Questo studio ha dimostrato che l'ecografia polmonare (LUS) e il miR-486-3p sierico erano aumentati nei neonati con sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). La valutazione combinata di questi due parametri ha migliorato la previsione della gravità della malattia e della prognosi, e si è scoperto che il miR-486-3p regola la funzione delle cellule nel modello di ARDS attraverso il targeting del ligando 4 della via Notch di tipo Delta.
Articolo di ricerca
Valore prognostico del punteggio ecografico polmonare e del miR-486-3p sierico nella sindrome da distress respiratorio neonatale acuto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio mirava a valutare il valore prognostico del punteggio ecografico polmonare (LUS) e della miR-486-3p sierica nella sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) neonatale e a esplorare il meccanismo sottostante. Sono stati arruolati complessivamente 112 neonati con ARDS e 100 neonati sani nati nello stesso periodo, rispettivamente nei gruppi di studio e di controllo sano. Ogni neonato ha eseguito un'ecografia polmonare entro 6 ore dall'ammissione in terapia intensiva ed è stato valutato per il punteggio LUS. La PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per quantificare l'espressione genica, mentre le analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) e della correlazione di Pearson sono state effettuate per valutare le prestazioni prognostiche e le correlazioni. Inoltre, è stato stabilito un modello in vitro di ARDS utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HPMECs) per indagare il meccanismo sottostante della miR-486-3p. È stato eseguito un saggio con reporter a doppia luciferasi per verificare la relazione target tra miR-486-3p e Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4). I risultati hanno mostrato che LUS e miR-486-3p sierica erano significativamente aumentati nei neonati con ARDS. L'analisi della curva ROC ha dimostrato che sia miR-486-3p che LUS potevano prevedere la prognosi neonatale dell'ARDS (AUC = 0,883 e 0,873, sensibilità: 96,4% e 89,3%, specificità: 77,4% e 73,8%, rispettivamente), e la combinazione di miR-486-3p con LUS ha mostrato un effetto predittivo migliore (AUC = 0,929, sensibilità: 92,9%, specificità: 84,5%). Dal punto di vista meccanicistico, miR-486-3p ha come target DLL4 per regolare le funzioni biologiche delle cellule del modello di ARDS. Nel complesso, la valutazione combinata di LUS e miR-486-3p sierica potrebbe rappresentare un approccio promettente per valutare la gravità della malattia e prevedere la prognosi nei neonati con ARDS. È ancora necessaria una validazione multicentrica per confermarne l'applicabilità generale.
Introduzione
La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) nei neonati è un disturbo respiratorio critico potenzialmente letale, caratterizzato principalmente da un'alterata funzione del surfattante alveolare, che rappresenta un grave rischio per la sopravvivenza neonatale1,2. Nonostante lo sviluppo di diverse modalità terapeutiche, la prognosi complessiva per i neonati colpiti rimane insoddisfacente3. L'identificazione precoce della gravità della malattia e una valutazione prognostica accurata sono quindi essenziali per ottimizzare gli interventi clinici e migliorare gli esiti dei pazienti. Una volta insorta l'ARDS, la funzione polmonare neonatale è gravemente compromessa, accompagnata da alterazioni della ventilazione e degli scambi gassosi4. L'ecografia polmonare può essere considerata il metodo di imaging primario per il monitoraggio della ventilazione nell'ARDS5. È diventata lo strumento di imaging preferito al letto del paziente per il monitoraggio delle lesioni polmonari nell'ARDS, e il punteggio ecografico polmonare (LUS) è stato ampiamente utilizzato per diagnosticare le malattie respiratorie acute nei neonati e valutare la gravità e la prognosi della malattia in ambito di terapia intensiva6. Tuttavia, un singolo esame di imaging o un test di laboratorio presentano difetti intrinseci e non possono soddisfare pienamente le esigenze di valutazione clinica7. Pertanto, esplorare nuovi biomarcatori per stabilire un sistema di valutazione combinata riveste grande importanza clinica.
I microRNA (miRNA) rappresentano una nuova classe di fattori regolatori genici che svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)8. Ad esempio, la downregolazione di miR-141-3p è strettamente associata alla gravità della malattia nella fibrosi polmonare e nel danno polmonare9. miR-124-3p è un fattore protettivo per l'ARDS agendo sul bersaglio p6510. Studi precedenti di sequenziamento ad alto rendimento hanno confermato che miR-486-3p è significativamente upregolato nei pazienti con ARDS11. Ricerche recenti hanno evidenziato l'asse hsa_circ_0006892/miR-486-3p come un possibile meccanismo molecolare implicato nello sviluppo dell'ARDS12. Questi risultati suggeriscono che miR-486-3p è strettamente correlato all'ARDS. Tuttavia, il valore prognostico e predittivo di miR-486-3p riguardo alla gravità e all'esito dell'ARDS neonatale deve ancora essere completamente chiarito.
Attualmente, la radiografia del torace, l'analisi del gas sanguigno e il rilevamento di un singolo biomarcatore sono i metodi principali per la valutazione della sindrome da distress respiratorio acuto neonatale. L'imaging toracico comporta un'esposizione alle radiazioni e non consente un monitoraggio ripetuto in tempo reale. L'analisi del gas sanguigno riflette soltanto la funzione respiratoria acuta e manca di valore predittivo per la prognosi a lungo termine. Il rilevamento di un singolo microRNA fornisce risultati quantitativi oggettivi, ma non è in grado di riflettere i cambiamenti morfologici in tempo reale del tessuto polmonare. Rispetto a questi approcci convenzionali, la combinazione di ecografia polmonare (LUS) e miR-486-3p sierico integra i vantaggi dell'imaging al letto del paziente e del rilevamento molecolare.
Questo studio si è concentrato su neonati che soddisfacevano i criteri di SDRA piuttosto che sulla classica SDIR da carenza di surfattante. Pertanto, questo studio intende valutare se l'ecografia polmonare basale e il miR-486-3p sierico possano prevedere la mortalità a breve termine nella SDRA neonatale. La ricerca mira a fornire dati preziosi per migliorare la valutazione clinica delle condizioni di malattia e delle valutazioni prognostiche a breve termine nella SDRA neonatale.
Protocollo
Questo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato per l'Etica Medica del Primo Ospedale Popolare di Yongkang, in rigorosa conformità alla Dichiarazione di Helsinki.
Soggetti
Questo studio di coorte osservazionale monocentrico con un componente sperimentale in vitro è stato condotto tra gennaio 2022 e dicembre 2023. Un totale di 112 neonati consecutivi diagnosticati con SDRA sono stati arruolati presso il Primo Ospedale Popolare di Yongkang. A scopo comparativo, sono stati reclutati come soggetti di controllo lattanti sani nati nello stesso periodo, senza storia di asfissia o di distress intrauterino.
Criteri di inclusione:
Tutti i partecipanti soddisfacevano i criteri diagnostici per la sindrome da distress respiratorio acuto neonatale come indicato nelle linee guida di Montreux (edizione 2017). La diagnosi è stata confermata da valutazioni cliniche e di imaging: gli esami radiografici hanno rivelato opacità diffuse in entrambi i polmoni, compatibili con edema polmonare, e l'ecocardiografia non ha mostrato segni di ipertensione atriale sinistra, escludendo così l'edema polmonare di origine cardiogena. Criteri aggiuntivi includevano l'insorgenza acuta dei sintomi e la necessità di ventilazione meccanica per più di 3 giorni, in assenza di gravi infezioni extrapulmonari. Il consenso informato è stato regolarmente ottenuto dalle famiglie dei neonati.
Criteri di esclusione:
Sono stati esclusi i neonati con deficit primario di surfattante alveolare, malformazioni cardiache congenite, disturbi metabolici o altre condizioni sottostanti significative. Inoltre, sono stati esclusi i neonati con malformazioni polmonari o della parete toracica o altre gravi anomalie congenite. È stata esclusa la sindrome da distress respiratorio del neonato (RDS).
Dati clinici
L'età gestazionale, il sesso, il peso alla nascita al momento del ricovero e le caratteristiche materne sono state registrate per tutti i partecipanti. Ogni neonato ha eseguito un'ecografia polmonare entro 6 ore dal ricovero in terapia intensiva ed è stato valutato mediante LUS. Il punteggio LUS è stato attribuito su una scala con un massimo di 36 punti, in cui un punteggio più elevato indicava una maggiore gravità dei sintomi polmonari. I campioni di sangue sono stati raccolti immediatamente al momento del ricovero, come parte della valutazione clinica iniziale e prima di qualsiasi intervento terapeutico significativo (ad esempio, re-somministrazione di surfattante, intensificazione della modalità di ventilazione o inizio di agenti vasoattivi). I campioni di sangue provenienti da neonati sani sono stati ottenuti al momento dell'inclusione nello studio. Per l'isolamento del siero, il sangue intero è stato posto in provette con separatore di siero ed è stato lasciato in posizione stazionaria a temperatura ambiente per 30 minuti, al fine di consentire una completa formazione del coagulo. I campioni sono stati quindi centrifugati a 1500 x g per 15 minuti a 4 °C. Il sopranatante sieroso limpido superiore è stato accuratamente aspirato, suddiviso in aliquote in provette criogeniche sterili e immediatamente conservato in un congelatore a temperatura ultra-bassa a -80 °C per esperimenti successivi. Solo campioni di siero chiari e non emolizzati sono stati utilizzati per gli esperimenti successivi. Le provette per la raccolta del sangue e il sangue residuo sono stati smaltiti come rifiuti biologici medici in conformità con le normative istituzionali.
Raggruppamento
Tutti i neonati sono stati suddivisi in due gruppi distinti: il gruppo lieve (gradi I-II) e il gruppo grave (gradi III-IV), in base ai reperti iniziali della radiografia del torace e alla gravità della condizione valutata 24 ore dopo il ricovero. L'interpretazione delle radiografie del torace ha evidenziato il grado I, caratterizzato da una ridotta trasparenza polmonare bilateralmente, con piccole particelle e ombre reticolari nel parenchima polmonare. Il grado II indicava un'estensione delle lesioni alle zone medie e periferiche del polmone, con segni evidenti di broncogramma aereo. Nel grado III, si osservava una riduzione significativa della trasparenza in entrambi i polmoni, con margini di cuore e diaframma poco definiti. Il grado IV era caratterizzato da segni marcati di broncogramma aereo, che portavano a un'opacizzazione quasi totale simile all'aspetto di un polmone bianco.
Neonati diagnosticati con SDRA hanno ricevuto un regime terapeutico completo dopo il ricovero in terapia intensiva neonatale. Questo regime comprendeva ventilazione meccanica, sedazione, somministrazione di surfattante polmonare, terapie antinfiammatorie, supporto nutrizionale, assistenza alla espettorazione e misure di rimpiazzo idrico. La diagnosi neonatale di SDRA è servita come punto di partenza dello studio. Gli endpoint sono stati definiti come recupero completo del paziente con dimissione oppure decesso del paziente a causa di trattamento inefficace. Sulla base degli esiti clinici, i partecipanti sono stati classificati in due gruppi: il gruppo dei sopravvissuti e il gruppo dei deceduti.
Cultura cellulare e trattamento
Le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HPMECs) sono state coltivate in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%, penicillina 100 U/mL e streptomicina 100 µg/mL. Le cellule sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂. Per stabilire un modello cellulare di ARDS, le cellule sono state trattate con lipopolisaccaride (LPS) a una concentrazione di 1 mg/L13,14. La corretta realizzazione del modello è stata confermata osservando un lieve restringimento cellulare al microscopio invertito dopo il trattamento con LPS. Al termine degli esperimenti, il mezzo di coltura usato, le cellule morte e i materiali di coltura monouso sono stati smaltiti come rifiuti biologicamente pericolosi.
Trasfezione cellulare e raggruppamento
Le HPMEC sono state seminate in piastre per colture e incubate fino al raggiungimento di una confluenza del 70% prima della trasfezione. I complessi di trasfezione sono stati preparati seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state suddivise in gruppi: controllo vuoto, mimico di miR-486-3p, controllo negativo del mimico, inibitore di miR-486-3p, controllo negativo dell'inibitore, mimico di miR-486-3p + plasmide di sovraespressione di DLL4 (OE-DLL4) e mimico di miR-486-3p + plasmide di sovraespressione vuoto (OE-NC). I complessi di trasfezione sono stati aggiunti ai pozzetti corrispondenti e incubati per 4–6 h. Il mezzo è stato sostituito con mezzo completo fresco e la coltura è proseguita per 24–48 h prima dei successivi esperimenti. La trasfezione riuscita è stata indicata dalla stabilità della confluenza cellulare senza eccessiva morte cellulare.
PCR quantitativa in tempo reale
L'RNA totale è stato estratto da campioni di siero e da cellule coltivate utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state misurate mediante spettrofotometro, e i campioni con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,1 sono stati considerati idonei per ulteriori analisi. Il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa. Successivamente, è stata eseguita una PCR quantitativa mediante un sistema di PCR in tempo reale con le seguenti condizioni di ciclaggio: una denaturazione iniziale a 95 °C per 3 min, seguita da 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s. Per il rilevamento dei microRNA, l'espressione relativa di miR-486-3p è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt, impiegando l'U6 snRNA come riferimento interno. Per la quantificazione dell'mRNA, l'espressione di DLL4 è stata normalizzata rispetto all'mRNA di GAPDH mediante lo stesso algoritmo 2-ΔΔCt. Le sequenze dei primer erano le seguenti: miR-486-3p forward: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' e miR-486-3p reverse: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 forward: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' e U6 reverse: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 forward: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' e DLL4 reverse: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH forward: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' e GAPDH reverse: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
Saggio di proliferazione cellulare CCK-8
Le cellule trasfettate sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1 × 103 cellule per pozzetto e incubate per 24, 48 e 72 h. Il mezzo di coltura è stato quindi aspirato e le cellule sono state lavate due volte con PBS 1×. Successivamente, sono stati aggiunti 100 µL di PBS 1× fresco e 10 µL di soluzione CCK-8 in ogni pozzetto, e le piastre sono state incubate a 37 °C per 2 h. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre, e la proliferazione cellulare è stata valutata in base ai valori di assorbanza. Un'esecuzione corretta del saggio è stata indicata da variazioni temporali dell'assorbanza tra i gruppi sperimentali.
Saggio di apoptosi mediante citometria a flusso
Le cellule sono state digerite con tripsina 0,25% e la sospensione cellulare ottenuta è stata raccolta e centrifugata a 1500 × g per 5 min a 4 °C. Il soprannatante è stato eliminato e i pellet cellulari sono stati lavati tre volte con PBS 1× pre-raffreddato. Le cellule sono state quindi risospese in 500 µL di 1x Binding Buffer, seguito dall'aggiunta di 5 µL di Annexin V-FITC e 5 µL di ioduro di propidio (PI). Dopo un'accurata miscelazione, i campioni sono stati incubati per 40 min a temperatura ambiente al buio. L'apoptosi cellulare è stata misurata mediante citometria a flusso e i dati sono stati analizzati con un software specifico per l'analisi della citometria a flusso. Un'esecuzione corretta del saggio è stata indicata da un basso tasso di apoptosi nel gruppo di controllo normale e da un marcato aumento dell'apoptosi nel gruppo modello di ARDS.
Saggio del reporter luciferasi
I potenziali geni bersaglio di miR-486-3p sono stati identificati utilizzando la banca dati online TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). Dopo l'identificazione dei siti di legame previsti, sono stati costruiti plasmidi reporter di luciferasi di tipo selvaggio (DLL4-WT) e mutanti (DLL4-MUT) contenenti le corrispondenti sequenze di legame. I vettori DLL4-WT e DLL4-MUT sono stati co-trasfettati nelle HPMEC insieme a mimici o inibitori di miR-486-3p, rispettivamente. L'attività relativa della luciferasi è stata successivamente misurata utilizzando un kit per saggio reporter a doppia luciferasi. I segnali di bioluminescenza sono stati rilevati mediante un luminometro seguendo le istruzioni del produttore. Una valida conferma del bersaglio è stata indicata da una riduzione significativa dell'attività della luciferasi nel gruppo DLL4-WT dopo la sovraespressione di miR-486-3p.
Nella Tabella dei materiali allegata sono riportate informazioni dettagliate su tutti i reagenti, i materiali di consumo e le attrezzature di laboratorio utilizzati in questo studio.
Metodi statistici
Le analisi statistiche e le visualizzazioni dei dati sono state eseguite utilizzando SPSS versione 26.0 e GraphPad Prism versione 9.0. I dati quantitativi sono stati espressi come media ± deviazione standard, con i confronti tra le medie di due campioni indipendenti valutati mediante il test t per campioni indipendenti. Per i confronti tra tre o più gruppi, sono state utilizzate l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e l'ANOVA per misure ripetute, seguite dal test post-hoc di Tukey per identificare le differenze tra i gruppi. I dati categorici sono stati espressi come numeri (percentuali) e i confronti tra gruppi sono stati analizzati mediante il test del chi-quadrato. Il test di Wilcoxon-Mann-Whitney è stato applicato per i dati non parametrici. Inoltre, è stata costruita una curva ROC per valutare il valore predittivo dei livelli sierici di espressione di miR-486-3p e dell'ecografia polmonare (LUS) nella determinazione della mortalità nei pazienti pediatrici con ARDS. È stata utilizzata l'analisi di correlazione di Pearson per esaminare le correlazioni. Tutti i gruppi sperimentali comprendevano tre repliche biologiche indipendenti e repliche tecniche. L'unità statistica è stata definita come un esperimento indipendente, con ogni replica biologica rappresentante un diverso lotto di colture cellulari derivato da passaggi differenti, mentre le repliche tecniche sono state utilizzate per ridurre la variabilità all'interno dell'esperimento. I dati provenienti dalle repliche tecniche sono stati prima mediati, quindi l'analisi statistica è stata effettuata sulla base dei valori medi delle repliche biologiche. La significatività statistica è stata stabilita a p < 0,05.
Risultati
Dati di base comparabili tra i gruppi
Le caratteristiche generali dei neonati inclusi nello studio sono riportate nella Tabella 1. Non sono state osservate differenze significative nelle caratteristiche demografiche di base tra i due gruppi: età gestazionale (36,07 ± 2,71 vs. 35,72 ± 2,64 settimane, p = 0,347), proporzione di sesso maschile (59,0% vs. 66,1%, p = 0,290), peso alla nascita (3,39 ± 0,57 vs. 3,33 ± 0,55 kg, p = 0,437), età materna (29,18 ± 4,00 vs. 29,66 ± 4,05 anni, p = 0,387) e modalità di parto (vaginale: 54,0% vs. 58,0%; cesareo: 46,0% vs. 42,0%, p = 0,554), indicando che i gruppi erano comparabili. Sulla base della valutazione radiografica del torace, nel gruppo con SDRA, 72 casi (64,3%) sono stati classificati come lievi (grado I-II), mentre 40 casi (35,7%) sono stati classificati come gravi (grado III-IV).
La gravità dell'ARDS è correlata alla prognosi del paziente
L'analisi comparativa degli esiti di sopravvivenza tra il gruppo di bambini con SDRA sopravvissuti e quelli deceduti è presentata nella Tabella 2. Tra i 112 neonati diagnosticati con SDRA, 84 casi (75%) sono sopravvissuti, mentre 28 casi (25%) hanno portato a decesso. In particolare, non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i due gruppi per quanto riguarda l'età del neonato, il sesso, il peso alla nascita, l'età materna, la modalità di parto, le caratteristiche del liquido amniotico, l'eziologia o altre variabili (p > 0,05). Tuttavia, è stata osservata una differenza significativa nella gravità della SDRA (p < 0,01), evidenziando un fattore prognostico critico.
miR-486-3p e LUS sono aumentati nella sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). L'analisi mediante RT-qPCR ha rivelato che i livelli sierici di miR-486-3p erano significativamente elevati nei neonati con ARDS rispetto ai controlli sani. Inoltre, all'interno del gruppo ARDS, il gruppo grave presentava livelli notevolmente più alti rispetto al gruppo lieve (P < 0,001) (Figura 1A). Inoltre, il punteggio LUS era più alto nel gruppo ARDS grave rispetto al gruppo ARDS lieve (p < 0,001) (Figura 1B). Dividendo i pazienti con ARDS in base all'esito clinico, il gruppo deceduto mostrava livelli di LUS e di miR-486-3p marcatamente più elevati rispetto al gruppo dei sopravvissuti (Figura 1C,D). È stata riscontrata una forte correlazione positiva tra LUS e miR-486-3p sierico nei pazienti non sopravvissuti (r = 0,832, p < 0,001) (Figura 1E).
La rilevazione combinata migliora la previsione prognostica
Sulla base del protocollo di analisi ROC, abbiamo valutato le prestazioni prognostiche di indicatori singoli e combinati. I valori di AUC di LUS e miR-486-3p per la predizione della mortalità a breve termine sono stati rispettivamente 0,873 (IC 95%: 0,809-0,936) e 0,883 (IC 95%: 0,822-0,944). I valori di sensibilità sono stati 89,3% e 96,4%, mentre i valori di specificità sono stati rispettivamente 73,8% e 77,4%. I valori ottimali di cutoff per LUS e miR-486-3p sono stati rispettivamente 15,500 e 1,465. Inoltre, l'AUC per il modello predittivo combinato è stata 0,929 (IC 95%: 0,883-0,975), con una sensibilità del 92,9% e una specificità dell'84,5% al valore ottimale di cutoff di 1,659 (Figura 1F).
L'upregolazione di miR-486-3p compromette la funzione cellulare
Dopo il protocollo di coltura cellulare e di intervento con LPS, abbiamo costruito un modello cellulare di ARDS in vitro utilizzando cellule HPMEC. I risultati della qPCR hanno mostrato che l'espressione di miR-486-3p è aumentata gradualmente nel tempo dopo la stimolazione con LPS (Figura 2A). miR-486-3p è stato sovraespresso o silenziato per studiarne gli effetti sulle cellule del modello di ARDS (Figura 2B). In accordo con i protocolli degli assay CCK-8 e di citometria a flusso, sono state valutate la proliferazione e l'apoptosi cellulare. La sovraespressione di miR-486-3p ha significativamente inibito la proliferazione cellulare e promosso l'apoptosi. Al contrario, il silenziamento di miR-486-3p ha attenuato il danno cellulare indotto dal LPS (Figura 2C,D).
miR-486-3p riduce l'espressione di DLL4
Secondo il protocollo di costruzione del plasmide e del saggio del reporter a doppia luciferasi, abbiamo verificato l'interazione tra miR-486-3p e DLL4. La previsione bioinformatica ha confermato un sito di legame conservato tra miR-486-3p e la regione 3’UTR di DLL4 (Figura 3A). L'attività della luciferasi nel gruppo wild-type di DLL4 è risultata significativamente ridotta dopo la sovraespressione di miR-486-3p, mentre nessun cambiamento evidente è stato osservato nel gruppo mutante (Figura 3B), dimostrando che DLL4 è un gene bersaglio diretto di miR-486-3p. Nei modelli cellulari, l'espressione di DLL4 è diminuita in maniera dipendente dal tempo dopo il trattamento con LPS (Figura 3C). La modulazione dell'espressione di miR-486-3p ha regolato negativamente anche i livelli di DLL4 (Figura 3D).
Nei campioni clinici, l'espressione di DLL4 era inferiore nei neonati con ARDS rispetto ai controlli sani e ulteriormente ridotta nel gruppo dei deceduti (Figura 3E–F). È stata osservata una correlazione negativa tra miR-486-3p e DLL4 nei pazienti non sopravvissuti (r = -0,795, P < 0,001) (Figura 3G). Tutti i test di qPCR per DLL4 sono stati eseguiti con tre replicati tecnici e i risultati si sono rivelati stabili.
DLL4 inverte il danno cellulare mediato da miR-486-3p
Dopo il protocollo di co-trasfezione utilizzando il mimico di miR-486-3p e il plasmide di sovraespressione di DLL4, abbiamo effettuato esperimenti di recupero. La qPCR ha confermato che l'espressione di DLL4 era stata efficacemente ripristinata dopo la trasfezione con OE-DLL4 (Figura 4A). Test funzionali hanno mostrato che la sovraespressione di DLL4 ha parzialmente invertito l'effetto inibitorio di miR-486-3p sulla proliferazione cellulare e il suo effetto pro-apoptotico (Figura 4B,C). Questi risultati hanno indicato che miR-486-3p modula parzialmente l'attività cellulare mirando DLL4.
Disponibilità dei dati:
Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono forniti come File Supplementare 1.
Figura 1: Confronto tra LUS e livello sierico di miR-486-3p tra i gruppi. (A) Livelli sierici di miR-486-3p nei neonati sani e nei neonati con SDRA. (B) Valori di LUS nei neonati sani e nei neonati con SDRA. (C) Livelli sierici di miR-486-3p nel gruppo dei sopravvissuti e nel gruppo dei deceduti. (D) Valori di LUS nel gruppo dei sopravvissuti e nel gruppo dei deceduti. (E) Analisi della correlazione tra miR-486-3p sierico e LUS nei neonati con SDRA non sopravvissuti. (F) Curve ROC del singolo LUS, del singolo miR-486-3p e del rilevamento combinato per la previsione della prognosi della SDRA neonatale. Tutti i dati quantitativi sono espressi come media ± deviazione standard; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. *** = p <0,001, rispetto al gruppo sano; ### = p <0,001, rispetto al gruppo con SDRA lieve. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetto di miR-486-3p sulle cellule del modello di SDRA. (A) Variazioni dipendenti dal tempo dell'espressione di miR-486-3p nelle HPMEC dopo trattamento con LPS. (B) Espressione relativa di miR-486-3p dopo interventi di sovraespressione e silenziamento. (C) Attività proliferativa cellulare rilevata mediante saggio CCK-8 dopo la modulazione dell'espressione di miR-486-3p. (D) Tasso di apoptosi cellulare rilevato mediante citometria a flusso dopo la modulazione dell'espressione di miR-486-3p. Tutti i dati sono presentati come media ± deviazione standard; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Indicatori statistici: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Verifica della relazione di targeting tra miR-486-3p e DLL4. (A) Diagramma schematizzato del sito di legame previsto tra miR-486-3p e la regione 3’UTR di DLL4. (B) Il saggio del gene reporter a doppia luciferasi ha confermato la relazione di targeting tra miR-486-3p e DLL4. (C) Cambiamenti dinamici dell'espressione di DLL4 in HPMEC dopo trattamento con LPS. (D) Espressione di DLL4 dopo sovraespressione o silenziamento di miR-486-3p. (E) Livelli sierici di DLL4 in neonati sani e in neonati con ARDS. (F) Livelli di DLL4 nei gruppi di sopravvivenza e di decesso tra i neonati con ARDS. (G) Analisi della correlazione tra miR-486-3p sierico e DLL4 nei neonati con ARDS non sopravvissuti. Tutti i dati quantitativi sono mostrati come media ± deviazione standard; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Marcatori statistici: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 rispetto al gruppo sano, ### = p <0,001 rispetto al gruppo con ARDS lieve. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetto del targeting di DLL4 da parte di miR-486-3p su cellule in un modello di ARDS. (A) Rilevazione dell'espressione di DLL4 dopo la co-trasfezione del mimico di miR-486-3p e del plasmide di sovraespressione di DLL4. (B) Variazioni dell'attività proliferativa cellulare dopo il recupero di DLL4. (C) Variazioni del tasso di apoptosi cellulare dopo il recupero di DLL4. Tutti i dati sono presentati come media ± deviazione standard; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Indicatori statistici: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Variabile | Sani (n=100) | ARDS neonatale (n=112) | p-valore |
| Età gestazionale (settimane) | 36,07 ± 2,71 | 35,72 ± 2,64 | 0,347 |
| Sesso (maschio, %) | 59 (59,0 %) | 74 (66,1 %) | 0,29 |
| Peso alla nascita (kg) | 3,39 ± 0,57 | 3,33 ± 0,55 | 0,437 |
| Età materna (anni) | 29,18 ± 4,00 | 29,66 ± 4,05 | 0,387 |
| Metodo di parto | 0,439 | ||
| Vaginale | 54 (54,0 %) | 65 (58,0 %) | |
| Cesareo | 46 (46,0 %) | 47 (42,0 %) | |
| Gradi di ARDS | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64,3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35,7 %) |
Tabella 1: Caratteristiche basali dei neonati inclusi. Questa tabella riassume le informazioni demografiche basali dei neonati sani e dei neonati con SDRA. I dati sono espressi come media ± deviazione standard per le variabili continue e come numero (percentuale) per le variabili categoriali. I valori di P indicano le differenze statistiche tra i gruppi. Abbreviazioni: ARDS = sindrome da distress respiratorio acuto.
| Variabile | Sopravvivenza (n=84) | Morte (n=28) | p-valore |
| Età gestazionale (settimane) | 35,95 ± 2,58 | 35,04 ± 2,76 | 0,112 |
| Sesso (maschio, %) | 53 (63,1 %) | 21 (75,0 %) | 0,253 |
| Peso alla nascita (kg) | 3,37 ± 0,58 | 3,23 ± 0,42 | 0,248 |
| Età materna (anni) | 29,49 ± 3,82 | 30,18 ± 4,74 | 0,438 |
| Metodo di parto | 0,444 | ||
| Vaginale | 47 (56,0 %) | 18 (64,3 %) | |
| Cesareo | 37 (44,0 %) | 10 (35,7 %) | |
| Liquido amniotico anomalo | 6 (9,5 %) | 4 (14,3 %) | 0,485 |
| Gradi di SDRA | 0,001** | ||
| I-II | 61 (72,6 %) | 11 (39,3 %) | |
| III-IV | 23 (27,4 %) | 17 (60,7 %) | |
| Eziologia | 0,827 | ||
| Soffocamento | 33 (39,3 %) | 12 (42,9 %) | |
| Polmonite | 17 (20,2 %) | 6 (21,4 %) | |
| Setticemia | 12 (14,3 %) | 2 (7,1 %) | |
| Sindrome da aspirazione di meconio | 22 (26,2 %) | 8 (28,6 %) |
Tabella 2: Confronto dei dati clinici tra il gruppo dei sopravvissuti e il gruppo dei deceduti nei neonati con SDRA. Questa tabella confronta gli indicatori clinici tra neonati con SDRA sopravvissuti e non sopravvissuti. I dati continui sono espressi come media ± deviazione standard, mentre i dati categorici sono espressi come numero (percentuale). I valori di p indicano la significatività statistica tra i due gruppi. ** = p<0,01. Abbreviazioni: SDRA = sindrome da distress respiratorio acuto.
File supplementare 1: Set di dati clinici e sperimentali grezzi che supportano i risultati di questo studio, inclusi i dati a livello individuale relativi al punteggio ecografico polmonare (LUS), all'espressione sierica di miR-486-3p, all'espressione di DLL4 e ai risultati dei saggi cellulari.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
L'ARDS neonatale è una delle principali cause di insufficienza respiratoria e mortalità precoce tra i neonati gravemente malati15. Una valutazione tempestiva e accurata della gravità della malattia e della prognosi rappresenta un prerequisito per interventi individualizzati e per la riduzione della mortalità. Un numero crescente di evidenze conferma che i microRNA partecipano alla progressione patologica dell'ARDS e si configurano come promettenti biomarcatori circolanti16. Studi indicano che miR-155 è marcatamente elevato nei pazienti settici affetti da lesione polmonare acuta/ARDS17. Inoltre, ricerche hanno evidenziato un aumento dei livelli sierici di miR-629-5p nei bambini diagnosticati con ARDS18. Il miR-34a sierico è strettamente correlato alla gravità e alla prognosi della SDN neonatale19. Nuovi studi dimostrano che miR-375 rappresenta un biomarcatore diagnostico e prognostico per l'ARDS neonatale20. Analogamente a queste molecole descritte, miR-486-3p sierico può essere rilevato stabilmente nel sangue periferico mediante PCR quantitativa ed è adatto per lo screening rapido nelle unità di terapia intensiva neonatale (NICU). Rispetto a miR-375 e miR-34a, che riflettono principalmente l'esordio precoce della malattia, l'espressione di miR-486-3p è più strettamente correlata alla gravità delle lesioni polmonari e varia dinamicamente in parallelo con il peggioramento della lesione polmonare. In combinazione con l'ecografia polmonare (LUS), consente una maggiore accuratezza prognostica riguardo alla mortalità a breve termine. Tuttavia, miR-486-3p presenta una specificità per la malattia relativamente bassa e le evidenze cliniche disponibili sono ancora limitate rispetto a quelle relative ai biomarcatori miRNA ben consolidati. Nel complesso, miR-486-3p potrebbe rappresentare un marcatore utile per la diagnosi ausiliaria o la previsione prognostica dell'ARDS neonatale.
L'ecografia polmonare (LUS) è un indicatore maturo di imaging al letto del paziente che valuta l'aerazione polmonare in base alle caratteristiche ultrasoniche del tessuto polmonare21. In particolare, la LUS si rivela una metrica quantitativa efficace per misurare l'entità della ventilazione alveolare22. Studi hanno confermato la sua utilità nella valutazione sia della gravità sia della prognosi della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) nei neonati23. In linea con ricerche precedenti, il nostro studio clinico ha evidenziato che i valori di LUS nei neonati affetti da ARDS erano significativamente più elevati rispetto a quelli dei neonati sani. Inoltre, tra i neonati colpiti, il sottogruppo con forma grave presentava valori di LUS marcatamente superiori rispetto al sottogruppo con forma lieve, evidenziando una relazione diretta tra valori elevati di LUS e la gravità di atelectasia, edema polmonare e consolidamento polmonare24. I nostri risultati hanno inoltre indicato che i pazienti deceduti presentavano valori di LUS notevolmente più alti rispetto ai sopravvissuti. È stata osservata una forte correlazione positiva tra LUS e miR-486-3p sierico nei neonati non sopravvissuti, ulteriore conferma del valore sinergico dei due indicatori. Ogni metodo presenta caratteristiche intrinseche: la LUS è priva di radiazioni, portatile e adatta al monitoraggio in tempo reale al letto del paziente, ma la sua interpretazione dipende fortemente dall'esperienza dell'operatore ed è soggetta a bias soggettivi. L'analisi del miR-486-3p sierico fornisce risultati quantitativi oggettivi e ripetibili, ma non è in grado di riflettere i cambiamenti morfologici in tempo reale del tessuto polmonare. Nella pratica clinica, si raccomanda l'uso routinario di questo approccio combinato nelle terapie intensive neonatali. È indicato per la stratificazione precoce del rischio nei neonati con sospetta o confermata ARDS, per la valutazione dinamica regolare dell'evoluzione della malattia e per il giudizio ausiliario della prognosi clinica a breve termine. Tuttavia, questo metodo non intende sostituire esami di imaging definitivi o indagini eziologiche; presenta una specificità limitata quando applicato a neonati affetti da altre malattie polmonari infiammatorie. Inoltre, poiché la nostra ricerca è stata condotta in un singolo centro, la sua applicabilità a popolazioni di diverse aree geografiche deve ancora essere verificata.
Clinicamente, abbiamo osservato che valori elevati di LUS, associati a livelli elevati di miR-486-3p sierico, erano correlati a una prognosi sfavorevole nella sindrome da distress respiratorio neonatale (ARDS), suggerendo che miR-486-3p potrebbe essere strettamente legato a un danno vascolare polmonare grave e a una ridotta capacità di riparazione vascolare nel polmone immaturo. I nostri esperimenti cellulari in vitro hanno integrato questa osservazione clinica dimostrando che miR-486-3p modula direttamente la proliferazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali, processi fondamentali che regolano l'integrità e la riparazione vascolare nel polmone neonatale. Inoltre, studi hanno dimostrato che gli miRNA svolgono ruoli cruciali in diversi processi cellulari25,26. È ben noto che gli miRNA esercitano principalmente i loro effetti attraverso la regolazione post-trascrizionale di geni bersaglio, coinvolgendo prevalentemente lo splicing degli miRNA e la repressione della traduzione proteica27. Il gene DLL4 svolge un ruolo importante nello sviluppo vascolare e nell'angiogenesi28. Ricerche hanno indicato che la famiglia microRNA-30 bersaglia DLL4 per modulare il comportamento delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi29. Questi risultati suggeriscono che la modulazione di DLL4 nell'endotelio potrebbe essere associata al danno vascolare polmonare nell'ARDS neonatale. Nella nostra indagine, abbiamo identificato e validato la relazione di targeting tra miR-486-3p e DLL4. Analisi successive hanno rivelato che un'espressione elevata di miR-486-3p inibisce significativamente la proliferazione delle HPMEC indotta da LPS, promuovendone al contempo l'apoptosi. In modo significativo, l'espressione di DLL4 è stata in grado di invertire parzialmente gli effetti mediati da miR-486-3p. Ciò suggerisce che miR-486-3p bersaglia DLL4 per influenzare la funzione delle HPMEC e regolare l'evoluzione dell'ARDS neonatale. Tuttavia, se esso influisca direttamente sulla disfunzione vascolare polmonare e contribuisca all'ARDS rimane da verificare ulteriormente. È degno di nota che DLL4 inverte solo parzialmente i cambiamenti cellulari indotti da miR-486-3p. In quanto miRNA tipico, miR-486-3p modula numerosi geni bersaglio a valle. Studi futuri si concentreranno sull'identificazione di ulteriori geni bersaglio per chiarire il meccanismo completo di miR-486-3p nell'ARDS neonatale.
Infine, va sottolineato che la rigorosa standardizzazione dei passaggi chiave del protocollo garantisce dati affidabili e ripetibili. Abbiamo uniformato le procedure di raccolta dei campioni, adottato protocolli standardizzati per la coltura cellulare e la trasfezione, e incluso repliche indipendenti per ridurre al minimo gli errori sperimentali. I problemi operativi comuni e le relative soluzioni sono riassunti di seguito: per la valutazione mediante LUS, standardizzare il protocollo di scansione a 12 regioni e le regole di punteggio uniformate, e regolare la postura del neonato per ottenere immagini chiare. Per il rilevamento di miRNA sierici, evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento, verificare la purezza dell'RNA (A260/A280 = 1,8–2,1) ed includere repliche tecniche. Per i modelli cellulari indotti da LPS, utilizzare LPS appena preparato a 1 mg/L e condizioni di coltura stabili. Ottimizzare la confluenza cellulare e il rapporto tra i reagenti durante la trasfezione, e sostituire il mezzo per ridurre la citotossicità. Assicurare una lisi cellulare completa e operazioni standardizzate per i saggi con dual-luciferasi.
Nel complesso, rispetto ai metodi convenzionali come l'imaging toracico, l'analisi dei gas del sangue e il test di un singolo biomarcatore, la strategia combinata LUS/miR-486-3p è priva di radiazioni, a basso costo e facile da eseguire, con prestazioni predittive migliorate. Funziona come uno strumento prognostico complementare affidabile per la sindrome da distress respiratorio acuto neonatale (ARDS). Clinicamente, questo metodo può essere applicato per la stratificazione precoce del rischio e il monitoraggio dinamico delle condizioni nelle terapie intensive neonatali. Può inoltre fungere da indice di valutazione unificato per studi multicentrici. Dal punto di vista meccanicistico, l'asse miR-486-3p/DLL4 validato fornisce nuove indicazioni per l'esplorazione dei meccanismi patologici e per la terapia mirata. Tuttavia, questo approccio combinato presenta anche limitazioni tecniche intrinseche. I risultati dell'ecografia polmonare (LUS) variano tra operatori diversi e l'miR-486-3p manca di specificità per le malattie polmonari infiammatorie. Questo metodo consente solo rilevazioni in un singolo punto temporale e non può sostituire esami definitivi di imaging o indagini eziologiche.
Nonostante i risultati promettenti, diverse limitazioni meritano attenzione. In primo luogo, il disegno dello studio basato su un'unica istituzione limita la generalizzabilità delle nostre conclusioni. In secondo luogo, non abbiamo avuto a disposizione una coorte di validazione esterna per verificare l'affidabilità delle prestazioni predittive del pannello LUS/miR-486-3p. In terzo luogo, i livelli sierici di miR-486-3p sono stati misurati in un unico momento temporale, impedendo così di cogliere la sua associazione dinamica con il decorso della malattia. In quarto luogo, l'assenza di analisi proteiche supplementari e di validazione in vitro/in vivo limita la robustezza delle nostre inferenze meccanicistiche. Infine, il ruolo specifico del miR-486-3p nella fisiopatologia dell'ARDS neonatale rimane in gran parte poco chiarito e richiede ulteriori indagini. In conclusione, l'aumento del punteggio LUS e i livelli elevati di miR-486-3p nel siero nei neonati diagnosticati con ARDS rappresentano punti di riferimento significativi nella pratica clinica. La valutazione sinergica di questi due biomarcatori potrebbe facilitare una previsione accurata sia della gravità sia della prognosi dell'ARDS neonatale, dimostrando così un certo valore applicativo clinico.
Dichiarazioni
Grammarly è stato utilizzato per l'ottimizzazione dell'espressione in inglese, la verifica grammaticale e la standardizzazione del formato. Tutte le idee di ricerca, gli esperimenti, i dati e le conclusioni sono opera originale degli autori.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi PCR da 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Soluzione di Tripsina-EDTA al 0,25% | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Tubi microcentrifuga da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Incubatore per colture cellulari con CO₂ al 5% e umidità controllata | Thermo Fisher | 3111 | |
| Piastre per coltura cellulare a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Piastre per coltura cellulare a 96 pozzetti | Corning | 3599 | |
| Etilene assoluto | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Kit per rilevamento dell'apoptosi Annexina V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Centrifuga da banco | Eppendorf | 5810R | |
| Cappa a sicurezza biologica | Thermo Fisher | 1300 Series A2 | |
| Kit per conteggio cellulare CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Tubi monouso sterili per prelievo di sangue | BD Vacutainer | 367815 | |
| Plasmide di sovraespressione DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| Plasmide reporter luciferasi DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| Plasmide reporter luciferasi DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| Mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Kit per saggio Dual-Luciferasi | Biolab | BL101A | |
| Lettore per saggio immunoenzimatico (ELISA) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Punte filtranti per pipetta (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Tubi per citometria a flusso | BD Biosciences | 352054 | |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolisaccaride (LPS) da E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Sistema per ecografia polmonare | Mindray | M9 | |
| Spettrofotometro microvolume | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| Inibitore di miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| Mimetico di miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| Set di primer per qPCR di miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Inibitore controllo negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Mimetico controllo negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Plasmide di sovraespressione controllo negativo (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Soluzione di Penicillina-Streptomicina (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Set di pipette (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Soluzione di colorazione con Ioduro di Propidio (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| Sistema per PCR quantitativa in tempo reale | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| Acqua priva di RNasi | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| RT-PCR Quick Master Mix | Toyobo | FSQ-101 | |
| Pipette monouso sterili | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| SYBR Green Real-time PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| Set di primer per qPCR di U6 snRNA | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Mixer vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Riferimenti
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