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Articolo di ricerca

L'espressione sierica di miR-488-3p come biomarcatore diagnostico non invasivo nei pazienti con artrite reumatoide

58 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/72346

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28 agosto 2026

 , 
1Department of Medical Laboratory, Hefei BOE Hospital

In questo articolo

Sommario

miR-488-3p potrebbe fungere da nuovo marcatore diagnostico non invasivo per l'AR. miR-488-3p modula la funzione biologica dei sinoviociti attraverso ROCK1. Ha mostrato una significativa correlazione negativa con la gravità della malattia nei pazienti affetti da AR.

Abstract

La diagnosi dell'artrite reumatoide (RA) rimane difficile a causa dei limiti dei biomarcatori esistenti. L'obiettivo dello studio è stato indagare il potenziale di miR-488-3p nel siero come biomarcatore per la RA e chiarirne il possibile meccanismo d'azione. Lo studio ha incluso 135 pazienti con RA, 130 pazienti con artrosi (OA) e 125 controlli sani. I livelli di espressione di miR-488-3p sono stati analizzati mediante RT-qPCR. Il meccanismo d'azione è stato studiato attraverso test funzionali (CCK-8, citometria a flusso, ELISA) ed esperimenti di validazione del bersaglio (gene reporter della luciferasi, RIP). I livelli di espressione sierica di miR-488-3p erano significativamente più bassi nei pazienti con RA rispetto ai pazienti con artrosi (OA) e ai controlli sani (p < 0,001). L'analisi della curva ROC ha mostrato che miR-488-3p possiede un'elevata accuratezza diagnostica nel distinguere i pazienti con RA dai controlli sani e dai pazienti con OA. miR-488-3p ha mostrato una correlazione negativa con la velocità di eritrosedimentazione (ESR), la proteina C-reattiva (CRP), il fattore reumatoide (RF) e i punteggi DAS28. La validazione funzionale ha rivelato che l'iperespressione di miR-488-3p inibisce la proliferazione e la risposta infiammatoria dei sinoviociti, inducendo al contempo l'apoptosi. Gli studi meccanicistici hanno mostrato che miR-488-3p può bersagliare direttamente la proteina chinasi 1 associata a Rho contenente coil-coil (ROCK1), che media i suoi effetti protettivi. Il miR-488-3p nel siero rappresenta una promettente novità come marcatore diagnostico non invasivo per la RA e protegge i sinoviociti dal danno.

Introduzione

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune comune caratterizzata da infiammazione sinoviale, erosione articolare e distruzione1,2. La prevalenza globale della RA è circa dello 0,5%–1%3, il che influisce gravemente sulla qualità della vita dei pazienti e sulla loro capacità lavorativa. La malattia ha un'esordio insidioso e i sintomi iniziali sono spesso atipici, facilmente soggetti a diagnosi errata o mancata4. Progredendo, la malattia può portare a deformità articolari, perdita di funzionalità e persino aumentare il rischio di complicanze come le malattie cardiovascolari5, imponendo un onere considerevole sui pazienti, le loro famiglie e i sistemi sanitari.

Al momento, per la diagnosi dell'AR6 è necessaria una combinazione di sintomi clinici, segni fisici, esami di laboratorio e valutazioni strumentali. Gli indicatori di laboratorio comunemente utilizzati includono la velocità di eritrosedimentazione (VES) e la proteina C reattiva (PCR), che sono marcatori aspecifici di infiammazione sistemica, nonché il fattore reumatoide (FR) e gli anticorpi anti-peptide citrullinato ciclico (anti-CCP), che rappresentano importanti biomarcatori sierologici per l'AR7,8. Tuttavia, questi biomarcatori tradizionali presentano delle limitazioni: il FR può risultare positivo in alcune persone sane e in pazienti affetti da altre malattie autoimmuni (tasso di falsi positivi di circa il 5%); gli anticorpi anti-CCP, sebbene altamente specifici (>95%), hanno una sensibilità limitata nelle fasi iniziali della malattia (circa 60–70%)4,9 e alcuni pazienti con AR rimangono sieronegativi10. Pertanto, è fondamentale individuare biomarcatori più sensibili e specifici per la diagnosi precoce, il monitoraggio della malattia e la valutazione della prognosi dell'AR11.

I microRNA (miRNA) sono un gruppo di molecole di RNA regolatore non codificante endogeno di circa 22–25 basi di lunghezza12,13. È stato scoperto che i miRNA agiscono come regolatori chiave nello sviluppo di diverse malattie e che la loro espressione alterata è strettamente correlata alla patogenesi delle malattie13,14,15, rendendo i miRNA biomarcatori promettenti per la diagnosi delle malattie e il monitoraggio terapeutico. Negli ultimi anni, il ruolo dei miRNA nell'artrite reumatoide (RA) ha ricevuto un'attenzione crescente16. Studi hanno dimostrato che diversi miRNA sono associati a un'espressione disregolata (ad esempio, miR-146a, miR-155, ecc.) nel siero, nei tessuti sinoviali e nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dei pazienti con RA17,18,19. Questi miRNA contribuiscono alla patogenesi della RA regolando la produzione di citochine infiammatorie, promuovendo la proliferazione e l'invasione delle cellule sinoviali e influenzando la differenziazione degli osteoclasti20. Tra questi, miR-488 è localizzato nella regione cromosomica umana 1q25.221, e studi precedenti ne hanno confermato gli effetti neuroprotettivi: svolge un ruolo regolatorio nella progressione dei gliomi22 e dei neuroblastomi23 e, in particolare, miR-488-3p promuove l'apoptosi dei condrociti osteoartrosici nell'osteoartrite (OA)24. Sebbene OA e RA siano malattie articolari diverse, condividono meccanismi comuni nei processi patologici di infiammazione sinoviale e distruzione della cartilagine25. Abbiamo ipotizzato che miR-488-3p possa svolgere un ruolo nella RA regolando vie bersaglio simili. Tuttavia, il ruolo specifico e i meccanismi potenziali di miR-488-3p nella RA non sono ancora stati chiariti.

Lo studio ha analizzato le variazioni nei livelli di espressione sierica di miR-488-3p nei pazienti con artrite reumatoide (RA) e la loro relazione con l'attività della malattia e gli indicatori clinici, al fine di valutare il potenziale valore di questo marcatore come strumento diagnostico non invasivo per la RA. Questo studio fornisce una nuova prospettiva per lo screening precoce e la previsione dell'evoluzione della malattia nella RA, migliorando così la prognosi dei pazienti affetti da questa patologia.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Hefei BOE (numero di approvazione 2021–1) e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'arruolamento.

Pazienti e campioni

Questo studio ha reclutato 135 pazienti con AR (diagnosticata secondo i criteri di classificazione ACR/EULAR del 2010) dal Dipartimento di Reumatologia e Immunologia dell'Ospedale Hefei BOE, 130 pazienti con OA dal Dipartimento di Ortopedia (diagnosticati secondo i criteri diagnostici per l'OA dell'Associazione Medica Cinese del 2018) e 125 controlli sani abbinati per età e sesso provenienti dal centro di medicina preventiva dello stesso ospedale. I partecipanti avevano un'età compresa tra i 30 e gli 80 anni. Ai controlli sani è stato confermato l'assenza di malattie autoimmuni, disturbi articolari e infezioni acute mediante un'analisi approfondita della storia clinica, esame fisico e test di laboratorio. Sono stati esclusi i partecipanti con malattie autoimmuni concomitanti, storia di infezione o trauma nei precedenti 3 mesi, neoplasie oppure in stato di gravidanza o allattamento.

Campionamento e preparazione

È stato prelevato sangue venoso a digiuno da tutti i soggetti dello studio. Dopo coagulazione a temperatura ambiente per 30 minuti, i campioni di siero sono stati isolati mediante centrifugazione a 1500 × g per 15 minuti. Il siero è stato conservato a -80°C fino all'analisi successiva.

Rilevamento di marcatori clinici e sierologici

Per valutare in modo completo lo stato della malattia e l'attività infiammatoria, sono stati misurati biomarcatori clinici e sierologici mediante metodi standardizzati di laboratorio clinico. La VES è stata determinata con il metodo di Westergren per valutare l'infiammazione sistemica aspecifica. La PCR è stata quantificata mediante un saggio immunoturbidimetrico (valore di riferimento normale: <10 mg/L) per valutare la risposta infiammatoria di fase acuta. Il FR è stato misurato mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) con un valore di riferimento normale di ≤20 UI/mL. Gli anticorpi anti-CCP sono stati dosati mediante un ELISA di seconda generazione per fornire evidenze sierologiche a supporto della diagnosi di AR.

Linee cellulari e coltura

Le cellule di sinoviociti umani di tipo fibroblastico colpiti da AR (HFLS-RA) sono state coltivate in Dulbecco's Modified Medium (DMEM) integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e penicillina-streptomicina all'1%. Le cellule sono state mantenute in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂, e sono state utilizzate per tutti gli esperimenti cellule comprese tra il terzo e il sesto passaggio.

Estrazione dell'RNA e RT-PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto da campioni di siero utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando un kit per la sintesi del primo filamento di miRNA per i miRNA e un kit di trascrizione inversa per i geni bersaglio dell'RNA messaggero (mRNA), seguendo le istruzioni del produttore. È stata eseguita una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando un sistema di PCR in tempo reale con una miscela master PCR a base di SYBR Green. Il programma termociclico è stato impostato su una pre-denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 5 s e annealing/estensione a 60 °C per 30 s). Ogni campione è stato analizzato in triplice replicato. L'RNA nucleare piccolo U6 (U6 snRNA) e la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati utilizzati come geni di riferimento endogeni per la normalizzazione rispettivamente di miRNA e mRNA. Le sequenze dei primer sono state riassunte nella Tabella Supplementare 1. I livelli di espressione relativi di miR-488-3p e dei suoi geni bersaglio sono stati calcolati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt. Sono state inoltre analizzate le variazioni nei livelli di mRNA dei geni bersaglio dopo sovraespressione o inibizione di miR-488-3p per verificare le loro relazioni regolatorie.

Trasfezione cellulare

Le cellule HFLS-RA sono state seminate in piastre da 6 pozzetti a una densità di 5 × 105 cellule/pozzetto. Le cellule sono state trasfettate utilizzando un reagente di trasfezione basato su liposomi, seguendo le istruzioni del produttore. I gruppi di trasfezione includevano gruppi di trasfezione singola e gruppi di co-trasfezione. I gruppi di trasfezione singola erano: 1) controllo—cellule non trasfettate; 2) controllo negativo del mimic (NC)—cellule trasfettate con il controllo negativo del mimic di miR-488-3p; 3) mimic di miR-488-3p—cellule trasfettate con il mimic di miR-488-3p; 4) controllo negativo dell'inibitore (NC)—cellule trasfettate con il controllo negativo dell'inibitore di miR-488-3p; 5) inibitore di miR-488-3p—cellule trasfettate con l'inibitore di miR-488-3p. I gruppi di co-trasfezione erano: 1) mimic di miR-488-3p + controllo negativo di sovraespressione (oe-NC)—cellule co-trasfettate con il mimic di miR-488-3p e il controllo negativo dei vettori di sovraespressione di ROCK1; 2) mimic di miR-488-3p + oe-ROCK1—cellule co-trasfettate con il mimic di miR-488-3p e i vettori di sovraespressione di ROCK1. Tutte le sequenze di trasfezione sono state riassunte nella Tabella Supplementare 1. Il vettore di sovraespressione di ROCK1 è stato ottenuto clonando la regione della sequenza codificante (CDS) nel plasmide pcDNA 3.1. Le cellule trasfettate sono state utilizzate per gli esperimenti successivi dopo 48 h dalla trasfezione.

Saggio della funzione cellulare

Saggio di proliferazione cellulare (Kit per il conteggio delle cellule-8 [CCK-8]): Le cellule HFLS-RA trasfettate sono state inoculate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 5 × 103 cellule/pozzetto, con tre pozzetti replicati per gruppo. A 0, 24, 48 e 72 h dalla trasfezione, sono stati aggiunti 10 µL di soluzione CCK-8 in ciascun pozzetto, seguiti da un'incubazione a 37 °C per 2 h. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm (lunghezza d'onda di rilevamento) e a 630 nm (lunghezza d'onda di riferimento) utilizzando un lettore di micropiastre. Il tasso di proliferazione relativo è stato calcolato utilizzando il tempo 0 h come valore di base.

Rilevamento dell'apoptosi (citometria a flusso): L'apoptosi è stata valutata analizzando con il saggio di apoptosi Annexin V-fluoresceina isotiocianato (FITC)/ioduro di propidio (PI). Le cellule sono state trasfettate con i plasmidi appropriati e quindi raccolte dopo la tripsinizzazione. Il tasso di apoptosi è stato determinato mediante citometria a flusso.

Saggio dei fattori infiammatori (saggio immunoenzimatico [ELISA]): Le cellule HFLS-RA sono state seminate in piastre a 24 pozzetti e trasfettate con il mimico di miR-488-3p, l'inibitore di miR-488-3p o i corrispondenti controlli negativi per 48 h. Le concentrazioni di interleuchina-6 (IL-6), fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e interleuchina-1β (IL-1β) nei supernatanti cellulari sono state quantificate utilizzando kit ELISA.

Convalida della proteina bersaglio

Previsione del bersaglio: ROCK1 è stato previsto come un bersaglio downstream di miR-488-3p utilizzando il database TargetScan26. Sono stati inoltre identificati i siti di legame previsti tra miR-488-3p e la regione non tradotta 3′ (3′UTR) di ROCK1.

Saggio del gene reporter Dual-Luciferase: L'UTR 3′ di tipo selvaggio o mutante di ROCK1 è stato clonato nel plasmide pGL3. I siti di legame previsti e i siti mutati sono mostrati nella Figura 4. Le cellule HEK-293T sono state co-trasfettate con il mimico o l'inibitore di miR-488-3p insieme ai vettori costruiti27. L'attività della luciferasi è stata misurata 48 h dopo la trasfezione con il mimico o l'inibitore di miR-488-3p.

Immunoprecipitazione dell'RNA (RIP): le cellule HFLS-RA sono state incubate con un anticorpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, diluizione 1:200) o con un anticorpo di controllo immunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, diluizione 1:5000), seguite dall'estrazione dell'RNA e dalla PCR quantitativa (qPCR) per l'arricchimento dell'mRNA di ROCK1, come descritto in precedenza.

Analisi statistica

Lo studio è stato analizzato statisticamente utilizzando SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) e GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). I dati delle misurazioni sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con tre replicati biologici, e ciascun replicato biologico è stato analizzato in triplice copia. I dati grezzi sono allegati nel materiale supplementare. I dati sono stati valutati mediante un diagramma di probabilità normale (P-P) prima dei test statistici parametrici. Per confrontare le variabili continue alla baseline (ad esempio, età, indice di massa corporea [BMI], ecc.) è stato utilizzato il test t per campioni indipendenti, mentre per le variabili categoriche (ad esempio, sesso, ecc.) è stato impiegato il test chi-quadrato. I livelli di espressione genica sono stati confrontati mediante il test t per campioni indipendenti. Le variazioni della proliferazione cellulare in diversi punti temporali sono state analizzate mediante analisi della varianza (ANOVA) a misure ripetute, mentre l'ANOVA ad un fattore è stata utilizzata per confrontare i tassi di apoptosi determinati mediante citometria a flusso. L'analisi della correlazione è stata effettuata utilizzando il coefficiente di Spearman (per variabili che non soddisfano la distribuzione normale) e il coefficiente di Pearson (per variabili che soddisfano la distribuzione normale). Le prestazioni diagnostiche sono state valutate mediante l'analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore). Il valore ottimale di cutoff, la sensibilità e la specificità sono stati determinati utilizzando l'indice di Youden massimo. Tutti i test statistici erano a due code, e un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Caratteristiche di base dei partecipanti allo studio

Questo studio ha incluso 125 controlli sani, 130 pazienti con OA e 135 pazienti con RA per un'analisi sistematica (Tabella 1). Non sono state osservate differenze significative nelle caratteristiche basali dei tre gruppi per quanto riguarda l'età (p = 0,191), il rapporto tra i sessi (p = 0,203) e l'IMC (p = 0,562), il che ha garantito la comparabilità della popolazione in studio. P...

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Discussione

Come sottolineato da Smolen et al1 nelle più recenti linee guida per la diagnosi e il trattamento dell'AR, lo sviluppo di nuovi biomarcatori ha un valore clinico significativo. In questo studio, abbiamo confermato che il miR-488-3p sierico era significativamente ridotto nei pazienti con AR e mostrava prestazioni diagnostiche promettenti, con sensibilità e specificità relativamente soddisfacenti. La diagnosi precoce dell'AR è sempre stata una difficoltà clinica, e i biomarcatori esistenti non sono ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per il rilevamento dell'apoptosi con Annexina V-FITCBD Bioscience556547apoptosi cellulare
anticorpo anti-Ago2Proteintech66720-1-IgImmunoprecipitazione dell'RNA
soluzione CCK-8DojindoCK04proliferazione cellulare
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)Thermo Fisher121000146coltura cellulare
suero bovino fetaleThermo Fisher10437028coltura cellulare
Citometro a flussoBD Bioscience FACSCaliburapoptosi cellulare
Kit ELISA per anticorpo anti-CCP umanoCusabioCSB-E09077h rilevamento anti-CCP
Kit ELISA per RF-IgA umanoFeien BiotechnologyEH4270rilevamento RF
Fibroblasti simili a sinoviociti umani con artrite reumatoide (HFLS-RA)Cell ApplicationsHFLS-RA-200validazione in vitro della funzione di miR-488-3p
anticorpo IgG di controlloAbcamab205718Immunoprecipitazione dell'RNA
Kit ELISA per Interleuchina-1β (IL-1β)R&D SystemsDY201-05concentrazione cellulare di IL-1β
Kit ELISA per Interleuchina-6 (IL-6)R&D SystemsD6050Bconcentrazione cellulare di IL-6
Reagente di trasfezione con liposomi 3000Ingenuity Life TechnologiesL3000015trasfezione cellulare
Lettore per micropiastreBioTek ELx808saggio ELISA
Kit Mir-XTM per la sintesi del primo filamento di miRNANihonbao Bioengineering Co., Ltd.638313trascrizione inversa
Mezzo Opti-MEMIngenuity Life Technologies, Inc31985070trasfezione cellulare
pcDNA 3.1InvitrogenV790-20soprappressione di ROCK1
Penicillina-streptomicinaThermo Fisher15140122coltura cellulare
Sistema di laboratorio Phadia 250Thermo Fisher Phadia 250analisi del sangue
Kit PrimeScriptTM per la trascrizione inversaNihonbao Bioengineering Co., Ltd.RR037Atrascrizione inversa
Ioduro di propidio (PI)/ribonucleasi (RNase)BD Bioscience550825apoptosi cellulare
Sistema QuantStudio 5Applied Biosystems, Inc.A28138saggio PCR
Reagente RNAiso PlusNihonbao Bioengineering Co., Ltd.9108isolamento dell'RNA
SYBR Green Premix Ex TaqNippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.RR420Aamplificazione PCR
Database TargetScanTargetScanN/Aprevisione dei siti di legame, (https://www.targetscan.org/) 
Tina-quant C-Reactive Protein IVRoche Diagnostics7876033190rilevamento CRP
Kit ELISA per Fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α)R&D SystemsDY210-05concentrazione cellulare di TNF-α

Riferimenti

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