Legatura di precisione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra mediante punti di riferimento anatomici in un modello murino di infarto del miocardio

Sommario

Questo protocollo induce un infarto miocardico nei topi mediante legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore, utilizzando il solco interventricolare anteriore come repère superficiale riproducibile per un posizionamento preciso del punto di sutura. L'infarto viene confermato mediante elettrocardiografia, ecocardiografia, colorazione istologica e analisi dei biomarcatori sierici.

Abstract

La legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD) è l'approccio più utilizzato per stabilire modelli murini di infarto miocardico (MI) nella ricerca cardiovascolare preclinica. Nei protocolli convenzionali, tuttavia, il sito di legatura viene tipicamente posizionato a 1–2 mm al di sotto dell'appendice atriale sinistra, un punto di riferimento che spesso risulta difficile da identificare in modo affidabile durante l'intervento chirurgico. In combinazione con una notevole variabilità interindividuale nell'anatomia coronarica murina, ciò porta frequentemente a una localizzazione imprecisa della LAD, a siti di legatura inconsistenti e a una ridotta riproducibilità tra diversi operatori. Per superare tali limitazioni, questo protocollo propone il solco interventricolare anteriore (AIS) come punto di riferimento guida per la legatura della LAD. L'AIS è un solco superficiale poco profondo direttamente visibile al microscopio, al di sotto del quale decorre immediatamente la LAD. A differenza degli approcci convenzionali, fornisce un riferimento anatomico stabile che consente una selezione più coerente del sito di legatura ed è più facile da identificare anche per operatori inesperti. Il protocollo combina un'anestesia standardizzata mediante inalazione di isoflurano con intubazione tracheale non invasiva e convalida l'infarto miocardico mediante elettrocardiografia, ecocardiografia, saggio immunoenzimatico (ELISA), colorazione istopatologica e imaging tridimensionale delle arterie coronarie. Questo protocollo fornisce un metodo sperimentale affidabile e riproducibile per indurre l'infarto miocardico nei topi al fine di studiare le alterazioni fisiopatologiche e immunitarie successive all'evento ischemico.

Introduzione

L'infarto miocardico (IM), una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare a livello mondiale, rappresenta una grave minaccia per la salute umana¹. Caratterizzato da un'esordio improvviso, un decorso clinico critico e un'elevata mortalità, l'IM è causato principalmente dall'occlusione trombotica delle arterie coronarie e può portare a una profonda ischemia miocardica, alla successiva necrosi dei cardiomiociti e a una cascata di complicanze, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte cardiaca improvvisa². Nonostante i notevoli progressi in cardiologia clinica, l'accesso limitato al tessuto miocardico umano continua a ostacolare lo studio dei meccanismi fisiopatologici sottostanti all'IM e lo sviluppo di strategie terapeutiche efficaci³. Di conseguenza, modelli animali in vivo affidabili, riproducibili e clinicamente rilevanti, in grado di riprodurre fedelmente le caratteristiche cliniche e l'evoluzione dell'IM, rimangono essenziali per studi meccanicistici e per la valutazione terapeutica preclinica.

Da quando Johns e Olson hanno stabilito per la prima volta un modello di infarto miocardico murino nel 1954, le metodologie per indurre l'infarto miocardico nei topi hanno subìto un perfezionamento continuo⁴. La legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD) sotto diretta visualizzazione microscopica è diventata la tecnica più ampiamente adottata poiché riproduce caratteristiche patologiche chiave dell'infarto miocardico umano, inclusa l'ischemia miocardica localizzata, la necrosi miocardica e il rimodellamento ventricolare post-infartuale⁵. Tuttavia, la legatura convenzionale della LAD richiede una notevole competenza di microchirurgia, generalmente acquisita solo dopo un addestramento approfondito, limitando la coerenza e la riproducibilità della procedura tra diversi operatori e laboratori⁶. Inoltre, complicanze intraoperatorie e postoperatorie—come emorragia, lesione o collasso polmonare, posizionamento errato della legatura e danno meccanico ai tessuti dovuto a ventilazione inadeguata—contribuiscono a una mortalità perioperatoria relativamente elevata, limitando ulteriormente l'applicazione diffusa di questo modello⁷. Per rispondere a questi limiti, Gao et al. hanno introdotto una tecnica modificata che prevede la legatura della LAD mediante eversione cardiaca, semplificando l'intervento chirurgico e abbassando la soglia tecnica necessaria per stabilire il modello⁸. Sono state inoltre sviluppate ulteriori approcci sperimentali, tra cui la criolesione coronarica e l'induzione farmacologica del danno miocardico, specificatamente per determinate applicazioni di ricerca^9,10. Tuttavia, la legatura permanente della LAD sotto diretta visualizzazione rimane il metodo preferito poiché riproduce in modo più fedele le principali caratteristiche fisiopatologiche dell'infarto miocardico umano, consentendo al contempo un controllo sulla dimensione e sulla localizzazione dell'infarto.

Nonostante il suo ampio utilizzo, la legatura convenzionale dell'arteria discendente anteriore (LAD) rimane limitata da un'identificazione variabile del sito di legatura, da un'incostanza procedurale, da una mortalità perioperatoria relativamente elevata e da una variabilità tra laboratori nella riproducibilità, fattori tutti che possono influenzare l'affidabilità e la comparabilità dei risultati sperimentali¹¹. L'obiettivo generale del presente protocollo è stabilire un metodo più standardizzato e riproducibile per la legatura permanente della LAD nei topi, utilizzando il solco interventricolare anteriore (AIS) come riferimento anatomico esterno per la localizzazione del vaso. Invece di stimare il sito di legatura a una distanza fissa al di sotto dell'appendice atriale sinistra, questo protocollo identifica l'AIS — una solcatura superficiale poco profonda direttamente visibile mediante visualizzazione al microscopio e sovrastante la LAD — come un riferimento anatomico stabile per guidare la legatura. Rispetto alla stima convenzionale basata sui punti di riferimento anatomici, questo approccio si propone di facilitare una selezione più coerente del sito di legatura, ridurre la variabilità dipendente dall'operatore e migliorare l'accessibilità per chirurghi meno esperti, mantenendo al contempo la compatibilità con le procedure standard di infarto miocardico (MI) nei topi. Questo protocollo è pertanto adatto a ricercatori che cercano un metodo chirurgico riproducibile per generare modelli di MI permanente per studi su danno miocardico, rimodellamento ventricolare, infiammazione e meccanismi correlati delle malattie cardiovascolari.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgevano animali sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato Etico del Centro per la Sperimentazione Animale della Southwest Medical University (Numero di approvazione: SWMU20240146). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J (liberi da patogeni specifici [SPF]), di età compresa tra 8 e 10 settimane e del peso di 20,0 ± 3,0 g. Adattare i topi per 1 settimana in condizioni standard di laboratorio (22°C ± 2°C; ciclo luce/buio di 12 h/12 h) prima di iniziare gli esperimenti.

1. Preparazione preoperatoria

1. Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici il giorno dell'intervento, inclusi pinze, forbici oftalmiche, un portaatutto, un emostatico micro-mosquito, un retrattore a forma di V per le palpebre, suture in nylon 7-0 a cerchio 3/8 con ago, suture in nylon 6-0 e suture in nylon 5-0. Autoclavare tutti gli strumenti metallici a 121°C per 20 minuti prima della procedura e risubilizzarli tra un animale e l'altro utilizzando un sterilizzatore a perle di vetro (250°C per 15 secondi), seguito da raffreddamento su un tampone sterile. Utilizzare suture provenienti da confezioni sterili sigillate.
2. Allestiti due aree di lavoro separate per mantenere una tecnica asettica. Preparare un'area con pinze, un kit per intubazione tracheale murino e una macchina per anestesia, e preparare una seconda area chirurgica sterile con strumenti sterilizzati, bastoncini di ovatta, povidone-iodio e garza sterile.
3. Applicare una crema depilatoria sulla regione toracica per 1 minuto. Rimuovere delicatamente la crema e i peli utilizzando garza sterile inumidita con acqua sterile o soluzione fisiologica.
   1. La semplice rimozione dei peli non costituisce una preparazione cutanea chirurgica. Eseguire la disinfezione cutanea asettica definitiva e il rivestimento sterile solo dopo aver anestetizzato, intubato e fissato il topo sulla piattaforma chirurgica, immediatamente prima dell'incisione cutanea (Passaggio 2.6).
4. Somministrare cefazolina (300 mg/kg) per via intraperitoneale 1 ora prima dell'intervento. Ricostituire il sodiocefazolina per iniezione in soluzione fisiologica sterile al 0,9% fino a una concentrazione lavorativa di 30 mg/mL e somministrare circa 0,2 mL per ogni 20 g di peso corporeo per raggiungere la dose desiderata. Continuare la somministrazione una volta al giorno per 5 giorni consecutivi dopo l'intervento.
   NOTA: Non somministrare agenti emostatici farmacologici sistemici o topici in questo protocollo. Ottenere l'emostasi intraoperatoria applicando una pressione delicata e continua con un bastoncino di ovatta sterile per 10–30 secondi, oppure fino a quando l'emorragia non si arresta.

2. Induzione dell'anestesia e intubazione tracheale

1. Posizionare il topo nella camera di induzione (16 × 10 × 11 cm) collegata alla macchina per anestesia. Impostare la portata del gas di trasporto a 0,5 L/min e indurre l'anestesia con isoflurano al 3,5%–4,0%.
   NOTA: Verificare un’anestesia adeguata attraverso l’assenza del riflesso di ritrazione plantare. Con queste impostazioni, il topo raggiunge generalmente un piano chirurgico di anestesia entro 2–4 minuti.
2. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina sulla piattaforma per intubazione tracheale murina. Sospendere il topo agganciando gli incisivi superiori all’elastico della piattaforma in modo che testa e collo siano estesi con un angolo di circa 45°. Allineare gli assi orale, faringeo e laringeo per portare la glottide in visione diretta.
3. Eseguire l’intubazione orotracheale
   1. Eseguire l’intubazione orotracheale sotto laringoscopia diretta senza tracheotomia per stabilire una ventilazione meccanica controllata. Utilizzare un catetere endovenoso da 20 G (diametro esterno, circa 0,9 mm; lunghezza, circa 15 mm) come tubo endotracheale.
   2. Aprire la bocca e spostare delicatamente la lingua da un lato usando pinzette. Inserire la lama di un laringoscopio per piccoli animali lungo il dorso della lingua e premere la base della lingua.
   3. Avanzare il laringoscopio finché l’epiglottide diventa visibile. Sollevare il laringoscopio verso l’alto e in avanti lungo l’asse dell’impugnatura per sollevare l’epiglottide ed esporre l’apertura glottica a forma di V e le corde vocali chiare.
   4. Avanzare il catetere attraverso la glottide aperta durante l’inspirazione, mantenendo una visione diretta delle corde vocali. Rimuovere il laringoscopio dopo che il catetere ha superato la glottide.
   5. Avanzare il catetere a una profondità di circa 5–7 mm. Ritirare lo stiletto e collegare il catetere al ventilatore.
      NOTA: Confermare il corretto posizionamento del tubo endotracheale osservando un movimento simmetrico bilaterale della parete toracica sincronizzato con il ventilatore. Se il movimento della parete toracica è minimo e si verifica invece un movimento addominale ritmico, accompagnato da un progressivo alleggerimento dell’anestesia, rimuovere il catetere dall’esofago e ripetere l’intubazione.
   6. Se la glottide non è visibile, ritirare il laringoscopio e riposizionare il topo sulla piattaforma di intubazione con testa e collo estesi a circa 45°. Riallineare gli assi orale, faringeo e laringeo, rimuovere eventuali secrezioni orofaringee con un batuffolo sterile e ripetere la laringoscopia. Se il topo mostra segni di risveglio dall’anestesia, riposizionarlo nella camera di induzione, approfondire l’anestesia e quindi ripetere il tentativo di intubazione.
   7. Interrompere la procedura se il topo sviluppa cianosi, emorragia laringea o apnea persistente. Sospendere la somministrazione di isoflurano e posizionare il topo su un tappetino riscaldante a temperatura controllata (37°C) fino al completo recupero.
   8. Non procedere con la toracotomia se l’intubazione tracheale non ha successo. Riprogrammare la procedura per una sessione successiva o escludere l’animale dallo studio, registrando l’evento come fallimento procedurale.
      NOTA: Ripetuti tentativi di intubazione possono causare edema laringeo, aumentando il rischio di distress respiratorio postoperatorio. Nella maggior parte dei casi, un’intubazione riuscita si ottiene entro i primi due tentativi dopo la visualizzazione diretta della glottide. La competenza nell’intubazione orotracheale richiede pratica e familiarità con la tecnica.
4. Somministrare aria come gas di trasporto a una portata di 0,5 L/min e mantenere l’anestesia con isoflurano al 1,5%–2,0%. Impostare il ventilatore su una frequenza respiratoria di 130 atti/min, un volume corrente di 2 mL e un rapporto inspiratorio/espiratorio di 5:4.
   NOTA: Il volume corrente impostato sul ventilatore supera il valore teorico stimato in base al peso corporeo poiché compensa il volume comprimibile del circuito del ventilatore e lo spazio morto del tubo endotracheale. Valutare la ventilazione durante tutta la procedura monitorando il topo per cianosi e segni di barotrauma, inclusi pneumotorace ed enfisema sottocutaneo.
   1. Monitorare continuamente la profondità dell’anestesia per tutta la durata della procedura. Valutare il pattern respiratorio e il riflesso di ritrazione plantare ogni 2 minuti. Monitorare la frequenza cardiaca in continuo mediante elettrocardiogramma (ECG) e regolare la concentrazione di isoflurano per mantenere una frequenza cardiaca di 400–500 battiti/min; una concentrazione di isoflurano del 1,5%–2,0% è generalmente sufficiente. Osservare durante tutta la procedura la presenza di sforzo respiratorio spontaneo contro il ventilatore, movimento dei baffi e variazioni del colore delle membrane mucose.
   2. Aumentare la concentrazione di isoflurano a incrementi dello 0,5%, fino a un massimo del 3,0%, se ricompare il riflesso di ritrazione plantare, si osserva movimento dei baffi o si verifica uno sforzo respiratorio spontaneo contro il ventilatore. Ridurre la concentrazione di isoflurano a decrementi dello 0,5%, fino a un minimo dell’1,0%, se la frequenza cardiaca scende al di sotto di 350 battiti/min. Interrompere la procedura chirurgica ogni volta che si osservano questi segni, continuare a monitorare frequenza cardiaca, pattern respiratorio, colore delle membrane mucose e movimento dei baffi, e riprendere la procedura solo dopo che i parametri fisiologici si sono stabilizzati.
5. Inclinare il topo verso il lato destro con il lato sinistro in alto per esporre la parete toracica sinistra. Fissare le quattro zampe e la coda alla piattaforma utilizzando nastro adesivo.
6. Disinfettare il sito chirurgico con tre applicazioni successive di iodopovidone. Per ogni applicazione, utilizzare un batuffolo sterile nuovo, partendo dal sito previsto per l’incisione e muovendosi verso l’esterno in una spirale concentrica fino a circa 1 cm oltre l’incisione prevista in tutte le direzioni. Gettare il batuffolo dopo ogni applicazione e non riportare un batuffolo usato al centro del campo operatorio. Lasciare asciugare completamente l’ultima applicazione all’aria, quindi applicare un campo sterile, esponendo solo l’area chirurgica prima di effettuare l’incisione cutanea.

3. Toracotomia ed esposizione del cuore

NOTA: Il flusso di lavoro chirurgico complessivo, inclusi il posizionamento dell'animale, la toracotomia, l'esposizione del cuore, la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD), la chiusura toracica e il recupero postoperatorio, è illustrato nella Figura 1 e nella Figura 2.

Figura 1: Localizzazione anatomica del sito di legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra mediante il solco interventricolare anteriore. (A) Vista ventrale del cuore murino esposto prima della legatura, che mostra il solco interventricolare anteriore (SIA). (B) Vista della stessa regione dopo la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD); la regione cerchiata indica il sito di legatura. (C) Schema che illustra la relazione spaziale tra il SIA e le arterie coronarie. La LAD decorre lungo il SIA, e il punto di legatura si trova nel terzo superiore del solco. RCA, arteria coronaria destra; LCA, arteria coronaria sinistra; LCX, arteria coronaria circonflessa sinistra. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Procedura chirurgica per la legatura guidata dal solco interventricolare anteriore dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra nei topi. (A) Posizionare e fissare il topo anestetizzato con la regione toracica sinistra depilata. (B) Eseguire un'incisione cutanea sulla parete toracica sinistra. (C) Separare i muscoli pettorali e identificare lo spazio intercostale appropriato per la toracotomia. (D,E) Inserire e posizionare il retrattore toracico per espandere lo spazio intercostale ed esporre il campo operatorio. (F) Visualizzare il cuore esposto e identificare il solco interventricolare anteriore (AIS). (G) Passare un filo di nylon 7-0 attraverso l'AIS e al di sotto dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD). (H) Fissare il filo per ottenere una legatura permanente della LAD. (I) Rimuovere il retrattore toracico e chiudere la parete toracica. (J,K) Chiudere in modo sequenziale i tessuti muscolare e cutaneo. (L) Consentire al topo di riprendersi sotto riscaldamento dopo l'intervento chirurgico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Utilizzando forbici oftalmiche, praticare un'incisione cutanea longitudinale di 1 cm sulla parete toracica sinistra, parallela all'asse lungo dello sterno e approssimativamente 2 mm laterale rispetto al margine sternale sinistro. Esporre i muscoli pettorali sottostanti.
2. Utilizzando pinze fini, separare in modo ottuso i muscoli pettorale maggiore e pettorale minore lungo la direzione delle loro fibre. Ritrarre i muscoli lateralmente per esporre le costole e gli spazi intercostali, evitando di tagliare i muscoli per minimizzare il sanguinamento.
3. Identificare lo spazio intercostale appropriato prima di aprire la cavità toracica. Individuare l'arteria intercostale anteriore, un ramo dell'arteria toracica interna che decorre all'interno di uno spazio intercostale parallelo alle costole, e identificare lo spazio intercostale terzo immediatamente craniale rispetto all'arteria più visibile nello spazio intercostale quarto.
4. Se l'arteria intercostale anteriore non è chiaramente visibile, palpare la prima costola e contare in senso caudale per identificare lo spazio tra la terza e la quarta costola. Verificare che lo spazio intercostale selezionato offra una visione diretta e priva di ostacoli dell'auricola atriale sinistra e della parete libera anteriore del ventricolo sinistro prima di procedere.
   NOTA: Un'identificazione accurata dello spazio intercostale terzo è essenziale poiché un sito errato di toracotomia potrebbe ridurre la visualizzazione del cuore e compromettere la procedura.
5. Eseguire una toracotomia attraverso lo spazio intercostale sinistro terzo. Allargare delicatamente lo spazio intercostale utilizzando un retrattore a forma di V per palpebra fino a quando l'auricola atriale sinistra e il terzo superiore del ventricolo sinistro risultino chiaramente esposti nel campo operatorio.
   NOTA: A questo stadio, il cuore è ancora ricoperto dal pericardio; pertanto, l'AIS non può essere identificata con certezza. Identificare l'AIS solo dopo aver aperto il pericardio (Passaggio 3.6), come descritto nei Passaggi 4.2–4.3.
6. Afferrare delicatamente il pericardio con una coppia di pinze fini e sollevarlo dal miocardio. Utilizzare una seconda coppia di pinze fini per strappare lentamente il pericardio e esporre completamente il cuore.

4. Legatura guidata da punti di riferimento dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

1. Fare passare un filo di nylon 6-0 attraverso la parete toracica ed esercitare una trazione delicata per ampliare il campo operatorio. Esporre completamente l’AIS prima di identificare il sito di legatura (Figura 1A).
2. Identificare l’AIS come un solco superficiale che si estende obliquamente dalla base cardiaca verso l’apice, delimitando la superficie di separazione tra ventricolo sinistro e destro (Figura 1C). Al microscopio, riconoscerlo come una depressione quasi circolare situata approssimativamente 1–2 mm al di sotto del margine inferiore dell’auricola atriale sinistra.
3. Se l’identificazione dell’AIS risulta difficoltosa, tamponare delicatamente la superficie epicardica con un bastoncino di cotone inumidito con soluzione fisiologica calda. Riesaminare il campo operatorio al microscopio per identificare il solco in modo più chiaro.
   NOTA: Al microscopio stereoscopico, l’AIS è un solco superficiale facilmente riconoscibile che delimita anatomicamente il confine interventricolare, con l’arteria coronaria discendente anteriore (LAD) che scorre immediatamente al di sotto. Se l’AIS rimane indistinto dopo il tamponamento, verificare innanzitutto che la toracotomia offra un’esposizione adeguata. Successivamente, identificare direttamente la LAD seguendo metodi precedentemente descritti: rispetto alla vena cardiaca adiacente, l’arteria presenta un colore più roseo, un calibro minore ed è distintamente pulsatile¹².
   1. Se non è possibile identificare l’AIS o l’arteria coronaria LAD, verificare innanzitutto che la toracotomia sia stata eseguita attraverso lo spazio intercostale sinistro terzo. Se necessario, riposizionare la toracotomia come descritto nei passaggi 3.3–3.5, quindi ripetere l’identificazione dell’AIS e della LAD come indicato nei passaggi 4.1–4.3.
   2. Interrompere la procedura se, dopo 10 minuti di attenta ispezione, non si riesce a identificare l’AIS o la LAD, se si verifica un sanguinamento incontrollabile, se la durata totale della procedura a torace aperto supera i 20 minuti, oppure se la frequenza cardiaca rimane al di sotto di 300 battiti/min nonostante l’adeguamento della profondità anestetica. Anestetizzare profondamente il topo con isoflurano al 5%, sopprimerlo mediante dislocazione cervicale e registrare l’animale come fallimento procedurale da includere nell’analisi degli esiti chirurgici.
4. Fare passare un filo di nylon 7-0 attraverso il solco nel terzo superiore dell’AIS (Figura 1B). Inserire l’ago perpendicolarmente alla superficie epicardica fino a una profondità di circa 0,5–1 mm, posizionando i punti di ingresso e di uscita su lati opposti del solco e distanziati approssimativamente della sua larghezza massima.
5. Fissare la legatura utilizzando un nodo chirurgico. Regolare la legatura finché non si osserva un immediato sbiancamento del miocardio a valle del sito di legatura dopo il primo nodo, senza evidente indepressione del tessuto locale.
   NOTA: Stringere il filo solo fino all’occlusione del flusso sanguigno coronarico. Una tensione eccessiva potrebbe danneggiare il miocardio adiacente o causare il taglio del filo attraverso il vaso e i tessuti circostanti.
6. Confermare l’occlusione coronarica riuscita entro 1 minuto dalla legatura osservando uno sbiancamento ischemico irregolare del miocardio a valle del sito di legatura¹². Confermare ulteriormente l’occlusione rilevando un’elevazione del tratto ST nell’ECG.
7. Se l’area ischemica è eccessivamente piccola o se non si osserva alcuno sbiancamento, rilasciare la legatura e ripetere la procedura di legatura.

5. Chiusura e recupero postoperatorio

1. Rimuovere con attenzione il retraore a forma di V delle palpebre. Chiudere la toracotomia con un singolo punto separato in nylon 5-0, passando l'ago attorno alle costole adiacenti, la terza e la quarta, per riavvicinare lo spazio intercostale terzo. Mantenere l'ago vicino alla superficie della costola per evitare di danneggiare il fascio neurovascolare intercostale. Prima di annodare il punto, comprimere delicatamente il torace alla fine dell'espirazione per espellere l'aria intratoracica residua, quindi mantenere la compressione mentre si fissa il punto con un nodo chirurgico.
2. Chiudere l'incisione cutanea in strati utilizzando punti in nylon 5-0. Assicurarsi di ottenere un completo apposizione dei margini della ferita prima di procedere.
3. Posizionare il topo su un tappetino riscaldante con controllo termico (37°C), interrompere la somministrazione di isoflurano e continuare la ventilazione meccanica fino al ritorno della respirazione spontanea. Osservare l'animale durante il risveglio dall'anestesia, inclusi movimenti della coda o dei baffi e il ripristino di un ritmo respiratorio regolare di circa 150 atti/min.
4. Verificare la prontezza per l'estubazione controllando la regolarità della respirazione spontanea, il movimento visibile della parete toracica sincronizzato con il ciclo del ventilatore e movimenti intenzionali degli arti o dei baffi. Ritirare lentamente il tubo endotracheale durante la fase espiratoria, quindi continuare a monitorare il topo sul tappetino riscaldante per 3–5 minuti per confermare l'assenza di distress respiratorio.
   NOTA: Il distress respiratorio dopo l'estubazione è comunemente causato da pneumotorace dovuto alla chiusura incompleta dello spazio intercostale. Se si verifica distress respiratorio, riindurre temporaneamente l'anestesia e ventilare il topo, riaprire i punti cutanei, ispezionare la chiusura intercostale e posizionare ulteriori punti in corrispondenza di eventuali perdite d'aria prima di ripetere la procedura di estubazione.
5. Riportare il topo nella sua gabbia di alloggio dopo il risveglio dall'anestesia. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg, per via sottocutanea) immediatamente dopo l'intervento e ogni 4–6 ore per le prime 48 ore.
6. Monitorare ogni topo almeno due volte al giorno nei primi 3 giorni postoperatori e una volta al giorno successivamente. Valutare il peso corporeo, la postura, l'attività, il ritmo respiratorio e lo stato della ferita chirurgica ed eutanasizzare qualsiasi animale che raggiunga i criteri umani prefissati, inclusa respirazione difficoltosa persistente, incapacità di accedere a cibo o acqua, o postura accovacciata e immobile non responsiva a stimoli.

6. Valutazione elettrocardiografica (ECG)

1. Registrare i segnali elettrocardiografici utilizzando un sistema di registrazione fisiologica multicanale dotato di amplificatore ECG. Inserire tre elettrodi sottocutanei agli arti nel topo, collegando l'ingresso positivo (VIN+) all'arto posteriore sinistro, l'ingresso negativo (VIN−) all'arto anteriore destro e la massa (GND) all'arto posteriore destro.
2. Collegare il modulo amplificatore ECG all'unità di acquisizione dati. Impostare il filtro notch a 50 Hz (o 60 Hz, in base alla frequenza di rete locale), quindi aprire il software di acquisizione e aggiungere un nuovo modulo amplificatore ECG nelle impostazioni del canale analogico.
   1. Configurare l'amplificatore con i seguenti parametri: guadagno = 2000, modalità = normale, filtro passa-basso = 150 Hz e filtro passa-alto = 0,05 Hz. Aprire le impostazioni di acquisizione, impostare la frequenza di campionamento a 1 kHz e chiudere la finestra di configurazione.
   2. Dopo aver posizionato gli elettrodi, fare clic su Avvia per iniziare la registrazione. Impostare la base dei tempi del display a 0,5 s per divisione principale e la scala verticale a 0,25 mV per divisione principale, quindi registrare l'ECG in modo continuo per almeno 30 s. Selezionare un tratto stabile, privo di artefatti, per l'analisi e la rappresentazione rappresentativa.
3. Registrare l'ECG immediatamente dopo la legatura, mantenendo il topo sotto anestesia con isoflurano al 1,5% e normotermia su un tappetino riscaldante. Registrare gli ECG sia dal gruppo di infarto miocardico (MI) che dal gruppo di controllo normale (NC) allo stesso punto temporale e in condizioni anestetiche comparabili.

7. Ecocardiografia

1. Rimuovere i peli dalla regione toracica anteriore utilizzando una crema depilatoria 1 giorno prima dell'imaging. Anestetizzare il topo con isoflurano al 1,5% per tutta la durata dell'esame.
2. Posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma riscaldata, fissare le quattro estremità agli elettrodi dell'ECG e applicare del gel ecografico sul precordio. Regolare la concentrazione di isoflurano secondo necessità per mantenere una frequenza cardiaca superiore a 400 battiti/min.
3. Posizionare la sonda ecografica nello spazio intercostale tra il terzo e il quarto spazio intercostale lungo il margine sternale sinistro. Orientare il marcatore della sonda verso l'arto anteriore destro con un angolo di circa 30° e allineare la sonda con l'asse lungo del cuore.
4. Eseguire tutte le acquisizioni mediante un trasduttore lineare con una frequenza di trasmissione centrale di 30 MHz, una banda passante di 20–46 MHz e una risoluzione assiale di 50 μmImpostare la potenza trasmessa al 100%, la profondità dell'immagine a 13 mm, la larghezza dell'immagine a 11 mm, la dinamica a 60 dB e il guadagno in modalità bidimensionale a 40 dB. Acquisire sequenze dinamiche in modalità B ad una velocità di acquisizione di 210 fotogrammi/s.
5. Salvare questi parametri di acquisizione come preset del sistema. Utilizzare lo stesso trasduttore, lo stesso preset, la stessa potenza di trasmissione, lo stesso range dinamico, la stessa profondità dell'immagine e la stessa larghezza dell'immagine per tutti gli animali e per tutte le sessioni di imaging, e non modificare la profondità dell'immagine tra i gruppi NC e MI.
6. All'interno della stessa vista longitudinale, posizionare la linea di campionamento M-mode a livello mid-ventricolare, perpendicolare al setto interventricolare e alla parete posteriore del ventricolo sinistro, con la finestra di campionamento che si estende su tutta la diametro anteroposteriore del ventricolo sinistro. Registrare il tracciato M-mode per l'analisi successiva.
7. Acquisire immagini in modo B in cui siano chiaramente visibili il ventricolo sinistro, l'atrio sinistro e la radice aortica, e registrare loop cine per analisi successive. Acquisire immagini corrispondenti in modo M nello stesso piano di imaging.
8. Misurare il diametro interno telediastolico del ventricolo sinistro (D_d), diametro interno telesistolico del ventricolo sinistro (Ds) e spessore del setto interventricolare dalle immagini acquisite. Acquisire cinque cicli cardiaci consecutivi e riportare i valori medi.
   NOTA: Calcolare automaticamente il volume telediastolico del ventricolo sinistro (LVEDV) e il volume telesistolico del ventricolo sinistro (LVESV) mediante il software di imaging. Calcolare la frazione di accorciamento (FS) come FS = (D_d − D_s) / D_d × 100% e frazione di eiezione (FE) come FE = (VTDV − VTSV) / VTDV × 100%.

8. Raccolta dei tessuti, colorazione istologica e ELISA

1. Prelevamento del tessuto
   1. Al giorno 7 dopo l'induzione dell'infarto miocardico (MI), eseguire un'ecocardiografia su ciascun topo. Anestetizzare il topo con isoflurano al 4%, raccogliere circa 1,5 mL di sangue mediante emorragia retro-orbitale, eutanasizzare il topo mediante dislocazione cervicale ed escindere il cuore.
   2. Lasciare coagulare i campioni di sangue durante la notte a 4°C. Centrifugare i campioni a 2000 × g per 10 min a 4°C, raccogliere il siero e conservarlo a −80°C fino all'analisi.
2. Saggio immunoenzimatico (ELISA)
   1. Quantificare il peptide natriuretico di tipo B (BNP), l'interleuchina-1β (IL-1β), il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e il fattore nucleare-κB p65 (NF-κB p65) nel siero mediante kit per saggio immunoenzimatico (ELISA).
      1. Portare tutti i reagenti e i campioni di siero a temperatura ambiente e preparare le soluzioni di lavoro seguendo le istruzioni del kit. Diluire i campioni di siero 1:5 in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), ovvero un volume di siero più quattro volumi di PBS.
      2. Aggiungere 50 μL di standard, PBS e campioni di siero diluiti rispettivamente nei pozzetti standard, zero e campione, lasciando vuoto il pozzetto bianco. Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevamento coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in tutti i pozzetti tranne il bianco, sigillare la piastra e incubare a 37°C per 60 min al buio.
      3. Svuotare il contenuto di ogni pozzetto e lavare la piastra cinque volte con tampone di lavaggio, lasciando il tampone in ciascun pozzetto per 20 s durante ogni ciclo di lavaggio. Asciugare la piastra tamponandola su carta senza lanugine.
      4. Aggiungere 100 μL di substrato appena preparato (soluzioni A e B miscelate in rapporto volumetrico 1:1) in ogni pozzetto. Incubare la piastra sigillata a 37°C per 15 min al buio, aggiungere 50 μL di soluzione di arresto e misurare la densità ottica a 450 nm.
   2. Sottrarre la densità ottica del bianco da ciascuna misurazione e generare una curva standard utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri (4PL). Calcolare la concentrazione di ciascun campione a partire dalla curva interpolata, moltiplicare il valore per il fattore di diluizione di 5 e riportare il valore medio ottenuto dai pozzetti in duplicato.
3. Processamento, inclusione e sezionamento del tessuto
   1. Risciacquare brevemente ciascun cuore escisso in soluzione salina tamponata al fosfato fredda per rimuovere il sangue residuo. Fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% per almeno 24 h a temperatura ambiente.
   2. Tagliare ciascun cuore per esporre una superficie trasversale piatta e posizionarlo in una cassetta per tessuti etichettata. Disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo a gradazione crescente (etanolo al 75% per 4 h, etanolo all'85% per 2 h, etanolo al 90% per 2 h, etanolo al 95% per 1 h e due passaggi di etanolo assoluto per 30 min ciascuno). Trasferire il tessuto attraverso una miscela etanolo–xilene per 5–10 min, chiarificarlo in due passaggi di xilene per 10 min ciascuno e infiltrarlo con tre passaggi di paraffina fusa per 1 h ciascuno.
   3. Includere ciascun cuore con l'asse corto rivolto verso la superficie del blocco. Tagliare sezioni seriali di 3 μm a livello medio-papillare, far galleggiare le sezioni su un bagno d'acqua a 40°C, montarle su vetrini e asciugarle a 60°C.
   4. Deparaffinizzare le sezioni in due passaggi di xilene (15 min ciascuno), seguiti da tre passaggi di etanolo assoluto (5 min ciascuno), etanolo al 75% (5 min) e acqua di osmosi inversa (RO) (5 min).
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è un probabile cancerogeno e un irritante respiratorio e cutaneo, mentre il xilene è infiammabile e neurotossico. Manipolare questi reagenti in una cappa chimica indossando guanti medici asettici, camice da laboratorio e protezione oculare, e smaltire i rifiuti secondo le procedure istituzionali per rifiuti pericolosi. L'etanolo e l'n-butanolo sono infiammabili; mantenerli lontani da fonti di accensione.
4. Colorazione istologica
   1. Colorazione con ematossilina ed eosina
      1. Immergere le sezioni deparaffinizzate e reidratate in ematossilina per 3–5 min. Risciacquare le sezioni in acqua.
      2. Differenziare le sezioni in alcol acido all'1% e risciacquarle in acqua. Bluare le sezioni in ammoniaca acquosa allo 0,5% e risciacquarle nuovamente.
      3. Trasferire le sezioni sequenzialmente in etanolo all'85%, etanolo al 95% ed etanolo assoluto per 5 min ciascuno. Controcolorare le sezioni in eosina per 3–5 min.
      4. Disidratare le sezioni in tre passaggi di etanolo assoluto per 5 min ciascuno, quindi in n-butanolo per 5 min. Chiarificare le sezioni in tre passaggi di xilene per 5 min ciascuno e montarle con resina neutra.
         NOTA: I nuclei appaiono blu, mentre il citoplasma e la matrice extracellulare appaiono rossi.
   2. Colorazione tricromica di Masson
      1. Mordentare le sezioni deparaffinizzate e reidratate in soluzione di dicromato di potassio al 2,5% durante la notte per circa 15 h a temperatura ambiente. Risciacquare le sezioni sotto acqua corrente per circa 30 s fino alla scomparsa della tinta giallastra.
      2. Colorare le sezioni in soluzione di Ponceau–fucsina acida per 6 min fino a quando il tessuto appare rosso brillante. Prolungare il tempo di colorazione se il colore risulta debole e risciacquare le sezioni sotto acqua corrente fino a quando l'effluente diventa incolore.
      3. Drenare l'acqua in eccesso senza far asciugare le sezioni. Differenziare le sezioni in acido fosfomolibdico acquoso per 1–2 min fino a quando il collagene appare pallido e le fibre muscolari rimangono rosse.
      4. Trasferire direttamente le sezioni in soluzione di blu di anilina senza risciacquo. Incubare le sezioni per 6–30 s.
      5. Differenziare le sezioni in tre a cinque passaggi di acido acetico all'1% per circa 8 s ciascuno. Disidratarle rapidamente in tre passaggi di etanolo assoluto per circa 3, 5 e 5 s rispettivamente.
      6. Chiarificare le sezioni in n-butanolo per 5 min e successivamente in xilene per 5 min. Montare le sezioni con resina neutra.
         NOTA: Le fibre collagene appaiono blu, mentre le fibre muscolari, il fibrina e gli eritrociti appaiono rossi.
   3. Colorazione con Rosso di Sirius
      1. Incubare le sezioni deparaffinizzate e reidratate in soluzione A di Rosso di Sirius in forno a 65°C per 30 min. Lavare le sezioni sotto acqua corrente fino alla scomparsa della tinta giallastra.
      2. Asciugare delicatamente il liquido in eccesso e immergere le sezioni in soluzione B di Rosso di Sirius per 2 min. Lavare brevemente le sezioni e asciugare il liquido in eccesso.
      3. Immergere le sezioni in soluzione C di Rosso di Sirius per 30 min. Risciacquarle brevemente per 1–2 s.
      4. Disidratare le sezioni in tre passaggi di etanolo assoluto per circa 3 s ciascuno. Chiarificarle in tre passaggi di xilene per 5 min ciascuno e montarle con resina neutra.
         NOTA: Sotto illuminazione a campo chiaro, le fibre collagene appaiono rosse su uno sfondo giallo.
5. Acquisizione e quantificazione delle immagini
   1. Acquisire tutte le immagini istologiche utilizzando uno scanner digitale di vetrini. Utilizzare impostazioni identiche di illuminazione, bilanciamento del bianco, esposizione e ingrandimento per tutte le sezioni di tutti i gruppi e includere una barra di scala di calibrazione in ogni immagine.
   2. Calibrare la scala spaziale prima dell'analisi delle immagini. Caricare un'immagine di riferimento contenente la barra di scala acquisita alla stessa risoluzione e dimensione in pixel delle immagini dello studio. Sotto Misura > Calibrazione > Imposta sistema, creare una nuova calibrazione spaziale, impostare l'unità su μm, definire la conversione pixel-micrometro allineando i punti di calibrazione con la barra di scala, salvare la calibrazione e applicarla a tutte le immagini.
   3. Caricare una sezione colorata con tricromica di Masson e delineare il ventricolo sinistro utilizzando lo strumento di area di interesse (AOI) irregolare. Escludere la cavità ventricolare, il ventricolo destro e gli artefatti di processamento del tessuto, quindi registrare l'area totale del ventricolo sinistro.
   4. Aprire Misura > Conta/Dimensiona e selezionare Seleziona colori per aprire la finestra di segmentazione. Scegliere la segmentazione basata sul cubo del colore e impostare i parametri come segue: sensibilità = 4, espansione della selezione di 1 indice di colore, dimensione minima del colore = 1 pixel e dimensione del kernel = 3 × 3. Applicare le stesse impostazioni di segmentazione a tutte le sezioni.
   5. Selezionare i pixel positivi al collagene di colore blu utilizzando lo strumento contagocce come punti iniziali. Campionare solo aree chiaramente positive al collagene, generare un'anteprima dell'immagine e verificare che la maschera includa le aree positive al collagene escludendo il miocardio colorato di rosso, la cavità ventricolare e lo sfondo. Regolare i punti iniziali se necessario prima di applicare la maschera.
      NOTA: Rieffettuare la selezione dei pixel iniziali per ciascuna sezione per tenere conto di piccole differenze di intensità di colorazione tra le sezioni. Mantenere identici i parametri di segmentazione (sensibilità, grado di espansione, dimensione minima del colore e dimensione del kernel) per tutte le immagini e accettare la segmentazione solo quando l'anteprima dimostra una copertura completa delle aree positive al collagene con esclusione delle strutture non collagene.
   6. Applicare la maschera di segmentazione e chiudere la finestra. Sotto Misura > Seleziona misurazioni, selezionare Area, fare clic su Conta, aprire Visualizza > Statistiche e registrare l'area positiva al collagene sommata.
   7. Calcolare la frazione volumetrica del collagene (CVF) dividendo l'area positiva al collagene per l'area totale del ventricolo sinistro ed esprimere il risultato come percentuale.

9. Trasparenza del tessuto e imaging tridimensionale dell'arteria coronaria

1. Etichettatura fluorescente della vascolarizzazione coronarica
   1. Iniettare 200 µL di soluzione al 2% di blu di Evans nella vena caudale laterale per etichettare la vascolarizzazione coronarica. Restituire il topo alla gabbia per 60 minuti per consentire la circolazione sistemica del colorante.
   2. Posizionare il topo nella camera di induzione (16 × 10 × 11 cm) collegata alla macchina per anestesia e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano. Eutanasia il topo mediante dislocazione cervicale, aprire la cavità toracica, escindere il cuore integro, risciacquarlo in PBS e fissarlo in paraformaldeide al 4% (PFA) per 24 ore a 4°C.
      ATTENZIONE: La PFA è un probabile cancerogeno e un irritante respiratorio e cutaneo. Manipolare la PFA in una cappa chimica indossando guanti medici asettici, camice da laboratorio e protezione oculare, e smaltire i rifiuti secondo le procedure istituzionali per rifiuti pericolosi.
   3. Preparare una soluzione al 3% di agarosio in acqua RO e incorporare il cuore fissato con il sito di legatura opportunamente orientato per l'acquisizione di immagini. Iniettare 1 µL di soluzione DAPI in ciascuno di otto siti intorno all'area di legatura utilizzando una siringa microlitrica e incubare il campione a temperatura ambiente per 2 giorni.
2. Chiarificazione del tessuto
   1. Eseguire la chiarificazione del tessuto utilizzando un kit per la chiarificazione tissutale FDISCO (imaging tridimensionale di organi chiarificati con solvente con elevata capacità di preservazione della fluorescenza) seguendo le istruzioni del produttore. Il kit comprende sei reagenti (A–F): i reagenti A, B, C, D ed E contengono rispettivamente il 50%, 70%, 80%, 100% e 100% di tetraidrofurano (THF) in acqua, mentre il reagente F è eter dibenzilico.
      ATTENZIONE: Il THF è altamente infiammabile, forma perossidi esplosivi durante lo stoccaggio ed è un irritante respiratorio e cutaneo. L'eter dibenzilico è un irritante per la pelle e per gli occhi. Manipolare tutti i reagenti in una cappa chimica indossando idonei dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti medici asettici, camice da laboratorio e protezione oculare. Smaltire i rifiuti secondo le procedure istituzionali per rifiuti pericolosi.
   2. Incubare ciascun cuore in sequenza nei reagenti A, B, C, D ed E per 6 ore per ciascun reagente. Utilizzare 10 mL di ciascun reagente per cuore, corrispondente a un rapporto minimo volume campione/volume reagente di 1:5.
   3. Trasferire il campione nel reagente F e continuare l'incubazione fino a quando il tessuto diventa otticamente trasparente, tipicamente per circa 1 ora.
   4. Eseguire tutti i passaggi di chiarificazione a 6°C–8°C con agitazione delicata. Posizionare il campione in un contenitore di vetro avvolto in alluminio e proteggerlo dalla luce per tutta la durata della procedura per preservare la fluorescenza.
3. Imaging a foglio luminoso con fluorescenza
   1. Montare il campione chiarificato sul supporto del campione. Utilizzare un microscopio a foglio luminoso con obiettivo 4× (apertura numerica = 0,28; distanza di lavoro = 20,0 mm).
   2. Immergere il campione montato in eter dibenzilico all'interno della camera di imaging. Illuminare il campione da entrambi i lati ed eccitare in sequenza il DAPI a 405 nm e il blu di Evans a 647 nm.
   3. Impostare i parametri di acquisizione come segue: per il canale a 405 nm, utilizzare un'intensità laser di 3.000 unità arbitrarie e un tempo di esposizione di 30 ms; per il canale a 647 nm, utilizzare un'intensità laser di 4.000 unità arbitrarie e un tempo di esposizione di 30 ms. Acquisire tutte le immagini con un passo z di 6 μm e una risoluzione dell'immagine di 1.024 × 1.024 pixel.
   4. Impostare la modalità di acquisizione della telecamera su XYCZT, in cui vengono acquisite prima le immagini laterali (XY), seguite dall'acquisizione sequenziale dei canali (C), dallo spostamento assiale (Z) e dall'acquisizione dei punti temporali (T), come configurato dal software di imaging.
4. Elaborazione dei dati di imaging e ricostruzione tridimensionale
   1. Assemblare i file immagine TIFF grezzi utilizzando il software di elaborazione immagini fornito con il microscopio. Convertire i file assemblati in formato IMS selezionando File > Converti in Imaris.
   2. Importare i file IMS convertiti nel software di analisi tridimensionale. Generare ricostruzioni volume-renderizzate utilizzando le impostazioni di rendering predefinite ed esportare immagini rappresentative utilizzando il modulo Snapshot.
      NOTA: Le ricostruzioni tridimensionali sono generate utilizzando la pipeline di rendering predefinita del software senza modifiche. Non viene applicata alcuna segmentazione dell'immagine, sogliatura, riduzione del rumore, sottrazione dello sfondo o altro pre-elaborazione. Le immagini ricostruite sono utilizzate per la visualizzazione qualitativa della vascolarizzazione coronarica e non sono destinate ad analisi quantitative.

10. Analisi Statistica

1. Esprimere tutti i dati come media ± errore standard della media (SEM). Eseguire le analisi statistiche utilizzando il software GraphPad Prism (versione 5.0).
2. Definire l'unità sperimentale come l'animale singolo. Analizzare n = 8 topi per gruppo per tutti gli endpoint funzionali, dei biomarcatori e istomorfometrici.
3. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati utilizzando identificatori di campione codificati, mantenendo l'oscuramento dell'investigatore rispetto all'assegnazione ai gruppi. Rivelare le assegnazioni ai gruppi solo al termine di tutte le analisi quantitative.
4. Valutare la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità delle varianze utilizzando il test di Levene in GraphPad Prism (versione 5.0) prima di selezionare il test statistico appropriato.
5. Confrontare due gruppi utilizzando un test t di Student non appaiato a due code t-test quando sono soddisfatte le assunzioni di normalità e di varianza omogenea. In caso contrario, eseguire un test di Mann-Whitney U test.
6. Considerare P < 0,05 statisticamente significativo. Indicare la significatività statistica come P < 0,05, P < 0,01 e P < 0.001.

Risultati

L'AIS ha funto da repère anatomico per la localizzazione dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD) e per l'identificazione del sito di legatura (Figura 1A–C). Dopo aver identificato l'AIS, il flusso chirurgico sequenziale per l'induzione dell'infarto miocardico (MI), comprendente toracotomia, esposizione del cuore, legatura della LAD, chiusura toracica e recupero postoperatorio, è stato eseguito come illustrato in Figura 2A–L. Il protocollo semplificato ha permesso un'induzione rapida e riproducibile dell'infarto miocardico nei topi. Questo protocollo richiede un periodo prolungato di addestramento pratico prima di poter essere eseguito in modo affidabile; l'intubazione tracheale e la legatura guidata dall'AIS sono i due passaggi con la curva di apprendimento più ripida. Durante le prime fasi dell'addestramento, la mortalità perioperatoria entro i primi 7 giorni postoperatori può raggiungere il 50% o più, e il tasso di successo nell'induzione del modello può scendere al 30% o inferiore. Una volta acquisite queste tecniche, il tasso di successo chirurgico supera costantemente il 90%. Nello studio attuale, non si sono verificati decessi perioperatori nei primi 7 giorni postoperatori. Tutte le procedure di addestramento sono state eseguite secondo lo stesso protocollo istituzionale approvato per l'uso degli animali.

Dopo la legatura della LAD, sono state osservate alterazioni elettrocardiografiche caratteristiche, tra cui un marcato approfondimento dell'onda Q, un'elevazione del segmento ST con morfologia convessa verso l'alto, un accentuato appuntimento dell'onda T (che tipicamente evolve in inversione dell'onda T durante la fase subacuta), un aumento della voltaggio del complesso QRS con ampiezza allargata e una pronunciata tachicardia (Figura 3A). L'esame macroscopico ha evidenziato un'area di pallore miocardico localizzato e una dilatazione ventricolare distale al sito di legatura nel gruppo con infarto miocardico (MI) rispetto al gruppo di controllo (NC) (Figura 3B). L'esame istopatologico ha mostrato fibre miocardiche disorganizzate, spazi intercellulari allargati, infiltrazione di cellule infiammatorie, deposito di collagene e alterazioni strutturali del miocardio nel gruppo MI, come dimostrato dalle colorazioni con ematossilina-eosina (H&E), tricromica di Masson e rosso di Sirius (Figura 3C). L'analisi quantitativa delle sezioni colorate con la tricromica di Masson ha evidenziato una frazione volumica collagena (CVF) significativamente maggiore nel gruppo MI rispetto al gruppo NC (18,24% ± 1,67% contro 0,05% ± 0,01%; P < 0,001; Figura 3D).

Figura 3: Cambiamenti elettrocardiografici, anatomici macroscopici e istopatologici dopo la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore nei topi. (A) Elettrocardiogrammi (ECG) rappresentativi registrati immediatamente dopo l'intervento chirurgico nei gruppi di controllo normale (NC) e di infarto miocardico (MI). (B) Immagini macroscopiche rappresentative di cuori provenienti dai gruppi NC e MI. Le barre della scala = 1 mm. (C) Sezioni trasversali cardiache rappresentative dei gruppi NC e MI colorate con ematossilina ed eosina (H&E; sinistra), tricromia di Masson (centro) e Rosso di Sirius (destra). Nelle sezioni colorate con la tricromia di Masson, il collagene appare blu e il miocardio rosso; nelle sezioni colorate con il Rosso di Sirius, il collagene appare rosso su uno sfondo giallo. Le barre della scala = 1.000 µm. (D) Frazione volumetrica del collagene (CVF), calcolata come area positiva al collagene divisa per l'area totale del ventricolo sinistro ed espressa in percentuale, nei gruppi NC e MI. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM); n = 8 topi per gruppo. La significatività statistica rispetto al gruppo NC è indicata con **P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il deterioramento della funzione cardiaca è stato confermato mediante ecocardiografia. Le immagini rappresentative in modo M hanno mostrato una ridotta contrattilità del ventricolo sinistro nel gruppo con infarto miocardico (MI) (Figura 4A). L'analisi quantitativa ha evidenziato una frazione di eiezione (EF) e una frazione di accorciamento (FS) del ventricolo sinistro significativamente ridotte nel gruppo MI rispetto al gruppo di controllo normale (NC) (Figura 4B,C). L'ELISA ha mostrato concentrazioni sieriche significativamente aumentate di BNP, TNF-α, NF-κB p65 e IL-1β nel gruppo MI (Figura 4D–G), in accordo con un deterioramento della funzione cardiaca e una risposta infiammatoria.

Figura 4: Modifiche della funzione cardiaca e livelli sierici di biomarcatori dopo la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra. (A) Immagini ecocardiografiche rappresentative in modo M dai gruppi di controllo normale (NC) e di infarto miocardico (MI). (B) Frazione di eiezione del ventricolo sinistro (EF). (C) Accorciamento frazionale del ventricolo sinistro (FS). (D–G) Concentrazioni sieriche di (D) peptide natriuretico di tipo B (BNP), (E) fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), (F) fattore nucleare-κB p65 (NF-κB p65) e (G) interleuchina-1β (IL-1β), misurate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). L'EF e la FS sono espresse in percentuale; BNP, TNF-α e IL-1β in pg/mL; NF-κB p65 in ng/mL. I dati sono riportati come media ± errore standard della media (SEM); n = 8 topi per gruppo. La significatività statistica rispetto al gruppo NC è indicata con *P < 0,01 e **P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'imaging tridimensionale con fluorescenza di cuori resi trasparenti ha dimostrato il decorso della discendente anteriore sinistra (LAD) al di sotto dell'arteria interventricolare superiore (AIS) e ha mostrato che la legatura nel sito definito anatomicamente produce un'occlusione coronarica (Figura 5A–F). Nel complesso, questi risultati dimostrano l'induzione con successo di un fenotipo di infarto miocardico (MI) in questa serie iniziale di otto animali per gruppo, caratterizzato da disfunzione del ventricolo sinistro, fibrosi miocardica e infiammazione sistemica. Lo studio attuale è stato progettato per stabilire e dimostrare la fattibilità del modello di infarto miocardico guidato dall'AIS, piuttosto che fornire una validazione esaustiva della dimensione del campione, della stabilità a lungo termine del modello o della concordanza anatomica tra l'AIS e la LAD. Di conseguenza, questi aspetti sono riconosciuti come limitazioni dello studio attuale e vengono discussi nella sezione Discussione. In particolare, le valutazioni funzionali e biochimiche si sono limitate alla fase acuta successiva all'infarto miocardico, e la relazione tra l'AIS e la LAD è stata dimostrata in maniera qualitativa ma non è ancora stata quantificata in una coorte sufficientemente ampia.

Figura 5: Imaging a fluorescenza tridimensionale della vascolarizzazione coronarica murina trasparentizzata. Cuori interi trasparentizzati sono stati marcati con Blu di Evans per visualizzare la vascolarizzazione coronarica e con 4′,6-diammidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare i nuclei, seguiti da imaging a foglio luminoso a fluorescenza e ricostruzione tridimensionale. (A–C) Ricostruzioni di cuori interi che mostrano il canale (A) DAPI, il canale (B) Blu di Evans e i canali sovrapposti (C). Barre della scala = 1.000 µm. (D–F) Viste ingrandite della regione vascolare coronarica che mostrano il canale (D) DAPI, il canale (E) Blu di Evans e i canali sovrapposti (F). Barre della scala = 400 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Non tutte le procedure producono un modello ottimale, e il riconoscimento di esiti subottimali è fondamentale per la risoluzione dei problemi. Una legatura posizionata troppo in prossimità o il passaggio dell'ago troppo in profondità possono causare un infarto eccessivamente esteso, accompagnato da insufficienza cardiaca grave, aritmia o rottura ventricolare, con conseguente mortalità precoce. Al contrario, una legatura posizionata troppo in distanza o troppo superficialmente può provocare un infarto di piccole dimensioni o non indurre affatto l'infarto. L'induzione di un modello di successo deve pertanto essere valutata mediante criteri multipli. Durante l'intervento chirurgico, lo sbiancamento del miocardio a valle del sito di legatura fornisce un indicatore immediato di occlusione coronarica, anche se questo reperto potrebbe non essere sempre facilmente visibile. L'ecocardiografia postoperatoria e l'esame istopatologico forniscono ulteriore conferma dell'avvenuta realizzazione del modello. Supplementary Figure 1 mostra un modello non riuscito rappresentativo, in cui l'esame istopatologico non evidenzia infiltrazione di cellule infiammatorie né fibrosi.

Figura supplementare 1. Risultati istologici rappresentativi di un modello di infarto miocardico non riuscito. Sezioni trasversali rappresentative del cuore di un topo in cui l'induzione dell'infarto miocardico non è riuscita, colorate con (A) ematossilina ed eosina (H&E), (B) tricromia di Masson e (C) rosso di Sirius. Rispetto a un'induzione riuscita di infarto miocardico, queste sezioni non mostrano infiltrazione di cellule infiammatorie né rimodellamento fibrotico nel miocardio del ventricolo sinistro, coerentemente con un'occlusione non riuscita dell'arteria coronaria. Le barre della scala = 1.000 µm.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Negli ultimi anni, i modelli clinici e sperimentali di infarto miocardico (MI) sono diventati sempre più importanti nella ricerca cardiovascolare, tuttavia molti interrogativi riguardo la patogenesi del MI e le strategie per il suo trattamento rimangono irrisolti. Questo articolo descrive un metodo perfezionato per stabilire un modello murino di MI, nel quale diversi passaggi procedurali critici richiedono particolare attenzione. Il primo passaggio critico è l'intubazione tracheale. Alcuni protocolli precedenti stabiliscono la via aerea mediante tracheotomia, che richiede l'incisione della cute cervicale e la dissezione dei tessuti per esporre la trachea prima dell'intubazione¹³; altri mantengono l'intubazione orotracheale ma raccomandano un'incisione mediana cervicale per migliorare la visualizzazione durante la procedura¹⁴. In contrasto con entrambi questi approcci, il presente protocollo utilizza un laringoscopio per illuminare l'orofaringe ed esegue l'intubazione orotracheale sotto diretta visualizzazione della glottide senza effettuare un'incisione cervicale. Sebbene questo approccio richieda maggiori competenze tecniche da parte dell'operatore, evita il trauma dei tessuti cervicali, riduce il rischio di infezione e di dolore postoperatorio e abbrevia il tempo operatorio. L'errore più comune durante l'intubazione è il posizionamento accidentale nell'esofago. Se il torace non si solleva durante la ventilazione e il tubo endotracheale non mostra condensa durante l'espirazione, ritirare immediatamente il tubo e ripetere l'intubazione. Collegare il ventilatore solo dopo aver confermato un movimento simmetrico bilaterale della parete toracica.

Il secondo passaggio, e più critico, consiste nell'identificazione dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD) e nel posizionamento accurato del legame. I metodi convenzionali presentano diverse difficoltà a questo stadio. La frequenza cardiaca a riposo del topo è di circa 500–600 battiti/min, e la LAD si trova adiacente a diverse vene coronariche accompagnatorie, rendendo intrinsecamente difficile l'identificazione in tempo reale dell'arteria durante l'intervento. Inoltre, anche in condizioni ottimali, una percentuale significativa di LAD non può essere chiaramente visualizzata al microscopio stereoscopico¹⁵. In questo contesto, protocolli precedenti che stimano il sito di legatura come un punto 1–2 mm al di sotto dell'appendice atriale sinistra sono limitati dall'identificazione intraoperatoria non costante di questo riferimento anatomico^12,14, mentre il complesso schema di ramificazione dell'arteria coronaria sinistra può ulteriormente compromettere la riproducibilità¹⁶. Per affrontare queste difficoltà, il presente protocollo utilizza l'incisura interventricolare anteriore (AIS) come punto di riferimento anatomico per posizionare il legame. Al microscopio stereoscopico, l'AIS appare come un solco superficiale sulla superficie ventrale del cuore, con la LAD che scorre immediatamente al di sotto. Fornisce quindi un riferimento anatomico relativamente stabile, meno dipendente dall'esperienza dell'operatore. Il posizionamento del legame nel terzo superiore dell'AIS offre un bersaglio anatomico costante per l'occlusione coronarica. I risultati rappresentativi dimostrano che questo approccio ha prodotto con successo il fenotipo atteso di infarto miocardico acuto negli animali esaminati.

Il reperto dell'AIS non è affidabile in tutte le circostanze. Quando l'esposizione toracica è limitata o un sanguinamento epicardico offusca la superficie cardiaca rendendo difficile identificare l'AIS, pulire delicatamente il campo operatorio con un bastoncino di cotone inumidito con soluzione salina e rivalutare il solco prima della legatura. Se l'AIS non può ancora essere identificato con sicurezza, identificare direttamente la LAD come descritto nel protocollo ed eseguire la legatura sotto visione diretta, anziché basarsi sull'AIS. Se necessario, confermare lo spazio intercostale corretto contando in senso caudale dalla prima costola per garantire un'esposizione adeguata dell'appendice atriale sinistro e della parete anteriore del ventricolo sinistro.

Tra le complicanze postoperatorie, il pneumotorace è la più comune e si manifesta tipicamente con distress respiratorio dopo l'estubazione. La chiave per prevenire il pneumotorace è l'evacuazione completa dell'aria residua dalla cavità toracica prima della chiusura dello spazio intercostale. Se si sospetta un pneumotorace, riindurre brevemente l'anestesia e ventilare il topo, riaprire i punti di sutura cutanei e ispezionare la chiusura intercostale. Se vengono identificati uno o più siti di chiusura incompleta, posizionare ulteriori punti di sutura nel sito della perdita d'aria prima di ripetere la procedura di estubazione. Un'altra complicanza potenziale è il sanguinamento intraoperatorio, che si verifica più comunemente quando l'ago perfora un piccolo vaso epicardico o una vena coronarica adiacente durante la legatura. Il sanguinamento è generalmente limitato e di solito può essere controllato applicando una leggera pressione con un bastoncino di cotone inumidito con soluzione salina per alcuni secondi. Prima di chiudere la cavità toracica, verificare che non sussista alcun sanguinamento attivo nel campo operatorio per ridurre al minimo le complicanze postoperatorie. Inoltre, i topi possono sviluppare aritmie, tra cui contrazioni ventricolari premature o fibrillazione ventricolare transitoria, durante o immediatamente dopo la procedura. Queste aritmie spesso si attenuano mantenendo la temperatura corporea, stabilizzando la profondità dell'anestesia e sospendendo temporaneamente la procedura per consentire il recupero spontaneo del ritmo cardiaco. Infine, le complicanze anestetiche derivano più comunemente dal mancato rapido ridimensionamento della concentrazione di isoflurano dopo un'intubazione tracheale riuscita. Ridurre immediatamente la concentrazione di isoflurano al livello di mantenimento dopo aver collegato il tubo endotracheale al ventilatore e monitorare continuamente la respirazione e la frequenza cardiaca per tutta la durata della procedura.

Complessivamente, questo metodo richiede una notevole abilità microchirurgica e, come altri modelli di legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD), rimane soggetto a variabilità derivanti dalle differenze anatomiche coronariche e dall'esperienza dell'operatore. Tuttavia, con un adeguato addestramento e una tecnica chirurgica costante, i ricercatori possono stabilire il modello di infarto miocardico con ragionevole coerenza, migliorando al contempo la riproducibilità della procedura e la sopravvivenza postoperatoria.

È necessario riconoscere diversi limiti di questo metodo. In primo luogo, le valutazioni funzionali e biochimiche sono state completate entro una settimana dall'induzione dell'infarto miocardico e riflettono quindi solo la fase acuta dell'infarto, senza una valutazione sistematica degli esiti a lungo termine come il rimodellamento ventricolare a 4–8 settimane dal intervento chirurgico. In secondo luogo, come in altri modelli di infarto miocardico con legatura permanente che utilizzano suture non riassorbibili, questo protocollo potrebbe causare aderenze pericardiche croniche. Questo rappresenta una caratteristica intrinseca del modello con legatura piuttosto che un limite specifico dell'approccio guidato dall'AIS. Tuttavia, la gravità di queste aderenze e i loro effetti sulla funzione cardiaca a lungo termine non sono stati quantificati nel presente studio. Studi futuri potrebbero indagare l'uso di suture riassorbibili e valutarne gli effetti sulla formazione di aderenze e sulle prestazioni del modello. In terzo luogo, sebbene l'imaging coronarico tridimensionale abbia dimostrato qualitativamente che l'arteria discendente anteriore decorre al di sotto dell'AIS, la concordanza anatomica tra queste strutture non è stata ancora quantificata in una coorte sufficientemente ampia. In quarto luogo, questo studio ha incluso esclusivamente topi maschi C57BL/6J. Sebbene si preveda che l'AIS rappresenti un repere anatomico costante, la sua applicabilità in topi femmina, in altre linee di topi e in altre specie richiede ulteriore validazione. Infine, i potenziali vantaggi di questo protocollo in termini di coerenza del sito di legatura e riproducibilità procedurale si basano sull'esperienza di un singolo laboratorio e non sono stati valutati mediante confronto diretto con i metodi convenzionali di legatura dell'arteria discendente anteriore o tra diversi operatori e istituzioni. Saranno pertanto necessari ulteriori studi di validazione per stabilire la generalizzabilità più ampia del metodo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina sterile allo 0,9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	-	Ricostituzione della cefazolina
Agarosio al 3%	Sigma-Aldrich	A0169	Inclusione del campione
Paraformaldeide al 4%	Sigma-Aldrich	158127	Fissazione del tessuto
Etilene alcol assoluto	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Disidratazione del tessuto; infiammabile
Fucsina acida	Aladdin	A104916-100g	Preparazione della soluzione di Ponceau–fucsina acida per la colorazione tricromatica di Masson
Software AcqKnowledge	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Acquisizione e analisi dell'elettrocardiogramma
Soluzione di ammoniaca, acquosa allo 0,5%	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Bluing durante la colorazione ematossilina-eosina
Blu di anilina, solubile in acido	Aladdin	A111200-100g	Preparazione della soluzione di blu di anilina per la colorazione tricromatica di Masson
Guanti medici sterili	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	-	Protezione chimica e biologica
Buprenorfina	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Analgesia postoperatoria
Cefazolina sodica per iniezione	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	-	Profilassi antibiotica perioperatoria
Tamponi di cotone	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	-	Asciugatura epicardica e preparazione asettica
Soluzione colorante DAPI	Thermo Fisher	D1306	Etichettatura nucleare
Crema depilatoria	Veet	-	Rimozione dei peli toracici
Scanner digitale per vetrini	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Acquisizione di immagini a tutto vetrino
Amplificatore ECG	BIOPAC Systems	ECG100C	Amplificazione dell'elettrocardiogramma
Sistema di registrazione dell'elettrocardiogramma	BIOPAC Systems	MP160	Registrazione dell'elettrocardiogramma
Kit ELISA, peptido natriuretico di tipo B murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Quantificazione sierica di BNP
Kit ELISA, interleuchina-1β murina	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	Quantificazione sierica di IL-1β
Kit ELISA, fattore nucleare-κB p65 murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Quantificazione sierica di NF-κB p65
Kit ELISA, fattore di necrosi tumorale-α murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	Quantificazione sierica di TNF-α
Cassette per inclusione	Jiangsu Shitai	22022	Inclusione del tessuto
Catetere endotracheale, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Intubazione orale; diametro esterno circa 0,9–1,0 mm; tagliato a circa 15 mm prima dell'uso
Eosina Y, solubile in alcol	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Contrastazione citoplasmatica durante la colorazione ematossilina-eosina
Blu di Evans	Jarvisbio	A312001	Etichettatura della vascolarizzazione coronarica
Pinzette fini	RWD Life Science	F12011-10	Manipolazione del tessuto e apertura del pericardio
Pinzette fini microchirurgiche	RWD Life Science	FC12002T-08	Manipolazione microchirurgica del tessuto
Forbici fini	RWD Life Science	S12000-09	Forbici oftalmiche per incisione cutanea e dissezione
Acido acetico glaciale	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	-	Preparazione di acido acetico all'1% per la differenziazione nella colorazione tricromatica di Masson
Vetrini in vetro	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montaggio delle sezioni
Sterilizzatore a perle di vetro	RWD Life Science	RS3002	Sterilizzazione degli strumenti tra animali
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 5.0	Analisi statistica
Pad riscaldante	RWD Life Science	69020	Termoregolazione postoperatoria
Soluzione colorante ematossilina	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Colorazione nucleare durante la colorazione ematossilina-eosina
Anticorpo di rilevamento coniugato con perossidasi di rafano	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nei kit ELISA	Rilevamento ELISA
Acido cloridrico	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Preparazione dell'alcol acido per la differenziazione dell'ematossilina
Software Image-Pro Plus	Media Cybernetics	Versione 6.0	Quantificazione della frazione volumetrica del collagene
Software Imaris	Bitplane	Versione 7.2.3	Ricostruzione e analisi tridimensionale
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-10	Anestetico inalatorio
Sistema di anestesia con isoflurano	RWD Life Science	TAIJI-IE	Somministrazione di isoflurano
Laringoscopio per piccoli animali	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Visualizzazione diretta durante l'intubazione
Microscopio a foglio luminoso a fluorescenza	Light Innovation Technology	LiToneXL	Imaging tridimensionale a fluorescenza
Software LitScan	Light Innovation Technology	Versione 3.31	Composizione e conversione delle immagini
Ventilatore meccanico	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	ventilazione meccanica; 130 respiri/min; volume corrente 2 mL
Emostato micro-mosquito	RWD Life Science	FC21001R-12	Trattenimento dell'ago durante legatura e chiusura
Siringa microlitro	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	-	Iniezione localizzata di DAPI
Lettore di micropiastre	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Misurazione della densità ottica a 450 nm
Microscopio stereoscopico	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Visualizzazione intraoperatoria
Microscopio ottico eretto	Leica	DM500	Imaging istologico
Lame per microtomo	Epredia	MX35 ULTRA	Taglio di sezioni in paraffina
Kit di colorazione modificato con Rosso di Sirius	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Colorazione del collagene; include le soluzioni A, B e C
n-Butanolo	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Disidratazione e chiarificazione istologica; infiammabile
Resina neutra per montaggio	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montaggio dei vetrini
Sutura in nylon, 3/8 di cerchio 7-0 con ago	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra
Sutura in nylon, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Chiusura toracica e cutanea
Sutura in nylon, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Esposizione e trazione della parete toracica
Stazione per inclusione in paraffina	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Inclusione del tessuto
Paraffina	NA	NA	Infiltrazione e inclusione del tessuto
Soluzione salina tamponata al fosfato	Sigma-Aldrich	P3813	Lavaggio del tessuto e diluizione dei reagenti
Acido fosfomolibdico	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	-	Differenziazione nella colorazione tricromatica di Masson
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Preparazione della soluzione di Ponceau–fucsina acida per la colorazione tricromatica di Masson
Dicromato di potassio	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	Mordente per la colorazione tricromatica di Masson
Povidone–iodio	SingleLady	GB26368-2010	Disinfezione cutanea
Acqua da osmosi inversa	Purificata in laboratorio	Non applicabile	Preparazione delle soluzioni
Microtomo rotativo	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Taglio di sezioni in paraffina
Adattatore per supporto campioni	Light Innovation Technology	Fornito con LiToneXL	Montaggio dei campioni chiarificati per imaging a foglio luminoso
Nastro adesivo cutaneo	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	-	Fissaggio degli arti e della coda
Coprioggetti per vetrini	Jiangsu Shitai	80340-1630	Applicazione dei coprioggetti
Stufa per vetrini	Shaoxing Luyue	101-3B	Asciugatura dei vetrini
Soluzione di arresto	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inclusa nei kit ELISA	Terminazione della reazione ELISA
Soluzioni substrato A e B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluse nei kit ELISA	Sviluppo del colore in ELISA
Bacinella galleggiante per tessuti	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Galleggiamento delle sezioni
Processore tessuti	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Processamento automatico dei tessuti
Kit per chiarificazione dei tessuti, reagenti A–F	Jarvisbio	JA11012	Chiarificazione dei tessuti basata su solventi
Piattaforma per intubazione tracheale	RWD Life Science	Re20-M	Posizionamento per intubazione orale
Software di analisi ecografica	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Analisi dei dati ecocardiografici
Gel ecografico	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Coppia ecocardiografica
Sistema di imaging ecografico	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Ecocardiografia
Retrattore a forma di V per palpebre	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Retrazione intercostale e delle costole
Tampone di lavaggio	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluso nei kit ELISA	Lavaggio delle piastre ELISA
Sistema di purificazione dell'acqua	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Produzione di acqua da osmosi inversa
Xilene	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Chiarificazione del tessuto e deparaffinizzazione; infiammabile e neurotossico