Questo protocollo descrive un modello di ferita escissionale cutanea nel ratto che incorpora una camera umida. Il sistema consente la valutazione di formulazioni topiche liquide, sospensioni cellulari, biomateriali e altri trattamenti per le ferite.
Articolo metodologico
Un modello di ferita da escissione in ratto per l'indagine di terapie in ferite cutanee di dimensioni critiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le ferite cutanee rappresentano una sfida sanitaria globale di grande rilevanza, causando una notevole morbosità e un pesante onere economico. Modelli animali affidabili e clinicamente rilevanti sono essenziali per studiare i meccanismi della riparazione tissutale e valutare nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, i modelli convenzionali di ferita escissionale nei roditori sono limitati dalla rapida contrazione della ferita dovuta al pannicolo carnoso, un processo che differisce in modo significativo dalla guarigione delle ferite nell'uomo. Quest'ultima avviene principalmente attraverso la formazione di tessuto di granulazione e la ri-epitelializzazione. Questo studio descrive un modello di ferita escissionale nel ratto progettato per limitare la contrazione della ferita, fornendo al contempo un ambiente protetto per testare interventi terapeutici sensibili. Ferite dorsali escissionali di 10 mm a spessore completo sono state create in ratti Sprague Dawley e stabilizzate mediante un anello O in gomma nitrilica (NBR) fissato con punti separati. Per mantenere un ambiente di ferita umido, è stato applicato un sigillo coesivo Eakin e una pellicola adesiva trasparente per formare una camera adatta all'amministrazione topica di cellule, biomateriali o composti farmaceutici. Sono stati utilizzati ulteriori strati protettivi, costituiti da una medicazione in schiuma, nastro adesivo, una benda tubolare e un sistema di fissazione a doppia spalla, per impedire agli animali di rimuovere la medicazione. La guarigione della ferita è stata monitorata per 14 giorni mediante planimetria digitale e valutazione istologica con colorazione ematossilina-eosina. La procedura ha richiesto circa 30 minuti per animale e ha prodotto risultati riproducibili nella guarigione delle ferite. L'anello O in NBR è stato utilizzato come stecca per limitare la contrazione della ferita. La guarigione è avvenuta principalmente attraverso la formazione di tessuto di granulazione e la ri-epitelializzazione. Le medicazioni sono rimaste integre fino a sette giorni senza segni di infezione. L'analisi istologica ha dimostrato un attivo processo di riparazione tissutale caratterizzato dalla rigenerazione dell'epidermide e dall'infiltrazione di cellule infiammatorie. Questo modello fornisce una piattaforma per la valutazione preclinica di terapie per le ferite e trattamenti rigenerativi avanzati.
Introduzione
Le ferite cutanee, comprese quelle di difficile guarigione, colpiscono più di 40 milioni di pazienti in tutto il mondo e rappresentano un onere sostanziale per i sistemi sanitari, con costi annui pari a 22 miliardi di dollari entro il 2024. Solo in Europa, 4 milioni di pazienti soffrono ogni anno di ferite di difficile guarigione, occupando fino alla metà dei ricoveri acuti disponibili1. Nonostante i progressi nelle tecniche chirurgiche, nelle pratiche intraoperatorie e nella disponibilità di medicazioni avanzate per le ferite, alcune ferite risultano refrattarie e, in ultima analisi, si sviluppano complicanze. È quindi essenziale sviluppare nuovi approcci terapeutici che richiedano un modello sperimentale animale di ferite cutanee per testare un'ampia gamma di materiali topici.
Tra i modelli sperimentali di ferite cutanee negli animali, l'escissione cutanea è la tecnica più applicabile per creare un modello di guarigione delle ferite2. Tale modello può aiutare a studiare emorragia, reazioni infiammatorie, granulazione, riepitelizzazione, angiogenesi e rimodellamento del tessuto3. Le ferite escissionali vengono create principalmente sul dorso dell'animale mediante rimozione chirurgica di un'area cutanea definita. La ferita deve essere di dimensione critica per evitare la guarigione spontanea. Questa ferita escisionale di dimensione critica consente un accesso diretto per studiare l'applicazione topica di diversi composti chimici, cellule o biomateriali e il loro coinvolgimento nel processo di guarigione4,5.
Roditori e pelle umana condividono somiglianze nelle fasi cellulari e molecolari della guarigione delle ferite, inclusi emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento. Ratti e topi sono le specie più utilizzate nei modelli di ferita a causa della loro disponibilità, delle piccole dimensioni, della relativa facilità di manipolazione genetica e della facilità di gestione. I ratti offrono diversi vantaggi pratici rispetto ai topi, tra cui una maggiore taglia corporea e una pelle più spessa, composta da un numero maggiore di strati di cheratinociti rispetto a quella dei topi. Le ferite nei topi guariscono tipicamente entro 7 giorni, mentre nei ratti il processo di guarigione può essere valutato in circa 12–14 giorni6.
Una sfida importante associata all'uso di roditori con cute lassa è la contrazione della ferita3. La cute dei roditori presenta uno strato di panniculus carnosus, che si contrae dopo una lesione per ridurre l'area esposta. Al contrario, le ferite umane hanno una capacità limitata di contrazione e dipendono dalla granulazione e dalla ri-epitelializzazione per la riparazione7. Un approccio per superare i limiti dei modelli animali consiste nel fissare fisicamente o immobilizzare la cute circostante la zona della ferita8. Le camere per ferite in titanio sono stati tra i dispositivi sviluppati con successo per prevenire la contrazione della ferita9, ma presentavano svantaggi come un elevato stress per l'animale dovuto al peso della camera, un posizionamento chirurgico complesso, il rischio di dislocazione del dispositivo, la possibilità di infezione e un costo elevato. Il concetto di modello di ferita immobilizzata è stato introdotto da Galiano et al.10 nel 2004 mediante la sutura di un anello rigido in silicone attorno al margine della ferita. Questo approccio riduce notevolmente la contrazione della ferita11, ma presenta diversi svantaggi e limitazioni, principalmente legati al rischio di danno ai tessuti molli, a un elevato tasso di spostamento dell'immobilizzazione e a una guarigione della ferita non uniforme. Gli immobilizzatori (come gli anelli rigidi in silicone) possono esercitare una pressione eccessiva sulla cute circostante, causando ischemia, irritazione e necrosi, specialmente se applicati in modo errato. Gli immobilizzatori in silicone vengono spesso danneggiati, rotti o dislocati a causa dei movimenti o dell'auto-pulizia dell'animale8,11. Suture irregolari creano spesso una tensione non uniforme attorno alla ferita, portando a una guarigione non omogenea. Nel modello qui presentato, un O-ring in gomma nitrilica (NBR) viene suturato sul margine della ferita cutanea posizionando 8-12 suture semplici interrotte in poliammide in modo equidistante attorno all'anello. Si prevede che questo approccio minimizzi i rischi sopra menzionati e limiti sufficientemente la contrazione della ferita, consentendo alla lesione di guarire attraverso la formazione di tessuto di granulazione e la ri-epitelializzazione, in modo simile al processo di guarigione delle ferite umane. Questo meccanismo di guarigione faciliterebbe la traduzione dei risultati ottenuti nei modelli animali in applicazioni cliniche.
La teoria della guarigione delle ferite in ambiente umido è stata introdotta da George D. Winter nel 1962 come concetto per la progettazione di prodotti per la cura delle ferite12. Sulla base di questa teoria, negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi tipi di medicazioni per ferite, come garze, film trasparenti, schiume e idrogeli13. D'altro canto, nel 1974 è stato progettato e sviluppato un anello sigillante moldabile in idrocolloide per barriera stomica, finalizzato a prevenire e proteggere da perdite. Tali anelli possono essere facilmente modellati e plasmati per adattarsi al contorno della ferita, in particolare nelle applicazioni di cura della stoma. In questo modello, una guarnizione coesiva viene applicata all'esterno della ferita e, insieme a film sterili e trasparenti, crea una camera umida che riproduce la situazione clinica dei pazienti con lesioni cutanee in trattamento, favorendo l'epitelializzazione della ferita e proteggendo gli agenti topici (ad esempio cellule, biomateriali, composti) da fuoriuscite.
La medicazione delle ferite è fondamentale per proteggere il letto della ferita da traumi fisici e infezioni microbiche. La medicazione delle ferite nei ratti è sempre stata una sfida a causa della loro bassa tolleranza. I ratti rimuovono o distruggono frequentemente le medicazioni mordendole e strappandole non appena riprendono conoscenza dall’anestesia. Ciò rende molto difficile il mantenimento di agenti topici come cellule e farmaci, e rende impossibile la protezione delle ferite da patogeni e contaminanti esterni. Questo rappresenta un’ulteriore difficoltà nel modello rodentico, specialmente negli studi che richiedono un ambiente sterile, come i test su biologici, le terapie cellulari e i prodotti medicinali avanzati. Nel modello qui presentato, una medicazione in schiuma e un nastro adesivo sono stati utilizzati per coprire la camera umida. Successivamente, una benda tubolare elastica, una benda di fissazione e un nastro chirurgico microporoso sono stati impiegati per applicare una medicazione incrociata a doppia spalla, al fine di impedire ai ratti di rimuovere o danneggiare le bende.
Il modello descritto combina diversi elementi provenienti da protocolli differenti ed è stato sviluppato nel corso di diversi anni. L'obiettivo era quello di stabilire un modello di ferita escissionale in ratti mediante l'uso di una camera umida ben tollerata dall'animale, al fine di facilitare il test di materiali topici sensibili, in particolare in forma liquida.
Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Etico di Linköping (Dnr 5163-2023), Svezia. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Esperienzeanimali mentali
- Utilizzare ratti maschi adulti Sprague Dawley di età compresa tra 8 e 14 settimane.
- Prima dell'esperimento, abituare i ratti per almeno 1 settimana in un ciclo luce/buio di 12 ore con una dieta standard.
2. Preparazione preoperatoria
- Anestetizzare l'animale utilizzando isoflurano al 1,5%–2,5% (4,5% per l'induzione) miscelato con ossigeno a 1,0–1,5 L/min. Posizionare l'animale in posizione prona su un tappetino riscaldante per mantenerlo al caldo. Applicare un lubrificante oftalmico per proteggere gli occhi e somministrare 0,05 mg/kg di peso corporeo di buprenorfina diluita in soluzione salina per via sottocutanea sulla schiena dell'animale per il sollievo dal dolore post-operatorio.
NOTA: È importante avere uno strato sottile di materiale isolante monouso tra l'animale e il tappetino.
ATTENZIONE: L'isoflurano è un depressore del sistema nervoso centrale e un irritante respiratorio. Utilizzare un vaporizzatore calibrato con un sistema attivo di aspirazione dei gas di scarto per prevenire l'esposizione ai vapori. - Rasare l'area del dorso con un tagliacapelli elettrico dalla base del collo fino a circa 10 cm più in basso. Pulire accuratamente l'area rasata due volte con clorexidina e alcol al 70%, quindi coprire l'animale con un campo operatorio fenestrato che esponga soltanto l'area pulita.
3. Creazione di una ferita escissionale
- Utilizzare strumenti chirurgici sterili adatti, come forbici e pinze.
- Disegnare un cerchio di 10 mm di diametro usando un modello e un pennarello chirurgico permanente, approssimativamente 4 cm caudalmente alla base del collo.
- Afferrare con la pinza il centro della pelle segnata ed escindere il tessuto cutaneo segnato con le forbici. La profondità della ferita deve arrivare fino alla fascia superficiale. Questa può essere identificata rilasciando completamente lo spessore della pelle e visualizzando la fascia semitrasparente che ricopre il muscolo.
- Applicare un anello di gomma NBR sul bordo della ferita cutanea e fissarlo in posizione mediante 8-12 punti di sutura. Lo scopo della fissazione con l'anello è prevenire la contrazione della pelle. Assicurarsi che i punti principali siano posizionati alle ore 12, seguiti da quelli alle ore 6, 3 e poi 9. Nel caso di 8 punti, posizionare ciascun punto al centro dello spazio tra due punti principali consecutivi (Figura 1A).
- Applicare un sigillo coesivo all'esterno dell'anello di gomma NBR, sfruttandone le proprietà adesive, per creare insieme a un film sterile trasparente e adesivo una camera umida (Figura 1B). A questo stadio, la ferita è immobilizzata dall'anello di gomma NBR, e le pareti laterali della camera sono formate dal bordo cutaneo e dal sigillo coesivo; il pavimento è costituito dalla superficie cruenta della ferita, mentre il tetto è formato dal film trasparente.
- Coprire la ferita con uno strato di film, quindi somministrare la soluzione terapeutica (soluzione cellulare o soluzione del composto) attraverso il film sulla superficie della ferita. La camera delle dimensioni descritte può facilmente contenere 100 µL.
- Coprire il sito di iniezione con un ulteriore strato di film per prevenire la fuoriuscita del trattamento (Figura 1C).
- Coprire il film con una benda in silicone morbido per proteggerlo (Figura 1D).
- Applicare nastri adesivi (Figura 1E), quindi una benda tubolare elastica, in una configurazione a doppia spalla intorno al ratto, utilizzando bende di fissaggio e nastri chirurgici microporosi (Figura 1F–H).
- Tagliare le unghie dei ratti per evitare che strappino la medicazione.
- Somministrare carprofene (5 mg/kg di peso corporeo), diluito in soluzione fisiologica, per via sottocutanea all'animale prima di scollegarlo dall'anestesia.
4. Procedure post-operatorie
- Mantenere l'animale sulla piastra riscaldante, coperto con una coperta, fino al risveglio dall'anestesia. Posizionare gli animali in gabbie separate o in una singola gabbia con un divisorio per evitare che si mordano a vicenda e rimuovano la medicazione.
- Somministrare carprofene, 5 mg/kg di peso corporeo diluiti in soluzione fisiologica, per via sottocutanea la mattina seguente per gestire il dolore post-operatorio. I ratti devono essere monitorati quotidianamente per rilevare segni di dolore post-operatorio o perdita di peso, e un'ulteriore dose di analgesia può essere somministrata se necessario.
5. Misurazioni della ferita e cambio della medicazione
- Esaminare ogni animale quotidianamente durante la prima settimana successiva all'intervento chirurgico sulla ferita. La medicazione deve essere ispezionata e corretta se gli animali mostrano difficoltà nei movimenti o segni di disagio.
- Cambiare la medicazione al giorno 7 mentre l'animale è sotto anestesia, come descritto al punto 2.1.
- Rimuovere delicatamente il cerotto dalla pelle. Scattare fotografie della ferita utilizzando un righello come riferimento di scala. Le immagini vengono analizzate mediante il software Fiji/ImageJ al fine di valutare l'area superficiale della ferita.
- Eseguire misurazioni o altre procedure secondo le necessità dell'investigatore.
- Applicare una medicazione pulita come descritto ai punti 3.8–3.11 e permettere all'animale di riprendersi come indicato al punto 4.1.
6. Raccolta delle ferite ed eutanasia
- Somministrare l'anestesia come indicato al punto 2.1 il giorno 14, oppure secondo il piano sperimentale specifico. Rimuovere la medicazione e scattare foto dei siti della ferita.
- Rimuovere la medicazione e scattare foto dei siti della ferita.
- Raccogliere il tessuto cutaneo della ferita. Utilizzando un bisturi, escindere la pelle intorno alla ferita, includendo una certa quantità di tessuto sano.
- Collocare il campione escisso in una provetta da 2 mL e congelarlo rapidamente in azoto liquido per successive analisi molecolari, oppure conservarlo in formaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente per l'analisi istologica. In alternativa, dividere il campione in due parti per eseguire entrambe le analisi.
- Dopo aver rimosso il tessuto della ferita, eutanasia l'animale mediante inalazione di CO2 o un metodo alternativo conforme all'approvazione etica.
ATTENZIONE: la CO2 provoca dolore, stress e rapida acidificazione delle membrane mucose prima della perdita di coscienza. Utilizzare un flussimetro regolato per sostituire gradualmente l'aria nella camera.
7. Colorazione istochimica: Fissazione della ferita, inclusione e sezionamento
- Fissare le biopsie del tessuto della ferita in soluzione di formaldeide al 4% per 3 h a temperatura ambiente, quindi conservarle a 4 °C durante la notte.
ATTENZIONE: La formaldeide è tossica, un potente sensibilizzante e un noto carcinogeno umano. Manipolare la soluzione in una cappa chimica indossando dispositivi di protezione individuale. - Lavare le biopsie due volte con PBS per 30 min ciascuna.
- Sostituire il PBS con etanolo (70%) e conservare a 4 °C.
- Conservare le biopsie per un massimo di 24–48 h prima dell'elaborazione per evitare la perdita di antigeni, oppure per 1–2 settimane per una semplice caratterizzazione istologica.
- Lavare accuratamente le biopsie con acqua corrente del rubinetto per rimuovere la formaldeide residua.
- Disidratare il tessuto in bagni di etanolo nell'ordine seguente: etanolo al 70% per 20 min; 2 passaggi con etanolo al 95% per 20 min ciascuno; 2 passaggi con etanolo al 100% per 20 min ciascuno.
- Mantenere le biopsie a 65 °C nel bagno di paraffina.
- Versare la paraffina fusa nello stampo designato, posizionando le biopsie al centro, e lasciarla raffreddare e solidificare. Le biopsie devono essere orientate perpendicolarmente alla superficie dello stampo per consentire la visualizzazione di tutti gli strati cutanei durante il sezionamento.
- Sezionare il blocco di tessuto inclusa in paraffina a uno spessore di 5 μm con un microtomo e far galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua deionizzata a 39 °C.
- Trasferire le sezioni sui vetrini e farle asciugare, permettendo al tessuto di aderire alla superficie del vetrino. I vetrini possono essere conservati a 4 °C per un uso successivo oppure processati immediatamente per la colorazione istochimica.
8. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)
- Deparaffinare i vetrini su piastra riscaldata a 60 °C per 30 minuti, quindi in 3 passaggi di xilolo (o qualsiasi sostituto) per 5 minuti ciascuno, seguiti da un passaggio di PBS per 2 minuti.
ATTENZIONE: Il xilolo è tossico e altamente infiammabile. Manipolare la soluzione in cappa aspirante, adottando le normali misure di protezione individuale. - Eseguire la reidratazione in etanolo al 100%, etanolo al 96%, quindi in acqua dH2O per 5 minuti ciascuno.
- Applicare la colorazione con ematossilina per 5 minuti, quindi lavare con acqua corrente per 5 minuti.
- Effettuare la differenziazione con alcol acido 0,3% (acido cloridrico 0,3% in etanolo al 70%) per pochi passaggi, quindi lavare con acqua corrente per 5 minuti.
- Colorare con eosina Y (0,2%) per 30 secondi, quindi lavare con acqua corrente per 5 minuti.
- Disidratare in etanolo al 96% per 1 minuto, quindi in etanolo al 100% per 1 minuto.
- Applicare alcune gocce di mezzo di montaggio, quindi posizionare il coprioggetto.
- Esaminare i vetrini al microscopio ottico e acquisire fotografie digitali.
Risultati
L'intervento chirurgico sul modello di ferita escissionale nel ratto ha richiesto circa 30 min per animale quando eseguito in modo efficiente. I diversi passaggi della creazione del modello, del fissaggio dell'anello O e della medicazione sono mostrati in Figura 1.
Figura 2 mostra il progresso della guarigione della ferita nei giorni 7 e 14. Il raggio della ferita è stato misurato in mm e l'area superficiale è stata calcolata con la formula (area = πr2), dove r = 5 mm al giorno 0. Il progresso della chiusura della ferita è stato espresso come percentuale dell'area non coperta rispetto all'area della ferita indotta al giorno 14. Utilizzando il software Fiji/ImageJ, è stata analizzata un'immagine digitale dell'area della ferita, con la scala calibrata a 10 mm mediante un righello incluso nell'immagine (Figura 2D). Dopo aver delineato e misurato l'area della ferita, questa è stata riportata in mm2. L'area residua della ferita al giorno 14 (29,4% ± 10,1%; n = 7) è mostrata in Figura 3.
La colorazione con ematossilina-eosina della ferita cutanea al giorno 14 è mostrata in Figura 4. Le sezioni hanno mostrato che le biopsie hanno seguito il processo naturale di guarigione delle ferite cutanee, a partire dalla periferia verso il centro. La guarigione della ferita è rimasta incompleta, con una zona centrale priva dell'ordinamento multilaminare classico normale e con uno strato epidermico sottile. Nel derma si è osservata un'abbondante infiltrazione di cellule infiammatorie, fondamentale per il processo di guarigione fisiologica. Nel complesso, il modello è stato ben tollerato dagli animali, con ostacolo alla contrazione cutanea e una guarigione incompleta ma fisiologica.
Figura 1: Creazione della ferita escissionale e procedura di medicazione. (A) Ferita escissionale creata sulla superficie dorsale del ratto, con un anello O cucito intorno al margine della ferita. (B) Anello di barriera idrocolloide modellabile applicato intorno all'anello O. (C) Due strati di medicazione adesiva trasparente applicati sopra l'anello di barriera idrocolloide. (D) Medicazione in schiuma posizionata sopra la medicazione adesiva trasparente. (E) Nastro adesivo elastico applicato per fissare la medicazione. (F–H) Una fascia tubolare di ritenzione applicata intorno al ratto, seguita da una fascia di fissaggio e da nastro chirurgico disposti in una configurazione a doppia spalla per fissare la medicazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative della guarigione della ferita. (A) Immagine rappresentativa della ferita ottenuta al giorno 7. (B–D) Immagini rappresentative della ferita ottenute al giorno 14, che mostrano la ferita con l'O-ring in posizione (B) e dopo la rimozione dell'O-ring (C,D). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dell'area della ferita al giorno 14. Percentuale dell'area della ferita rimanente al giorno 14, che dimostra la riduzione delle dimensioni della ferita. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (DS) (n = 7). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Valutazione istologica della guarigione della ferita al giorno 14. Sezioni rappresentative di tessuto ferito colorate con ematossilina ed eosina (HE) a 10×, 20× e 40× di ingrandimento. La zona centrale della ferita mostrava una ri-epitelizzazione incompleta, mentre i margini della ferita evidenziavano una guarigione fisiologica dell'epidermide. Nel derma erano presenti abbondanti cellule infiammatorie, compatibili con la normale risposta alla guarigione della ferita. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
Le ferite cutanee difficili da guarire sono ferite che non progrediscono attraverso le normali fasi di guarigione entro il periodo previsto e possono essere conseguenza di interventi chirurgici, traumi e reazioni allergiche, oltre a essere secondarie a molte altre patologie, tra cui insufficienza vascolare, diabete e obesità14. Nonostante la disponibilità di diverse modalità di gestione, molti pazienti non guariscono correttamente. L'indagine di nuove strategie terapeutiche, come terapie cellulari, sostanze chimiche, estratti vegetali e composti appena scoperti, è fondamentale per identificare nuove strategie di trattamento. Il modello può essere applicato a un'ampia gamma di studi sulla cicatrizzazione delle ferite. L'adozione di un protocollo standardizzato per testare farmaci, cellule e trattamenti biologici potrebbe facilitare la ricerca preclinica sulla guarigione delle ferite. Il modello di ferita escissionale e il protocollo qui descritto affrontano i principali limiti del modello di ferita cutanea nel ratto utilizzato nella ricerca: ovvero la contrazione cutanea e la medicazione della ferita.
Le ferule in titanio sono comunemente utilizzate per ridurre il restringimento della ferita nei modelli murini di ferita escissionale; tuttavia, il loro utilizzo presenta alcune limitazioni. La rigidità della ferula altera l'ambiente meccanico della ferita e del tessuto circostante, il che potrebbe influenzare le risposte cellulari, l'infiammazione e il rimodellamento della matrice. Di conseguenza, la guarigione avviene in condizioni diverse rispetto a quelle riscontrate nella cute di rodenti non trattati. Sebbene la limitazione del restringimento migliori la comparabilità con la chiusura delle ferite nell'uomo, i vincoli meccanici imposti dalla ferula potrebbero introdurre artefatti che influenzano il processo di guarigione e che devono essere considerati nell'interpretazione dei risultati sperimentali15.
A tale scopo, nel modello sono stati utilizzati anelli O-ring in NBR per limitare il restringimento della pelle e sono stati fissati al margine originale della ferita. Gli anelli sono stati ben tollerati dagli animali e mantenuti in posizione per i 14 giorni dell'esperimento. Sebbene non sia stato osservato qualitativamente un apprezzabile restringimento della ferita in alcun animale, la tatuatura del margine della ferita o altri metodi quantitativi potrebbero rafforzare la valutazione del restringimento della ferita in futuri studi. Pertanto, la tatuatura può essere considerata un passaggio facoltativo in questo protocollo.
L'applicazione di medicazioni protegge le ferite da contaminazione e infezione, mantenendo al contempo il trattamento sul sito della lesione, il che è fondamentale nei modelli di guarigione delle ferite cutanee. Tuttavia, non è raro che alcuni animali rimuovano diversi tipi di medicazioni. I ratti spesso si puliscono e manipolano l'area della ferita, il che può portare allo spostamento o alla rimozione completa della medicazione, nonostante l'uso di film adesivi o metodi secondari di fissaggio. La perdita della copertura della medicazione può alterare l'ambiente della ferita, influire sulla somministrazione del trattamento e aumentare la variabilità tra gli animali16. Nel modello qui presentato, la medicazione è rimasta integra fino a 7 giorni, senza essere rimossa o danneggiata dagli animali. Non si è osservato alcun segno di infezione della ferita cutanea in nessuno degli animali sperimentali. È consigliabile sostituire le medicazioni settimanalmente poiché l'aderenza diventa più stretta man mano che gli animali crescono e aumentano di peso. È necessario prestare attenzione a bilanciare una fissazione sicura con la mobilità dell'animale, assicurandosi al contempo che la medicazione non sia troppo lenta e possa essere rimossa dagli animali.
Il protocollo è flessibile e personalizzabile. Sebbene si raccomandi l'inalazione di isoflurano per il rapido recupero e l'elevata sicurezza, gli sperimentatori possono utilizzare alternativamente un'anestesia iniettabile, come chetamina/xilazina, qualora non sia disponibile un vaporizzatore di isoflurano. Sebbene in questo studio siano stati utilizzati solo ratti maschi, il protocollo è ugualmente applicabile ai ratti femmine.
Si raccomanda la somministrazione di buprenorfina come analgesico in associazione con carprofene, poiché questa combinazione potenzia il sollievo dal dolore. La buprenorfina da sola può inoltre garantire un'adeguata analgesia postoperatoria grazie alla sua durata d'azione relativamente lunga. Rispetto ad altri oppioidi, questo farmaco ha un effetto minimo sulla funzione immunitaria, il che rappresenta un vantaggio per la guarigione delle ferite in accordo con il processo infiammatorio17. I farmaci antinfiammatori non steroidei, che sopprimono l'infiammazione e riducono il dolore, dovrebbero essere evitati quando si studia l'infiammazione. Sebbene in questo studio sia stata creata una sola ferita per animale, i ricercatori potrebbero creare ulteriori ferite utilizzando lo stesso protocollo, nel rispetto dell'approvazione etica e del disegno sperimentale. È necessario considerare attentamente il benessere animale e i principi delle 3R. I ricercatori devono attenersi ai principi delle 3R (sostituzione, riduzione e affinamento) e rispettare il benessere degli animali quando si utilizzano modelli animali. Le procedure chirurgiche devono essere conformi alle linee guida e seguire rigorosamente il protocollo animale approvato. In questo studio, la guarigione delle ferite è stata valutata mediante misurazione dell'area della ferita e valutazione istologica, con la re-epitelizzazione che rappresenta un componente della risposta riparativa. La presenza dei punti di sutura in relazione al fissaggio dell'anello potrebbe interferire con la guarigione locale. Il numero di punti di sutura deve essere costante tra gli animali. La valutazione dell'area della ferita deve includere tutte le superfici esposte, compresi i siti di sutura18. Questo modello può essere sviluppato per includere diverse condizioni sottostanti associate alle ferite cutanee, come ischemia, diabete e invecchiamento. I principali limiti di questo studio sono stati l'assenza di un gruppo di controllo senza steccatura, la mancanza di una valutazione quantitativa della contrazione della ferita e la limitata disponibilità di misure biologiche quantitative oltre alla valutazione dell'area della ferita e all'istologia descrittiva. Diversi problemi tecnici e difficoltà operative sono emersi durante lo sviluppo di questo modello. Un corretto posizionamento del vestito protettivo o della medicazione è essenziale per il benessere animale e per una guarigione efficace della ferita. Una medicazione troppo lenta potrebbe essere rimossa dall'animale dopo il risveglio dall'anestesia, mentre una medicazione eccessivamente stretta potrebbe limitare i movimenti, compromettere la circolazione o interferire con la respirazione. La medicazione deve consentire uno spazio sufficiente per un dito (o il mignolo, nei ratti più piccoli) tra la medicazione stessa e la pelle. Gli animali devono essere monitorati quotidianamente e la medicazione deve essere regolata se si osservano segni di disagio, ridotta mobilità o postura anomala. La gestione del dolore postoperatorio può variare da animale ad animale a causa delle differenze nella sensibilità agli analgesici. Gli animali devono essere valutati regolarmente per rilevare segni correlati al dolore, come atteggiamento accovacciato, ridotta attività, diminuzione dell'appetito e perdita di peso. Analgesia aggiuntiva deve essere somministrata quando necessario, secondo le linee guida istituzionali. Una fissazione costante dell'anello è fondamentale per prevenire la contrazione della ferita. Gli 8–12 punti semplici interrotti devono essere distribuiti uniformemente intorno all'anello per garantire una tensione omogenea e prevenire sollevamenti o deformazioni. Ogni punto deve essere fissato con un nodo chirurgico per ridurre al minimo il rischio di allentamento durante il recupero. Infine, si raccomanda di utilizzare ratti della stessa linea, età, peso corporeo e sesso all'interno di uno stesso studio per minimizzare le variazioni. Inoltre, lo stesso ricercatore esperto potrebbe eseguire tutte le procedure chirurgiche. Per evitare bias, si raccomanda l'uso della doppia cecità nelle analisi istologiche e molecolari.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la Regione Östergötland per il finanziamento di questa ricerca. Gli autori ringraziano il Sig. Anders Delleskog presso il CBR, Università di Linköping, per i suggerimenti, il supporto e l'assistenza nella messa a punto del modello animale. Gli autori ringraziano inoltre la Dott.ssa Maria Ntzouni della Core Facility, Università di Linköping, per il supporto e la guida nell'inclusione, sezionamento e colorazione con ematossilina-eosina dei tessuti cutanei. Un ringraziamento speciale a Sallam Abdallah presso il R&Unità 3D per la pelle e le cellule coltivate, Università di Linköping, per la preparazione dei campioni di pelle e la colorazione con ematossilina-eosina.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Salfarm Scandinavia | 451790 | Conc. 0,3 mg/mL |
| Carprofene | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 mg/mL |
| Sigillo Eakin | Swemed | 2076152 | Spessore 3 mm |
| Stazione di inclusione | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| Eosina | Histolab | 1650 | Soluzione colorante 0,2% |
| Etilene assoluto | Solveco | 1015 | Grado analitico |
| Benda di fissazione | Swemed | 2048934 | 4 cm x 4 m PA/viscosa |
| Formaldeide | Histolab | 2176 | 4% in PBS, pH 7,2-7,4 |
| Tagliacapelli | Swevet | F95000 | Lunghezza di taglio: 0,5 mm |
| Ematossilina | Histolab | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | Histolab | 14250 | Sostituto della xilene |
| Isoflurano | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 mg/g |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7,5x8,5 cm |
| Film Mepore | Swemed | 2057753 | 6x7 cm con telaio |
| Nastro chirurgico Micropore | Swemed | 2063856 | 1,2 cm x 9,1 m |
| Microtomo | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| Mezzo di montaggio | Histolab | 00840-05 | Pertex |
| O-ring | Ruilogod | B0B1TRQBRT | Diametro interno 11 mm, larghezza 1 mm |
| Sutura (ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | Poliammide non assorbibile |
| Disidratazione del tessuto | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast elasticizzato bidirezionale | Swemed | 2069292 | 7,5 cm x 10 m PES/PA |
Riferimenti
- Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
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