Articolo metodologico

Preparazione di campioni di midollo osseo fissati in formalina e inclusi in paraffina per la trascrittomica spaziale mediante decalcificazione basata su EDTA

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DOI:

10.3791/72474

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28 agosto 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In questo articolo

Sommario

Un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione di campioni ossei fissati in formalina e inclusi in paraffina per l'analisi della trascrittomica spaziale include un passaggio di decalcificazione con EDTA della durata di 10 giorni, finalizzato a preservare l'integrità dell'RNA. Punti critici chiave di controllo della qualità aiutano a determinare se i campioni soddisfano i requisiti per l'analisi successiva dell'espressione genica spaziale.

Abstract

Il midollo osseo (MO) è una struttura complessa e dinamica in cui le relazioni spaziali influenzano il comportamento cellulare, la segnalazione e la funzione. Per questo motivo, comprendere appieno la dinamica delle interazioni cellulari richiede tecniche complementari di tipo spaziale in grado di preservare e mappare l'architettura delle popolazioni cellulari in situ. Nonostante i notevoli progressi ottenuti con le tecnologie single-cell, che hanno contribuito a chiarire l'eterogeneità trascrizionale del tessuto midollare sano e patologico, l'organizzazione spaziale dei diversi tipi cellulari, i programmi regolatori specifici delle nicchie e le loro interazioni necessitano ancora di ulteriori studi. I recenti sviluppi della trascrittomica spaziale hanno reso possibile l'analisi imparziale dell'espressione genica con contesto spaziale in diversi tessuti, rendendo queste tecnologie complementari ai metodi single-cell, che mancano di risoluzione spaziale. Sebbene la trascrittomica spaziale sia stata ampiamente utilizzata nei tessuti molli, il suo impiego in tessuti mineralizzati come il MO rimane limitato a causa delle difficoltà associate all'elaborazione del tessuto osseo. Il protocollo qui presentato è stato impiegato per preparare campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) provenienti da tessuti murini e umani sani e patologici. È previsto un passaggio di decalcificazione basato sull'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) della durata di 10 giorni, al fine di preservare l'integrità dell'RNA e consentire l'applicazione della trascrittomica spaziale su campioni di ossa lunghe. Questo protocollo descrive la preparazione di campioni di MO per l'analisi trascrittomica spaziale, inclusi l'elaborazione del tessuto, la conservazione e la sezionatura, nonché passaggi essenziali di valutazione della qualità, come la verifica dell'integrità delle sezioni, della morfologia tissutale e della qualità dell'RNA. Il flusso di lavoro supporta inoltre l'identificazione dei tipi cellulari e l'integrazione con dati trascrittomica single-cell per caratterizzare la composizione cellulare, definire le interazioni cellula-cellula e visualizzare la distribuzione spaziale delle cellule eterogenee dal punto di vista trascrizionale in condizioni sane e patologiche. Nel complesso, questo flusso di lavoro permette di preparare tessuti sani e maligni completamente mineralizzati per l'analisi trascrittomica spaziale, preservando al contempo l'architettura del midollo osseo.

Introduzione

Il midollo osseo (BM) è un organo altamente complesso e compartimentalizzato che rappresenta la sede primaria dell'emopoiesi e della maturazione delle cellule immunitarie1,2. Questo tessuto eterogeneo comprende una vasta gamma di linee cellulari emopoietiche, mesenchimali, endoteliali e immunitarie che coesistono in un nicchia tridimensionale altamente specializzata e organizzata3,4. All'interno di questa nicchia, ciascuna popolazione cellulare occupa territori anatomici distinti, e il contesto spaziale svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento cellulare, della segnalazione e della funzione4,5. La vicinanza fisica a strutture specifiche, come l'osso trabecolare o le reti vascolari, regola processi fisiologici essenziali, tra cui il mantenimento della quiescenza delle cellule staminali emopoietiche (HSC) e il rimodellamento osseo6,7. Di conseguenza, questo microambiente dinamico e le interazioni strettamente regolate tra i suoi componenti cellulari e stromali modellano le reti di regolazione che mantengono l'omeostasi e influenzano l'evoluzione delle malattie ematologiche maligne8,9,10,11,12,13.

I progressi nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno rivoluzionato la nostra comprensione della diversità cellulare del midollo osseo (BM), consentendo la scoperta di sottotipi cellulari precedentemente non riconosciuti e delle loro interazioni previste all'interno della nicchia3,10,11,12,14,15,16. Tuttavia, la trascrittomica a singola cellula, sebbene fornisca informazioni ad alta risoluzione sui singoli componenti della nicchia ematopoietica, è intrinsecamente limitata dal processo di digestione del tessuto, che dissocia le cellule dal loro ambiente nativo e potenzialmente ne altera lo stato originale17, e dalla mancanza di contesto spaziale che definisce l'organizzazione del tessuto osseo4,18. La perdita di questo contesto posizionale rende impossibile mappare con certezza dove risiedono specifiche popolazioni distinte dal punto di vista trascrizionale o come interagiscono con le cellule vicine19. Inoltre, il tessuto osseo denso viene spesso dissociato solo parzialmente, con conseguente sottorappresentazione di popolazioni cellulari chiave, come osteociti e adipociti, nei dataset di scRNA-seq e una rappresentazione distorta dell'eterogeneità tissutale20,21. La trascrittomica spaziale permette lo studio dell'espressione genica in situ, all'interno di sezioni tissutali con struttura spaziale preservata, recuperando così informazioni contestuali e superando i limiti delle tecnologie a singola cellula8,19,22,23,24,25,26. Questa tecnologia rappresenta un progresso essenziale nel campo, poiché consente il posizionamento spaziale preciso e l'organizzazione strutturale delle diverse popolazioni cellulari che compongono il midollo osseo, aspetti indispensabili per comprendere le loro interazioni e i loro ruoli funzionali all'interno del microambiente nativo8,26. Inoltre, nel contesto delle malattie, la trascrittomica spaziale permette a ricercatori e clinici di colmare il divario tra la patologia tradizionale e la genomica ad alto rendimento, consentendo di sovrapporre dati molecolari a immagini morfologiche1,8. Le tecnologie di trascrittomica spaziale possono essere classificate in due grandi gruppi: metodi basati sul sequenziamento e metodi basati sull'imaging17,24. Le piattaforme basate sul sequenziamento, come Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) e l'open-source Open-ST, catturano l'mRNA su array o microsfere con codici a barre spaziali prima del sequenziamento di nuova generazione. I metodi basati sull'imaging, tra cui Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX e Xenium, visualizzano direttamente i trascritti in situ mediante ibridazione multiplex o chimica dei sonde a lucchetto (padlock probe)27,28. In alternativa, le piattaforme possono essere classificate come mirate (targeted) o non mirate (untargeted), a seconda che richiedano o meno la rilevazione mediante sonde specifiche17,24.

I metodi di trascrittomica spaziale sono stati ampiamente applicati a tessuti molli, come il cervello, il cuore e il fegato, dove la produzione di sezioni istologiche intatte è semplice29,30,31. Al contrario, l'applicazione della trascrittomica spaziale all'osso è notevolmente più complessa a causa della sua natura mineralizzata, che richiede un processo di decalcificazione32,33, ovvero la rimozione controllata di fosfato di calcio, necessaria per ammorbidire il tessuto abbastanza da permetterne la sezionatura e l'analisi istologica o molecolare successiva8,20,23,34. I metodi tradizionali di decalcificazione comunemente utilizzati nella pratica clinica si basano tipicamente su soluzioni acide aggressive, come acido cloridrico, nitrico, formico o fosforico, che degradano gravemente l'integrità dell'RNA e alterano la morfologia cellulare35,36. Tale degradazione molecolare riduce il rapporto segnale-rumore nei saggi spaziali, portando spesso a tassi di rilevamento genico inaccettabilmente bassi rispetto ai tessuti molli8,10. Questa limitazione evidenzia la necessità di protocolli standardizzati di decalcificazione in grado di preservare in modo affidabile l'integrità dell'mRNA in campioni mineralizzati per analisi spaziali basate sul sequenziamento8,20.

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione di campioni di midollo osseo fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) per la trascrittomica spaziale, precedentemente applicato da Muiños-Lopez et al.8. Il flusso di lavoro include un passaggio di decalcificazione della durata di 10 giorni mediante acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a pH controllato. A differenza degli acidi aggressivi, l'EDTA agisce come un chelante delicato che preserva la struttura microscopica e mantiene la qualità degli acidi nucleici, rendendolo adatto per applicazioni molecolari8,20,33,36,37. A scopo dimostrativo, il protocollo è stato applicato a campioni di tessuto osseo provenienti da modelli murini sani e affetti da mieloma multiplo (MM), nonché a campioni di midollo osseo umano ottenuti sia da individui sani che malati; i campioni sono stati successivamente sequenziati sulla piattaforma Visium Spatial Gene Expression38. Il flusso di lavoro comprende procedure standardizzate per il reperimento del tessuto da campioni ossei umani e murini, fissazione, decalcificazione, disidratazione, inclusione in paraffina e sezionamento, seguite da una pipeline completa di controllo della qualità che include la valutazione dell'integrità dei sezioni, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), la valutazione della qualità dell'RNA (DV200) e, opzionalmente, l'immunofluorescenza (IF) per la verifica del tipo cellulare. Questi passaggi preparatori garantiscono che solo sezioni di alta qualità proseguano nei successivi flussi di lavoro di trascrittomica spaziale, inclusi il pretrattamento dei sezioni, la costruzione di librerie, il sequenziamento e l'analisi della qualità e dei dati risultanti.

Questa procedura standardizzata supporta la preparazione e la valutazione della qualità di campioni di MO umana e murina per l'analisi transcriptomica spaziale. È pensata per facilitare lo studio di programmi regolatori specifici del nicchio in disturbi ematologici e scheletrici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità alla Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono stati approvati dal Comitato per l'Etica Sperimentale sugli Animali dell'Università di Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protocolli CEEA082-20 e CEEA039-20). La cura, il trattamento e l'eutanasia degli animali sono stati eseguiti nel rispetto della legislazione spagnola al fine di minimizzare il dolore e la sofferenza.

Lo studio umano è stato approvato dal Comitato per l'Etica della Ricerca della Scuola di Medicina dell'Università di Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; progetti 2022.100mod1 e 2023.172) e dal Comitato per l'Etica della Ricerca del Servizio Sanitario di Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Tutte le procedure che coinvolgevano partecipanti umani sono state condotte in conformità con i principi etici della Dichiarazione di Helsinki. I dati personali sono stati trattati in forma riservata, nel rispetto della Legge Organica spagnola 3/2018 sulla Protezione dei Dati Personali e sulla Garanzia dei Diritti Digitali e della Legge spagnola 14/2007 sulla Ricerca Biomedica.

NOTA: Una lista dettagliata dei reagenti e dell'equipaggiamento utilizzati in questo studio è riportata nella Tabella dei Materiali. Il flusso sperimentale completo per l'implementazione della trascrittomica spaziale nei tessuti ossei è illustrato schematicamente in Figura 1 ed è organizzato in tre fasi operative: acquisizione del campione, controllo di qualità (QC) e profilazione trascrittomica spaziale. L'acquisizione del campione comprende la raccolta di frammenti ossei umani o murini, seguita da fissazione, decalcificazione con EDTA, disidratazione, inclusione in paraffina e sezione e preparazione dei vetrini. La fase di controllo di qualità valuta l'integrità istologica e la conservazione dell'RNA. Le sezioni ossee validate vengono quindi sottoposte a permeabilizzazione del tessuto direttamente sul vetrino, preparazione della libreria, sequenziamento e analisi dei dati.

Elaborazione del tessuto osseo: fissazione, decalcificazione, disidratazione; diagramma del flusso di lavoro della trascrittomica spaziale.
Figura 1: Raccolta dei campioni e flusso di lavoro di preparazione basato sull'EDTA per tessuti ossei murini e umani. Le femori di topo e i campioni ossei umani vengono raccolti, fissati, decalcificati con EDTA, disidratati, inclusi in paraffina e sezionati. La qualità del campione viene valutata mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e analisi dell'integrità dell'RNA (valutazione DV200), seguita dalla pre-elaborazione del tessuto per la trascrittomica spaziale, preparazione della libreria, sequenziamento e controllo della qualità dei dati. Abbreviazioni: BM = midollo osseo; DV200 = percentuale di frammenti di RNA più lunghi di 200 nucleotidi; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; H&E = ematossilina ed eosina; QC = controllo di qualità. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Acquisizione ed elaborazione dei campioni di tessuto osseo

  1. Prelevamento dell'osso del topo
    1. Anestetizzare gli animali con il 5% di isoflurano e confermare la perdita dei riflessi.
    2. Una volta completamente anestetizzati, eseguire l'eutanasia mediante dislocazione cervicale seguendo le linee guida istituzionali e regolatorie.
      ​NOTA: L'operazione di eutanasia deve essere effettuata da personale qualificato e la morte deve essere confermata prima di procedere al prelievo dei tessuti.
    3. Disinfettare la cute spruzzando etanolo al 70% sulla superficie dorsale del topo e, utilizzando forbici chirurgiche, praticare un piccolo taglio per rimuovere con cura la pelle ed esporre gli arti posteriori.
    4. Dissezionare gli arti posteriori tagliando sopra l'articolazione dell'anca e trasferirli in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) fredda. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
    5. Rimuovere il muscolo adiacente e il tessuto connettivo utilizzando pinze sterili e un bisturi.
    6. Trasferire le ossa in un contenitore sterile da 50 mL precedentemente riempito con DPBS pulita e fredda, quindi posizionare il contenitore sul ghiaccio.
    7. Procedere immediatamente con la fissazione del campione per preservare l'integrità del tessuto.
  2. Manipolazione dei campioni ossei umani
    1. Ricevere biopsie a core osseo o frammenti ossei chirurgici in contenitori sterili da 100 mL.
    2. Trasferire i frammenti ossei in un contenitore pulito e sterile da 100 mL precedentemente riempito con DPBS fredda, quindi posizionarlo sul ghiaccio.
    3. Procedere immediatamente con la fissazione del campione per preservare l'integrità del tessuto.
      ATTENZIONE: I campioni umani devono essere manipolati in condizioni BSL 2.
  3. Fissazione del tessuto osseo
    1. Prendere il contenitore da 50 mL o 100 mL contenente il campione osseo e scartare il DPBS.
    2. Etichettare le cassette di plastica e inserire i campioni ossei in ciascuna cassetta singolarmente. Chiudere saldamente i coperchi per prevenire la perdita del tessuto durante le fasi successive di lavorazione.
      ​NOTA: Per i campioni di topo, posizionare un osso per cassetta. Per i campioni ossei umani, se necessario, utilizzare un bisturi sterile per tagliare il tessuto in frammenti sufficientemente piccoli da adattarsi alle cassette standard, posizionando un frammento per cassetta. Se i campioni ossei umani sono troppo duri per essere sezionati a questo stadio, possono essere lasciati interi e trasferiti nella soluzione decalcificante; una volta decalcificati, il tessuto ammorbidito può essere tagliato in frammenti di dimensioni adeguate e posizionato in cassette etichettate.
    3. Aggiungere soluzione di formaldeide tamponata al 4% in rapporto 1:20 (campione:fissativo) e incubare il campione per 24 h a 4 °C.
      ATTENZIONE: Manipolare il fissativo all'interno di una cappa chimica a causa della sua tossicità e delle sue vapori volatili.
      NOTA: Evitare la sovrafissazione (>48 h), che riduce l'integrità dell'RNA nei flussi di lavoro FFPE39.
  4. Decalcificazione del tessuto osseo mineralizzato
    1. Scartare il formalina e lavare il campione osseo con acqua ultrapura. Risciacquare con acqua, agitare brevemente e scartare per eliminare eventuali residui di formalina.
    2. Preparare una soluzione di EDTA 0,25 M in acqua ultrapura e regolare il pH a 6,95.
      NOTA: Sebbene l'EDTA sia spesso regolato a pH 8,0 nei protocolli tradizionali di decalcificazione, questo flusso di lavoro utilizza l'EDTA a circa pH 6,95 per favorire una chelazione efficiente preservando al contempo la morfologia del tessuto e la qualità dell'RNA8.
    3. Aggiungere la soluzione di EDTA al contenitore contenente il campione osseo e incubare per 10 giorni a 4 °C con agitazione delicata.
      ​NOTA: Per i campioni di topo, circa 50 mL di soluzione di EDTA sono generalmente sufficienti. Per i campioni ossei umani, si utilizzano tipicamente circa 100 mL. Tuttavia, questo volume può essere adattato in base alle dimensioni dell'osso per garantire un'immersione completa ed efficace della decalcificazione.
    4. Dopo 5 giorni di decalcificazione, scartare la soluzione di EDTA e sostituirla con lo stesso volume di EDTA fresco, poiché la capacità chelante si satura nel tempo. Continuare l'incubazione nelle stesse condizioni.
    5. Dopo 10 giorni di incubazione, scartare la soluzione di EDTA e valutare se la decalcificazione è completa.
      1. Praticare un piccolo taglio con un bisturi sterile o inserire un ago sterile fine in un angolo o in una regione periferica del tessuto, scegliendo sempre un'area di bassa rilevanza analitica per evitare di alterare le regioni di interesse. Posizionare l'osso su una piastra di Petri sterile per stabilizzare il campione durante il taglio o l'inserimento dell'ago. Se il tessuto può essere tagliato facilmente o l'ago passa con minima resistenza, il campione è adeguatamente decalcificato.
      2. Nel caso dei femori di topo, piegare delicatamente l'osso con pinze per valutarne la flessibilità, un indicatore affidabile della completa rimozione del minerale.
        NOTA: La durata della fase di decalcificazione dipende dalle dimensioni e dallo spessore del campione osseo, nonché dal volume di EDTA utilizzato. Se l'osso rimane rigido dopo il periodo iniziale di incubazione, continuare la decalcificazione finché il tessuto non è sufficientemente morbido da poter essere tagliato facilmente. Un'eccessiva prolungazione potrebbe compromettere la qualità del tessuto e l'integrità dell'RNA; pertanto, l'estensione dovrebbe essere limitata al tempo minimo necessario per ottenere un ammorbidimento adeguato20.
  5. Disidratazione
    1. Lavare aggiungendo acqua ultrapura al contenitore contenente il campione osseo, quindi incubare per 5 min a 4 °C con agitazione.
    2. Scartare l'acqua e sostituirla con una soluzione di etanolo al 70%. Incubare per 1 h a 4 °C.
      NOTA: Questo passaggio può rappresentare un punto di sosta. I campioni possono essere conservati in etanolo al 70% a 4 °C prima di procedere ai passaggi successivi. La durata massima di conservazione non è stata validata sperimentalmente in questo protocollo, quindi gli utenti devono procedere secondo le pratiche standard del proprio laboratorio.
    3. Disidratare in modo sequenziale il campione in concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 96%; 1 h ciascuna a 4 °C), seguite da etanolo al 100% per tutta la notte a 4 °C.
    4. Scartare l'etanolo al 100% e sostituirlo con xilene. Incubare per 4 h a temperatura ambiente (RT).
    5. Scartare lo xilene e posizionare la cassetta del campione in un contenitore di vetro contenente paraffina fusa e pulita. Incubare nella paraffina fusa per tutta la notte a 60 °C.
      NOTA: Tempi di infiltrazione più brevi possono essere utilizzati quando sono disponibili sistemi di lavorazione assistiti da vuoto, poiché questi dispositivi facilitano una penetrazione più efficiente della paraffina40,41,42.
      ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene e soluzioni di etanolo a gradazione devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica per garantire un'adeguata ventilazione e ridurre al minimo l'esposizione ai vapori tossici e infiammabili.
  6. Inclusione in paraffina
    ​NOTA: Pulire le superfici della stazione di inclusione con una soluzione decontaminante per RNasi per prevenire la degradazione dell'RNA.
    1. Accendere la stazione di inclusione e preriscaldare il serbatoio della paraffina, il bagno per cassette, il bagno per stampi e la piastra riscaldante per stampi a 60 °C. Attivare la piastra fredda per farla raffreddare prima dell'inclusione.
    2. Lasciare sciogliere completamente la paraffina e solo successivamente posizionare le cassette contenenti i campioni infiltrati di paraffina nel bagno per cassette. Incubare per 2 h per assicurare una completa eliminazione dello xilene prima dell'inclusione.
    3. Posizionare tutti gli stampi necessari nel bagno per stampi.
      NOTA: Per i campioni umani, utilizzare stampi di inclusione metallici standard. Per i campioni di topo, utilizzare stampi di inclusione in plastica compatibili con la piattaforma Visium che includano una cavità quadrata con dimensioni adatte al corretto posizionamento delle sezioni su vetrini Visium. Poiché gli ossi interi di topo non si adattano completamente all'interno della cavità quadrata di questi stampi, tagliare le ossa immediatamente prima dell'inclusione utilizzando un bisturi sterile per ottenere frammenti di dimensioni adeguate. Uno o due frammenti ossei possono essere inclusi per stampo, a seconda delle loro dimensioni.
    4. Aggiungere uno strato sottile di base di paraffina fresca dispensando paraffina fusa dall'uscita centrale della stazione di inclusione.
    5. Aprire la cassetta e trasferire delicatamente il tessuto dalla cassetta allo stampo utilizzando pinze calde.
    6. Posizionare lo stampo riempito di paraffina sulla piastra riscaldante per stampi e, mentre la paraffina è ancora liquida, orientare il tessuto nel piano di taglio desiderato con pinze calde.
    7. Posizionare lo stampo sulla superficie fredda della stazione di inclusione per fissare brevemente la posizione del frammento osseo.
    8. Riempire completamente lo stampo con paraffina fusa dal dispensatore, assicurandosi che il tessuto sia completamente ricoperto e che non rimangano bolle di grandi dimensioni.
    9. Posizionare la cassetta etichettata sulla parte superiore dello stampo in modo che formi la base del blocco di paraffina.
    10. Trasferire lo stampo con la cassetta attaccata sulla piastra fredda della stazione di inclusione. Lasciare solidificare completamente la paraffina per 10 min, fino a quando il blocco non diventa opaco e rigido.
    11. Una volta solidificato, rimuovere il blocco di paraffina dallo stampo e conservarlo a 4 °C fino alla fase di sezionamento.
      NOTA: Questo passaggio può rappresentare un punto di sosta. Il blocco di paraffina può essere conservato a 4 °C; tuttavia, ogni volta che possibile, lo sezionamento del tessuto e le analisi trascrittomiche spaziali successive dovrebbero essere eseguiti il più presto possibile dopo l'inclusione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA durante la conservazione43,44.
  7. Sezionamento e preparazione dei vetrini
    NOTA: Pulire il microtomo e il bagno a immersione con una soluzione decontaminante per RNasi per prevenire la degradazione dell'RNA.
    1. Riempire il bagno a immersione con acqua distillata e preriscaldarlo a 42 °C. Accendere il microtomo e installare una nuova lama. Etichettare i vetrini con una matita.
    2. Montare il blocco di paraffina nel portacampione, assicurandosi che la cassetta sia orientata secondo il piano di taglio longitudinale desiderato.
      ​NOTA: Preparare un sacchetto di plastica pieno di ghiaccio e, quando il taglio diventa difficoltoso a causa della morbidezza della paraffina, posizionare il sacchetto di ghiaccio direttamente sul blocco mentre è ancora montato sul microtomo, fissandolo con un elastico per alcuni minuti per indurire la paraffina e migliorare la qualità delle sezioni.
    3. Impostare lo spessore del microtomo a 20 µm ed eseguire i tagli di sgrossamento.
    4. Modificare l'impostazione del microtomo a 5 µm. Raccogliere quattro sezioni da 5 µm in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato e privo di RNasi. Mantenere il tubo sul ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C.
    5. Continuare il sezionamento a 5 µm e far galleggiare i nastri nel bagno a immersione. Una volta che la sezione si è completamente espansa e priva di grinze, raccoglierla con il vetrino etichettato.
      1. Ogni numero prefissato di sezioni (ad esempio ogni 5-10 nastri, a seconda delle dimensioni del tessuto), raccogliere ulteriori 4 sezioni da 5 µm in un nuovo tubo da 1,5 mL etichettato. Ripetere questo processo fino a ottenere un totale di tre tubi da 1,5 mL contenenti sezioni da 5 µm.
        NOTA: Se il tessuto si crepa, si rompe o non può essere ottenuto in una sezione continua, il campione non è completamente decalcificato e richiede ulteriore tempo di decalcificazione. Recuperare il campione invertendo i passaggi del flusso di lavoro fino a raggiungere la fase di decalcificazione. A tale scopo, sciogliere il blocco di paraffina a 60 °C per circa 2 h e trasferire il campione in xilene (2 h). Riidratare il campione attraverso soluzioni di etanolo a gradazione (100%, 96%, 80%, 70%) seguite da acqua distillata. Riportare il campione riidratato in EDTA fresco 0,25 M (pH 6,95) ed estendere il periodo di decalcificazione secondo necessità prima di procedere con disidratazione, reinclusione e sezionamento. Questa procedura di recupero dovrebbe essere utilizzata esclusivamente come ultima risorsa, poiché l'inversione del processo FFPE potrebbe compromettere l'integrità dell'RNA.
    6. Posizionare i vetrini in un forno a 37 °C per tutta la notte per far evaporare qualsiasi residuo di acqua, quindi conservarli a 4 °C.
    7. Per migliorare l'adesione del tessuto, opzionalmente cuocere i vetrini per 3 h a 42 °C prima di incubarli per tutta la notte a 37 °C.
      NOTA: Questo passaggio non è generalmente necessario quando si utilizzano i vetrini elencati nella Tabella dei Materiali, poiché questi vetrini offrono un'ottima adesione e il tessuto rimane tipicamente ben attaccato durante tutte le fasi di lavorazione. Questo passaggio può rappresentare un punto di sosta. I vetrini possono essere conservati a 4 °C; tuttavia, ogni volta che possibile, le analisi trascrittomiche spaziali successive dovrebbero essere eseguite il più presto possibile dopo l'inclusione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA durante la conservazione43,44.

2. Valutazione della qualità del campione

  1. Valutazione della qualità delle sezioni
    1. Esaminare tutte le sezioni una alla volta al microscopio ottico in luce normale (4×–10×). Ispezionare ogni vetrino per assicurarsi che le sezioni non siano frammentate e registrare la qualità di ciascuna sezione.
      ​NOTA: Verificare la presenza di pieghe, grinze, compressioni o segni di vibrazione, che potrebbero indicare problemi legati alla durezza del paraffina, alla qualità del taglio o alla decalcificazione incompleta. Assicurarsi che nessuna area del tessuto sia mancante a causa di distacco durante il sezionamento o il trasferimento nel bagno d'acqua.
    2. Selezionare le sezioni meglio conservate per la trascrittomica spaziale (quelle più complete e con la migliore morfologia).
    3. Identificare le sezioni consecutive adiacenti a quelle selezionate e riservarle per la colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e per l'immunofluorescenza (IF), in modo che l'immagine colorata corrisponda il più possibile al tessuto che verrà sequenziato.
  2. Colorazione H&E per la valutazione dell'integrità del tessuto
    1. Posizionare i vetrini su un portavetrini in vetro e incubarli per 15 min a 60 °C.
    2. Trasferire il portavetrini in barattoli di vetro contenenti xilene per 15 min.
    3. Reidratare le sezioni spostando il portavetrini attraverso barattoli contenenti etanolo al 100%, 96%, 80% e 70%, lasciando 5 min in ciascuna soluzione.
      ​ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene e soluzioni di etanolo in gradazione devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica per garantire un'adeguata ventilazione e ridurre al minimo l'esposizione ai vapori tossici e infiammabili.
    4. Lavare i vetrini per 5 min in un barattolo contenente acqua.
    5. Immergere il portavetrini in ematossilina per 10 min, quindi lavare sotto acqua corrente fino a quando l'acqua di lavaggio diventa limpida.
    6. Immergere il portavetrini in acqua contenente cinque gocce di acido cloridrico concentrato, agitando delicatamente finché non appare una tonalità rossiccia.
    7. Trasferire il portavetrini in acqua satura di carbonato di litio fino allo sviluppo di una colorazione blu stabile, quindi risciacquare brevemente in acqua.
    8. Colorare le sezioni con eosina al 1% (p/v) per 5 min, quindi risciacquare nuovamente in acqua.
    9. Deidratare i vetrini spostando il portavetrini attraverso barattoli contenenti acqua, etanolo al 70%, 80%, 96% e 100%, lasciando 5 min in ciascuna soluzione.
    10. Chiarificare i vetrini in xilene per 15 min.
    11. Asciugare delicatamente il retro di ogni vetrino, applicare un mezzo di montaggio su un coprioggetto e montare le sezioni. Lasciare i vetrini asciugare a temperatura ambiente (RT) per 24 h prima dell'acquisizione delle immagini.
    12. Effettuare l'acquisizione delle immagini del tessuto utilizzando un microscopio ad alta risoluzione con un ingrandimento di 20x.
      NOTA: Eseguire la colorazione H&E su sezioni adiacenti come primo passaggio di controllo qualità per valutare l'idoneità del campione alla trascrittomica spaziale. Dopo la selezione, eseguire una seconda colorazione H&E direttamente sulla sezione destinata alla trascrittomica spaziale, seguendo le linee guida del produttore per la preparazione del tessuto indicate nella Tabella dei Materiali.
  3. Valutazione dell'integrità dell'RNA (DV200)
    ​NOTA: Nel protocollo di espressione genica spaziale, il tradizionale parametro di integrità dell'RNA (RIN) non è efficace poiché nei tessuti fissati i picchi dell'RNA ribosomiale 18S e 28S sono generalmente assenti. Pertanto, la metrica DV200, definita come la percentuale di frammenti di RNA superiori a 200 nucleotidi, è comunemente utilizzata come parametro di qualità più informativo rispetto al RIN per campioni clinici degradati. Per Visium v2, 10x Genomics raccomanda l'uso di blocchi FFPE con un valore DV200 ≥ 30% per garantire un'efficiente ibridazione delle sonde e un'ottimale prestazione del test. La selezione di blocchi di tessuto con i valori DV200 più elevati disponibili aiuta a prevenire perdite nel sequenziamento e massimizza la sensibilità dei punti di rilevamento.
    1. Recuperare i tubi da 1,5 mL contenenti le sezioni da 5 µm raccolte durante il passaggio di sezionamento del tessuto e posizionarli sul ghiaccio per l'estrazione dell'RNA.
    2. Estrarre l'RNA totale. Questa procedura standardizzata include la deparaffinizzazione del campione, la digestione con proteasi K per invertire i legami incrociati da formalina, la rimozione del DNA genomico mediante trattamento con DNasi I e l'eluzione finale dell'RNA purificato in acqua priva di RNasi.
    3. Valutare l'integrità dell'RNA utilizzando un sistema basato su elettroforesi capillare con un saggio RNA ad alta sensibilità. Un riepilogo del flusso di lavoro è riportato in File Supplementare 142,45,46,47,48.
  4. Immunofluorescenza (IF) opzionale per la verifica del tipo cellulare
    1. Posizionare il vetrino FFPE su un portavetrini in vetro e incubarlo per 15 min a 60 °C.
    2. Trasferire il portavetrini in barattoli di vetro contenenti xilene per 15 min.
    3. Reidratare la sezione spostando il portavetrini attraverso etanolo al 100%, 96%, 80% e 70% per 2 min ciascuno, seguiti da 5 min in acqua e 5 min in PBS-Tween (1x PBS con 0,1% di Tween-20).
      ATTENZIONE: Tutti i passaggi che coinvolgono xilene ed etanolo devono essere eseguiti all'interno di una cappa chimica.
    4. Eseguire il recupero dell'antigene seguendo le raccomandazioni del produttore per l'anticorpo primario, assicurandosi che il tampone di recupero, il pH e le condizioni di riscaldamento corrispondano a quanto indicato nella scheda tecnica dell'anticorpo. NOTA: In questo flusso di lavoro, il recupero dell'antigene viene effettuato utilizzando Tris 10 mM ed EDTA 1 mM, pH 9,0, in un sistema di riscaldamento tipo pentola per 30 min a 95 °C, quindi raffreddato per 20 min a temperatura ambiente.
    5. Lavare il vetrino due volte per 10 min ciascuna in PBS-Tween.
    6. Tracciare una barriera idrofoba intorno al tessuto utilizzando una penna idrofoba e bloccare il legame non specifico applicando il 5% di BSA in DPBS 1x sulle sezioni di tessuto per almeno 40 min a temperatura ambiente in una camera umidificata.
      NOTA: La camera umidificata viene preparata posizionando un foglio di carta filtro in una scatola di plastica per vetrini e inumidendolo completamente con acqua distillata per mantenere un ambiente umido stabile durante l'incubazione con gli anticorpi.
    7. Preparare la soluzione dell'anticorpo primario in DPBS 1x alla diluizione raccomandata per ciascun anticorpo.
      NOTA: In questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati anticorpi primari contro Emcn (V.7C7) e Cd271 (ME20.4) per identificare rispettivamente le cellule endoteliali (EC) e le cellule staminali mesenchimali (MSC) murine, mentre sono stati impiegati anticorpi contro CD31 (JC70A) o PRRX1 (policlonale) per identificare i corrispettivi umani, come indicato dal protocollo del produttore.
    8. Rimuovere la soluzione di blocco tamponando delicatamente il bordo del vetrino su carta assorbente per eliminare le gocce residue, quindi applicare la miscela di anticorpi primari e incubare il vetrino tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata.
    9. Lavare il vetrino due volte per 5 min in PBS-Tween e preparare la soluzione dell'anticorpo secondario alla diluizione raccomandata dal produttore, assicurandosi che i fluorocromi siano spettralmente compatibili e non si sovrappongano.
      NOTA: In questo flusso di lavoro, è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor alla diluizione 1:200.
    10. Applicare la miscela di anticorpi secondari e incubare per 30 min a temperatura ambiente, protetta dalla luce in una camera umidificata.
    11. Lavare il vetrino due volte per 5 min in PBS-Tween.
    12. Applicare un'1:10 di diluizione del mezzo di montaggio contenente DAPI (vedere Tabella dei Materiali), preparata in una soluzione 1:1 di PBS–glicerolo, e incubare il campione per 5 min.
    13. Montare la sezione con un coprioggetto e sigillare i bordi con smalto per unghie per prevenire l'essiccazione.
    14. Visualizzare il tessuto colorato utilizzando una piattaforma di imaging multispettrale.

File Supplementare 1: Sintesi dei Passaggi del Protocollo per la Valutazione dell'Integrità dell'RNA e del Flusso di Lavoro di Visium Spatial Transcriptomics. Questo file supplementare fornisce un riassunto dettagliato delle procedure eseguite in conformità alle istruzioni del produttore. Include: (i) il test High Sensitivity RNA ScreenTape utilizzato per valutare l'integrità dell'RNA (DV200), descritto al punto 2.3.3 del protocollo principale, e (ii) una panoramica del flusso di lavoro Visium CytAssist per l'espressione genica spaziale, che comprende la pre-elaborazione del tessuto, la preparazione della libreria e il sequenziamento (passaggi 3.1–3.3 del protocollo principale).Fare clic qui per scaricare questo file.

3. Trascrittomica spaziale

NOTA: eseguire il flusso di lavoro di trascrittomica spaziale utilizzando la piattaforma e i reagenti elencati nella Tabella dei materiali, seguendo le guide utente corrispondenti42,45,46. File Supplementare 1 riassume i principali passaggi di pre-elaborazione del tessuto, preparazione della libreria e sequenziamento.

  1. Controllo di qualità dei dati di transcriptomica spaziale
    1. Demultiplexare i dati di transcriptomica spaziale utilizzando la pipeline standard per set di dati Visium (vedere Tabella dei Materiali).
    2. Mappare le letture sul genoma di riferimento Ensembl 105 appropriato.
      NOTA: sono stati utilizzati GRCh38 per campioni umani e mm10 per campioni murini.
    3. Generare le matrici filtrate di caratteristiche e codici a barre utilizzando la stessa pipeline e importarle nell'ambiente di analisi single-cell/spaziale successivo (vedere Tabella dei Materiali).
    4. Esaminare le immagini ematossilina-eosina (H&E) nell'interfaccia di visualizzazione fornita dalla pipeline di transcriptomica spaziale (vedere Tabella dei Materiali) e rimuovere manualmente i punti che sovrappongono la regione dell'osso corticale o del tessuto osseo, a seconda del set di dati.
    5. Normalizzare i set di dati utilizzando un metodo di trasformazione stabilizzante della varianza comunemente applicato nei flussi di lavoro di analisi single-cell (vedere Tabella dei Materiali).

Risultati

Per valutare l'applicabilità di questo protocollo basato sull'EDTA in diverse specie e contesti patologici, il metodo è stato applicato a quattro campioni di midollo osseo: due femori murini e due campioni ossei umani rappresentativi di condizioni sane e di mieloma multiplo (MM) (Tabella 1 e Figura 1).

Identificazione del campioneSpecieSessoEtàMalattia
YFPcγ1MouseFemmina210 giorniSano
mMMMouseMaschio314 giorniMM
hHBMUmanoMaschio76 anniSano
hMMUmanoFemmina50 anniMM

Tabella 1: Campioni ossei murini e umani inclusi nello studio. Per ogni campione sono indicati la specie, il sesso, l'età e lo stato di salute. Abbreviazioni: hHBM = midollo osseo umano sano; hMM = mieloma multiplo umano; mMM = mieloma multiplo murino; MM = mieloma multiplo; YFPcγ1 = topo di controllo sano.

I campioni utilizzati in questo studio sono stati precedentemente caratterizzati e descritti in pubblicazioni precedenti del gruppo di ricerca, in particolare nei lavori di Muiños-Lopez et al. e Cenzano et al., ad eccezione del campione di topo MM. Per i campioni già riportati, i dati e i risultati di trascrittomica spaziale sono presentati in tali studi8,10. Pertanto, il materiale incluso in questo contesto è utilizzato per valutare l'adeguatezza tecnica del protocollo per la trascrittomica spaziale, piuttosto che per presentare nuovi risultati biologici.

Campioni ossei di femore di topo sono stati ottenuti dal modello murino di mieloma (MM) geneticamente modificato BIC (BIcγ1), che riproduce le caratteristiche cliniche e immunologiche dei pazienti affetti da MM, e dai corrispondenti topi di controllo sani (YFPcγ1)8,49. Da ciascun animale è stato prelevato un singolo femore, pulito ed elaborato secondo un protocollo standardizzato (Figura 2A). I femori sono stati utilizzati specificamente per queste analisi poiché offrono un midollo abbondante, una qualità superiore della nicchia ematopoietica e una lavorazione facilmente riproducibile, rendendoli particolarmente adatti a una piattaforma di trascrittomica spaziale basata sul sequenziamento8,10. La decalcificazione riuscita del femore del topo di controllo è stata confermata macroscopicamente osservando un aumento evidente della flessibilità del tessuto durante la manipolazione manuale con pinzette (Figura 2B). Successivamente, questo frammento osseo è stato incorporato in modo efficiente in paraffina utilizzando uno stampo specializzato compatibile con la trascrittomica spaziale, al fine di preservare l'integrità dell'RNA e l'architettura tissutale per analisi molecolari successive (Figura 2C).

Sono stati analizzati anche due campioni di MO umano con diverse modalità di lavorazione8,10. Un campione fresco di MO umano ematologicamente sano è stato ottenuto da rifiuti chirurgici durante una sostituzione d’anca presso l’Ospedale Universitario di Navarra (Figura 2D–F). Per dimostrare l’utilità traslazionale del protocollo, questo campione è stato processato come i campioni murini. In accordo con i risultati osservati nei tessuti murini, la decalcificazione con EDTA dell’osso umano è stata confermata macroscopicamente dalla completa ammorbidimento del tessuto, come evidenziato dalla facile penetrazione di un ago (Figura 2E). Il frammento osseo umano decalcificato è stato correttamente incluso in paraffina utilizzando uno stampo metallico standard per le successive lavorazioni (Figura 2F). Il secondo campione umano consisteva in biopsie di MO in blocchetti FFPE provenienti dalla cresta iliaca di un paziente affetto da MM, conservate presso il Dipartimento di Anatomia Patologica della Clínica Universidad de Navarra (CUN). È importante notare che questo campione archiviato di MM era stato precedentemente decalcificato mediante un protocollo clinico standard che prevede l’uso di acidi forti36. Questo campione offre un confronto qualitativo con i campioni trattati con EDTA; tuttavia, le differenze nella provenienza del tessuto, nella storia di fissazione, nella conservazione e nel processo di decalcificazione fanno sì che le differenze osservate non possano essere attribuite esclusivamente all’agente decalcificante.

Processamento istologico dei tessuti: sei campioni di tessuto con righelli; imaging per l'analisi nella ricerca.
Figura 2: Campioni di osso murino e umano durante la preparazione basata su EDTA. (A) Femori di controllo di topo integri prima della decalcificazione. (B) Femore di controllo di topo decalcificato che mostra un aumento della flessibilità. (C) Frammenti ossei di controllo di topo inclusi in paraffina. (D) Frammenti ossei umani sani provenienti da intervento chirurgico all'anca prima della decalcificazione. (E) Lo stesso frammento dopo decalcificazione con EDTA, che mostra la penetrazione dell'ago. (F) Osso umano sano decalcificato con EDTA incluso in paraffina. Barre della scala: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abbreviazione: EDTA = acido etilendiamminotetraacetico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per analizzare l'architettura tissutale generale, è stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) (Figura 3). La migliore conservazione morfologica osservata nei campioni murini potrebbe riflettere differenze nella manipolazione e nella preparazione dei campioni piuttosto che caratteristiche intrinseche proprie della specie. I femori di topo sono stati raccolti specificamente per la trascrittomica spaziale e processati immediatamente come ossa integre, preservandone così l'architettura (Figura 3A, B). Al contrario, i campioni umani provengono o da materiale residuo ottenuto durante interventi di sostituzione dell'anca (Figura 3C) o da biopsie ossee diagnostiche per mieloma multiplo (MM) (Figura 3D), entrambi i quali possono presentare una qualità tissutale pre-analitica variabile. Di conseguenza, le differenze morfologiche tra il campione umano decalcificato con EDTA e la biopsia di MM decalcificata con acido sono lievi, poiché entrambi i campioni umani mostrano già limitazioni strutturali di base introdotte non solo dalla decalcificazione, ma anche dal generale processo di preparazione del tessuto (Figura 3C, D). Pertanto, una valutazione completa della qualità del campione per la trascrittomica spaziale richiede l'analisi di diversi parametri distinti. In primo luogo, è necessario monitorare attentamente l'integrità del tessuto, poiché la conservazione strutturale può variare notevolmente in base al tipo specifico di campione e non soltanto in relazione all'acido decalcificante utilizzato. In secondo luogo, va valutata anche la qualità dell'RNA, poiché le condizioni di decalcificazione possono influenzarla20,35,36.

Confronto istologico di campioni di tessuto al microscopio; scala di 500μm per l'analisi strutturale.
Figura 3: Sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) utilizzate per la valutazione della qualità del tessuto. Sezioni consecutive in paraffina fissate in formalina (FFPE) corrispondono a (A) un topo controllo sano10, (B) un topo con mieloma multiplo (MM), (C) osso umano sano8,10 e (D) una biopsia umana di MM8. Le barre della scala corrispondono a 500 µm. Abbreviazioni: FFPE = fissato in formalina, in paraffina; H&E = ematossilina ed eosina; MM = mieloma multiplo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per integrare l'analisi istologica, è stata valutata la qualità dell'RNA. Mentre la colorazione H&E ha prodotto differenze ambigue, l'integrità dell'RNA ha chiaramente distinto gli effetti dei due metodi di decalcificazione (Tabella 2). I valori DV200 sia dai campioni murini che dal campione osseo umano sano hanno superato la soglia raccomandata per i saggi Visium FFPE, indicando una distribuzione sufficiente della lunghezza dei frammenti di RNA per l'ibridazione delle sonde e la costruzione della libreria. Il campione del topo sano con YFP mostra un DV200 dell'82,55% e il campione osseo umano sano (hHBM) raggiunge il 58%, entrambi ben al di sopra della soglia di accettabilità del 30% definita da 10x Genomics. Il campione del topo con MM (mMM) mostra un DV200 del 31,3%, vicino al limite inferiore di accettabilità, il che potrebbe riflettere un prolungato stoccaggio del blocco in paraffina a 4 °C prima della sezionatura, tra altri fattori specifici del campione. Al contrario, la biopsia umana con mieloma multiplo decalcificata con acido (hMM) presenta un DV200 di soli l'8%, associato a un'integrità dell'RNA notevolmente più bassa, anche quando il deterioramento morfologico è meno pronunciato. In sintesi, è importante eseguire valutazioni sia strutturali che molecolari per determinare l'idoneità del campione per analisi spaziali successive.

Identificazione del campioneDV200 (%)1
YFPcγ182,55
mMM31,3
hHBM58
hMM28
1DV200: Percentuale di frammenti totali di RNA > 200 nucleotidi.
2Questo campione è stato decalcificato utilizzando un protocollo clinico standard che prevede l'uso di acidi forti.

Tabella 2: Qualità dell'RNA dei campioni dello studio. Il DV200 indica la percentuale di frammenti di RNA più lunghi di 200 nucleotidi; sono stati considerati idonei per le analisi successive di trascrittomica spaziale i valori pari almeno al 30%. Abbreviazioni: hHBM = midollo osseo umano sano; hMM = mieloma multiplo umano; mMM = mieloma multiplo murino.

È possibile eseguire anche ulteriori valutazioni della qualità. Per validare ulteriormente l'integrità del tessuto e confermare la conservazione di specifici compartimenti cellulari dopo la decalcificazione con EDTA, è stata effettuata una colorazione immunofluorescente (IF) opzionale su sezioni FFPE adiacenti di tessuti murini e umani. Gli anticorpi contro Endomucina (Emcn) e Cd271 sono stati utilizzati per visualizzare rispettivamente le cellule endoteliali (EC) e le cellule mesenchimali (MSC) nel campione murino di mieloma (Figura 4A). Questa colorazione ha mostrato che i tessuti trattati con EDTA presentavano strutture vascolari ben definite con marcatura continua per Emcn e reti stromali preservate, dimostrando che i marcatori testati sono rimasti rilevabili dopo il trattamento. Inoltre, l'imaging ad alta risoluzione mediante un sistema automatizzato di imaging multispettrale ha fornito ulteriori evidenze del fatto che gli antigeni testati sono rimasti rilevabili per la verifica del tipo cellulare, aggiungendo un ulteriore livello di controllo qualità prima dell'analisi trascrittomiche spaziale. Inoltre, questi risultati sono stati osservati anche in campioni umani sani di soggetti anziani, nei quali l'espressione delle EC è stata rilevata anche mediante anticorpi anti-CD31 e quella delle MSC mediante anticorpi anti-PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), dimostrando che i marcatori del nicchio testati sono rimasti identificabili dopo la decalcificazione con EDTA (Figura 4B). Al contrario, questi risultati non sono stati replicabili in biopsie umane di mieloma sottoposte a diversi protocolli di decalcificazione acida. Come menzionato in precedenza, l'integrità dell'RNA in questi campioni era bassa, limitando l'analisi trascrittomiche successiva. A causa dello stato degradato di questi campioni umani, la loro utilizzabilità successiva si è limitata al profilo trascrittomico di base8 e alla valutazione immunohistochimica (IHC) delle cellule plasmatiche maligne (PC) (Figura 4C).

Microscopia a immunofluorescenza di sezioni di tessuto; colorazione multicolore; analisi della struttura cellulare.
Figura 4: Immunofluorescenza e immunohistochimica facoltative per la verifica del tipo cellulare. (A) Tessuto di MM murino che mostra nuclei marcati con DAPI (blu), MSC positivi per CD271 (verde) ed EC positivi per EMCN (rosso). (B) Osso umano sano che mostra nuclei marcati con DAPI (blu), MSC positivi per PRRX1 (verde) ed EC positivi per CD31 (rosso)10. (C) Biopsia umana di MM che mostra plasmacellule maligne positive per CD1388. Barre della scala: (A) 250 µm (panoramica), 20 µm (ingrandimento sovrapposto) e 50 µm (immagini a canale singolo); (B) 500 µm (panoramica) e 20 µm (ingrandimenti sovrapposti e a canale singolo); (C) 500 µm. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; EC = cellula endoteliale; MM = mieloma multiplo; MSC = cellula stromale mesenchimale; PC = cellula plasmatica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nel complesso, i risultati relativi alla morfologia del tessuto e al DV200 supportano l'idoneità dei campioni processati con EDTA per analisi trascrittomiche spaziali successive. Applicazioni trascrittomiche spaziali di questo protocollo di preparazione sono state riportate in precedenza8,10.

Discussione

Integrando una decalcificazione controllata a base di EDTA, una procedura standardizzata per i campioni in paraffina (FFPE) e rigorosi punti di controllo della qualità, questo protocollo supera molte delle limitazioni tradizionalmente associate alla preparazione del tessuto osseo per la trascrittomica spaziale, in particolare quelle legate alla degradazione dell'RNA e ai danni morfologici causati dai metodi di decalcificazione acidi forti8,10,20,33,36. Il passaggio più critico nella preparazione di campioni mineralizzati per la trascrittomica spaziale è la decalcificazione. Una decalcificazione insufficiente produce un osso ancora troppo rigido per essere sezionato, rendendo fisicamente impossibile ottenere sezioni di alta qualità per la trascrittomica spaziale8,20,23,37,50. Quando il tessuto osseo rimane troppo duro, va in frantumi o vibra contro la lama del microtomo, producendo sezioni strappate o forate che non rappresentano accuratamente l'architettura nativa del midollo osseo (BM). È importante sottolineare che il successo della decalcificazione non può essere completamente verificato fino alla fase di microtomia: anche campioni che appaiono superficialmente ammorbiditi potrebbero ancora contenere minerali residui, evidenti solo durante il tentativo di tagliare sottili sezioni FFPE. Per questo motivo, un attento monitoraggio dell'avanzamento della decalcificazione è essenziale per garantire risultati riproducibili.

Il protocollo prevede l'utilizzo di EDTA 0,25 M a pH 6,95 per 10 giorni, con agitazione costante e sostituzione della soluzione al quinto giorno8,10. Durante lo sviluppo del protocollo, sono stati valutati l'EDTA da solo, l'EDTA integrato con polivinilpirrolidone e l'acido formico al 10%, insieme a diverse durate di decalcificazione e programmi di sostituzione della soluzione; i dati comparativi non sono riportati qui. Durate inferiori a 10 giorni hanno spesso causato la rottura del tessuto durante la sezionatura dei campioni murini, mentre i campioni umani hanno mostrato un comportamento variabile a seconda del campione. La durata di 10 giorni viene pertanto utilizzata per i femori di topo, mentre i campioni umani potrebbero richiedere una decalcificazione più lunga in base alla densità e al contenuto trabecolare. Prima dell'inclusione in paraffina, devono essere effettuati controlli fisici di qualità. Se durante la microtomia si evidenzia una decalcificazione insufficiente, la procedura di riprocessamento deve essere utilizzata solo come misura estrema di recupero, poiché ulteriore calore, esposizione a solventi e reidratazione potrebbero compromettere la qualità dell'RNA.

Il limite principale di questo metodo è il tempo di lavorazione prolungato, che contrasta fortemente con le procedure rapide basate su acidi comunemente utilizzate in patologia clinica20,36. Sebbene tempi di lavorazione più lunghi siano generalmente accettabili in ambito di ricerca, studi recenti, come il protocollo descritto da Miao et al., che utilizza la soluzione di Morse (22,5% di acido formico e 10% di citrato di sodio) per decalcificare entro 24 ore, evidenziano l'interesse crescente nell'accelerare la preparazione dell'osso per saggi spaziali20. Tuttavia, i metodi basati su acidi comportano storicamente un rischio molto maggiore di degradazione dell'RNA, riducendo i valori DV200 e limitando infine la loro compatibilità con la trascrittomica spaziale1,8,35,36. Questo approccio basato sull'EDTA privilegia la conservazione dell'RNA rispetto alla velocità, garantendo compatibilità con piattaforme spaziali basate sul sequenziamento come Visium.

Un limite potenziale della trascrittomica spaziale del MO è l'elevata abbondanza di trascritti di immunoglobuline derivati dalle CP, che può ridurre il rilevamento di geni a bassa abbondanza. Come nelle strategie di controllo qualità e filtraggio applicate in uno studio precedente del gruppo di ricerca, inclusa la rimozione di spot di bassa qualità (<200 UMIs e <150 geni rilevati), il filtraggio di tipi cellulari con basso contributo (<20% per spot) durante le analisi di deconvoluzione e la selezione di geni marcatore rilevati nei dataset trascrittomici spaziali, anche i trascritti di immunoglobuline possono essere filtrati computazionalmente durante l'analisi successiva per minimizzarne l'impatto quando opportuno8. Approcci trascrittomici spaziali mirati possono ulteriormente migliorare il rilevamento di trascritti a bassa abbondanza in specifiche applicazioni.

Le potenziali applicazioni di questo metodo sono ampie. La recente integrazione di dati spaziali e di singola cellula ha rivelato nicchie osteogeniche umane specializzate e complessi gradienti di segnalazione che si irradiano dall'osso trabecolare3,26. Inoltre, la trascrittomica spaziale ha mostrato che l'invecchiamento rimodella il microambiente del midollo osseo (BM) alterando l'organizzazione spaziale e la comunicazione delle cellule endoteliali (EC), portando a un supporto osteogenico compromesso e all'emergere di reti di segnalazione infiammatoria all'interno della nicchia senescente10. Il profilo multiomico ha inoltre identificato distinti compartimenti microambientali, come le regioni arterio-endostee che supportano la mielopoiesi precoce e le zone peri-adipocitarie arricchite in cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici3. Nel contesto del mieloma multiplo (MM), questo protocollo consente l'integrazione di approcci trascrittomica spaziale e di singola cellula per caratterizzare la composizione del midollo osseo murino malato e le interazioni cellula-cellula. Studi precedenti hanno rivelato distribuzioni spazialmente distinte delle plasmacellule (PC) maligne e identificato programmi immunitari e infiammatori, come la NETosi e la segnalazione IL-17, inversamente associati alle regioni arricchite da tumore. Inoltre, un aumento della densità di PC maligne si è correlato a un passaggio da stati di cellule T effettrici a stati di esaurimento. Questi risultati sono stati inoltre validati in campioni di midollo osseo umano in paraffina (FFPE), dimostrandone la rilevanza traslazionale in presenza di diversi carichi patologici8. In definitiva, questo flusso di lavoro preparativo fornisce la base tecnica per esplorare le complesse interazioni cellulari all'interno dell'architettura mineralizzata del midollo osseo.

Le piattaforme di espressione genica spaziale ad alta definizione possono fornire un'analisi dell'intero trascrittoma con risoluzione prossima a quella monocellulare38,51,52. Questi approcci potrebbero estendere l'utilizzo del protocollo di preparazione a un'analisi ad alta risoluzione delle popolazioni cellulari spazialmente organizzate nel midollo osseo e delle neoplasie ematologiche. Il protocollo, pertanto, costituisce una base tecnica per futuri studi sull'ematopoiesi fisiologica e maligna.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi. È stato concesso in licenza a MIMO Biosciences un brevetto sul know-how e sull'uso sperimentale dei modelli murini MIcγ1 di MM (numero di domanda PCT/EP2023/071025).

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III e cofinanziato dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (ERDF) A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) e RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Dipartimento della Salute del Governo della Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC e AIRC nell'ambito del programma Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) e The Paula and Rodger Riney Foundation a favore di FP. IAC ha ricevuto sostegno da una borsa Marie Curie (H2020- MSCA-IF-837491) della Commissione Europea, da una borsa AECC Talent (INVES258003CALV) e dal Dipartimento della Salute del Governo della Navarra (GN2023/03). MC è stato sostenuto da una borsa FPU (FPU22/03283) del Ministero della Scienza, Innovazione e Università. Desideriamo ringraziare il personale del Laboratorio di Genomica Avanzata e della Struttura Animale del CIMA dell'Università di Navarra per l'insostituibile assistenza tecnica e intellettuale. Ringraziamo inoltre i Dipartimenti di Anatomia Patologica della Clínica Universidad de Navarra (CUN) e dell'Ospedale Universitario della Navarra per aver fornito campioni di MO e per la straordinaria collaborazione. Un ringraziamento speciale va a José Ángel Martínez-Climent e Marta Larrayoz per i loro modelli murini di MM. Grazie a Patxi San Martín-Uriz, Tania López ed Eduardo Larequi per l'eccellente supporto nell'ottimizzazione delle tecnologie, nello sviluppo dei protocolli e nella risoluzione dei problemi relativi all'elaborazione di campioni di MO murini e umani per la trascrittomica spaziale. Ringraziamo anche Beñat Ariceta e Asier Ullate per tutto il lavoro computazionale svolto sulla trascrittomica spaziale. Infine, siamo profondamente grati ai pazienti e ai donatori sani che hanno generosamente partecipato a questo studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi da 1,5 mLEppendorf15625367
Contenitore sterile da 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ASistema basato su elettroforesi capillare–per la valutazione dell'integrità dell'RNA
Contenitore sterile da 50 mL IberoMedREOR001
Tubo da 50 mL FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAPenna per barriera idrofoba 
Anticorpo anti-PRRX1 prodotto in coniglioSigma-AldrichHPA051084
BSA (Albumina Sierica Bovina)Sigma-AldrichA9418-50G
Cassette KartellLABWARE2921
Anticorpo monoclonale CD271 (Recettore NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, Cellula Endoteliale (Concentrato) Clone JC70AAligent DakoM0823
CoverslipFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium con DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Soluzione di deparaffinizzazioneQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APSoluzione salina tamponata al fosfato (DPBS, 1×), formula di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio, Thermo Scientific Chemicals
Montante DPX per istologiaSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione 0,5 M, grado biologia molecolare, ultrapuro
Stazione di inclusione Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Anticorpo Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Genoma di riferimento Ensembl (GRCh38 / mm10, release 105)EMBL-EBIN/AGenoma di riferimento utilizzato per l'allineamento delle letture.
EosinaMillipore SigmaHT110116
EtileneMillipore SigmaE7023-500MLForbici chirurgiche
Falc Instruments B-I Bagno termostatato per istologiaFalc610.1030.00
Formalina al 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldeide 3,7%–4,0% p/v tamponata a pH = 7 e stabilizzata con metanolo (CE-IVD) per diagnostica clinica
Porta-vetrini per colorazione in vetro WHEATONZ710970-3EA
Vasetti per colorazione in vetro BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GliceroloSigma-AldrichC3H803
Secondario anticorpo capra anti-topo IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Secondario anticorpo capra anti-topo IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Secondario anticorpo capra anti-coniglio IgG (H+L) altamente cross-adsorbito, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Ematossilina Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Valutazione dell'integrità dell'RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Valutazione dell'integrità dell'RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Valutazione dell'integrità dell'RNA
Microscopio ad alta risoluzione Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Acido cloridrico (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Piattaforma Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Secondario anticorpo capra anti-ratto IgG (H+L) cross-adsorbito, Alexa Fluo 568, InvitrogenInvitrogenA11077
Forbici Iris - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isolfurano
Carbonato di litio Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware utilizzato per visualizzare le immagini HE e curare i punti Visium; apre file .cloupe generati dalla pipeline di analisi.
Muffole metalliche per inclusioneBio-Optica07-BM24256
Vetrini per microscopioavantor631-0108Vetrini per microscopio Superfrost Plus
Lame per microtomoFEATHERFEAT207500006_U
Microtomo HM 340EEprediaN/AModello HM 340E
AgoBD301156BD Microlanc Ago 3, 21 G, 1 IN (25 mm)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Microscopio a luce bianca
Paraffina PanReac AppliChem256993Paraffina P.F. 55–58°C plastificata + pellet di DMSO (CE-IVD) per diagnostica clinica
Piastra di Petri CorningCLS430167-100EA
Muffole di plastica per inclusione Bio-Optica07-MP7070
Pinze di Potts-SmithF.S.T 11012-18Pinze
Fluorimetro Qubit 3.0Invotrogen Q33216
Provette per saggio QubitInvotrogen Q32856
Kit per saggio RNA HS QubitInvotrogen Q32855
Tubo microcentrifuga RNAse free da 1,5 mLThermo Scientific AM12400
Acqua priva di RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Soluzione disinfettante
Kit RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Estrazione totale di RNA
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AMetodo di normalizzazione stabilizzante la varianza implementato in Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/APacchetto R utilizzato per l'analisi di trascrittomica singola cellula e spaziale.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware utilizzato per demultiplexing, allineamento e generazione di matrici funzionalità-barcode per dataset Visium.
Scalpello Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/APacchetto R utilizzato per la visualizzazione e l'integrazione della trascrittomica spaziale.
Lama per scalpello chirurgico n. 23Swann-Morton210Lame per scalpello chirurgico
Ciclatore termico Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Piattaforma di imaging multispettrale per la visualizzazione di IF
Kit accessorio Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Kit sonda trascrittoma umano Visium Piccolo 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Kit sonda trascrittoma murino Visium Piccolo 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Kit vetrino espressione genica spaziale Visium 4 rxns 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XilenePanreac214736Xilene, miscela di isomeri per analisi, ACS, ISO

Riferimenti

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

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