispetto alla risposta sistemica della fase acuta.
Evidenze emergenti da modelli animali hanno dimostrato che l'infezione da Mycoplasma pneumoniae può indurre non solo patologie respiratorie, ma anche danni al sistema digerente attraverso l'asse polmone-intestino mediato dalla flora intestinale31. In topi infettati con MP, sono stati osservati danni patologici sia nei polmoni che nel colon, insieme a modifiche nella composizione del microbiota intestinale, tra cui una ridotta abbondanza di batteri benefici come Corynebacterium glutamicum e un aumento dell'abbondanza di potenziali patogeni come Lachnospiraceae NK4A136 group e Escherichia-Shigella, accompagnati da livelli elevati di lipopolisaccaride (LPS) nel contenuto colico e nel sangue32. Si è inoltre riportato che la baicalina attenua l'infiammazione polmonare e regola la flora intestinale nei topi con MPP attraverso la via TLR4/NF-κB, sostenendo il coinvolgimento di questa cascata di segnalazione nella comunicazione crociata tra polmone e intestino33. Questi risultati sono coerenti con un possibile coinvolgimento della segnalazione NF-κB nell'asse miR-93-5p/TLR4 esaminato nel presente studio.
A livello meccanicistico, TLR4, un mediatore chiave dell'immunità innata associato a risposte pro-infiammatorie34,35,36,37, è risultato upregolato durante l'infezione da MP. L'espressione elevata di TLR4 è stata accompagnata da livelli aumentati delle citochine infiammatorie IL-6 e TNF-α e da una ridotta vitalità delle cellule epiteliali. L'overespressione di miR-93-5p ha soppresso l'espressione di TLR4, attenuato il rilascio di citochine infiammatorie e migliorato la sopravvivenza cellulare in condizioni infettive. Pertanto, la downregolazione di miR-93-5p nei pazienti con MPP, in particolare in quelli con lesioni del sistema digerente, potrebbe essere associata a un aumento della segnalazione infiammatoria mediata da TLR4 e a risposte infiammatorie sistemiche più ampie. I risultati attuali non dimostrano l'attivazione della via downstream NF-κB, poiché non sono stati valutati IκBα fosforilato e p65.
Diversi limiti di questo studio devono essere riconosciuti. In primo luogo, si è trattato di uno studio monocentrico con un campione relativamente piccolo, in particolare per il sottogruppo DSI, il che potrebbe limitare la potenza statistica e la generalizzabilità. È necessaria una validazione esterna in coorti più ampie e multicentriche per confermare questi risultati e stabilire valori soglia clinici affidabili. In secondo luogo, sebbene l'IκBα sia stato rilevato mediante Western blotting, non è stata effettuata una validazione completa di altri componenti a valle della via TLR4/NF-κB, inclusi MyD88, p-IκBα e p65. Una validazione a livello proteico di questi componenti del segnale rafforzerebbe l'interpretazione meccanicistica. In terzo luogo, il disegno osservazionale non consente inferenze causali; esperimenti di perdita e guadagno di funzione, inclusi mimici o inibitori di miRNA in vitro o in vivo, sono necessari per determinare se il miR-93-5p contribuisca direttamente al danno digestivo associato alla MPP. In quarto luogo, gli esperimenti in vitro sono stati condotti in cellule epiteliali polmonari A549. Sebbene questo modello sia adatto a valutare gli effetti antinfiammatori del miR-93-5p in un contesto polmonare, non può modellare direttamente la patologia gastrointestinale. L'associazione proposta tra il segnale polmonare miR-93-5p/TLR4 e le manifestazioni digestive, potenzialmente mediata attraverso l'asse polmone-intestino, richiede una validazione diretta in modelli di cellule epiteliali intestinali, come le cellule Caco-2, e in modelli animali in vivo di infezione da MP. Infine, le sfide tecniche associate al rilevamento degli miRNA, inclusa la stabilità dell'RNA e le strategie di normalizzazione, rimangono ostacoli all'implementazione clinica routinaria. Nonostante questi limiti, i risultati forniscono una base per futuri studi meccanicistici e sforzi di validazione su larga scala.
In conclusione, l'upregolazione di miR-93-5p ha attenuato l'infiammazione indotta da MP nelle cellule epiteliali polmonari attraverso la soppressione di TLR4. Dal punto di vista clinico, livelli ridotti di miR-93-5p circolante sono stati associati a lesioni del sistema digerente nei bambini con MPP, suggerendo un potenziale utilizzo come biomarcatore complementare per identificare i pazienti a rischio di complicanze gastrointestinali.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule epiteliali alveolari umane A549 | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Linea cellulare epiteliale alveolare umana utilizzata per il modello MPP in vitro |
| Anticorpo anti-GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, Cina | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Anticorpo primario utilizzato per la rilevazione di GAPDH come controllo di caricamento nel Western blot |
| Anticorpo anti-IκBα | Beyotime, Cina | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Anticorpo primario utilizzato per la rilevazione di IκBα mediante Western blot |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Solarbio, Cina | Cat# A8012 | Reagente bloccante utilizzato durante il Western blot |
| Centrifuga | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Centrifuga utilizzata durante la coltura cellulare e la preparazione dei campioni |
| Sistema di imaging chemiluminescente | Tanon, Cina | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Sistema di imaging utilizzato per visualizzare i segnali chemiluminescenti del Western blot |
| Sistema per saggio del reporter dual-luciferasi | Promega, USA | Cat# E1910 | Utilizzato per misurare l'attività della luciferasi di firefly e di Renilla |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Supplemento sierico per il mezzo di coltura cellulare |
| Anticorpo secondario caprino anti-coniglio IgG, coniugato con HRP | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Anticorpo secondario coniugato con HRP utilizzato per il Western blot |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Software utilizzato per l'analisi statistica e la rappresentazione grafica |
| Kit ELISA per interleuchina-6 (IL-6) | Elabscience, Cina | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | Kit ELISA utilizzato per quantificare l'IL-6 |
| Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Reagente a base lipidica utilizzato per la trasfezione delle cellule A549 |
| Lettore per micropiastre | Tecan, Svizzera | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Lettore per micropiastre utilizzato per misurare la densità ottica a 490 nm |
| Simulanti di miR-93-5p | Ribobio, Cina | Cat# miR10000093-1-5 | Simulante sintetico di miR-93-5p utilizzato per l'overespressione di miR-93-5p |
| Controllo negativo per miR-93-5p | Ribobio, Cina | Cat# miR1N0000001-1-5 | Controllo negativo per la trasfezione con simulante di miR-93-5p |
| Kit per saggio di proliferazione cellulare e citotossicità MTT | Beyotime, Cina | Cat# C0009S | Utilizzato per valutare la vitalità cellulare |
| Stirpe standard di Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Stirpe standard di M. pneumoniae utilizzata per stabilire il modello di infezione |
| Vettore reporter di luciferasi pGL3-Basic | Promega, USA | Cat# E1751 | Vettore reporter utilizzato per il saggio del reporter dual-luciferasi |
| Soluzione tampone salina fosfato (PBS) | Solarbio, Cina | Cat# IP9212 | Tampone utilizzato per il lavaggio delle cellule e la preparazione dei campioni |
| Substrato Western Pierce ECL | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Substrato chemiluminescente utilizzato per la rilevazione nel Western blot |
| Mezzo Pleuropneumonia-like organism (PPLO) | BD, USA | Cat# 255420 | Mezzo di coltura utilizzato per M. pneumoniae |
| Membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membrana utilizzata per il trasferimento proteico durante il Western blot |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Giappone | Cat# RR036A | Mix master per trascrizione inversa utilizzato per la sintesi di cDNA |
| Kit di reagenti PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Giappone | Cat# RR037A | Kit di reagenti utilizzato per la trascrizione inversa |
| Sistema di PCR in tempo reale | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Strumento di PCR in tempo reale utilizzato per l'analisi qPCR |
| Mezzo RPMI-1640 | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Mezzo di coltura cellulare utilizzato per le cellule A549 |
| SPSS | IBM | Versione 27.0; RRID: SCR_016479 | Software utilizzato per l'analisi statistica |
| Controllo negativo per l'overespressione di TLR4 | Ribobio, Cina | NA | Controllo negativo per esperimenti di overespressione di TLR4 |
| Plasmide per overespressione di TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, Cina | NA | Plasmide utilizzato per l'overespressione di TLR4 |
| Reagente TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Reagente utilizzato per l'estrazione totale di RNA |
| Kit ELISA per fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) | Elabscience, Cina | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | Kit ELISA utilizzato per quantificare il TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Giappone | Cat# BL697A | Mix master utilizzato per la PCR quantitativa |
| Sistema elettroforetico per Western blot | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Sistema elettroforetico utilizzato per la separazione delle proteine |
Riferimenti
- Yan C et al. Current status of Mycoplasma pneumoniae. infection in China. World Journal of Pediatrics. 2024;20(1):1-4.
- Poddighe D. Extra-pulmonary diseases related to Mycoplasma pneumoniae. in children: recent insights into the pathogenesis. Current Opinion in Rheumatology. 2018;30(4). doi:10.1097/BOR.0000000000000494.
- Schildgen O et al. Clinical manifestations in infants and children with Mycoplasma pneumoniae. infection. PLOS ONE. 2018;13(4). doi:10.1371/journal.pone.0195288.
- Li X et al. Intestinal necrosis due to nonocclusive mesenteric ischemia in a child with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia: a case report. BMC Infectious Diseases. 2025;25(1):1049.
- Ran B, Yang Z, Li M. METTL3-mediated miR-4534 maturation promotes IVDD progression by targeting the Sirt6-mediated Nrf2/HO-1 pathway. 2024;21(6):2795-2813.
- Du B et al. The lung-gut crosstalk in respiratory and inflammatory bowel disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2023;13. doi:10.3389/fcimb.2023.1218565.
- Jiang Y et al. Intestinal bacteria flora changes in patients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia. with or without wheezing. Scientific Reports. 2022;12(1):5683.
- Lin L-J et al. The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute Mycoplasma pneumoniae. infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(2):351-356.
- Cui J et al. Integrated microfluidic cartridge for rapid and colorimetric detection of Mycoplasma pneumoniae. Microchimica Acta. 2025;192(9):559.
- Wang X, Starodubtseva MN, Kapron CM, et al. Cadmium, von Willebrand factor and vascular aging. NPJ Aging. 2023;9(1):11.
- Chen J. Efficacy of the PDCA cyclic care model in improving lung function and speed of recovery in children with Mycoplasma pneumonia. American Journal of Translational Research. 2025;17(3):1792-1802.
- Li Y et al. Clinical significance of serum miR-98-5p in children with Mycoplasma pneumoniae. infection complicated with digestive system damage. Immunobiology. 2025;230(4):153101.
- Zhang Y, Wu ZM. LINC02605 involved in paediatric pneumonia complicated with diarrhoea via miR-539-5p/CXCL1 axis. European Journal of Clinical Investigation. 2024;54(9). doi:10.1111/eci.14234.
- Gao H et al. Knockdown of lncRNA MEG3 protects against sepsis-induced acute lung injury in mice through miR-93-5p-dependent inhibition of NF-κB signaling pathway. Pathology - Research and Practice. 2022;239:154142.
- Gao H et al. MicroRNA-93 contributes to the suppression of lung inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury in mice via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2020;46(2):561-570.
- Wedgwood S et al. Intestinal dysbiosis and the developing lung: the role of Toll-like receptor 4 in the gut-lung axis. Frontiers in Immunology. 2020;11. doi:10.3389/fimmu.2020.00357.
- Zou N et al. Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation as a novel therapy connecting the central and peripheral systems: a review. Int J Surg. 2024;110(8):4993-5006.
- Chen Y et al. Combination of azithromycin and methylprednisolone alleviates Mycoplasma pneumoniae.-induced pneumonia by regulating miR-499a-5p/STAT3 axis. Exp Ther Med. 2022;24(3):578.
- Poddighe D. Mycoplasma pneumoniae.-related extra-pulmonary diseases and antimicrobial therapy. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(1):188-189.
- Meyer Sauteur PM, Ramien ML, Theiler M. Mycoplasma pneumoniae.: extrapulmonary manifestations in children with focus on mucocutaneous disease. The Pediatric Infectious Disease Journal. 9900. doi:10.1097/INF.0000000000004946.
- Liu C et al. Mast cells participate in regulation of lung-gut axis during Staphylococcus aureus pneumonia. Cell Proliferation. 2019;52(2).
- Guo J et al. People are an organic unity: gut-lung axis and pneumonia. Heliyon. 2024;10(6).
- Fan F et al. Clinical characteristics and serum inflammatory markers of community-acquired mycoplasma pneumonia in children. The Clinical Respiratory Journal. 2023;17(7):607-617.
- Ding L, Jiang Y. Biomarkers associated with the diagnosis and prognosis of Mycoplasma pneumoniae. pneumonia in children: a review. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2025;15. doi:10.3389/fcimb.2025.1552144.
- Peng W et al. Comparative analysis of the efficacy and safety of different methods for injecting polidocanol in the treatment of venous malformations. Phlebology. 2024;39(9):629-635.
- Wang J et al. Peripheral blood microR-146a and microR-29c expression in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia and its clinical value. Italian Journal of Pediatrics. 2023;49(1):119.
- Chu C et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia. Italian Journal of Pediatrics. 2019;45(1):163.
- Powell BH, Witwer KW, Meffert MK. Cellular miRNAs and viruses: trends in miRNA sequestering and target de-repression. J Virol. 2025;99(7).
- Gan T, Yu J, He J. miRNA, lncRNA and circRNA: targeted molecules with therapeutic promises in Mycoplasma pneumoniae. infection. Arch Microbiol. 2023;205(8):293.
- Im PK et al. Hyperuricemia, gout and the associated comorbidities in China: findings from a prospective study of 0.5 million adults. The Lancet Regional Health – Western Pacific. 2025;58. doi:10.1016/j.lanwpc.2025.101572.
- Hu J et al. Insight into the pathogenic mechanism of Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 2022;80(1):14.
- Li B et al. Cecropin AD ameliorates pneumonia and intestinal injury in mice with Mycoplasma pneumoniae. by mediating gut microbiota. BMC Vet Res. 2025;21(1):39.
- Song D et al. The mechanism of baicalin in improving pulmonary inflammatory response and injury and regulating intestinal flora in Mycoplasma pneumoniae pneumoni.a mice. Cellular Signalling. 2025;126:111530.
- Coutinho-Wolino KS et al. Bioactive compounds modulating Toll-like 4 receptor (TLR4)-mediated inflammation: pathways involved and future perspectives. Nutrition Research. 2022;107:96-116.
- Thorburn AN et al. TLR2, TLR4 and MyD88 mediate allergic airway disease (AAD) and Streptococcus pneumoniae-induced suppression of AAD. PLOS ONE. 2016;11(6).
- Tang J et al. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. International Immunopharmacology. 2021;91:107272.
- Jia H et al. Pulmonary epithelial TLR4 activation leads to lung injury in neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 2016;197(3):859-871.