miR-488-3p potrebbe fungere da nuovo marcatore diagnostico non invasivo per l'AR. miR-488-3p modula la funzione biologica dei sinoviociti attraverso ROCK1. Ha mostrato una significativa correlazione negativa con la gravità della malattia nei pazienti affetti da AR.
Articolo di ricerca
L'espressione sierica di miR-488-3p come biomarcatore diagnostico non invasivo nei pazienti con artrite reumatoide
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diagnosi dell'artrite reumatoide (RA) rimane difficile a causa dei limiti dei biomarcatori esistenti. L'obiettivo dello studio è stato indagare il potenziale di miR-488-3p nel siero come biomarcatore per la RA e chiarirne il possibile meccanismo d'azione. Lo studio ha incluso 135 pazienti con RA, 130 pazienti con artrosi (OA) e 125 controlli sani. I livelli di espressione di miR-488-3p sono stati analizzati mediante RT-qPCR. Il meccanismo d'azione è stato studiato attraverso test funzionali (CCK-8, citometria a flusso, ELISA) ed esperimenti di validazione del bersaglio (gene reporter della luciferasi, RIP). I livelli di espressione sierica di miR-488-3p erano significativamente più bassi nei pazienti con RA rispetto ai pazienti con artrosi (OA) e ai controlli sani (p < 0,001). L'analisi della curva ROC ha mostrato che miR-488-3p possiede un'elevata accuratezza diagnostica nel distinguere i pazienti con RA dai controlli sani e dai pazienti con OA. miR-488-3p ha mostrato una correlazione negativa con la velocità di eritrosedimentazione (ESR), la proteina C-reattiva (CRP), il fattore reumatoide (RF) e i punteggi DAS28. La validazione funzionale ha rivelato che l'iperespressione di miR-488-3p inibisce la proliferazione e la risposta infiammatoria dei sinoviociti, inducendo al contempo l'apoptosi. Gli studi meccanicistici hanno mostrato che miR-488-3p può bersagliare direttamente la proteina chinasi 1 associata a Rho contenente coil-coil (ROCK1), che media i suoi effetti protettivi. Il miR-488-3p nel siero rappresenta una promettente novità come marcatore diagnostico non invasivo per la RA e protegge i sinoviociti dal danno.
Introduzione
L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune comune caratterizzata da infiammazione sinoviale, erosione articolare e distruzione1,2. La prevalenza globale della RA è circa dello 0,5%–1%3, il che influisce gravemente sulla qualità della vita dei pazienti e sulla loro capacità lavorativa. La malattia ha un'esordio insidioso e i sintomi iniziali sono spesso atipici, facilmente soggetti a diagnosi errata o mancata4. Progredendo, la malattia può portare a deformità articolari, perdita di funzionalità e persino aumentare il rischio di complicanze come le malattie cardiovascolari5, imponendo un onere considerevole sui pazienti, le loro famiglie e i sistemi sanitari.
Al momento, per la diagnosi dell'AR6 è necessaria una combinazione di sintomi clinici, segni fisici, esami di laboratorio e valutazioni strumentali. Gli indicatori di laboratorio comunemente utilizzati includono la velocità di eritrosedimentazione (VES) e la proteina C reattiva (PCR), che sono marcatori aspecifici di infiammazione sistemica, nonché il fattore reumatoide (FR) e gli anticorpi anti-peptide citrullinato ciclico (anti-CCP), che rappresentano importanti biomarcatori sierologici per l'AR7,8. Tuttavia, questi biomarcatori tradizionali presentano delle limitazioni: il FR può risultare positivo in alcune persone sane e in pazienti affetti da altre malattie autoimmuni (tasso di falsi positivi di circa il 5%); gli anticorpi anti-CCP, sebbene altamente specifici (>95%), hanno una sensibilità limitata nelle fasi iniziali della malattia (circa 60–70%)4,9 e alcuni pazienti con AR rimangono sieronegativi10. Pertanto, è fondamentale individuare biomarcatori più sensibili e specifici per la diagnosi precoce, il monitoraggio della malattia e la valutazione della prognosi dell'AR11.
I microRNA (miRNA) sono un gruppo di molecole di RNA regolatore non codificante endogeno di circa 22–25 basi di lunghezza12,13. È stato scoperto che i miRNA agiscono come regolatori chiave nello sviluppo di diverse malattie e che la loro espressione alterata è strettamente correlata alla patogenesi delle malattie13,14,15, rendendo i miRNA biomarcatori promettenti per la diagnosi delle malattie e il monitoraggio terapeutico. Negli ultimi anni, il ruolo dei miRNA nell'artrite reumatoide (RA) ha ricevuto un'attenzione crescente16. Studi hanno dimostrato che diversi miRNA sono associati a un'espressione disregolata (ad esempio, miR-146a, miR-155, ecc.) nel siero, nei tessuti sinoviali e nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dei pazienti con RA17,18,19. Questi miRNA contribuiscono alla patogenesi della RA regolando la produzione di citochine infiammatorie, promuovendo la proliferazione e l'invasione delle cellule sinoviali e influenzando la differenziazione degli osteoclasti20. Tra questi, miR-488 è localizzato nella regione cromosomica umana 1q25.221, e studi precedenti ne hanno confermato gli effetti neuroprotettivi: svolge un ruolo regolatorio nella progressione dei gliomi22 e dei neuroblastomi23 e, in particolare, miR-488-3p promuove l'apoptosi dei condrociti osteoartrosici nell'osteoartrite (OA)24. Sebbene OA e RA siano malattie articolari diverse, condividono meccanismi comuni nei processi patologici di infiammazione sinoviale e distruzione della cartilagine25. Abbiamo ipotizzato che miR-488-3p possa svolgere un ruolo nella RA regolando vie bersaglio simili. Tuttavia, il ruolo specifico e i meccanismi potenziali di miR-488-3p nella RA non sono ancora stati chiariti.
Lo studio ha analizzato le variazioni nei livelli di espressione sierica di miR-488-3p nei pazienti con artrite reumatoide (RA) e la loro relazione con l'attività della malattia e gli indicatori clinici, al fine di valutare il potenziale valore di questo marcatore come strumento diagnostico non invasivo per la RA. Questo studio fornisce una nuova prospettiva per lo screening precoce e la previsione dell'evoluzione della malattia nella RA, migliorando così la prognosi dei pazienti affetti da questa patologia.
Protocollo
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Hefei BOE (numero di approvazione 2021–1) e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'arruolamento.
Pazienti e campioni
Questo studio ha reclutato 135 pazienti con AR (diagnosticata secondo i criteri di classificazione ACR/EULAR del 2010) dal Dipartimento di Reumatologia e Immunologia dell'Ospedale Hefei BOE, 130 pazienti con OA dal Dipartimento di Ortopedia (diagnosticati secondo i criteri diagnostici per l'OA dell'Associazione Medica Cinese del 2018) e 125 controlli sani abbinati per età e sesso provenienti dal centro di medicina preventiva dello stesso ospedale. I partecipanti avevano un'età compresa tra i 30 e gli 80 anni. Ai controlli sani è stato confermato l'assenza di malattie autoimmuni, disturbi articolari e infezioni acute mediante un'analisi approfondita della storia clinica, esame fisico e test di laboratorio. Sono stati esclusi i partecipanti con malattie autoimmuni concomitanti, storia di infezione o trauma nei precedenti 3 mesi, neoplasie oppure in stato di gravidanza o allattamento.
Campionamento e preparazione
È stato prelevato sangue venoso a digiuno da tutti i soggetti dello studio. Dopo coagulazione a temperatura ambiente per 30 minuti, i campioni di siero sono stati isolati mediante centrifugazione a 1500 × g per 15 minuti. Il siero è stato conservato a -80°C fino all'analisi successiva.
Rilevamento di marcatori clinici e sierologici
Per valutare in modo completo lo stato della malattia e l'attività infiammatoria, sono stati misurati biomarcatori clinici e sierologici mediante metodi standardizzati di laboratorio clinico. La VES è stata determinata con il metodo di Westergren per valutare l'infiammazione sistemica aspecifica. La PCR è stata quantificata mediante un saggio immunoturbidimetrico (valore di riferimento normale: <10 mg/L) per valutare la risposta infiammatoria di fase acuta. Il FR è stato misurato mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) con un valore di riferimento normale di ≤20 UI/mL. Gli anticorpi anti-CCP sono stati dosati mediante un ELISA di seconda generazione per fornire evidenze sierologiche a supporto della diagnosi di AR.
Linee cellulari e coltura
Le cellule di sinoviociti umani di tipo fibroblastico colpiti da AR (HFLS-RA) sono state coltivate in Dulbecco's Modified Medium (DMEM) integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e penicillina-streptomicina all'1%. Le cellule sono state mantenute in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂, e sono state utilizzate per tutti gli esperimenti cellule comprese tra il terzo e il sesto passaggio.
Estrazione dell'RNA e RT-PCR quantitativa in tempo reale
L'RNA totale è stato estratto da campioni di siero utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando un kit per la sintesi del primo filamento di miRNA per i miRNA e un kit di trascrizione inversa per i geni bersaglio dell'RNA messaggero (mRNA), seguendo le istruzioni del produttore. È stata eseguita una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando un sistema di PCR in tempo reale con una miscela master PCR a base di SYBR Green. Il programma termociclico è stato impostato su una pre-denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di amplificazione (denaturazione a 95 °C per 5 s e annealing/estensione a 60 °C per 30 s). Ogni campione è stato analizzato in triplice replicato. L'RNA nucleare piccolo U6 (U6 snRNA) e la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati utilizzati come geni di riferimento endogeni per la normalizzazione rispettivamente di miRNA e mRNA. Le sequenze dei primer sono state riassunte nella Tabella Supplementare 1. I livelli di espressione relativi di miR-488-3p e dei suoi geni bersaglio sono stati calcolati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt. Sono state inoltre analizzate le variazioni nei livelli di mRNA dei geni bersaglio dopo sovraespressione o inibizione di miR-488-3p per verificare le loro relazioni regolatorie.
Trasfezione cellulare
Le cellule HFLS-RA sono state seminate in piastre da 6 pozzetti a una densità di 5 × 105 cellule/pozzetto. Le cellule sono state trasfettate utilizzando un reagente di trasfezione basato su liposomi, seguendo le istruzioni del produttore. I gruppi di trasfezione includevano gruppi di trasfezione singola e gruppi di co-trasfezione. I gruppi di trasfezione singola erano: 1) controllo—cellule non trasfettate; 2) controllo negativo del mimic (NC)—cellule trasfettate con il controllo negativo del mimic di miR-488-3p; 3) mimic di miR-488-3p—cellule trasfettate con il mimic di miR-488-3p; 4) controllo negativo dell'inibitore (NC)—cellule trasfettate con il controllo negativo dell'inibitore di miR-488-3p; 5) inibitore di miR-488-3p—cellule trasfettate con l'inibitore di miR-488-3p. I gruppi di co-trasfezione erano: 1) mimic di miR-488-3p + controllo negativo di sovraespressione (oe-NC)—cellule co-trasfettate con il mimic di miR-488-3p e il controllo negativo dei vettori di sovraespressione di ROCK1; 2) mimic di miR-488-3p + oe-ROCK1—cellule co-trasfettate con il mimic di miR-488-3p e i vettori di sovraespressione di ROCK1. Tutte le sequenze di trasfezione sono state riassunte nella Tabella Supplementare 1. Il vettore di sovraespressione di ROCK1 è stato ottenuto clonando la regione della sequenza codificante (CDS) nel plasmide pcDNA 3.1. Le cellule trasfettate sono state utilizzate per gli esperimenti successivi dopo 48 h dalla trasfezione.
Saggio della funzione cellulare
Saggio di proliferazione cellulare (Kit per il conteggio delle cellule-8 [CCK-8]): Le cellule HFLS-RA trasfettate sono state inoculate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 5 × 103 cellule/pozzetto, con tre pozzetti replicati per gruppo. A 0, 24, 48 e 72 h dalla trasfezione, sono stati aggiunti 10 µL di soluzione CCK-8 in ciascun pozzetto, seguiti da un'incubazione a 37 °C per 2 h. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm (lunghezza d'onda di rilevamento) e a 630 nm (lunghezza d'onda di riferimento) utilizzando un lettore di micropiastre. Il tasso di proliferazione relativo è stato calcolato utilizzando il tempo 0 h come valore di base.
Rilevamento dell'apoptosi (citometria a flusso): L'apoptosi è stata valutata analizzando con il saggio di apoptosi Annexin V-fluoresceina isotiocianato (FITC)/ioduro di propidio (PI). Le cellule sono state trasfettate con i plasmidi appropriati e quindi raccolte dopo la tripsinizzazione. Il tasso di apoptosi è stato determinato mediante citometria a flusso.
Saggio dei fattori infiammatori (saggio immunoenzimatico [ELISA]): Le cellule HFLS-RA sono state seminate in piastre a 24 pozzetti e trasfettate con il mimico di miR-488-3p, l'inibitore di miR-488-3p o i corrispondenti controlli negativi per 48 h. Le concentrazioni di interleuchina-6 (IL-6), fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e interleuchina-1β (IL-1β) nei supernatanti cellulari sono state quantificate utilizzando kit ELISA.
Convalida della proteina bersaglio
Previsione del bersaglio: ROCK1 è stato previsto come un bersaglio downstream di miR-488-3p utilizzando il database TargetScan26. Sono stati inoltre identificati i siti di legame previsti tra miR-488-3p e la regione non tradotta 3′ (3′UTR) di ROCK1.
Saggio del gene reporter Dual-Luciferase: L'UTR 3′ di tipo selvaggio o mutante di ROCK1 è stato clonato nel plasmide pGL3. I siti di legame previsti e i siti mutati sono mostrati nella Figura 4. Le cellule HEK-293T sono state co-trasfettate con il mimico o l'inibitore di miR-488-3p insieme ai vettori costruiti27. L'attività della luciferasi è stata misurata 48 h dopo la trasfezione con il mimico o l'inibitore di miR-488-3p.
Immunoprecipitazione dell'RNA (RIP): le cellule HFLS-RA sono state incubate con un anticorpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, diluizione 1:200) o con un anticorpo di controllo immunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, diluizione 1:5000), seguite dall'estrazione dell'RNA e dalla PCR quantitativa (qPCR) per l'arricchimento dell'mRNA di ROCK1, come descritto in precedenza.
Analisi statistica
Lo studio è stato analizzato statisticamente utilizzando SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) e GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). I dati delle misurazioni sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con tre replicati biologici, e ciascun replicato biologico è stato analizzato in triplice copia. I dati grezzi sono allegati nel materiale supplementare. I dati sono stati valutati mediante un diagramma di probabilità normale (P-P) prima dei test statistici parametrici. Per confrontare le variabili continue alla baseline (ad esempio, età, indice di massa corporea [BMI], ecc.) è stato utilizzato il test t per campioni indipendenti, mentre per le variabili categoriche (ad esempio, sesso, ecc.) è stato impiegato il test chi-quadrato. I livelli di espressione genica sono stati confrontati mediante il test t per campioni indipendenti. Le variazioni della proliferazione cellulare in diversi punti temporali sono state analizzate mediante analisi della varianza (ANOVA) a misure ripetute, mentre l'ANOVA ad un fattore è stata utilizzata per confrontare i tassi di apoptosi determinati mediante citometria a flusso. L'analisi della correlazione è stata effettuata utilizzando il coefficiente di Spearman (per variabili che non soddisfano la distribuzione normale) e il coefficiente di Pearson (per variabili che soddisfano la distribuzione normale). Le prestazioni diagnostiche sono state valutate mediante l'analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore). Il valore ottimale di cutoff, la sensibilità e la specificità sono stati determinati utilizzando l'indice di Youden massimo. Tutti i test statistici erano a due code, e un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Caratteristiche di base dei partecipanti allo studio
Questo studio ha incluso 125 controlli sani, 130 pazienti con OA e 135 pazienti con RA per un'analisi sistematica (Tabella 1). Non sono state osservate differenze significative nelle caratteristiche basali dei tre gruppi per quanto riguarda l'età (p = 0,191), il rapporto tra i sessi (p = 0,203) e l'IMC (p = 0,562), il che ha garantito la comparabilità della popolazione in studio. Per quanto riguarda le caratteristiche della malattia, la VES (82,63 ± 40,32 contro 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,001) e i livelli di PCR (56,33 ± 38,07 contro 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,001) nel gruppo RA erano significativamente più elevati rispetto al gruppo OA, riflettendo il livello di infiammazione sistemica. Nel frattempo, il FR, un marcatore sierologico associato alla RA, era positivo nel 70,37% (95/135), con una concentrazione sierica significativamente più alta (144,13 ± 81,05 contro 5,10 ± 1,37 UI/mL, p < 0,001); inoltre, la percentuale di positività all'anti-CCP nei pazienti con RA era del 56,30% (76/135), con un punteggio DAS28 di 4,12 ± 1,36.
Caratteristiche di espressione e valore diagnostico di miR-488-3p nei pazienti con AR
I livelli di espressione sierici di miR-488-3p erano significativamente ridotti nei pazienti con AR rispetto ai pazienti con OA e ai controlli sani (p < 0,0001, Figura 1A). L'analisi della curva ROC ha mostrato che miR-488-3p presentava un'elevata accuratezza diagnostica nel distinguere l'AR dall'OA e dai controlli sani: nel differenziare l'AR dai controlli sani, il valore dell'AUC era di 0,931 (IC 95%: 0,896–0,967), con una sensibilità del 96,15% (IC 95%: 91,31%–98,35%) e una specificità dell'80,95% (IC 95%: 73,22%–86,85%, p < 0,001, Figura 1B); nel distinguere i pazienti con AR da quelli con OA, il valore dell'AUC era di 0,800 (IC 95%: 0,747–0,854), con una sensibilità del 85,93% (IC 95%: 79,06%–90,80%) e una specificità del 66,15% (IC 95%: 57,66%–73,72%, p < 0,001, Figura 1C). Un'analisi di regressione logistica multivariata ha identificato miR-488-3p come un fattore indipendente associato al rischio di AR (OR = 0,166, IC 95%: 0,097–0,284; Tabella 2).
Analisi della correlazione tra miR-488-3p e gli indicatori clinici dell'AR
I livelli di espressione sierici di miR-488-3p erano significativamente correlati in modo negativo con indicatori clinici chiave dell'AR, inclusi VES, PCR, FR e punteggio DAS28 (tutti p < 0,001; Tabella 3). In particolare, miR-488-3p era correlato negativamente con la VES (r = −0,718), la PCR (r = −0,726), il FR (r = −0,805) e il punteggio DAS28 (r = −0,836) (Tabella 3).
L'overespressione di miR-488-3p inibisce la proliferazione cellulare e le risposte infiammatorie e induce l'apoptosi nelle cellule HFLS-RA
Per studiare l'effetto di miR-488-3p sulla funzione di HFLS-RA, abbiamo modulato la sua espressione mediante trasfezione con mimici e inibitori. L'analisi RT-qPCR ha confermato che il livello di espressione di miR-488-3p era significativamente più elevato nel gruppo trattato con mimico di miR-488-3p rispetto al gruppo controllo (p = 0,0001), mentre il livello di espressione nel gruppo trattato con inibitore di miR-488-3p era significativamente più basso (p = 0,0003, Figura 2A). Il saggio CCK-8 ha mostrato che l'overespressione di miR-488-3p inibiva la proliferazione cellulare, che risultava significativamente inferiore rispetto al gruppo controllo a 24 h, 48 h e 72 h (p = 0,0208, p < 0,0001, p = 0,0036), mentre l'inibizione dell'espressione di miR-488-3p aumentava significativamente la proliferazione cellulare (Figura 2B). L'analisi mediante citometria a flusso ha mostrato che l'overespressione di miR-488-3p promuoveva significativamente l'apoptosi (p = 0,0033, Figura 2C).
Abbiamo quindi eseguito un ELISA per studiare l'effetto dell'upregolazione dell'espressione di miR-488-3p sui livelli delle citochine infiammatorie. I risultati hanno mostrato che quando miR-488-3p era sovraespresso, i livelli delle citochine infiammatorie (IL-6, TNF-α e IL-1β) erano significativamente ridotti (p < 0,0001, Figura 3A-C), mentre l'inibizione dell'espressione di miR-488-3p ha prodotto l'effetto opposto. Questi effetti regolatori significativi sono stati confermati in tutti e tre gli esperimenti biologici indipendenti replicati, mentre i controlli negativi non hanno mostrato variazioni significative (p > 0,05).
MiR-488-3p regola l'espressione di molecole ROCK1
Per chiarire i meccanismi molecolari alla base del ruolo di miR-488-3p nella progressione della malattia RA, abbiamo esplorato i bersagli downstream di miR-488-3p. Analisi bioinformatiche hanno mostrato che miR-488-3p era predetto legarsi alla regione 3'UTR di ROCK1 (Figura 4A). Il saggio del reporter a doppia luciferasi ha confermato che l'attività della luciferasi era significativamente ridotta quando la 3'UTR wild-type di ROCK1 era co-trasfettata con i mimici di miR-488-3p (p < 0,0001), e l'attività della luciferasi era significativamente aumentata quando l'espressione di miR-488-3p era inibita (p < 0,0001); mentre non si osservava alcun cambiamento significativo di questo effetto regolatorio dopo la mutazione del sito di legame (Figura 4B). Esperimenti di RIP hanno ulteriormente verificato questa relazione regolatoria, mostrando che il livello di espressione dell'mRNA di ROCK1 era significativamente più elevato nei complessi arricchiti con anticorpo Ago2 rispetto ai controlli IgG (p < 0,0001, Figura 4C).
Inoltre, nei campioni clinici, ROCK1 ha mostrato un profilo di espressione opposto a quello di miR-488-3p, dove è stata osservata una significativa upregolazione di ROCK1 rispetto sia ai pazienti con artrosi che ai controlli sani (Figura 4D). In cellule HFLS-RA, la RT-qPCR ha rivelato che l'overespressione di miR-488-3p ha determinato una significativa riduzione dell'espressione di ROCK1 (p = 0.0093), mentre l'inibizione di miR-488-3p ha aumentato significativamente l'espressione di ROCK1 (p = 0.0003, Figura 4E).
ROCK1 media gli effetti regolatori di miR-488-3p sulle cellule HFLS-RA
In cellule HFLS-RA, la soppressione dell'espressione di ROCK1 indotta dalla sovraespressione di miR-488-3p è stata invertita mediante la trasfezione con vettori di sovraespressione di ROCK1 (Figura 5A). Analogamente, l'effetto inibitorio della sovraespressione di miR-488-3p sulla proliferazione cellulare è stato attenuato dalla sovraespressione di ROCK1 (Figura 5B). Inoltre, la sovraespressione di ROCK1 ha anche invertito l'apoptosi potenziata indotta da miR-488-3p (Figura 5C) e ha ripristinato i livelli delle citochine infiammatorie che erano stati ridotti dalla sovraespressione di miR-488-3p (Figura 5D).
Figura 1. Livelli di espressione e prestazioni diagnostiche di miR-488-3p in pazienti con artrite reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e controlli sani. (A) Confronto dei livelli di espressione relativi di miR-488-3p in pazienti con AR, pazienti con OA e controlli sani. (B) Analisi della curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) di miR-488-3p per distinguere l'AR dai controlli sani. (C) Analisi della curva ROC di miR-488-3p per distinguere l'AR dai pazienti con OA. AUC, area sotto la curva; CI, intervallo di confidenza. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Effetti funzionali di miR-488-3p in cellule HFLS-RA. (A) Espressione relativa di miR-488-3p in cellule HFLS-RA trasfettate determinata mediante reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR). (B) Effetti della sovraespressione e dell'inibizione di miR-488-3p sulla proliferazione cellulare. (C) Effetti della sovraespressione e dell'inibizione di miR-488-3p sull'apoptosi. I dati sono espressi come media ± DS. Tutte le misurazioni sono state effettuate con tre replicati biologici, ciascuno con tre replicati tecnici. p < 0,05 indica una differenza statisticamente significativa tra i gruppi indicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Effetto di miR-488-3p sulla secrezione delle citochine infiammatorie. (A) Interleuchina-6 (IL-6). (B) Fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α). (C) Interleuchina-1β (IL-1β). Le concentrazioni delle citochine sono state misurate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). I dati sono espressi come media ± DS. Tutte le misurazioni sono state effettuate con tre replicati biologici, ciascuno con tre replicati tecnici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Convalida del meccanismo molecolare alla base della regolazione mirata di ROCK1 da parte di miR-488-3p. (A) Sito di legame previsto di miR-488-3p all'interno della regione non tradotta 3′ (3′UTR) di ROCK1. (B) Saggio del reporter a doppia luciferasi che dimostra l'interazione tra miR-488-3p e la 3′UTR di ROCK1 di tipo selvaggio o mutante. (C) Saggio di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP) che mostra l'arricchimento dell'RNA messaggero (mRNA) di ROCK1 nei complessi arricchiti con anticorpo contro Argonaute 2 (Ago2). (D) Livelli relativi di espressione di ROCK1 in pazienti con artrite reumatoide (RA), pazienti con osteoartrite (OA) e controlli sani. (E) Espressione relativa di ROCK1 in cellule HFLS-RA trasfettate determinata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrittasi inversa (RT-qPCR). I dati sono espressi come media ± DS. Tutte le misurazioni sono state effettuate utilizzando tre repliche biologiche, ciascuna con tre repliche tecniche. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Coinvolgimento di ROCK1 nella regolazione delle cellule HFLS-RA da parte di miR-488-3p. (A) Regolazione dell'espressione di ROCK1 nelle cellule HFLS-RA dopo la trasfezione cellulare. (B) Effetti della sovraespressione di ROCK1 sulla proliferazione cellulare in condizioni di sovraespressione di miR-488-3p. (C) Effetti della sovraespressione di ROCK1 sull'apoptosi in condizioni di sovraespressione di miR-488-3p. (D) Effetti della sovraespressione di ROCK1 sulla produzione di citochine infiammatorie in condizioni di sovraespressione di miR-488-3p. I dati sono espressi come media ± DS. Tutte le misurazioni sono state effettuate utilizzando tre repliche biologiche, ciascuna con tre repliche tecniche. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Variabile | Controllo (n = 125) | OA (n = 130) | RA (n = 135) | p-valore |
| Età (anni) | 55,10 ± 9,30 | 57,21 ± 10,27 | 55,22 ± 11,61 | 0,191 |
| Sesso (maschio/femmina) | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0,203 |
| BMI (kg/m2) | 22,79 ± 1,73 | 22,98 ± 1,98 | 23,04 ± 2,05 | 0,562 |
| Durata della malattia (anni) | - | 7,96 ± 4,00 | 8,03 ± 3,83 | 0,882 |
| Anti-CCP positivo (n/%) | - | - | 76 (56,30) | - |
| ESR (mm/h) | 18,39 ± 6,38 | 82,63 ± 40,32 | <0,001 | |
| CRP (mg/L) | 10,54 ± 4,98 | 56,33 ± 38,07 | <0,001 | |
| RF positivo | - | - | 95 (70,37) | |
| RF (IU/mL) | - | 5,10 ± 1,37 | 144,13 ± 81,05 | <0,001 |
| DAS28 | - | - | 4,12 ± 1,36 | - |
Tabella 1: Caratteristiche basali dei partecipanti allo studio. I tre gruppi di studio erano comparabili per quanto riguarda le caratteristiche demografiche. I pazienti con AR presentavano marker infiammatori e livelli di FR elevati.
| Variabile | OR | 95%CI | p-valore |
| Età (anni) | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| Sesso (maschio/femmina) | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| IMC (kg/m2) | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| Durata della malattia (anni) | 1.13 | 0.663–1.929 | <0.001 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
Tabella 2: Fattori indipendenti derivati da regressione logistica multivariabile associati alla progressione dell'artrosi in artrite reumatoide. È stato identificato che miR-488-3p è associato al rischio di sviluppo di AR in pazienti con OA.
| Elementi | MiR-488-3p (artrite reumatoide) | p-valore |
| Correlazione (r) | ||
| VES (mm/h) | -0.718 | <0.001 |
| PCR (mg/L) | -0.726 | <0.001 |
| FR (UI/mL) | -0.805 | <0.001 |
| DAS28 | -0.836 | <0.001 |
Tabella 3: Correlazioni tra miR-488-3p e caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti con AR. miR-488-3p è risultato significativamente correlato in modo negativo con VES, PCR, RF e punteggio DAS28 nei pazienti con AR.
Tabella supplementare 1. Informazioni sulle sequenze per la trasfezione cellulare e il saggio PCR. Vengono riassunte le sequenze dei primer e i reagenti per la trasfezione utilizzati nello studio.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Come sottolineato da Smolen et al1 nelle più recenti linee guida per la diagnosi e il trattamento dell'AR, lo sviluppo di nuovi biomarcatori ha un valore clinico significativo. In questo studio, abbiamo confermato che il miR-488-3p sierico era significativamente ridotto nei pazienti con AR e mostrava prestazioni diagnostiche promettenti, con sensibilità e specificità relativamente soddisfacenti. La diagnosi precoce dell'AR è sempre stata una difficoltà clinica, e i biomarcatori esistenti non sono sufficientemente sensibili per la diagnosi dell'AR, mentre il potenziale diagnostico significativo del miR-488-3p potrebbe colmare questa lacuna, specialmente per l'identificazione dei pazienti con AR sieronegativa. Rispetto a individui sani, i pazienti con AR presentavano un'infiammazione sistemica più pronunciata. Mentre nei pazienti con OA il disturbo articolare è prevalentemente degenerativo e localizzato, si osserva spesso un'infiammazione sistemica di basso grado. Pertanto, l'efficienza discriminante del miR-488-3p è molto maggiore quando confrontata con individui sani rispetto al confronto con pazienti con OA. Le prestazioni diagnostiche del miR-488-3p non sono state confrontate direttamente con quelle dei biomarcatori clinici consolidati. I pazienti inclusi in questo studio sono stati diagnosticati secondo lo standard clinico attuale per l'AR, che comprende biomarcatori consolidati come anticorpi anti-CCP, RF, VES e PCR. Sono state osservate differenze significative in questi marcatori tra pazienti con OA e AR (Tabella 1). Pertanto, questa coorte non era adatta per un confronto diretto delle prestazioni diagnostiche del miR-488-3p con questi biomarcatori consolidati. Tali confronti richiedono una coorte di validazione indipendente.
Inoltre, è stato riscontrato che i livelli di espressione di miR-488-3p sono significativamente correlati in modo negativo con diversi indicatori clinici della AR, inclusi i marcatori infiammatori sistemici (VES, PCR)28 e gli autoanticorpi (FR)6. Di particolare rilevanza clinica, miR-488-3p ha mostrato una forte correlazione negativa con il punteggio di attività della malattia (DAS28). Il DAS28 è un indice composito che riflette l'attività della malattia in base a gonfiore articolare, dolore alla palpazione, infiammazione e stato clinico del paziente. Pertanto, questi risultati suggeriscono che miR-488-3p potrebbe fungere da biomarcatore potenziale per l'attività della malattia nella AR. Tali dati supportano anche il suo ruolo regolatorio nella patogenesi della AR e indicano che potrebbe influenzare l'evoluzione della malattia inibendo le vie di segnalazione infiammatorie o le risposte autoimmuni29.
Negli esperimenti funzionali, abbiamo scoperto che il miR-488-3p inibisce la proliferazione e promuove l'apoptosi delle cellule HFLS-RA provenienti da pazienti con AR, riducendo inoltre in modo significativo la produzione di citochine infiammatorie (IL-6, TNF-α e IL-1β). Le cellule HFLS-RA svolgono un ruolo chiave nel processo patologico dell'AR30, e la loro proliferazione anomala e la crescita invasiva possono portare a iperplasia sinoviale e distruzione articolare, mentre la sovrapproduzione di fattori infiammatori aggrava ulteriormente le risposte infiammatorie locali e sistemiche31. Pertanto, la regolazione della funzione delle cellule HFLS-RA da parte del miR-488-3p potrebbe inibire direttamente l'invasione sinoviale e l'erosione ossea nell'AR, fornendo una base teorica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate. Studi precedenti hanno dimostrato che altri miRNA, come il miR-155, possono influenzare l'evoluzione dell'AR regolando la funzione dei sinoviociti19, il che ulteriormente conferma i nostri risultati.
Studi meccanicistici hanno dimostrato che miR-488-3p può bersagliare direttamente ROCK1 e inibirne l'espressione legandosi alla sua regione 3'UTR. ROCK1 è una molecola effettore chiave della via di segnalazione Rho/ROCK, che partecipa al riassetto del citoscheletro, alla risposta infiammatoria e alla fibrosi32. Studi precedenti hanno mostrato che ROCK1 è altamente espresso nei sinoviociti dell'AR e ne promuove la migrazione e l'invasione33. Come previsto, la sovraespressione di ROCK1 ha significativamente invertito gli effetti di miR-488-3p sulle cellule HFLS-RA, indicandone il coinvolgimento nel ruolo regolatorio di miR-488-3p nella progressione dell'AR.
Tuttavia, vi è ancora molto lavoro da svolgere nelle future ricerche. L'espressione di miR-488-3p nei campioni clinici è stata valutata mediante RT-qPCR utilizzando U6 come riferimento interno. Studi precedenti hanno riportato risultati contrastanti sulla stabilità di U6, in particolare in campioni circolanti come il siero. Sebbene nel presente studio siano stati condotti esperimenti preliminari per garantire la stabilità di U6, la potenziale variabilità di U6 rimane una limitazione, aumentando così il rischio di diagnosi errata. È pertanto necessaria una ulteriore validazione mediante geni di riferimento interno più stabili. Dall'altro lato, la valutazione clinica di miR-488-3p si è basata su una coorte monocentrica, senza validazione esterna. La dimensione del campione era relativamente ridotta, limitata alla scala dell'ospedale. Inoltre, è mancato un follow-up longitudinale volto a valutare il valore prognostico di miR-488-3p. Tali limitazioni dovrebbero essere affrontate in futuri studi. Inoltre, alcuni studi mostrano che in vivo la somministrazione degli miRNA continua a rappresentare una sfida importante per la traduzione clinica34Studi futuri potrebbero validare il potenziale terapeutico del miR-488-3p in vivo mediante la generazione di topi knock-out condizionali o l'utilizzo di sistemi di somministrazione mirati, come nanoveicoli.35.
In conclusione, questo studio ha rivelato il valore potenziale di miR-488-3p nella diagnosi e nel possibile indirizzamento terapeutico dell'AR. MiR-488-3p ha dimostrato un'elevata capacità diagnostica e ha inibito la proliferazione e le risposte infiammatorie delle cellule HFLS-AR, promuovendone al contempo l'apoptosi. Ciò suggerisce che potrebbe rappresentare un bersaglio promettente per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per l'AR. Le future ricerche dovrebbero concentrarsi su 1) la validazione della stabilità diagnostica di miR-488-3p in ampie coorti multicentriche, 2) l'esplorazione dei suoi effetti sinergici con agenti terapeutici esistenti, come gli inibitori JAK o i farmaci biologici28, e 3) l'ottimizzazione dei sistemi di somministrazione degli miRNA per migliorarne la fattibilità della traduzione clinica36.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati grezzi che supportano i risultati di questo studio sono disponibili nei materiali supplementari presentati insieme a questo manoscritto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per il rilevamento dell'apoptosi con Annexina V-FITC | BD Bioscience | 556547 | apoptosi cellulare |
| anticorpo anti-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | Immunoprecipitazione dell'RNA |
| soluzione CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferazione cellulare |
| Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | coltura cellulare |
| suero bovino fetale | Thermo Fisher | 10437028 | coltura cellulare |
| Citometro a flusso | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptosi cellulare |
| Kit ELISA per anticorpo anti-CCP umano | Cusabio | CSB-E09077h | rilevamento anti-CCP |
| Kit ELISA per RF-IgA umano | Feien Biotechnology | EH4270 | rilevamento RF |
| Fibroblasti simili a sinoviociti umani con artrite reumatoide (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | validazione in vitro della funzione di miR-488-3p |
| anticorpo IgG di controllo | Abcam | ab205718 | Immunoprecipitazione dell'RNA |
| Kit ELISA per Interleuchina-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | concentrazione cellulare di IL-1β |
| Kit ELISA per Interleuchina-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | concentrazione cellulare di IL-6 |
| Reagente di trasfezione con liposomi 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | trasfezione cellulare |
| Lettore per micropiastre | BioTek | ELx808 | saggio ELISA |
| Kit Mir-XTM per la sintesi del primo filamento di miRNA | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | trascrizione inversa |
| Mezzo Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | trasfezione cellulare |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | soprappressione di ROCK1 |
| Penicillina-streptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | coltura cellulare |
| Sistema di laboratorio Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | analisi del sangue |
| Kit PrimeScriptTM per la trascrizione inversa | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | trascrizione inversa |
| Ioduro di propidio (PI)/ribonucleasi (RNase) | BD Bioscience | 550825 | apoptosi cellulare |
| Sistema QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | saggio PCR |
| Reagente RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | isolamento dell'RNA |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplificazione PCR |
| Database TargetScan | TargetScan | N/A | previsione dei siti di legame, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-Reactive Protein IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | rilevamento CRP |
| Kit ELISA per Fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | concentrazione cellulare di TNF-α |
Riferimenti
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