Articolo metodologico

Preparazione di campioni di midollo osseo fissati in formalina e inclusi in paraffina per la trascrittomica spaziale mediante decalcificazione basata su EDTA

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DOI:

10.3791/72474

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28 agosto 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In questo articolo

Sommario

Un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione di campioni ossei fissati in formalina e inclusi in paraffina per l'analisi della trascrittomica spaziale include un passaggio di decalcificazione con EDTA della durata di 10 giorni, finalizzato a preservare l'integrità dell'RNA. Punti critici chiave di controllo della qualità aiutano a determinare se i campioni soddisfano i requisiti per l'analisi successiva dell'espressione genica spaziale.

Abstract

Il midollo osseo (MO) è una struttura complessa e dinamica in cui le relazioni spaziali influenzano il comportamento cellulare, la segnalazione e la funzione. Per questo motivo, comprendere appieno la dinamica delle interazioni cellulari richiede tecniche complementari di tipo spaziale in grado di preservare e mappare l'architettura delle popolazioni cellulari in situ. Nonostante i notevoli progressi ottenuti con le tecnologie single-cell, che hanno contribuito a chiarire l'eterogeneità trascrizionale del tessuto midollare sano e patologico, l'organizzazione spaziale dei diversi tipi cellulari, i programmi regolatori specifici delle nicchie e le loro interazioni necessitano ancora di ulteriori studi. I recenti sviluppi della trascrittomica spaziale hanno reso possibile l'analisi imparziale dell'espressione genica con contesto spaziale in diversi tessuti, rendendo queste tecnologie complementari ai metodi single-cell, che mancano di risoluzione spaziale. Sebbene la trascrittomica spaziale sia stata ampiamente utilizzata nei tessuti molli, il suo impiego in tessuti mineralizzati come il MO rimane limitato a causa delle difficoltà associate all'elaborazione del tessuto osseo. Il protocollo qui presentato è stato impiegato per preparare campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) provenienti da tessuti murini e umani sani e patologici. È previsto un passaggio di decalcificazione basato sull'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) della durata di 10 giorni, al fine di preservare l'integrità dell'RNA e consentire l'applicazione della trascrittomica spaziale su campioni di ossa lunghe. Questo protocollo descrive la preparazione di campioni di MO per l'analisi trascrittomica spaziale, inclusi l'elaborazione del tessuto, la conservazione e la sezionatura, nonché passaggi essenziali di valutazione della qualità, come la verifica dell'integrità delle sezioni, della morfologia tissutale e della qualità dell'RNA. Il flusso di lavoro supporta inoltre l'identificazione dei tipi cellulari e l'integrazione con dati trascrittomica single-cell per caratterizzare la composizione cellulare, definire le interazioni cellula-cellula e visualizzare la distribuzione spaziale delle cellule eterogenee dal punto di vista trascrizionale in condizioni sane e patologiche. Nel complesso, questo flusso di lavoro permette di preparare tessuti sani e maligni completamente mineralizzati per l'analisi trascrittomica spaziale, preservando al contempo l'architettura del midollo osseo.

Introduzione

Il midollo osseo (BM) è un organo altamente complesso e compartimentalizzato che rappresenta la sede primaria dell'emopoiesi e della maturazione delle cellule immunitarie1,2. Questo tessuto eterogeneo comprende una vasta gamma di linee cellulari emopoietiche, mesenchimali, endoteliali e immunitarie che coesistono in un nicchia tridimensionale altamente specializzata e organizzata3,4. All'interno di questa nicchia, ciascuna popolazione cellulare occupa territori anatomici distinti, e il contesto spaziale svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento cellulare, della segnalazione e della funzione4,5. La vicinanza fisica a strutture specifiche, come l'osso trabecolare o le reti vascolari, regola processi fisiologici essenziali, tra cui il mantenimento della quiescenza delle cellule staminali emopoietiche (HSC) e il rimodellamento osseo6,7. Di conseguenza, questo microambiente dinamico e le interazioni strettamente regolate tra i suoi componenti cellulari e stromali modellano le reti di regolazione che mantengono l'omeostasi e influenzano l'evoluzione delle malattie ematologiche maligne8,9,10,11,12,13.

I progressi nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno rivoluzionato la nostra comprensione della diversità cellulare del midollo osseo (BM), consentendo la scoperta di sottotipi cellulari precedentemente non riconosciuti e delle loro interazioni previste all'interno della nicchia3,10,11,12,14,15,16. Tuttavia, la trascrittomica a singola cellula, sebbene fornisca informazioni ad alta risoluzione sui singoli componenti della nicchia ematopoietica, è intrinsecamente limitata dal processo di digestione del tessuto, che dissocia le cellule dal loro ambiente nativo e potenzialmente ne altera lo stato originale17, e dalla mancanza di contesto spaziale che definisce l'organizzazione del tessuto osseo4,18. La perdita di questo contesto posizionale rende impossibile mappare con certezza dove risiedono specifiche popolazioni distinte dal punto di vista trascrizionale o come interagiscono con le cellule vicine19. Inoltre, il tessuto osseo denso viene spesso dissociato solo parzialmente, con conseguente sottorappresentazione di popolazioni cellulari chiave, come osteociti e adipociti, nei dataset di scRNA-seq e una rappresentazione distorta dell'eterogeneità tissutale20,21. La trascrittomica spaziale permette lo studio dell'espressione genica in situ, all'interno di sezioni tissutali con struttura spaziale preservata, recuperando così informazioni contestuali e superando i limiti delle tecnologie a singola cellula8,19,22,23,24,25,26. Questa tecnologia rappresenta un progresso essenziale nel campo, poiché consente il posizionamento spaziale preciso e l'organizzazione strutturale delle diverse popolazioni cellulari che compongono il midollo osseo, aspetti indispensabili per comprendere le loro interazioni e i loro ruoli funzionali all'interno del microambiente nativo8,26. Inoltre, nel contesto delle malattie, la trascrittomica spaziale permette a ricercatori e clinici di colmare il divario tra la patologia tradizionale e la genomica ad alto rendimento, consentendo di sovrapporre dati molecolari a immagini morfologiche1,8. Le tecnologie di trascrittomica spaziale possono essere classificate in due grandi gruppi: metodi basati sul sequenziamento e metodi basati sull'imaging17,24. Le piattaforme basate sul sequenziamento, come Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) e l'open-source Open-ST, catturano l'mRNA su array o microsfere con codici a barre spaziali prima del sequenziamento di nuova generazione. I metodi basati sull'imaging, tra cui Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX e Xenium, visualizzano direttamente i trascritti in situ mediante ibridazione multiplex o chimica dei sonde a lucchetto (padlock probe)27,28. In alternativa, le piattaforme possono essere classificate come mirate (targeted) o non mirate (untargeted), a seconda che richiedano o meno la rilevazione mediante sonde specifiche17,24.

I metodi di trascrittomica spaziale sono stati ampiamente applicati a tessuti molli, come il cervello, il cuore e il fegato, dove la produzione di sezioni istologiche intatte è semplice29,30,31. Al contrario, l'applicazione della trascrittomica spaziale all'osso è notevolmente più complessa a causa della sua natura mineralizzata, che richiede un processo di decalcificazione32,33, ovvero la rimozione controllata di fosfato di calcio, necessaria per ammorbidire il tessuto abbastanza da permetterne la sezionatura e l'analisi istologica o molecolare successiva8,20,23,34. I metodi tradizionali di decalcificazione comunemente utilizzati nella pratica clinica si basano tipicamente su soluzioni acide aggressive, come acido cloridrico, nitrico, formico o fosforico, che degradano gravemente l'integrità dell'RNA e alterano la morfologia cellulare35,36. Tale degradazione molecolare riduce il rapporto segnale-rumore nei saggi spaziali, portando spesso a tassi di rilevamento genico inaccettabilmente bassi rispetto ai tessuti molli8,10. Questa limitazione evidenzia la necessità di protocolli standardizzati di decalcificazione in grado di preservare in modo affidabile l'integrità dell'mRNA in campioni mineralizzati per analisi spaziali basate sul sequenziamento8,20.

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione di campioni di midollo osseo fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) per la trascrittomica spaziale, precedentemente applicato da Muiños-Lopez et al.8. Il flusso di lavoro include un passaggio di decalcificazione della durata di 10 giorni mediante acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a pH controllato. A differenza degli acidi aggressivi, l'EDTA agisce come un chelante delicato che preserva la struttura microscopica e mantiene la qualità degli acidi nucleici, rendendolo adatto per applicazioni molecolari8,20,33,36,37. A scopo dimostrativo, il protocollo è stato applicato a campioni di tessuto osseo provenienti da modelli murini sani e affetti da mieloma multiplo (MM), nonché a campioni di midollo osseo umano ottenuti sia da individui sani che malati; i campioni sono stati successivamente sequenziati sulla piattaforma Visium Spatial Gene Expression38. Il flusso di lavoro comprende procedure standardizzate per il reperimento del tessuto da campioni ossei umani e murini, fissazione, decalcificazione, disidratazione, inclusione in paraffina e sezionamento, seguite da una pipeline completa di controllo della qualità che include la valutazione dell'integrità dei sezioni, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), la valutazione della qualità dell'RNA (DV200) e, opzionalmente, l'immunofluorescenza (IF) per la verifica del tipo cellulare. Questi passaggi preparatori garantiscono che solo sezioni di alta qualità proseguano nei successivi flussi di lavoro di trascrittomica spaziale, inclusi il pretrattamento dei sezioni, la costruzione di librerie, il sequenziamento e l'analisi della qualità e dei dati risultanti.

Questa procedura standardizzata supporta la preparazione e la valutazione della qualità di campioni di MO umana e murina per l'analisi transcriptomica spaziale. È pensata per facilitare lo studio di programmi regolatori specifici del nicchio in disturbi ematologici e scheletrici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Università di Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protocolli CEEA082-20 e CEEA039-20). La cura, il trattamento e l'eutanasia degli animali sono stati eseguiti nel rispetto della legislazione spagnola al fine di minimizzare dolore e sofferenza.

Lo studio umano è stato approvato dal Comitato di Etica per la Ricerca dell'Università di Navarra, Facoltà di Medicina (Comisión de Ética de Investigación, CEI; progetti 2022.100mod1 e 2023.172) e dal Comitato di Etica per la Ricerca del Servizio Sanitario di Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Tutte le procedure che coinvolgevano partecipanti umani sono state condotte in conformità con i principi etici della Dichiarazione di Helsinki. I dati personali sono stati trattati in forma riservata, nel rispetto della Legge Organica spagnola 3/2018 sulla Protezione dei Dati Personali e sulla Garanzia dei Diritti Digitali e della Legge spagnola 14/2007 sulla Ricerca Biomedica.

NOTA: Una lista dettagliata dei reagenti e dell'attrezzatura utilizzati in questo studio è riportata nella Tabella dei Materiali. Il percorso sperimentale completo per l'implementazione della trascrittomica spaziale nei tessuti ossei è illustrato schematicamente nella Figura 1 ed è organizzato in tre fasi operative: acquisizione del campione, controllo di qualità (QC) e profilazione trascrittomica spaziale. L'acquisizione del campione comprende il prelievo di frammenti ossei umani o murini, seguito da fissazione, decalcificazione con EDTA, disidratazione, inclusione in paraffina, sezione e preparazione dei vetrini. La fase di controllo di qualità valuta l'integrità istologica e la conservazione dell'RNA. Le sezioni ossee validate vengono quindi sottoposte a permeabilizzazione del tessuto direttamente sul vetrino, preparazione della libreria, sequenziamento e analisi dei dati.

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Figura 1: Flusso di lavoro per la raccolta dei campioni e la preparazione basata su EDTA per tessuti ossei murini e umani. Si raccolgono femori di topo e campioni ossei umani, che vengono fissati, decalcificati con EDTA, disidratati, inclusi in paraffina e sezionati. La qualità del campione viene valutata mediante colorazione H&E e analisi dell'integrità dell'RNA (valutazione DV200), seguite dalla pre-elaborazione del tessuto per trascrittomica spaziale, preparazione della libreria, sequenziamento e controllo di qualità dei dati. Abbreviazioni: BM = midollo osseo; DV200 = percentuale di frammenti di RNA più lunghi di 200 nucleotidi; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; H&E = ematossilina ed eosina; QC = controllo di qualità. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Acquisizione ed elaborazione dei campioni di tessuto osseo

  1. Prelevamento dell'osso del topo
    1. Anestetizzare gli animali con isoflurano al 5% e confermare la perdita dei riflessi.
    2. Una volta completamente anestetizzati, eseguire l'eutanasia mediante dislocazione cervicale seguendo le linee guida istituzionali e regolatorie.
      ​NOTA: L'eutanasia deve essere eseguita da personale addestrato e la morte deve essere confermata prima di procedere con il prelievo dei tessuti.
    3. Disinfettare la cute spruzzando etanolo al 70% sulla superficie dorsale del topo e, utilizzando forbici chirurgiche, praticare una piccola incisione per rimuovere con attenzione la pelle ed esporre gli arti posteriori.
    4. Dissezionare gli arti posteriori tagliando sopra l'articolazione dell'anca e trasferirli in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di soluzione salina tampone al fosfato di Dulbecco (DPBS) fredda. Porre il tubo sul ghiaccio.
    5. Rimuovere il muscolo e il tessuto connettivo adiacenti utilizzando pinze sterili e un bisturi.
    6. Trasferire le ossa in un contenitore sterile da 50 mL pre-riempito con DPBS pulita e fredda, quindi porre il contenitore sul ghiaccio.
    7. Procedere immediatamente con la fissazione del campione per preservare l'integrità del tessuto.
  2. Manipolazione dei campioni ossei umani
    1. Ricevere biopsie a core osseo o frammenti ossei chirurgici in contenitori sterili da 100 mL.
    2. Trasferire i frammenti ossei in un contenitore sterile pulito da 100 mL pre-riempito con DPBS fredda, quindi porlo sul ghiaccio.
    3. Procedere immediatamente con la fissazione del campione per preservare l'integrità del tessuto.
      ATTENZIONE: I campioni umani devono essere manipolati in condizioni BSL 2.
  3. Fissazione del tessuto osseo
    1. Prendere il contenitore da 50 mL o 100 mL contenente il campione osseo e scartare il DPBS.
    2. Etichettare le cassetine di plastica e inserire i campioni ossei in cassetine singole. Chiudere i coperchi saldamente per prevenire la perdita del tessuto durante le fasi successive di lavorazione.
      ​NOTA: Per i campioni di topo, posizionare un osso per cassetina. Per i campioni ossei umani, se necessario, utilizzare un bisturi sterile per tagliare il tessuto in frammenti di dimensioni sufficientemente piccole da entrare nelle cassetine standard, e posizionare un frammento per cassetina. Se i campioni ossei umani sono troppo duri per essere sezionati a questo stadio, possono essere lasciati integri e trasferiti nella soluzione decalcificante; una volta decalcificati, il tessuto ammorbidito può essere tagliato in frammenti di dimensioni adeguate e posizionato in cassetine etichettate.
    3. Aggiungere soluzione di formaldeide tamponata al 4% in un rapporto campione-fissativo di 1:20 e incubare il campione per 24 h a 4 °C.
      ATTENZIONE: Manipolare il fissativo all'interno di una cappa chimica a causa della sua tossicità e delle sue esalazioni volatili.
      NOTA: Evitare una fissazione eccessiva (>48 h), che riduce l'integrità dell'RNA nei flussi di lavoro FFPE39.
  4. Decalcificazione del tessuto osseo mineralizzato
    1. Scartare il formalina e lavare il campione osseo con acqua ultrapura. Risciacquare con acqua, agitare brevemente e scartare per eliminare eventuali residui di formalina.
    2. Preparare una soluzione di EDTA 0,25 M in acqua ultrapura e regolare il pH a 6,95.
      NOTA: Sebbene l'EDTA venga spesso regolato a pH 8,0 nei protocolli tradizionali di decalcificazione, questo protocollo utilizza l'EDTA a circa pH 6,95 per favorire una chelazione efficiente preservando al contempo la morfologia del tessuto e la qualità dell'RNA8.
    3. Aggiungere la soluzione di EDTA al contenitore contenente il campione osseo e incubare per 10 giorni a 4 °C con agitazione delicata.
      ​NOTA: Per i campioni di topo, circa 50 mL di soluzione di EDTA sono generalmente sufficienti. Per i campioni ossei umani, si utilizzano tipicamente circa 100 mL. Tuttavia, questo volume può essere adattato in base alle dimensioni dell'osso per assicurare un'immersione completa ed efficace decalcificazione.
    4. Dopo 5 giorni di decalcificazione, scartare la soluzione di EDTA e sostituirla con lo stesso volume di EDTA fresca, poiché la capacità chelante si satura nel tempo. Continuare l'incubazione nelle stesse condizioni.
    5. Dopo 10 giorni di incubazione, scartare la soluzione di EDTA e valutare se la decalcificazione è completa.
      1. Praticare un piccolo taglio con un bisturi sterile o inserire un ago sterile fine in un angolo o in una regione periferica del tessuto, scegliendo sempre un'area di bassa rilevanza analitica per evitare di alterare le regioni di interesse. Posizionare l'osso su una piastra di Petri sterile per stabilizzare il campione durante il taglio o l'inserimento dell'ago. Se il tessuto può essere tagliato facilmente o l'ago penetra con minima resistenza, il campione è adeguatamente decalcificato.
      2. Nel caso dei femori di topo, piegare delicatamente l'osso con le pinze per valutarne la flessibilità, un indicatore affidabile della completa rimozione del minerale.
        NOTA: La durata della fase di decalcificazione dipende dalle dimensioni e dallo spessore del campione osseo, nonché dal volume di EDTA utilizzato. Se l'osso rimane rigido dopo il periodo iniziale di incubazione, continuare la decalcificazione finché il tessuto non è sufficientemente morbido da poter essere tagliato facilmente. Un'eccessiva prolungazione potrebbe compromettere la qualità del tessuto e l'integrità dell'RNA, quindi l'estensione dovrebbe essere limitata al tempo minimo necessario per ottenere un ammorbidimento adeguato20.
  5. Disidratazione
    1. Lavare aggiungendo acqua ultrapura al contenitore contenente il campione osseo, quindi incubare per 5 min a 4 °C con agitazione.
    2. Scartare l'acqua e sostituirla con una soluzione di etanolo al 70%. Incubare per 1 h a 4 °C.
      NOTA: Questo passaggio può fungere da punto di sosta. I campioni possono essere conservati in etanolo al 70% a 4 °C prima di procedere con i passaggi successivi. La durata massima di conservazione non è stata validata sperimentalmente in questo protocollo, pertanto gli utenti dovrebbero procedere secondo le pratiche standard del proprio laboratorio.
    3. Disidratare in modo sequenziale il campione in concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 96%; 1 h ciascuna a 4 °C), seguite da etanolo al 100% per tutta la notte a 4 °C.
    4. Scartare l'etanolo al 100% e sostituirlo con xilene. Incubare per 4 h a temperatura ambiente (RT).
    5. Scartare il xilene e posizionare la cassetina del campione in un recipiente contenente paraffina fusa e pulita. Incubare nella paraffina fusa per tutta la notte a 60 °C.
      NOTA: Tempi di infiltrazione più brevi possono essere utilizzati quando sono disponibili sistemi di lavorazione assistiti da vuoto, poiché questi dispositivi facilitano una penetrazione più efficiente della paraffina40,41,42.
      ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene e soluzioni di etanolo a gradazione crescente devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica per garantire una corretta ventilazione e ridurre al minimo l'esposizione ai vapori tossici e infiammabili.
  6. Inclusione in paraffina
    ​NOTA: Pulire le superfici della stazione di inclusione con una soluzione decontaminante per RNasi per prevenire la degradazione dell'RNA.
    1. Accendere la stazione di inclusione e preriscaldare il serbatoio della paraffina, il bagno della paraffina per cassetine, il bagno della paraffina per stampi e la piastra riscaldante per stampi a 60 °C. Attivare la piastra fredda per farla raffreddare prima dell'inclusione.
    2. Lasciare sciogliere completamente la paraffina e solo successivamente posizionare le cassetine contenenti i campioni infiltrati di paraffina nel bagno della paraffina per cassetine. Incubare per 2 h per assicurare una completa rimozione del xilene prima dell'inclusione.
    3. Posizionare tutti gli stampi necessari nel bagno della paraffina per stampi.
      NOTA: Per i campioni umani, utilizzare stampi metallici standard per inclusione. Per i campioni di topo, utilizzare stampi di plastica compatibili con la piattaforma Visium che includono una cavità quadrata con dimensioni adatte al corretto posizionamento delle sezioni sui vetrini Visium. Poiché gli ossi interi di topo non entrano completamente nella cavità quadrata di questi stampi, tagliare le ossa immediatamente prima dell'inclusione utilizzando un bisturi sterile per ottenere frammenti di dimensioni adeguate. Uno o due frammenti ossei possono essere inclusi per stampo, a seconda delle loro dimensioni.
    4. Aggiungere uno strato sottile di paraffina fresca dispensando paraffina fusa dall'uscita centrale della stazione di inclusione.
    5. Aprire la cassetina e trasferire delicatamente il tessuto dalla cassetina allo stampo utilizzando pinze calde.
    6. Posizionare lo stampo riempito di paraffina sulla piastra riscaldante per stampi e, mentre la paraffina è ancora liquida, orientare il tessuto nel piano di taglio desiderato con pinze calde.
    7. Posizionare lo stampo sulla superficie fredda della stazione di inclusione per fissare brevemente la posizione del frammento osseo.
    8. Riempire completamente lo stampo con paraffina fusa dal dispensatore, assicurandosi che il tessuto sia completamente ricoperto e che non rimangano bolle d'aria di grandi dimensioni.
    9. Posizionare la cassetina etichettata sulla parte superiore dello stampo in modo che formi la base del blocco di paraffina.
    10. Trasferire lo stampo con la cassetina attaccata sulla piastra fredda della stazione di inclusione. Lasciare solidificare completamente la paraffina per 10 min, fino a quando il blocco non diventa opaco e rigido.
    11. Una volta solidificato, rimuovere il blocco di paraffina dallo stampo e conservarlo a 4 °C fino alla fase di sezionamento.
      NOTA: Questo passaggio può fungere da punto di sosta. Il blocco di paraffina può essere conservato a 4 °C; tuttavia, ogni volta che possibile, il sezionamento del tessuto e le analisi trascrittomica spaziale successive dovrebbero essere eseguiti il più presto possibile dopo l'inclusione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA durante la conservazione43,44.
  7. Sezionamento e preparazione dei vetrini
    NOTA: Pulire il microtomo e il bagno a immersione con una soluzione decontaminante per RNasi per prevenire la degradazione dell'RNA.
    1. Riempire il bagno a immersione con acqua distillata e preriscaldarlo a 42 °C. Accendere il microtomo e installare una nuova lama. Etichettare i vetrini con una matita.
    2. Montare il blocco di paraffina nel portacampione, assicurandosi che la cassetina sia orientata secondo il piano di taglio longitudinale desiderato.
      ​NOTA: Preparare un sacchetto di plastica pieno di ghiaccio e, quando il taglio diventa difficile a causa della morbidezza della paraffina, posizionare il sacchetto di ghiaccio direttamente sul blocco mentre è ancora montato sul microtomo, fissandolo con un elastico per alcuni minuti per indurire la paraffina e migliorare la qualità delle sezioni.
    3. Impostare lo spessore del microtomo a 20 µm ed eseguire i tagli di assestamento.
    4. Modificare l'impostazione del microtomo a 5 µm. Raccogliere quattro sezioni da 5 µm in un tubo microcentrifugo da 1,5 mL privo di RNasi e etichettato. Mantenere il tubo sul ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C.
    5. Continuare il sezionamento a 5 µm e far galleggiare i nastri nel bagno a immersione. Una volta che la sezione si è completamente espansa e senza grinze, prelevarla con il vetrino etichettato.
      1. Ogni numero stabilito di sezioni (ad esempio ogni 5-10 nastri, a seconda delle dimensioni del tessuto), raccogliere ulteriori 4 sezioni da 5 µm in un nuovo tubo da 1,5 mL etichettato. Ripetere questo processo fino a ottenere un totale di tre tubi da 1,5 mL contenenti sezioni da 5 µm.
        NOTA: Se il tessuto si incrina, si rompe o non può essere ottenuto in una sezione continua, il campione non è completamente decalcificato e richiede ulteriore tempo di decalcificazione. Recuperare il campione invertendo i passaggi del protocollo fino a raggiungere la fase di decalcificazione. A tale scopo, sciogliere il blocco di paraffina a 60 °C per circa 2 h e trasferire il campione in xilene (2 h). Riidratare il campione attraverso soluzioni di etanolo a gradazione decrescente (100%, 96%, 80%, 70%) seguite da acqua distillata. Riportare il campione riidratato in EDTA fresco 0,25 M (pH 6,95) ed estendere il periodo di decalcificazione come necessario prima di procedere con disidratazione, reinclusione e sezionamento. Questa procedura di recupero dovrebbe essere utilizzata esclusivamente come ultima risorsa, poiché l'inversione del processo FFPE potrebbe compromettere l'integrità dell'RNA.
    6. Posizionare i vetrini in un forno a 37 °C per tutta la notte per far evaporare qualsiasi residuo d'acqua, quindi conservarli a 4 °C.
    7. Per migliorare l'adesione del tessuto, opzionalmente cuocere i vetrini per 3 h a 42 °C prima di incubarli per tutta la notte a 37 °C.
      NOTA: Questo passaggio non è generalmente necessario quando si utilizzano i vetrini in vetro elencati nella Tabella dei Materiali, poiché questi vetrini offrono un'adesione forte e il tessuto rimane tipicamente saldamente attaccato durante l'intero processo. Questo passaggio può fungere da punto di sosta. I vetrini possono essere conservati a 4 °C; tuttavia, ogni volta che possibile, le analisi trascrittomica spaziale successive dovrebbero essere eseguite il più presto possibile dopo l'inclusione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA durante la conservazione43,44.

2. Valutazione della qualità del campione

  1. Valutazione della qualità delle sezioni
    1. Esaminare tutte le sezioni una alla volta al microscopio ottico a campo chiaro (4×–10×). Ispezionare ogni vetrino per assicurarsi che le sezioni non siano frammentate e registrare la qualità di ciascuna sezione.
      ​NOTA: Verificare la presenza di pieghe, grinze, compressioni o segni di vibrazione, che potrebbero indicare problemi legati alla durezza del paraffina, alla affilatura della lama o a una decalcificazione incompleta. Accertarsi che nessuna area del tessuto sia mancante a causa di distacco durante il sezionamento o il trasferimento nel bagno d'acqua.
    2. Selezionare le sezioni meglio conservate per la trascrittomica spaziale (quelle più complete e con la migliore morfologia).
    3. Identificare le sezioni consecutive adiacenti a quelle selezionate e riservarle per la colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e l'immunofluorescenza (IF), assicurandosi che l'immagine colorata corrisponda il più possibile al tessuto che verrà sequenziato.
  2. Colorazione H&E per l'integrità del tessuto
    1. Posizionare i vetrini su un portaoggetti in vetro e incubarli per 15 min a 60 °C.
    2. Trasferire il portaoggetti in barattoli di vetro contenenti xilene per 15 min.
    3. Reidratare le sezioni spostando il portaoggetti attraverso barattoli di vetro contenenti etanolo al 100%, 96%, 80% e 70%, con un'incubazione di 5 min in ciascuna soluzione.
      ​ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene e soluzioni di etanolo a gradiente devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica per garantire un'adeguata ventilazione e ridurre al minimo l'esposizione ai vapori tossici e infiammabili.
    4. Risciacquare i vetrini per 5 min in un barattolo di vetro riempito con acqua.
    5. Immergere il portaoggetti in ematossilina per 10 min, quindi lavare sotto acqua corrente fino a quando l'acqua di risciacquo diventa limpida.
    6. Immergere il portaoggetti in acqua contenente cinque gocce di acido cloridrico concentrato, agitando delicatamente fino a quando appare una tonalità rossiccia.
    7. Trasferire il portaoggetti in acqua satura di carbonato di litio fino a quando si sviluppa una colorazione blu stabile, quindi risciacquare brevemente in acqua.
    8. Colorare le sezioni con eosina al 1% (p/v) per 5 min, quindi risciacquare nuovamente in acqua.
    9. Disidratare i vetrini spostando il portaoggetti attraverso barattoli di vetro contenenti acqua, etanolo al 70%, 80%, 96% e 100%, con un'incubazione di 5 min in ciascuna soluzione.
    10. Chiarificare i vetrini in xilene per 15 min.
    11. Asciugare delicatamente il retro di ogni vetrino, applicare un mezzo di montaggio su un coprioggetto e montare le sezioni. Lasciare i vetrini asciugare a RT per 24 h prima dell'acquisizione delle immagini.
    12. Eseguire l'acquisizione delle immagini del tessuto utilizzando un microscopio ad alta risoluzione con un ingrandimento di 20x.
      NOTA: Eseguire prima la colorazione H&E su sezioni adiacenti come passaggio di controllo qualità per valutare l'idoneità del campione alla trascrittomica spaziale. Dopo la selezione, eseguire una seconda colorazione H&E direttamente sulla sezione destinata alla trascrittomica spaziale, seguendo le linee guida del produttore per la preparazione del tessuto della piattaforma di espressione genica spaziale indicate nella Tabella dei Materiali.
  3. Valutazione dell'integrità dell'RNA (DV200)
    ​NOTA: Per il protocollo di espressione genica spaziale, il tradizionale RNA Integrity Number (RIN) non è efficace poiché i picchi dell'RNA ribosomiale 18S e 28S sono tipicamente assenti nei tessuti fissati. Pertanto, la metrica DV200, definita come la percentuale di frammenti di RNA superiori a 200 nucleotidi, è comunemente utilizzata come parametro qualitativo più informativo rispetto al RIN per campioni clinici degradati. Per Visium v2, 10x Genomics raccomanda l'uso di blocchi FFPE con un valore DV200 ≥ 30% per garantire un'efficiente ibridazione delle sonde e prestazioni ottimali del saggio. La selezione di blocchi di tessuto con i valori DV200 più elevati disponibili aiuta a prevenire i drop-out nel sequenziamento e massimizza la sensibilità dei punti.
    1. Recuperare le provette da 1,5 mL contenenti le sezioni da 5 µm raccolte durante il passaggio di sezionamento del tessuto e posizionarle sul ghiaccio per l'estrazione dell'RNA.
    2. Estrarre l'RNA totale. Questa procedura standardizzata include la deparaffinizzazione del campione, la digestione con proteasi K per invertire i legami incrociati da formalina, la rimozione del DNA genomico mediante trattamento con DNasi I e l'eluzione finale dell'RNA purificato in acqua priva di RNasi.
    3. Valutare l'integrità dell'RNA utilizzando un sistema basato su elettroforesi capillare con un saggio RNA ad alta sensibilità. Un riepilogo del flusso di lavoro è fornito nel File Supplementare 142,45,46,47,48.
  4. Immunofluorescenza opzionale per la verifica del tipo cellulare
    1. Posizionare il vetrino FFPE su un portaoggetti in vetro e incubarlo per 15 min a 60 °C.
    2. Trasferire il portaoggetti in barattoli di vetro contenenti xilene per 15 min.
    3. Reidratare la sezione spostando il portaoggetti attraverso etanolo al 100%, 96%, 80% e 70% per 2 min ciascuno, seguiti da 5 min in acqua e 5 min in PBS-Tween (PBS 1x supplementato con 0,1% di Tween-20).
      ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene ed etanolo devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica.
    4. Eseguire il recupero dell'antigene secondo le raccomandazioni del produttore per l'anticorpo primario, assicurandosi che il tampone di recupero, il pH e le condizioni di riscaldamento corrispondano alla scheda tecnica dell'anticorpo. NOTA: In questo flusso di lavoro, il recupero dell'antigene viene eseguito utilizzando Tris 10 mM ed EDTA 1 mM, pH 9,0, in un sistema di riscaldamento a pentola per 30 min a 95 °C, quindi raffreddato per 20 min a RT.
    5. Lavare il vetrino due volte per 10 min ciascuna in PBS-Tween.
    6. Tracciare una barriera idrofoba intorno al tessuto utilizzando una penna idrofoba e bloccare il legame non specifico applicando una soluzione di BSA al 5% in DPBS 1x sulle sezioni di tessuto per almeno 40 min a RT in una camera umidificata.
      NOTA: La camera umida viene preparata posizionando un foglio di carta da filtro in una scatola di plastica per la colorazione dei vetrini e inumidendolo completamente con acqua distillata per mantenere un ambiente umido stabile durante l'incubazione con gli anticorpi.
    7. Preparare la soluzione dell'anticorpo primario in DPBS 1x alla diluizione raccomandata per ciascun anticorpo.
      NOTA: In questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati anticorpi primari contro Emcn (V.7C7) e Cd271 (ME20.4) per identificare rispettivamente le cellule endoteliali (EC) e le cellule staminali mesenchimali (MSC) murine, mentre sono stati utilizzati anticorpi contro CD31 (JC70A) o PRRX1 (policlonale) per identificare i loro omologhi umani, secondo il protocollo del produttore.
    8. Rimuovere la soluzione di blocco tamponando delicatamente il bordo del vetrino su carta assorbente per rimuovere le gocce residue, quindi applicare la miscela di anticorpi primari e incubare il vetrino tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata.
    9. Lavare il vetrino due volte per 5 min in PBS-Tween e preparare la soluzione dell'anticorpo secondario alla diluizione raccomandata dal produttore, assicurandosi che i fluorocromi siano spettralmente compatibili e non si sovrappongano.
      NOTA: In questo flusso di lavoro, è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor alla diluizione 1:200.
    10. Applicare la miscela di anticorpi secondari e incubare per 30 min a RT, al riparo dalla luce in una camera umidificata.
    11. Lavare il vetrino due volte per 5 min in PBS-Tween.
    12. Applicare una diluizione 1:10 del mezzo di montaggio contenente DAPI (vedere Tabella dei Materiali), preparata in una soluzione PBS–glicerolo 1:1, e incubare il campione per 5 min.
    13. Montare la sezione con un coprioggetto e sigillare i bordi con smalto per unghie per prevenire l'essiccazione.
    14. Visualizzare il tessuto colorato utilizzando una piattaforma di imaging multispettrale.

File Supplementare 1: Sintesi dei Passaggi del Protocollo per la Valutazione dell'Integrità dell'RNA e del Flusso di Lavoro di Trascrittomica Spaziale Visium. Questo file supplementare fornisce una sintesi dettagliata dei passaggi procedurali eseguiti in conformità con le istruzioni del produttore. Include: (i) il saggio High Sensitivity RNA ScreenTape utilizzato per valutare l'integrità dell'RNA (DV200) come descritto al passaggio 2.3.3 del protocollo principale, e (ii) una panoramica del flusso di lavoro Visium CytAssist per l'espressione genica spaziale, che comprende la pre-elaborazione del tessuto, la preparazione della libreria e il sequenziamento (passaggi 3.1–3.3 del protocollo principale).Cliccare qui per scaricare questo file.

3. Trascrittomica spaziale

NOTA: eseguire il flusso di lavoro di trascrittomica spaziale utilizzando la piattaforma e i reagenti elencati nella Tabella dei Materiali, seguendo le guide utente corrispondenti42,45,46. File Supplementare 1 riassume i principali passaggi di preelaborazione del tessuto, preparazione della libreria e sequenziamento.

  1. Controllo di qualità dei dati di transcriptomica spaziale
    1. Demultiplexare i dati di transcriptomica spaziale utilizzando la pipeline standard per set di dati Visium (vedere Tabella dei Materiali).
    2. Mappare le letture sul genoma di riferimento Ensembl 105 appropriato.
      NOTA: sono stati utilizzati GRCh38 per campioni umani e mm10 per campioni murini.
    3. Generare le matrici filtrate di caratteristiche-barcode utilizzando la stessa pipeline e importarle nell'ambiente di analisi successiva per singola cellula/spaziale (vedere Tabella dei Materiali).
    4. Esaminare le immagini H&E nell'interfaccia di visualizzazione fornita dalla pipeline di transcriptomica spaziale (vedere Tabella dei Materiali) e rimuovere manualmente i punti che si sovrappongono alla regione dell'osso corticale o al tessuto osseo, a seconda del set di dati.
    5. Normalizzare i set di dati utilizzando un metodo di trasformazione stabilizzante la varianza comunemente applicato nei flussi di lavoro di analisi della singola cellula (vedere Tabella dei Materiali).

Risultati

Per valutare l'applicabilità di questo protocollo basato sull'EDTA in diverse specie e contesti patologici, il protocollo è stato applicato a quattro campioni di midollo osseo: due femori murini e due campioni ossei umani rappresentativi di condizioni sane e di mieloma multiplo (MM) (Tabella 1 e Figura 1).

Identificazione del campioneSpecieSessoEtàMalattia
YFPcγ1MouseFemmina210 giorniSano
mMMMouseMaschio314 giorniMM
hHBMUmanoMaschio76 anniSano
hMMUmanoFemmina50 anniMM

Tabella 1: Campioni ossei murini e umani inclusi nello studio. Per ogni campione sono indicati la specie, il sesso, l'età e lo stato di salute. Abbreviazioni: hHBM = midollo osseo umano sano; hMM = mieloma multiplo umano; mMM = mieloma multiplo murino; MM = mieloma multiplo; YFPcγ1 = topo di controllo sano.

I campioni utilizzati in questo studio sono stati precedentemente caratterizzati e riportati in pubblicazioni precedenti del gruppo di ricerca, in particolare nei lavori di Muiños-Lopez et al. e Cenzano et al., ad eccezione del campione murino MM. Per i campioni già descritti, i dati e i risultati di trascrittomica spaziale sono presentati in tali studi8,10. Pertanto, il materiale incluso in questo contesto è utilizzato per valutare l'adeguatezza tecnica del protocollo per la trascrittomica spaziale, piuttosto che per presentare nuovi risultati biologici.

Campioni ossei di femore di topo sono stati ottenuti dal modello murino di mieloma (MM) geneticamente modificato BIC (BIcγ1), che riproduce le caratteristiche cliniche e immunologiche dei pazienti affetti da MM, e dai corrispondenti topi di controllo sani (YFPcγ1)8,49. Un singolo femore per animale è stato prelevato, pulito ed elaborato secondo un protocollo standardizzato (Figura 2A). I femori sono stati utilizzati specificamente per queste analisi poiché offrono un abbondante midollo disponibile, una qualità superiore della nicchia e una lavorazione facilmente riproducibile, rendendoli particolarmente adatti a una piattaforma trascrittomica spaziale basata sul sequenziamento8,10. La decalcificazione riuscita del femore del topo di controllo è stata confermata macroscopicamente da un evidente aumento della flessibilità del tessuto durante la manipolazione manuale con pinzette (Figura 2B). Successivamente, questo frammento osseo è stato efficacemente incluso in paraffina utilizzando uno stampo specializzato, compatibile con la trascrittomica spaziale, al fine di preservare l'integrità dell'RNA e l'architettura del tessuto per analisi molecolari successive (Figura 2C).

Sono stati analizzati anche due campioni di MO umano con diverse modalità di lavorazione8,10. Un campione di MO umano fresco, ematologicamente sano, è stato ottenuto da materiale di scarto chirurgico durante una sostituzione ortopedica dell'anca presso l’Hospital Universitario de Navarra (Figura 2D–F). Per dimostrare l'utilità traslazionale del protocollo, questo campione è stato lavorato come i campioni murini. In accordo con i risultati osservati nei tessuti murini, la decalcificazione con EDTA dell'osso umano è stata confermata macroscopicamente dalla completa ammorbidimento del tessuto, evidenziato dalla facile penetrazione di un ago (Figura 2E). Il frammento osseo umano decalcificato è stato correttamente incluso in paraffina mediante uno stampo metallico standard per le successive lavorazioni (Figura 2F). Il secondo campione umano consisteva in biopsie di MO in blocchetti FFPE prelevate dalla cresta iliaca di un paziente affetto da MM, conservate presso il Dipartimento di Anatomia Patologica della Clínica Universidad de Navarra (CUN). È importante notare che questo campione archiviato di MM era stato precedentemente decalcificato mediante un protocollo clinico standard che prevede l'uso di acidi forti36. Questo campione offre un confronto qualitativo con i campioni trattati con EDTA; tuttavia, le differenze riguardanti l'origine del tessuto, la fissazione, la conservazione e il processo di decalcificazione implicano che le differenze osservate non possono essere attribuite esclusivamente all'agente decalcificante.

figure-results-1
Figura 2: Campioni ossei murini e umani durante la preparazione basata sull'EDTA. (A) Femori di controllo di topo intatti prima della decalcificazione. (B) Femore di controllo di topo decalcificato che mostra un aumento della flessibilità. (C) Frammenti ossei di controllo di topo inclusi in paraffina. (D) Frammenti ossei umani sani provenienti da intervento chirurgico all'anca prima della decalcificazione. (E) Lo stesso frammento dopo la decalcificazione con EDTA, con evidente penetrazione dell'ago. (F) Osso umano sano decalcificato con EDTA incluso in paraffina. Barre della scala: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abbreviazione: EDTA = acido etilenodiamminotetraacetico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per analizzare l'architettura tissutale generale, è stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) (Figura 3). La migliore conservazione morfologica osservata nei campioni murini potrebbe riflettere differenze nella manipolazione e nella lavorazione dei campioni piuttosto che caratteristiche intrinseche specifiche della specie. I femori di topo sono stati raccolti appositamente per la trascrittomica spaziale e processati immediatamente come ossa integre, preservandone così l'architettura (Figura 3A, B). Al contrario, i campioni umani provengono o da materiale residuo ottenuto durante interventi di sostituzione dell'anca (Figura 3C) oppure da biopsie ossee diagnostiche del mieloma multiplo (MM) (Figura 3D), entrambi i quali possono presentare una qualità tissutale pre-analitica variabile. Di conseguenza, le differenze morfologiche tra il campione umano decalcificato con EDTA e la biopsia di MM decalcificata con acido sono lievi, poiché entrambi i campioni umani mostrano già limitazioni strutturali di base introdotte non solo dalla decalcificazione, ma anche dalla lavorazione generale del tessuto (Figura 3C, D). Pertanto, una valutazione completa della qualità del campione per la trascrittomica spaziale richiede l'analisi di diversi parametri distinti. In primo luogo, l'integrità del tessuto deve essere attentamente monitorata, poiché la conservazione strutturale può variare notevolmente in base al tipo specifico di campione e non soltanto in funzione dell'acido decalcificante utilizzato. In secondo luogo, è necessario valutare anche la qualità dell'RNA, poiché le condizioni di decalcificazione possono influenzarla20,35,36.

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Figura 3: Sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) utilizzate per la valutazione della qualità del tessuto. Sezioni consecutive in paraffina fissate in formalina (FFPE) corrispondono a (A) un topo controllo sano10, (B) un topo con mieloma multiplo (MM), (C) osso umano sano8,10 e (D) una biopsia umana di MM8. Barre della scala = 500 µm. Abbreviazioni: FFPE = fissato in formalina, in paraffina; H&E = ematossilina ed eosina; MM = mieloma multiplo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per integrare l'analisi istologica, è stata valutata la qualità dell'RNA. Mentre la colorazione H&E ha mostrato differenze ambigue, l'integrità dell'RNA ha chiaramente distinto gli effetti dei due metodi di decalcificazione (Tabella 2). I valori DV200 sia dai campioni murini che dal campione osseo umano sano hanno superato la soglia raccomandata per i saggi Visium FFPE, indicando una distribuzione sufficiente della lunghezza dei frammenti di RNA per l'ibridazione delle sonde e la costruzione della libreria. Il campione del topo sano esprimente YFP mostra un DV200 del 82,55%, e il campione osseo umano sano (hHBM) raggiunge il 58%, entrambi ben al di sopra della soglia di accettabilità del 30% definita da 10x Genomics. Il campione del topo con mieloma (mMM) mostra un DV200 del 31,3%, vicino al limite inferiore di accettabilità, il che potrebbe riflettere un prolungato stoccaggio del blocco in paraffina a 4 °C prima della sezionatura, tra altri fattori specifici del campione. Al contrario, la biopsia umana di mieloma decalcificata con acido (hMM) presenta un DV200 di soli l'8%, associato a una marcatamente minore integrità dell'RNA, anche quando il deterioramento morfologico è meno pronunciato. In sintesi, è importante eseguire valutazioni sia strutturali che molecolari per determinare l'idoneità del campione per analisi spaziali successive.

Identificazione del campioneDV200 (%)1
YFPcγ182,55
mMM31,3
hHBM58
hMM28
1DV200: Percentuale di frammenti di RNA totali > 200 nucleotidi.
2Questo campione è stato decalcificato utilizzando un protocollo clinico standard che prevede l'uso di acidi forti.

Tabella 2: Qualità dell'RNA dei campioni dello studio. DV200 indica la percentuale di frammenti di RNA più lunghi di 200 nucleotidi; sono stati considerati idonei per le analisi successive di trascrittomica spaziale i valori pari almeno al 30%. Abbreviazioni: hHBM = midollo osseo umano sano; hMM = mieloma multiplo umano; mMM = mieloma multiplo murino.

Possono essere eseguite anche ulteriori valutazioni della qualità. Per validare ulteriormente l'integrità del tessuto e confermare la conservazione di specifici compartimenti cellulari dopo la decalcificazione con EDTA, è stata effettuata una colorazione immunofluorescente (IF) opzionale su sezioni FFPE adiacenti di tessuti murini e umani. Gli anticorpi contro endomucina (Emcn) e Cd271 sono stati utilizzati per visualizzare rispettivamente le cellule endoteliali (EC) e le cellule stromali mesenchimali (MSC) nel campione murino di mieloma (MM) (Figura 4A). Questa colorazione ha mostrato che i tessuti trattati con EDTA presentavano strutture vascolari ben definite con una colorazione continua per Emcn e reti stromali preservate, dimostrando che i marcatori testati sono rimasti rilevabili dopo il trattamento. Inoltre, l'analisi ad alta risoluzione mediante un sistema automatizzato di imaging multispettrale ha fornito ulteriori evidenze del fatto che gli antigeni testati sono rimasti rilevabili per la verifica del tipo cellulare, aggiungendo un ulteriore livello di controllo qualità prima dell'analisi trascrittomica spaziale. Inoltre, questi risultati sono stati osservati anche in campioni umani sani di soggetti anziani, nei quali l'espressione delle EC è stata rilevata mediante anticorpi anti-CD31 e quella delle MSC mediante anticorpi anti-PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), dimostrando che i marcatori del nicchio testati sono rimasti identificabili dopo la decalcificazione con EDTA (Figura 4B). Al contrario, questi risultati non sono stati replicabili in biopsie umane di MM sottoposte a diversi protocolli di decalcificazione acida. Come menzionato in precedenza, l'integrità dell'RNA in questi campioni era bassa, limitando l'analisi trascrittomica successiva. A causa dello stato degradato di questi campioni umani, la loro utilizzabilità successiva si è limitata al profilo trascrittomica di base8 e alla valutazione immunohistochimica (IHC) delle cellule plasmatiche maligne (PC) (Figura 4C).

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Figura 4: Immunofluorescenza e immunohistochemia facoltative per la verifica del tipo cellulare. (A) Tessuto di MM murino che mostra nuclei marcati con DAPI (blu), MSC positivi per CD271 (verde) ed EC positivi per EMCN (rosso). (B) Osso sano umano che mostra nuclei marcati con DAPI (blu), MSC positivi per PRRX1 (verde) ed EC positivi per CD31 (rosso)10. (C) Biopsia di MM umano che mostra PC maligni positivi per CD1388. Barre della scala: (A) 250 µm (panoramica), 20 µm (ingrandimento sovrapposto) e 50 µm (immagini a canale singolo); (B) 500 µm (panoramica) e 20 µm (ingrandimenti sovrapposti e a canale singolo); (C) 500 µm. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; EC = cellula endoteliale; MM = mieloma multiplo; MSC = cellula stromale mesenchimale; PC = cellula plasmatica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Insieme, i risultati relativi alla morfologia del tessuto e al DV200 supportano l'idoneità dei campioni trattati con EDTA per analisi trascrittomique spaziali successive. Applicazioni trascrittomique spaziali di questo protocollo di preparazione sono state precedentemente riportate8,10.

Discussione

Integrando una decalcificazione controllata a base di EDTA, una procedura standardizzata per i campioni in paraffina (FFPE) e rigorosi punti di controllo della qualità, questo protocollo supera molte delle limitazioni tradizionalmente associate alla preparazione del tessuto osseo per la trascrittomica spaziale, in particolare quelle legate alla degradazione dell'RNA e ai danni morfologici causati dai metodi di decalcificazione acidi forti8,10,20,33,36. Il passaggio più critico nella preparazione di campioni mineralizzati per la trascrittomica spaziale è la decalcificazione. Una decalcificazione insufficiente produce un osso ancora troppo rigido per essere sezionato, rendendo fisicamente impossibile ottenere sezioni di alta qualità per la trascrittomica spaziale8,20,23,37,50. Quando il tessuto osseo rimane troppo duro, va in frantumi o vibra contro la lama del microtomo, producendo sezioni strappate o forate che non rappresentano accuratamente l'architettura nativa del midollo osseo (BM). È importante sottolineare che il successo della decalcificazione non può essere completamente verificato fino alla fase di microtomia: anche campioni che appaiono superficialmente ammorbiditi potrebbero ancora contenere minerali residui, evidenti solo durante il tentativo di tagliare sottili sezioni FFPE. Per questo motivo, un attento monitoraggio dell'avanzamento della decalcificazione è essenziale per garantire risultati riproducibili.

Il protocollo prevede l'utilizzo di EDTA 0,25 M a pH 6,95 per 10 giorni, con agitazione costante e sostituzione della soluzione al quinto giorno8,10. Durante lo sviluppo del protocollo, sono stati valutati l'EDTA da solo, l'EDTA integrato con polivinilpirrolidone e l'acido formico al 10%, insieme a diverse durate di decalcificazione e programmi di sostituzione della soluzione; i dati comparativi non sono riportati qui. Durate inferiori a 10 giorni hanno spesso causato la rottura del tessuto durante la sezionatura dei campioni murini, mentre i campioni umani hanno mostrato un comportamento variabile a seconda del campione. La durata di 10 giorni viene pertanto utilizzata per i femori di topo, mentre i campioni umani potrebbero richiedere una decalcificazione più lunga in base alla densità e al contenuto trabecolare. Prima dell'inclusione in paraffina, devono essere effettuati controlli fisici di qualità. Se durante la microtomia si evidenzia una decalcificazione insufficiente, la procedura di riprocessamento deve essere utilizzata solo come misura estrema di recupero, poiché ulteriore calore, esposizione a solventi e reidratazione potrebbero compromettere la qualità dell'RNA.

Il limite principale di questo metodo è il tempo di lavorazione prolungato, che contrasta fortemente con le procedure rapide basate su acidi comunemente utilizzate in patologia clinica20,36. Sebbene tempi di lavorazione più lunghi siano generalmente accettabili in ambito di ricerca, studi recenti, come il protocollo descritto da Miao et al., che utilizza la soluzione di Morse (22,5% di acido formico e 10% di citrato di sodio) per decalcificare entro 24 ore, evidenziano l'interesse crescente nell'accelerare la preparazione dell'osso per saggi spaziali20. Tuttavia, i metodi basati su acidi comportano storicamente un rischio molto maggiore di degradazione dell'RNA, riducendo i valori DV200 e limitando infine la loro compatibilità con la trascrittomica spaziale1,8,35,36. Questo approccio basato sull'EDTA privilegia la conservazione dell'RNA rispetto alla velocità, garantendo compatibilità con piattaforme spaziali basate sul sequenziamento come Visium.

Un limite potenziale della trascrittomica spaziale del MO è l'elevata abbondanza di trascritti di immunoglobuline derivati dalle CP, che può ridurre il rilevamento di geni a bassa abbondanza. Come nelle strategie di controllo qualità e filtraggio applicate in uno studio precedente del gruppo di ricerca, inclusa la rimozione di spot di bassa qualità (<200 UMIs e <150 geni rilevati), il filtraggio di tipi cellulari con basso contributo (<20% per spot) durante le analisi di deconvoluzione e la selezione di geni marcatore rilevati nei dataset trascrittomici spaziali, anche i trascritti di immunoglobuline possono essere filtrati computazionalmente durante l'analisi successiva per minimizzarne l'impatto quando opportuno8. Approcci trascrittomici spaziali mirati possono ulteriormente migliorare il rilevamento di trascritti a bassa abbondanza in specifiche applicazioni.

Le potenziali applicazioni di questo metodo sono ampie. La recente integrazione di dati spaziali e di singola cellula ha rivelato nicchie osteogeniche umane specializzate e complessi gradienti di segnalazione che si irradiano dall'osso trabecolare3,26. Inoltre, la trascrittomica spaziale ha mostrato che l'invecchiamento rimodella il microambiente del midollo osseo (BM) alterando l'organizzazione spaziale e la comunicazione delle cellule endoteliali (EC), portando a un supporto osteogenico compromesso e all'emergere di reti di segnalazione infiammatoria all'interno della nicchia senescente10. Il profilo multiomico ha inoltre identificato distinti compartimenti microambientali, come le regioni arterio-endostee che supportano la mielopoiesi precoce e le zone peri-adipocitarie arricchite in cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici3. Nel contesto del mieloma multiplo (MM), questo protocollo consente l'integrazione di approcci trascrittomica spaziale e di singola cellula per caratterizzare la composizione del midollo osseo murino malato e le interazioni cellula-cellula. Studi precedenti hanno rivelato distribuzioni spazialmente distinte delle plasmacellule (PC) maligne e identificato programmi immunitari e infiammatori, come la NETosi e la segnalazione IL-17, inversamente associati alle regioni arricchite da tumore. Inoltre, un aumento della densità di PC maligne si è correlato a un passaggio da stati di cellule T effettrici a stati di esaurimento. Questi risultati sono stati inoltre validati in campioni di midollo osseo umano in paraffina (FFPE), dimostrandone la rilevanza traslazionale in presenza di diversi carichi patologici8. In definitiva, questo flusso di lavoro preparativo fornisce la base tecnica per esplorare le complesse interazioni cellulari all'interno dell'architettura mineralizzata del midollo osseo.

Le piattaforme di espressione genica spaziale ad alta definizione possono fornire un'analisi dell'intero trascrittoma con risoluzione prossima a quella monocellulare38,51,52. Questi approcci potrebbero estendere l'utilizzo del protocollo di preparazione a un'analisi ad alta risoluzione delle popolazioni cellulari spazialmente organizzate nel midollo osseo e delle neoplasie ematologiche. Il protocollo, pertanto, costituisce una base tecnica per futuri studi sull'ematopoiesi fisiologica e maligna.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi. È stato concesso in licenza a MIMO Biosciences un brevetto sul know-how e sull'uso sperimentale dei modelli murini MIcγ1 di MM (numero di domanda PCT/EP2023/071025).

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III e cofinanziato dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (ERDF) A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) e RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Dipartimento della Salute del Governo della Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC e AIRC nell'ambito del programma Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) e The Paula and Rodger Riney Foundation a favore di FP. IAC ha ricevuto sostegno da una borsa Marie Curie (H2020- MSCA-IF-837491) della Commissione Europea, da una borsa AECC Talent (INVES258003CALV) e dal Dipartimento della Salute del Governo della Navarra (GN2023/03). MC è stato sostenuto da una borsa FPU (FPU22/03283) del Ministero della Scienza, Innovazione e Università. Desideriamo ringraziare il personale del Laboratorio di Genomica Avanzata e della Struttura Animale del CIMA dell'Università di Navarra per l'insostituibile assistenza tecnica e intellettuale. Ringraziamo inoltre i Dipartimenti di Anatomia Patologica della Clínica Universidad de Navarra (CUN) e dell'Ospedale Universitario della Navarra per aver fornito campioni di MO e per la straordinaria collaborazione. Un ringraziamento speciale va a José Ángel Martínez-Climent e Marta Larrayoz per i loro modelli murini di MM. Grazie a Patxi San Martín-Uriz, Tania López ed Eduardo Larequi per l'eccellente supporto nell'ottimizzazione delle tecnologie, nello sviluppo dei protocolli e nella risoluzione dei problemi relativi all'elaborazione di campioni di MO murini e umani per la trascrittomica spaziale. Ringraziamo anche Beñat Ariceta e Asier Ullate per tutto il lavoro computazionale svolto sulla trascrittomica spaziale. Infine, siamo profondamente grati ai pazienti e ai donatori sani che hanno generosamente partecipato a questo studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi da 1,5 mLEppendorf15625367
Contenitore sterile da 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ASistema basato su elettroforesi capillare–per la valutazione dell'integrità dell'RNA
Contenitore sterile da 50 mL IberoMedREOR001
Tubo da 50 mL FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAPenna per barriera idrofoba 
Anticorpo anti-PRRX1 prodotto in coniglioSigma-AldrichHPA051084
BSA (Albumina Sierica Bovina)Sigma-AldrichA9418-50G
Cassette KartellLABWARE2921
Anticorpo monoclonale CD271 (Recettore NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, Cellula Endoteliale (Concentrato) Clone JC70AAligent DakoM0823
CoverslipFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium con DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Soluzione di deparaffinizzazioneQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APSoluzione salina tamponata al fosfato (DPBS, 1×), formula di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio, Thermo Scientific Chemicals
Montante DPX per istologiaSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione 0,5 M, grado biologia molecolare, ultrapuro
Stazione di inclusione Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Anticorpo Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Genoma di riferimento Ensembl (GRCh38 / mm10, release 105)EMBL-EBIN/AGenoma di riferimento utilizzato per l'allineamento delle letture.
EosinaMillipore SigmaHT110116
EtileneMillipore SigmaE7023-500MLForbici chirurgiche
Falc Instruments B-I Bagno termostatato per istologiaFalc610.1030.00
Formalina al 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldeide 3,7%–4,0% p/v tamponata a pH = 7 e stabilizzata con metanolo (CE-IVD) per diagnostica clinica
Porta-vetrini per colorazione in vetro WHEATONZ710970-3EA
Vasetti per colorazione in vetro BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GliceroloSigma-AldrichC3H803
Secondario anticorpo capra anti-topo IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Secondario anticorpo capra anti-topo IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Secondario anticorpo capra anti-coniglio IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Ematossilina Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Valutazione dell'integrità dell'RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Valutazione dell'integrità dell'RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Valutazione dell'integrità dell'RNA
Microscopio ad alta risoluzione Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Acido cloridrico (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Piattaforma Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Secondario anticorpo capra anti-ratto IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluo 568, InvitrogenInvitrogenA11077
Forbici Iris - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isolfurano
Carbonato di litio Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware utilizzato per visualizzare le immagini HE e curare i punti Visium; apre file .cloupe generati dalla pipeline di analisi.
Muffole metalliche per inclusioneBio-Optica07-BM24256
Vetrini per microscopioavantor631-0108Vetrini per microscopio Superfrost Plus
Lame per microtomoFEATHERFEAT207500006_U
Microtomo HM 340EEprediaN/AModello HM 340E
AgoBD301156BD Microlanc Ago 3, 21 G, 1 IN (25 mm)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Microscopio a luce bianca
Paraffina PanReac AppliChem256993Paraffina P.F. 55–58°C plastificata + pellet di DMSO (CE-IVD) per diagnostica clinica
Piastra di Petri CorningCLS430167-100EA
Muffole di plastica per inclusione Bio-Optica07-MP7070
Pinze di Potts-SmithF.S.T 11012-18Pinze
Fluorimetro Qubit 3.0Invotrogen Q33216
Provette per saggio QubitInvotrogen Q32856
Kit per saggio RNA HS QubitInvotrogen Q32855
Tubo microcentrifuga RNAse free da 1,5 mLThermo Scientific AM12400
Acqua priva di RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Soluzione disinfettante
Kit RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Estrazione totale di RNA
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AMetodo di normalizzazione stabilizzante la varianza implementato in Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/APacchetto R utilizzato per l'analisi di trascrittomica singola cellula e spaziale.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware utilizzato per demultiplexing, allineamento e generazione di matrici funzionalità-barcode per dataset Visium.
Scalpello Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/APacchetto R utilizzato per la visualizzazione e l'integrazione della trascrittomica spaziale.
Lama per scalpello chirurgico n. 23Swann-Morton210Lame per scalpello chirurgico
Ciclatore termico Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Piattaforma di imaging multispettrale per la visualizzazione di IF
Kit accessorio Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Kit sonda trascrittoma umano Visium Piccolo 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Kit sonda trascrittoma murino Visium Piccolo 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Kit vetrino espressione genica spaziale Visium 4 rxns 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XilenePanreac214736Xilene, miscela di isomeri per analisi, ACS, ISO

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