Questo protocollo integra dati trascrittomici multidimensionali con l'apprendimento automatico per identificare geni legati all'invecchiamento e ai mitocondri nella cardiomiopatia dilatativa, al fine di scoprire biomarcatori e sottotipi molecolari.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo di ricerca
Questo protocollo integra dati trascrittomici multidimensionali con l'apprendimento automatico per identificare geni legati all'invecchiamento e ai mitocondri nella cardiomiopatia dilatativa, al fine di scoprire biomarcatori e sottotipi molecolari.
La cardiomiopatia dilatativa (DCM) è caratterizzata da dilatazione del ventricolo sinistro e disfunzione sistolica ed è associata a disfunzione mitocondriale e attivazione immuno-infiammatoria. Tuttavia, le firme molecolari legate all'invecchiamento e i percorsi regolatori mitocondriali nella DCM non sono ancora completamente compresi. Questo studio ha analizzato sei dataset trascrittomici bulk e un dataset di sequenziamento dell'RNA a singola cellula provenienti dal database Gene Expression Omnibus. Dopo normalizzazione dei dati, correzione del batch e annotazione dei tipi cellulari, i geni candidati legati all'invecchiamento e ai mitocondri sono stati identificati mediante analisi dell'espressione differenziale, analisi della rete di co-espressione genica pesata e costruzione della rete di interazione proteina-proteina. I geni centrali sono stati ulteriormente selezionati utilizzando la regressione con operatore di riduzione e selezione assoluta minima, la foresta casuale e l'eliminazione ricorsiva delle caratteristiche mediante macchina a vettori di supporto. Sono state effettuate analisi sull'infiltrazione di cellule immunitarie, sulla comunicazione intercellulare e sul sottotipaggio molecolare per caratterizzare il microambiente immunitario cardiaco nella DCM. Un totale di 66 geni legati all'invecchiamento e 16 geni legati ai mitocondri sono risultati associati alla DCM ed erano principalmente arricchiti nei percorsi di segnalazione del fattore inducibile da ipossia-1, nella fosforilazione ossidativa e nei percorsi correlati alla sintasi dell'ossido nitrico. Le analisi mediante apprendimento automatico e sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno identificato SERPINE1, TGFB2, CYBB e TLR2 come geni centrali. CYBB e TLR2 erano altamente espressi nei monociti e nei macrofagi, mentre SERPINE1 e TGFB2 erano prevalentemente espressi nelle cellule stromali. L'analisi del paesaggio immunitario ha mostrato un aumento dell'attivazione dei macrofagi pro-infiammatori e una alterata comunicazione intercellulare nei campioni di DCM. Sulla base dell'espressione dei geni centrali, i campioni di DCM sono stati suddivisi in due sottotipi molecolari associati rispettivamente alla segnalazione del fattore di crescita endoteliale vascolare e alla biosintesi degli acidi biliari primari. Questo protocollo fornisce un quadro integrato per l'identificazione di biomarcatori candidati e sottotipi molecolari nella DCM.
La cardiomiopatia dilatativa (DCM) è un disturbo miocardico caratterizzato da dilatazione del ventricolo sinistro e compromissione della funzione sistolica. È la terza causa più comune di scompenso cardiaco e l'indicazione principale per il trapianto cardiaco a livello mondiale1. Studi basati sulla popolazione stimano una prevalenza di circa 1 caso ogni 250 adulti, con una prevalenza maggiore nei maschi e una percentuale significativa di casi attribuibili a varianti monogeniche2. Questi risultati indicano che sia la predisposizione genetica sia i fattori ambientali contribuiscono all'insorgenza e alla progressione della DCM.
La patogenesi della miocardiopatia dilatativa coinvolge processi interconnessi, tra cui l'attivazione infiammatoria, lo stress ossidativo, l'apoptosi dei cardiomiociti e una segnalazione profibrotica disregolata. Polimorfismi genetici infiammatori, inclusi varianti del promotore del fattore di necrosi tumorale-α, sono stati associati alla suscettibilità alla miocardiopatia dilatativa di origine virale3. Un aumento dello stress ossidativo è stato inoltre associato alla morte dei cardiomiociti e al malfunzionamento del ventricolo sinistro nei sottotipi umani di miocardiopatia dilatativa4. Inoltre, l'attivazione anomala della via di segnalazione Wnt/β-catenina e della via calcineurina/fattore nucleare delle cellule T attivate promuove l'ipertrofia miocardica e la fibrosi interstiziale, contribuendo così alla progressione della malattia5,6. La disfunzione mitocondriale rappresenta un altro componente importante della miocardiopatia dilatativa, poiché i cardiomiociti presentano elevate richieste energetiche. Il deterioramento della biogenesi mitocondriale, dell'omeostasi del calcio, della mitofagia e dell'integrità del DNA mitocondriale può compromettere la fosforilazione ossidativa e contribuire a un malfunzionamento cardiaco progressivo7,8,9,10.
Nonostante questi risultati meccanicistici, rimangono lacune conoscitive importanti. In particolare, le relazioni temporali e causali tra il rimodellamento strutturale dei mitocondri e la disfunzione bioenergetica durante l'insorgenza e la progressione della miocardiopatia dilatativa non sono state completamente definite11. Sono state esplorate diverse strategie terapeutiche. La terapia con cellule staminali ha mostrato potenziale rigenerativo grazie a effetti paracrini, citoprotettivi e immunomodulatori, ma è ancora necessaria l'ottimizzazione delle fonti cellulari, delle vie di somministrazione e della sopravvivenza post-trapianto12. Anche gli approcci della terapia genica, inclusa la somministrazione basata su virus adeno-associati e la modifica del genoma basata su ripetizioni palindrome corte interspaziate e raggruppate (CRISPR), offrono potenziali strategie terapeutiche di precisione. Tuttavia, limitazioni legate alla tropismo cardiaco, all'immunogenicità del vettore e alla sicurezza a lungo termine rimangono irrisolte13.
I set di dati trascrittomici pubblici provenienti da archivi come il Gene Expression Omnibus (GEO) sono ampiamente utilizzati per la scoperta di biomarcatori nella MCD. Queste risorse forniscono accesso a coorti cliniche multicentriche, supportano indagini economiche e riproducibili e possono migliorare la potenza statistica attraverso l'integrazione incrociata dei dataset14. Il profilo trascrittomico consente inoltre lo screening genomica di geni candidati, la sottotipizzazione molecolare e l'analisi a livello di percorsi biologici15. Tuttavia, i dataset pubblici presentano limitazioni intrinseche, tra cui effetti tecnici di lotto, eterogeneità clinica ed eziologica, capacità limitata di trarre inferenze causali e informazioni longitudinali o prognostiche incomplete16. Pertanto, i risultati ottenuti da dataset trascrittomici pubblici sono più adatti alla generazione di ipotesi e alla priorizzazione di biomarcatori candidati, e richiedono validazione in coorti indipendenti e modelli sperimentali.
Molti studi bioinformatici sulla miocardiopatia dilatativa (DCM) si basano principalmente sull'analisi dell'espressione differenziale, che può generare risultati falsi positivi e non caratterizza appieno le reti di co-espressione genica né l'eterogeneità cellulare all'interno del tessuto cardiaco. Per affrontare tali limitazioni, il presente studio ha adottato una strategia analitica integrata che combina metodi complementari. L'analisi trascrittomica su popolazione totale fornisce profili di espressione a livello tissutale, adatti per confronti caso-controllo. L'analisi delle reti pesate di co-espressione genica (WGCNA) identifica moduli genici associati a tratti fenotipici e consente di dare priorità a insiemi di geni funzionalmente correlati piuttosto che a singoli geni differenzialmente espressi. L'analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI) identifica geni altamente connessi sulla base della topologia della rete. Tre algoritmi di apprendimento automatico — regressione con operatore di selezione e riduzione assoluta minima (least absolute shrinkage and selection operator), foresta casuale (random forest) e macchina a vettori di supporto con eliminazione ricorsiva delle caratteristiche (support vector machine-recursive feature elimination) — sono stati utilizzati per identificare biomarcatori candidati nei dataset integrati¹⁷. Successivamente, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è stato impiegato per esaminare i modelli di espressione specifici per tipo cellulare e le reti di comunicazione intercellulare18.
Sebbene la disfunzione mitocondriale e i cambiamenti molecolari legati all'invecchiamento siano stati ciascuno studiati nella miocardiopatia dilatativa (DCM), le loro associazioni combinate con modifiche trascrizionali correlate alla malattia rimangono poco esplorate. Lo studio attuale ha integrato diversi dataset trascrittomica bulk e scRNA-seq per identificare geni centrali (hub genes) legati all'invecchiamento e ai mitocondri nella DCM, caratterizzare il microambiente immunitario cardiaco ed esaminare sottotipi molecolari basati sui geni identificati. Questo approccio integrato è stato utilizzato per individuare biomarcatori candidati e fornire una base per successivi studi meccanicistici e di validazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Tutte le procedure sugli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese del Henan (Numero di approvazione: HNSZYYYJS2023011150). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le Linee guida per la valutazione etica del benessere degli animali da laboratorio (GB/T 35892-2018) e con i principi 3R di Sostituzione, Riduzione e Perfezionamento. I reagenti, le basi di dati, il software e l'attrezzatura utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Risorse di dati e materiali sperimentali
Topi transgenici maschi di grado SPF CTNTR141W con un fenotipo di cardiomiopatia dilatativa (DCM) spontanea e un peso corporeo di 25 ± 2 g sono stati utilizzati come gruppo modello. Topi maschi di grado SPF C57BL/6J di pari età con un peso corporeo di 25 ± 2 g sono stati utilizzati come gruppo di controllo. Ogni gruppo comprendeva 12 topi. Tutti gli animali provenivano da istituzioni dotate di licenze valide per la produzione di animali da laboratorio ed erano allevati in un ambiente a barriera di grado SPF a 22 ± 2 °C e umidità relativa del 40%–60%, con un ciclo luce/buio di 12 h, con libero accesso a cibo e acqua sterilizzati. Dopo 1 settimana di ambientamento, tutti i topi sono stati mantenuti nelle stesse condizioni per ulteriori 4 settimane prima della valutazione della funzione cardiaca e del prelievo dei campioni. Tutti i topi avevano un'età compresa tra 6 e 8 settimane all'inizio dell'esperimento. I topi sono stati anestetizzati profondamente e soppressi mediante dislocazione cervicale.
Sette dataset trascrittomici pubblici di tessuto miocardico del ventricolo sinistro provenienti da pazienti con miocardiopatia dilatativa (DCM) sono stati recuperati dal database Gene Expression Omnibus (GEO)19. Questi dataset includevano sei dataset trascrittomici bulk e un dataset di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq), GSE145154. Nell'analisi sono state incluse sia le frazioni positive per CD45 che quelle negative per CD45. Le frazioni cellulari positive e negative per CD45 sono state combinate prima del raggruppamento. L'identità del campione è stata utilizzata come variabile principale di batch per l'integrazione con Harmony. Sono stati inclusi campioni normali del ventricolo sinistro e campioni di ventricolo sinistro con DCM da GSE145154, in particolare GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 e GSM4307521. I dataset utilizzati in questo studio sono stati GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 e GSE141910. Sono stati esclusi tutti i campioni non appartenenti alla DCM, e sono stati mantenuti solo i campioni di controllo (gruppo Controllo) e i campioni con DCM (gruppo DCM). Nessun campione è stato rimosso dopo il controllo di qualità. Le informazioni sui campioni dei dataset GEO inclusi sono riassunte di seguito: GSE5406 conteneva 102 campioni (16 di controllo e 86 con DCM); GSE42955 conteneva 17 campioni (5 di controllo e 12 con DCM); GSE57338 conteneva 231 campioni (136 di controllo e 95 con DCM); GSE79962 conteneva 20 campioni (11 di controllo e 9 con DCM); GSE116250 conteneva 51 campioni (14 di controllo e 37 con DCM); e GSE141910 conteneva 322 campioni (161 di controllo e 161 con DCM).
2. Pre-elaborazione dei dati del trascrittoma in bulk
Le matrici di espressione grezze e i file di annotazione clinica per i sei dataset in bulk sono stati scaricati utilizzando il pacchetto GEOquery20. Sono stati recuperati i file CEL grezzi per i dataset di microarray Affymetrix e le matrici di conteggio grezze per i dataset di RNA-seq. La correzione del fondo, la normalizzazione quantile e il calcolo dell'espressione per i dati di microarray sono stati eseguiti utilizzando l'algoritmo robust multi-array average implementato nel pacchetto affy21.
I dati di conteggio dell'RNA-seq sono stati normalizzati utilizzando il metodo della media trimmata dei valori M nel pacchetto edgeR22 e sono stati convertiti in valori log₂ trasformati di conteggi per milione. Gli identificatori delle sonde sono stati convertiti in simboli genici ufficiali utilizzando file di annotazione specifici della piattaforma. Quando più sonde corrispondevano allo stesso gene, è stato calcolato il valore medio di espressione.
Gli effetti tecnici di batch tra i dataset sono stati rimossi utilizzando l'algoritmo ComBat nel pacchetto sva23. La provenienza del dataset e la piattaforma di rilevamento sono state specificate come fattori di batch. È stata eseguita un'analisi delle componenti principali prima e dopo la correzione del batch per valutare l'efficacia della rimozione degli effetti di batch.
3. Pre-elaborazione dei dati del trascrittoma a singola cellula e annotazione cellulare
La matrice di espressione genica da GSE145154 è stata importata in Seurat per costruire un oggetto Seurat utilizzando Seurat versione 524. Le cellule di bassa qualità sono state escluse utilizzando le seguenti soglie: da 200 a 6.000 geni rilevati per cellula, conteggio totale di identificatori molecolari unici superiore a 500 e percentuale di geni mitocondriali inferiore al 25%. Le cellule al di fuori di queste soglie di controllo qualità sono state escluse in quanto di bassa qualità o rotte. Abbiamo escluso le cellule di bassa qualità utilizzando esclusivamente le soglie di controllo qualità descritte sopra.
La normalizzazione logaritmica è stata eseguita utilizzando la funzione NormalizeData con un fattore di scala di 10.000. I 3.000 geni altamente variabili sono stati selezionati utilizzando la funzione FindVariableFeatures con il metodo vst. I dati sono stati normalizzati utilizzando ScaleData, seguiti dall'analisi delle componenti principali per la riduzione lineare della dimensionalità.
Gli effetti di batch sono stati corretti utilizzando l'algoritmo Harmony25 mediante la funzione RunHarmony, specificando l'identità del campione come variabile di raggruppamento. I primi 15 componenti principali sono stati utilizzati per raggruppare le cellule mediante le funzioni FindNeighbors e FindClusters. Il raggruppamento è stato eseguito utilizzando l'algoritmo Leiden con una risoluzione di 0,15. La riduzione non lineare della dimensionalità e la visualizzazione sono state effettuate utilizzando l'approssimazione uniforme della varietà e la proiezione.
I tipi cellulari sono stati annotati utilizzando geni marcatore canonici insieme all'annotazione automatizzata mediante il pacchetto SingleR26. I geni marcatore erano i seguenti: cellule B, IGKC, MS4A1 e CD79A; cardiomiociti, TNNI3, MYL2 e ACTC1; cellule endoteliali, VWF, PECAM1 ed EGFL7; macrofagi, C1QC, C1QB e C1QA; monociti, S100A8, S100A9 e G0S2; cellule natural killer, NKG7, GNLY e CCL5; cellule muscolari lisce, MYL9, TAGLN e ACTA2; cellule stromali, FBLN1, LUM e DCN; e cellule T, CD3E, CD3G e CD3D.
4. Analisi dell'espressione differenziale e punteggio di arricchimento dei set genici
È stato costruito un modello lineare utilizzando il pacchetto limma27 per confrontare l'espressione genica tra i gruppi con miocardiopatia dilatativa (DCM) e i controlli sani. I geni con valore di P < 0,05 e un fold change assoluto maggiore di 1,5, corrispondente a un log₂ fold change assoluto maggiore di 0,58, sono stati definiti come espressi in modo significativamente differenziale.
È stata eseguita un'analisi di arricchimento dei set di geni su singolo campione per calcolare i punteggi di arricchimento per i set di geni associati all'invecchiamento e ai mitocondri in ciascun campione28. Le differenze nei punteggi di arricchimento tra i gruppi con miocardiopatia dilatativa e controlli sani sono state valutate mediante il test della somma dei ranghi di Wilcoxon, considerando statisticamente significativi i valori di P < 0,05.
A livello di singola cellula, i punteggi dei moduli legati all'invecchiamento e ai mitocondri sono stati calcolati utilizzando la funzione AddModuleScore in Seurat. Le differenze nei punteggi dei moduli tra i gruppi sono state valutate mediante il test della somma dei ranghi di Wilcoxon.
Le firme geniche associate all'invecchiamento sono state recuperate dal database CellAge (https://genomics.senescence.info/cells/) e i set genici mitocondriali sono stati ottenuti da GeneCards (https://www.genecards.org/). Gli elenchi completi dei geni utilizzati per il punteggio sono forniti nel File Supplementare 1.
5. Costruzione della rete di co-espressione genica pesata
Sono stati mantenuti i 5000 geni codificanti proteine con la maggiore varianza di espressione nei dati trascrittomici bulk per la costruzione della rete. È stata applicata la funzione pickSoftThreshold per calcolare l'indice di adattamento alla topologia senza scala a diverse potenze di soglia morbida. La soglia ottimale è stata determinata come la potenza minima che produce una rete senza scala con un valore di R2 superiore a 0,9. Di conseguenza, per le analisi successive della rete è stata adottata una potenza di soglia morbida pari a β = 5.
È stata costruita una rete di co-espressione pesata con segno utilizzando la funzione blockwiseModules con una dimensione minima del modulo pari a 30. Sono stati calcolati i coefficienti di correlazione di Pearson tra ogni eigengene del modulo e il punteggio di arricchimento legato all'invecchiamento o ai mitocondri. Sono stati considerati moduli significativamente associati quelli con un coefficiente di correlazione assoluto maggiore di 0,4 e P < 0,001.
I geni all'interno dei moduli significativamente associati sono stati incrociati con i geni differenzialmente espressi per identificare i geni candidati associati all'invecchiamento in DCM e i geni candidati associati ai mitocondri in DCM.
6. Analisi dell'arricchimento funzionale
Sono state condotte analisi dell'arricchimento funzionale, incluse le analisi dei percorsi dell'Ontologia Genica (GO) e dell'Enciclopedia di Kyoto dei Geni e dei Genomi (KEGG), sui geni candidati utilizzando il pacchetto clusterProfiler29. L'arricchimento GO ha riguardato le tre categorie standard: processo biologico, componente cellulare e funzione molecolare.
Tutte le analisi sono state eseguite con annotazione della specie umana, tasso di scoperte false (FDR) per la correzione del valore P e una soglia di q-value pari a 0,05. Gli insiemi genici sono stati limitati a un intervallo dimensionale di 10–500 geni e i termini con un FDR < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Infine, i risultati dell'arricchimento GO sono stati visualizzati tramite grafici a barre raggruppate, mentre i risultati dell'arricchimento KEGG sono stati mostrati utilizzando grafici a bolle.
7. Costruzione della rete PPI e identificazione dei geni hub
I geni candidati sono stati sottoposti al database STRING versione 11.530, con l'organismo impostato su Homo sapiens e la soglia di confidenza delle interazioni fissata a un punteggio combinato superiore a 0,7. I nodi disconnessi sono stati nascosti e i dati sulle interazioni sono stati esportati in formato di valori separati da tabulazione.
I dati di interazione sono stati importati in Cytoscape versione 3.9.1 per la visualizzazione31. I punteggi topologici dei nodi sono stati calcolati utilizzando il plugin CytoHubba32 con tre algoritmi: Degree, componente massima del vicinato e centralità della cricca massimale.
I moduli funzionali principali all'interno della rete sono stati identificati utilizzando il plugin MCODE33 con i seguenti parametri predefiniti: cutoff del grado, 2; k-core, 2; cutoff del punteggio del nodo, 0,2; e profondità massima, 100. I geni classificati tra i primi 10 da tutti e tre gli algoritmi topologici sono stati incrociati con i geni della sottorete principale MCODE per identificare i geni hub finali dell'interazione proteina-proteina.
8. Selezione dei geni centrali basata sull'apprendimento automatico e costruzione del modello diagnostico
Per garantire riproducibilità e una rappresentazione bilanciata, il dataset trascrittomico bulk integrato è stato suddiviso casualmente in set di addestramento e di validazione in un rapporto 7:3, utilizzando un seme casuale fisso (seed = 123456). La suddivisione è stata stratificata per gruppo di malattia (DCM vs. controllo) per mantenere proporzioni di classe costanti in entrambi i set. Prima della suddivisione, gli effetti di batch derivanti da diverse fonti di dataset sono stati corretti utilizzando il pacchetto sva, e i campioni integrati sono stati trattati come una singola coorte durante l'assegnazione casuale.
Tre algoritmi di apprendimento automatico sono stati applicati per analizzare i geni candidati. In primo luogo, è stata eseguita una regressione logistica LASSO tramite la funzione cv.glmnet nel pacchetto glmnet34È stato costruito un modello di classificazione binaria con validazione incrociata a 5 ripetizioni, adottando l'AUC come metrica di valutazione. I geni con coefficienti diversi da zero a lambda.min sono stati conservati come geni candidati.
In secondo luogo, è stato costruito un modello di classificazione basato su foresta casuale con 500 alberi decisionali utilizzando il pacchetto randomForest35. Il numero di variabili campionate per ogni suddivisione è stato impostato alla radice quadrata del numero totale di caratteristiche. L'importanza dei geni è stata quantificata in base al coefficiente di Gini e sono stati mantenuti i 10 geni con i punteggi di importanza più elevati.
In terzo luogo, l'analisi SVM-RFE è stata implementata utilizzando la funzione rfe nel pacchetto caret36. Il numero di caratteristiche è stato impostato in un intervallo da 1 a 10 e è stata adottata una cross-validation a 5 ripetizioni per l'addestramento del modello. Il sottoinsieme di geni con l'accuratezza ottimale nella cross-validation è stato infine selezionato.
I geni identificati da tutti e tre gli algoritmi sono stati definiti come i geni finali del nucleo associati all'invecchiamento e ai mitocondri nella MCD. Successivamente, sono stati costruiti modelli diagnostici utilizzando 10 algoritmi di classificazione: albero decisionale, macchina ad aumento del gradiente, modello lineare generalizzato potenziato, k-nearest neighbors, regressione logistica, rete neurale, minimi quadrati parziali, foresta casuale, macchina a vettori di supporto e boosting estremo del gradiente.
Le curve caratteristiche operative del ricevitore sono state generate utilizzando il pacchetto pROC37. L'area sotto la curva, l'accuratezza, la sensibilità e la specificità sono state calcolate per valutare le prestazioni diagnostiche negli insiemi di addestramento e di validazione.
È stata eseguita un'analisi SHapley Additive exPlanations per calcolare il contributo di ciascun gene fondamentale alle previsioni del modello38. Sono stati generati grafici riassuntivi e grafici a cascata per ogni campione. Un modello diagnostico finale con un'area sotto la curva maggiore di 0,8 nel set di validazione è stato considerato come avente una buona prestazione diagnostica.
9. Inferenza della comunicazione cellula-cellula
Le reti di comunicazione cellula-cellula nel microambiente cardiaco sono state inferite utilizzando il pacchetto CellChat39. È stato costruito un oggetto CellChat mediante il database CellChatDB.human. I ligandi e i recettori differenzialmente espressi sono stati identificati utilizzando identifyOverExpressedGenes, mentre le coppie di interazione significative sono state filtrate mediante identifyOverExpressedInteractions.
Le probabilità di comunicazione tra i tipi cellulari sono state calcolate utilizzando computeCommunProb. La rete globale di comunicazione a livello di tipo cellulare è stata aggregata utilizzando aggregateNet. Il numero di interazioni e l'intensità della comunicazione tra ogni coppia di tipi cellulari sono stati quantificati e visualizzati mediante mappe termiche e grafici a barre.
10. Quantificazione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie
I punteggi di arricchimento per 28 tipi di cellule immunitarie sono stati calcolati per ogni campione bulk mediante l'analisi di arricchimento dell'insieme di geni da singolo campione28 e un insieme di geni specifici per le cellule immunitarie40. Per confrontare i punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie tra il gruppo con miocardiopatia dilatativa e il gruppo di controllo sano è stato utilizzato il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
È stata condotta un'analisi della correlazione di Pearson per valutare l'associazione tra i livelli di espressione dei geni fondamentali e i punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie. Tutte le correlazioni con P < 0,05 sono state considerate statisticamente significative.
11. Clustering consensuale per la sottotipizzazione molecolare
Il clustering consensuale non supervisionato dei campioni di miocardiopatia dilatativa (DCM) è stato eseguito utilizzando i profili di espressione genica principali tramite il pacchetto ConsensusClusterPlus41I parametri di raggruppamento sono stati impostati con un numero massimo di cluster pari a 6, 1000 iterazioni di ricampionamento e una proporzione di ricampionamento dello 0,8. Per il raggruppamento è stato adottato il metodo di partizionamento attorno ai medoidi con distanza euclidea, e un seme casuale fisso è stato utilizzato per garantire la riproducibilità.
Il numero ottimale di sottotipi è stato determinato in base al grafico dell'area delta e ai punteggi di stabilità del cluster di consenso, con K = 2 identificato come valore finale. È stata inoltre eseguita un'analisi delle componenti principali per verificare la chiara separazione dei due sottotipi molecolari.
È stata applicata un'analisi della variazione dei set genici42 per calcolare i punteggi di arricchimento dei percorsi KEGG specifici per campione. Il pacchetto limma27 è stato utilizzato per rilevare l'attivazione differenziale dei percorsi tra i sottotipi, e un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
12. Valutazione ecocardiografica della funzione cardiaca
I topi sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 1% (30 mg/kg) e posizionato in posizione supina su un tavolo operatorio termoregolato. Dopo la rimozione dei peli del torace, del gel ecografico è stato applicato uniformemente sulla regione precordiale.
È stata eseguita un'ecocardiografia M-mode guidata bidimensionale al livello dei muscoli papillari del ventricolo sinistro utilizzando un sistema ecografico per piccoli animali. Sono stati acquisiti tre cicli cardiaci stabili consecutivi per misurare il diametro del ventricolo sinistro in fine diastole, il diametro in fine sistole, la frazione di eiezione e la frazione di accorciamento. Tutte le valutazioni ecocardiografiche sono state effettuate in cieco da un ultrasonografista professionista.
Tre topi sono stati selezionati casualmente da ciascun gruppo per l'esame ecocardiografico, e questi 6 animali in totale sono stati successivamente sacrificati per la raccolta del tessuto miocardico e la misurazione mediante ELISA. Gli animali sperimentali rimanenti hanno subito ulteriori saggi di laboratorio paralleli, i cui dati non sono stati inclusi nel presente studio.
13. Raccolta del tessuto miocardico, estrazione delle proteine e saggio immunoenzimatico (ELISA)
Dopo la valutazione ecocardiografica, i topi sono stati sottoposti a eutanasia sotto anestesia profonda. I tessuti cardiaci sono stati rapidamente prelevati. tramite toracotomia mediana, e il miocardio del ventricolo sinistro è stato dissezionato su ghiaccio. I tessuti isolati sono stati accuratamente lavati con soluzione salina tamponata al fosfato fredda per eliminare il sangue intracardiaco residuo. Dopo aver asciugato il liquido in eccesso con carta filtrante sterile, i campioni sono stati immediatamente congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a −80 °C per l'estrazione proteica successiva, evitando rigorosamente cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
I tessuti miocardici congelati sono stati pesati e tagliati in frammenti di circa 1 mm3 su ghiaccio. I tessuti sono stati lisati in tampone di lisi RIPA freddo contenente inibitori di proteasi e fosfatasi, in un rapporto standardizzato di 100 µL di tampone per 10 mg di tessuto. I campioni sono stati completamente omogeneizzati meccanicamente su ghiaccio e incubati per 30 min per ottenere una lisi cellulare completa.
I lisati sono stati centrifugati a 12.000 × g per 15 min a 4 °C. I soprannatanti ottenuti sono stati raccolti in provette prive di enzimi e la concentrazione totale di proteine è stata quantificata utilizzando un kit per saggio proteico con acido bicinconinico, seguendo i protocolli del produttore. Tutti i campioni sono stati normalizzati a una concentrazione proteica identica con il buffer di lisi.
I livelli di espressione proteica dei quattro geni hub nei lisati miocardici sono stati misurati utilizzando i corrispondenti kit per saggio immunoenzimatico (ELISA). Standard diluiti in serie e lisati di tessuto normalizzati sono stati aggiunti in duplicato (100 µL per pozzetto) su micropiastre pre-ricoperte. Le piastre sono state incubate per 2 h a temperatura ambiente e accuratamente lavate con il tampone di lavaggio fornito con il kit.
A ogni pozzetto è stato aggiunto un anticorpo coniugato con enzima ed è stato incubato per 1 h a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio accurato. Successivamente è stata aggiunta la soluzione cromogenica del substrato e le piastre sono state incubate per 20 min a temperatura ambiente al buio. La reazione colorimetrica è stata interrotta con la soluzione di arresto e i valori di assorbanza sono stati misurati a 450 nm (lunghezza d'onda di riferimento: 570 nm) utilizzando un lettore di micropiastre a lunghezza d'onda completa.
14. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche e le rappresentazioni grafiche dei dati sono state eseguite utilizzando R versione 4.2.3. Per le misurazioni delle concentrazioni tramite ELISA di ciascun gene bersaglio (TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2), è stato applicato inizialmente il test di Shapiro-Wilk per valutare la normalità dei dati nei gruppi Controllo e DCM separatamente. Successivamente, è stato utilizzato un test F per valutare l'omogeneità delle varianze tra i due gruppi. Il metodo per il confronto tra gruppi è stato determinato in base ai risultati del test di omogeneità delle varianze: se le varianze erano omogenee (P ≥ 0.05), è stato adottato un test t di Student non appaiato per confrontare i valori medi tra i gruppi; se le varianze erano eterogenee (P < 0.05), è stato utilizzato il test t di Welch corretto per l'analisi. Tutti i test erano a due code e la soglia di significatività statistica è stata fissata a P < 0.05. I dati sono stati rappresentati mediante boxplot sovrapposti a punti individuali dispersi (jittered). I valori di P di tutti i test e il tipo di test t utilizzato sono stati riportati in dettaglio su ciascun grafico.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Pre-elaborazione dei dati e analisi dell'espressione differenziale
Tutti e sei i dataset trascrittomica bulk hanno subito una pre-elaborazione standardizzata e una correzione degli effetti di batch prima dell'analisi successiva. I dati di microarray sono stati normalizzati utilizzando l'algoritmo robust multi-array average, mentre i dati di conteggio da RNA-seq sono stati normalizzati mediante il metodo della media trimmata dei valori M. L'algoritmo ComBat è stato applicato per rimuovere gli effetti ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il flusso di lavoro integrato multilivello ha combinato meta-analisi trascrittomica su larga scala, costruzione di reti di co-espressione genica pesate, apprendimento automatico ensemble, validazione trascrittomica a singola cellula e verifica in vivo su modelli animali. Quattro geni centrali associati all'invecchiamento e ai mitocondri, CYBB, SERPINE1, TGFB2 e TLR2, sono stati identificati come biomarcatori diagnostici candidati per la cardiomiopatia dilatativa (DCM). L'integrazione di sei dataset trascrittomic...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
L'autore dichiara di non avere interessi concorrenti.
Si ringraziano per i dati pubblicamente disponibili forniti attraverso il database Gene Expression Omnibus. Si ringraziano inoltre i revisori e gli editori per i loro commenti costruttivi sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Scientifico di Ricerca a Livello Provinciale (Grant No. 2021JDZX2026), “Meccanismo della Formula Yiqi Huoxue nell'Attenuare il Rimodellamento Vascolare Aterosclerotico mediante la Regolazione Infiammatoria mediata da KLF2-Nrf2”.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gel ecografico Aquasonic Clear | Parker Laboratories, Inc. | Mar-34 | Utilizzato per l'imaging ecocardiografico in piccoli animali. |
| Kit per saggio BCA delle proteine | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Rilevamento a 562 nm; intervallo, 20–2.000 µg/mL; utilizzato per la quantificazione totale delle proteine nei lisati cardiaci di topo. |
| Database CellAge | Risorse genomiche per l'invecchiamento umano | https://genomics.senescence.info/cells/ | Fonte di firme geniche correlate all'invecchiamento. |
| CytoHubba, plugin per Cytoscape | Negozio di applicazioni Cytoscape | Versione 0.1 | Utilizzato per il punteggio topologico dei nodi nelle reti di interazione proteina-proteina. |
| Cytoscape | Consorzio Cytoscape | Versione 3.9.1 | Utilizzato per la visualizzazione delle reti di interazione proteina-proteina. |
| Lettore a microplacca a spettro completo | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Utilizzato per misurare l'assorbanza nei saggi ELISA. |
| Gene Expression Omnibus | Centro nazionale per le risorse di biotecnologia | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | Repositorio pubblico utilizzato per ottenere set di dati trascrittomici. |
| GeneCards | Istituto Weizmann di Scienze | https://www.genecards.org/ | Fonte di set genici mitocondriali. |
| Cocktail inibitore di proteasi e fosfatasi Halt, 100×, privo di EDTA | Thermo Fisher Scientific | 78441 | Conservato a 4 °C; aggiunto al buffer RIPA a 10 µL/mL immediatamente prima dell'uso. |
| Azoto liquido | Fornitore locale di gas per laboratorio | Non applicabile | Utilizzato per il congelamento rapido del tessuto miocardico. |
| Topi maschi C57BL/6J di grado SPF, 6–8 settimane di età, 25 ± 2 g | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Non applicabile | Numero di licenza per la produzione di animali da laboratorio SCXK (Jing) 2021-0006; utilizzati come controlli normali. |
| Topi maschi transgenici DCM CTNTR141W di grado SPF, 6–8 settimane di età, 25 ± 2 g | Istituto di Scienze degli Animali da Laboratorio, Accademia cinese delle scienze mediche | Non applicabile | Numero di licenza per la produzione di animali da laboratorio SCXK (Jing) 2021-0065; utilizzati come modello spontaneo di miocardiopatia dilatativa (DCM). |
| MCODE, plugin per Cytoscape | Negozio di applicazioni Cytoscape | Versione 2.0.2 | Utilizzato per identificare le sottoreti funzionali principali nelle reti di interazione proteina-proteina. |
| Kit ELISA per CYBB murino | Biogradetech | A-QEK09250-96wells | Utilizzato in questo studio per misurare CYBB nei lisati di tessuto miocardico murino. |
| Kit ELISA per PAI-1 murino | EK-BIO | ML30970 | Utilizzato in questo studio per misurare PAI-1, la proteina codificata da SERPINE1, nei lisati di tessuto miocardico murino. |
| Kit ELISA per TGF-β2 murino | ElaBoX | SEKM-0036 | Utilizzato in questo studio per misurare TGF-β2 nei lisati di tessuto miocardico murino. |
| Kit ELISA per TLR-2 murino | Solarbio | SEKM-0163 | Utilizzato in questo studio per misurare TLR-2 nei lisati di tessuto miocardico murino. |
| Soluzione salina tamponata al fosfato, pH 7,4, priva di calcio e magnesio | Biological Industries | 02-024-1ACS | Soluzione sterile 1×; conservata a 4 °C; utilizzata per il lavaggio e la diluizione del tessuto. |
| Pacchetto R: caret | CRAN | Versione 6.0-94 | Utilizzato per l'eliminazione ricorsiva delle caratteristiche mediante macchina a vettori di supporto. |
| Pacchetto R: CellChat | Sviluppatori di CellChat | Versione 1.6.1 | Utilizzato per l'inferenza delle comunicazioni intercellulari dai dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. |
| Pacchetto R: clusterProfiler | Bioconductor | Versione 4.8.3 | Utilizzato per l'analisi di arricchimento funzionale. |
| Pacchetto R: ConsensusClusterPlus | Bioconductor | Versione 1.64.0 | Utilizzato per il clustering consensuale non supervisionato. |
| Pacchetto R: edgeR | Bioconductor | Versione 3.42.4 | Utilizzato per la normalizzazione dei dati di sequenziamento dell'RNA con il metodo della media trimmata dei valori M. |
| Pacchetto R: GEOquery | Bioconductor | Versione 2.68.0 | Utilizzato per scaricare dati dal Gene Expression Omnibus. |
| Pacchetto R: glmnet | CRAN | Versione 4.1-8 | Utilizzato per la regressione logistica con operatore di riduzione e selezione assoluta minima. |
| Pacchetto R: limma | Bioconductor | Versione 3.56.2 | Utilizzato per l'analisi dell'espressione differenziale e la modellizzazione statistica. |
| Pacchetto R: pROC | CRAN | Versione 1.18.5 | Utilizzato per l'analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore). |
| Pacchetto R: randomForest | CRAN | Versione 4.7-1.2 | Utilizzato per l'apprendimento automatico con alberi decisionali casuali (random forest). |
| Pacchetto R: Seurat | CRAN | Versione 5.0.1 | Utilizzato per l'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. |
| Pacchetto R: SingleR | Bioconductor | Versione 2.2.0 | Utilizzato per l'annotazione automatica dei tipi cellulari. |
| Pacchetto R: sva | Bioconductor | Versione 3.48.0 | Utilizzato per la correzione degli effetti di batch con ComBat. |
| Centrifuga refrigerata | Sigma-Aldrich | SIGMA 3-K | Utilizzata per la centrifugazione dei lisati di tessuto miocardico. |
| Buffer di lisi ed estrazione RIPA | Thermo Fisher Scientific | 89900 | Soluzione pronta all'uso 1×; conservata a 4 °C; integrata con inibitori di proteasi e fosfatasi prima dell'uso. |
| Sistema di imaging ecografico per piccoli animali | VINNO Technology Co., Ltd. | VINN06LAB | Utilizzato per la valutazione ecocardiografica della funzione cardiaca. |
| Pentobarbital sodico | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 20040428 | Preparato come soluzione al 1%, 10 mg/mL, in soluzione salina sterile; utilizzato per l'anestesia intraperitoneale a 30 mg/kg. |
| Database STRING | Consorzio STRING | Versione 11.5 | Utilizzato per la costruzione di reti di interazione proteina-proteina. |
| Omogeneizzatore tissutale TGrinder H24 | TIANGEN | OSE-TH-01 | Utilizzato per omogeneizzare il tessuto miocardico murino nel buffer RIPA a 6,0 m/s per 30–60 s in 2–3 cicli. |
| Piattaforma termoregolata/tavolo operatorio riscaldato per piccoli animali | Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd. | T-30350 | Utilizzata per mantenere i topi a 37 °C durante l'ecocardiografia; intervallo operativo, da temperatura ambiente a 50 °C. |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.