Rapporto di un caso di un pedigree con neuropatia motoria ereditaria distale causata da una variante omozigote c.1124G>A nel gene VRK1 (Vaccinia-Related Kinase 1)

Sommario

Questo studio riporta un pedigree consanguineo cinese con neuropatia motoria ereditaria distale ad esordio nell'età adulta (dHMN) causata da una variante omozigote c.1124G>A nel gene della chinasi correlata al vaccinia 1 (VRK1). I risultati ampliano lo spettro fenotipico clinico e genetico della dHMN associata a VRK1 nella popolazione cinese.

Abstract

Questo studio ha lo scopo di analizzare i fenotipi clinici, le caratteristiche neurofisiologiche e la patogenicità delle varianti geniche in una famiglia affetta da neuropatia motoria ereditaria distale (dHMN) causata da varianti nel gene VRK1, al fine di fornire evidenze a supporto della diagnosi clinica e del counseling genetico per questa malattia. Riportiamo una famiglia consanguinea cinese con dHMN causata da una variante omozigote c.1124G>Una variante nel VRK1 gene. Sono stati raccolti i dati clinici ed elettrofisiologici del probando. È stata eseguita la sequenza dell'esoma completo (WES) e la validazione mediante sequenziamento di Sanger per identificare il sito della variante, e l'interpretazione della patogenicità è stata effettuata secondo le linee guida dell'American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP). Il probando era un maschio di 24 anni che presentava da 2 anni un'insufficienza e un'atrofia progressiva dei distretti distali degli arti inferiori, accompagnate da arti superiori gracili e assenza di disturbi sensitivi. L'esame elettrofisiologico ha mostrato una riduzione dell'ampiezza del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) nei nervi motori sia degli arti superiori che inferiori, indicativa di un danno neurogeno periferico, mentre la conduzione nervosa sensitiva era normale. L'analisi genetica ha rilevato una variante omozigote c.1124G>una variante (p.Trp375Ter) nel VRK1 gene. I suoi genitori e le sorelle maggiori erano portatrici eterozigoti, e il pedigree era conforme a un'ereditarietà autosomica recessiva. Secondo le linee guida ACMG, questa variante è stata classificata come patogena (evidenze: PVS1, PM2, PP1). Il VRK1 omozigote c.1124G>Una variante causa una forma di dHMN ad insorgenza nell'adulto, piuttosto che l'ipoplasi pontocerebellare di tipo 1A (PCH1A) come annotato in alcuni database genetici. Questo albero genealogico presenta fenotipi distintivi, inclusi arti superiori gracili e ampiezze dei potenziali d'azione muscolari compositi (CMAP) diffuse ridotte sia negli arti superiori che inferiori, ampliando così lo spettro clinico e genetico della dHMN associata a VRK1 nella popolazione cinese.

Introduzione

La neuropatia motoria ereditaria distale (dHMN) costituisce un gruppo geneticamente eterogeneo di disturbi ereditari del sistema nervoso periferico, definito patologicamente da una degenerazione dipendente dalla lunghezza dei motoneuroni inferiori e dei loro assoni. Clinicamente, i pazienti presentano una progressiva debolezza e atrofia dei muscoli distali degli arti, mentre la funzione sensitiva rimane per lo più intatta nella maggior parte dei casi¹. Le manifestazioni iniziali interessano tipicamente gli arti inferiori distali, inclusa la debolezza nella flessione delle dita dei piedi e l'atrofia dei muscoli gastrocnemio e intrinseci del piede, con un progressivo coinvolgimento dei muscoli interossei della mano e dei muscoli tenar/ipothenar man mano che la malattia progredisce². I modelli di ereditarietà variano tra i sottotipi, con forme autosomiche dominanti e autosomiche recessive descritte. Ad oggi, sono stati associati alla dHMN oltre 50 geni patogeni, tuttavia la causa genetica sottostante rimane non identificata in più della metà degli individui colpiti³.

Data l'elevata eterogeneità genetica e l'ampio sovrapposizione fenotipica con altre condizioni neuromuscolari, la diagnosi della dHMN basata esclusivamente sulla valutazione clinica è spesso poco affidabile⁴. Gli approcci diagnostici convenzionali a passi successivi, che procedono dalla fenotipizzazione clinica al sequenziamento di geni candidati, sono inefficienti e presentano una bassa resa diagnostica, in particolare nei casi sporadici o fenotipicamente atipici^1,2. I pannelli genici mirati offrono un'alternativa più economicamente efficiente, ma sono limitati da liste di geni predefinite e possono non rilevare varianti patogene rare o nuove. Il sequenziamento dell'intero genoma offre la copertura genomica più completa, ma è limitato dall'elevato costo, dai lunghi tempi di analisi e dal gran numero di varianti di significato incerto nei contesti clinici di routine⁵. Per il presente studio, abbiamo adottato un approccio diagnostico integrato che combina valutazione clinica sistematica, esame neurofisiologico, sequenziamento dell'esoma (WES) e analisi della segregazione familiare. I test neurofisiologici aiutano a confermare il coinvolgimento esclusivamente motorio del nervo periferico e a definire la distribuzione del danno nervoso, restringendo così la diagnosi differenziale. Il WES consente l'analisi simultanea di tutti i geni noti associati alla dHMN, il rilevamento di potenziali nuove varianti patogene e successiva analisi della segregazione familiare, filtrando ulteriormente le varianti incidentali benigne e rafforzando l'evidenza della patogenicità delle varianti candidate, trovando un equilibrio pragmatico tra resa diagnostica, costo e interpretabilità.

Il gene vaccinia-related kinase 1 (VRK1) codifica una chinasi serina/treonina che partecipa alle vie di trasduzione del segnale nucleare e di riparazione del danno al DNA, e la sua funzione fisiologica è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi e della vitalità neuronale⁶. Varianti patogenetiche in VRK1 determinano uno spettro clinico ampio: ipoplasia pontocerebellare di tipo 1A ad esordio infantile (PCH1A), caratterizzata da microcefalia, ipotonia grave e ritardo motorio profondo nello sviluppo; dHMN ad esordio nell'età adulta con interessamento prevalentemente distale degli arti; e forme più rare, tra cui paraplegia spastica ereditaria (HSP) e fenotipi simili alla sclerosi laterale amiotrofica (ALS)^7,8,9. In particolare, la variante nonsenso omozigote c.1124G>A (p.Trp375Ter) in VRK1 è stata documentata in più famiglie indipendenti affette da dHMN con ereditarietà autosomica recessiva costante, confermando il suo ruolo causale consolidato nella dHMN¹⁰. Questa variante introduce un codone di terminazione prematuro nella regione codificante della coda C-terminale di VRK1 e si prevede che causi la perdita della funzione proteica attraverso la produzione di una proteina troncata o l'attivazione del decadimento dell'mRNA mediato da nonsenso. Sebbene il meccanismo patologico preciso non sia stato validato funzionalmente per questa specifica variante, si ipotizza che un'attività chinasi VRK1 compromessa possa alterare la riparazione del DNA neuronale e le cascate di segnalazione intracellulare, contribuendo così alla degenerazione dei motoneuroni e allo sviluppo della dHMN.

In ambito clinico, il test genetico per VRK1 dovrebbe essere prioritario nei seguenti scenari: pazienti con sospetto clinico di dHMN che presentano debolezza e atrofia motoria distale di tipo length-dependent con sensibilità preservata, in particolare quelli con storia familiare autosomica recessiva o insorgenza della malattia in età adulta; individui provenienti da famiglie consanguinee che presentano neuropatia motoria distale inspiegata; pazienti con manifestazioni sovrapposte del sistema nervoso centrale e periferico non attribuibili ad altre patologie genetiche note; e casi di dHMN o malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2 (CMT2) negativi per varianti patogene comuni nei geni associati^11,12. È necessario riconoscere diversi importanti limiti di questo approccio diagnostico. In primo luogo, la dHMN associata a VRK1 presenta un notevole sovrapposizione fenotipica con altre patologie neuromuscolari, tra cui l’atrofia muscolare spinale (SMA), la CMT2, la paraplegia spastica ereditaria (HSP) e le fasi iniziali della sclerosi laterale amiotrofica (ALS), con possibile rischio di errata classificazione diagnostica. In secondo luogo, l’interpretazione delle varianti rare di VRK1 rimane complessa, poiché la maggior parte di esse non dispone di validazione funzionale e si basa fortemente su strumenti di previsione bioinformatica (in silico), portando a una classificazione di patogenicità incerta per un sottoinsieme di varianti. In terzo luogo, essendo uno studio su un singolo pedigree, la generalizzabilità dei nostri risultati è limitata, e le correlazioni genotipo-fenotipo richiedono ulteriore conferma in coorti di pazienti più ampie.

Attualmente, i casi di dHMN associata a VRK1 in popolazioni cinesi rimangono scarsi e l'intera eterogeneità fenotipica e le caratteristiche cliniche di questa condizione non sono ancora state completamente definite. In questo studio, riportiamo una famiglia consanguinea cinese con dHMN causata da una variante omozigote c.1124G>A nel gene VRK1. Integrando dati clinici, elettrofisiologici e genetici, descriviamo le caratteristiche fenotipiche e genotipiche di questo ceppo familiare, fornendo dati di riferimento utili per una diagnosi clinica accurata e per il counseling genetico relativo alla dHMN associata a VRK1.

PRESENTAZIONE DEL CASO:

Il probando (III₁) era un maschio di 24 anni proveniente da Bijie, nella provincia di Guizhou, nato da genitori cugini di primo grado. Il pedigree familiare su tre generazioni è mostrato in Figura 1 ed è compatibile con un modello di ereditarietà autosomica recessiva. II₁ e II₂ (i genitori del probando) erano entrambi portatori eterozigoti della variante VRK1 c.1124G>A e risultavano asintomatici. Il probando (III₁) era omozigote per la variante e presentava sintomi clinici. III₂ e III₄ (le sorelle maggiori del probando) erano portatrici eterozigoti senza fenotipo clinico. III₃ (la terza sorella maggiore del probando) era stata adottata in età infantile e presentava un quadro simile di debolezza agli arti inferiori e atrofia muscolare, ma non era disponibile una conferma genetica.

Manifestazioni cliniche

Motivo della visita: Debolezza e atrofia progressiva di entrambi gli arti inferiori da 2 anni.

Anamnesi della malattia attuale: Due anni prima, il paziente aveva sviluppato una debolezza asintomatica degli arti inferiori distali senza fattori scatenanti evidenti. Riferiva di cadere facilmente durante la deambulazione su terreno piano, ma era in grado di accovacciarsi e rialzarsi senza aiuto. Il paziente e la sua famiglia avevano notato un assottigliamento progressivo delle gambe al di sotto delle ginocchia. Fin dall'infanzia presentava una scarsa tolleranza all'esercizio fisico, con difficoltà nel correre e nel saltare. Non erano presenti formicolii, dolore o alterazioni della sensibilità termica agli arti, né evidente debolezza agli arti superiori né sintomi bulbari. L'intelligenza era normale e lavorava autonomamente come parrucchiere.

Esame neurologico

Forza muscolare (scala MRC): Flessione dell'anca 5/5, estensione del ginocchio 4+/5, dorsiflessione della caviglia 4/5, flessione plantare della caviglia 3+/5 bilateralmente; muscoli prossimali degli arti superiori 5/5, estensione del polso 4+/5, flessione delle dita 4/5, muscoli intrinseci della mano 4/5 bilateralmente.

Tono muscolare: Normale in tutti e quattro gli arti; nessun aumento o diminuzione del tono.

Massa muscolare: È stata osservata una evidente atrofia dei muscoli distali degli arti inferiori (gastrocnemio, tibiale anteriore e muscoli intrinseci del piede) (Figura 2A). Gli arti superiori apparivano snelli, con un'atrofia lieve dei muscoli intrinseci della mano (Figura 2B).

Fascicolazioni: Non sono state osservate fascicolazioni visibili nei muscoli degli arti o del tronco.

Reflessi tendinei: I riflessi degli arti superiori erano ridotti; i riflessi tendinei degli arti inferiori (riflessi rotuleo e achilleo) erano assenti bilateralmente.

Segni patologici: Il segno di Babinski bilaterale e il segno di Chaddock erano negativi.

Esame sensoriale: La sensibilità superficiale (dolore, tatto, temperatura) e la sensibilità profonda (vibrazione, posizione) erano integre in tutti gli arti.

Coordinazione: Il test dito-naso e il test tallone-ginocchio-tibia erano normali bilateralmente.

Nervi cranici: Pupille uguali e reattive alla luce; movimenti oculari esterni completi; simmetria facciale; sollevamento normale del palato; movimenti normali della lingua senza atrofia né fascicolazioni; assenza di disfagia o disartria.

Andatura: Andatura steppante bilateralmente.

Esami di laboratorio ausiliari: La creatina chinasi sierica (CK), il livello di vitamina B₁₂ e i test della funzione tiroidea (TSH, FT3, FT4) erano tutti entro i limiti dei valori di riferimento normali.

Neuroimaging: L'immagine di risonanza magnetica cranica e spinale (MRI) non è stata eseguita in questo paziente.

Diagnosi differenziale

PCH1A: Esclusa. Il paziente presentava una forma ad insorgenza adulta, senza microcefalia, ipotonia, displasia cerebellare o ritardo dello sviluppo, aspetti non compatibili con il fenotipo classico infantile di PCH1A.

SMA: Esclusa. Il paziente presentava un esordio in età adulta con interessamento esclusivamente distale e forza normale nei segmenti prossimali degli arti, senza il tipico quadro di debolezza prevalentemente prossimale associato alla SMA.

CMT2: Escluso mediante neurofisiologia. Il paziente presentava un interessamento puramente motorio dei nervi, con potenziali d'azione nervosi sensitivi completamente normali, e pertanto non soddisfaceva i criteri diagnostici per la CMT2.

SLA: Esclusa. Non era presente alcun coinvolgimento dei motoneuroni superiori, né sintomi bulbari né fascicolazioni nei muscoli innervati dai nervi cervicali o bulbari; il decorso cronico progressivo con interessamento esclusivamente distale risultava atipico per la SLA.

HSP: Esclusa. Il paziente non presentava spasticità, non aveva iperreflessia né segni patologici, con interessamento esclusivamente del motoneurone inferiore.

Malattia di Kennedy (atrofia muscolare spinobulbare, SBMA): Esclusa. Non era presente interessamento bulbare, né fascicolazioni periorali, né manifestazioni endocrinologiche; il modello di ereditarietà non era compatibile con una trasmissione legata al cromosoma X.

Diagnosi, Valutazione e Piano

Diagnosi

1. dHMN, confermata dalla variante patogena omozigote c.1124G>A (p.Trp375Ter) nel gene VRK1 (ereditarietà autosomica recessiva).

2. Neuropatia periferica assonale puramente motoria, che interessa prevalentemente gli arti inferiori distali.

Valutazione

Il paziente presentava una debolezza motoria distale e un'atrofia muscolare di sviluppo lento, con sensibilità preservata, in accordo con il fenotipo classico dell'età adulta di dHMN legata a VRK1.

I risultati neurofisiologici hanno indicato una lesione assonale motoria diffusa con conduzione sensitiva normale, compatibile con una neuropatia motoria pura.

La gravità della malattia era da lieve a moderata nell'attuale presentazione: il paziente rimaneva deambulante e in grado di svolgere autonomamente le attività quotidiane, senza coinvolgimento bulbare o respiratorio.

Il pedigree mostrava un'eredità autosomica recessiva, con i portatori eterozigoti che rimanevano asintomatici.

Gestione e piano di follow-up

1. Gestione sintomatica: Prescrivere ortesi per caviglia e piede per migliorare la stabilità del passo e prevenire lesioni da caduta; inviare alla medicina riabilitativa per programmi personalizzati di allenamento della forza e di allungamento muscolare al fine di mantenere l'escursione articolare e prevenire le contratture.

2. Controllo periodico: Pianificare valutazioni neurologiche annuali, comprese ripetute indagini elettrofisiologiche, per monitorare l'evoluzione della malattia.

3. Consulenza genetica: Fornire una consulenza genetica dettagliata al probando e ai membri della famiglia riguardo al rischio di ricorrenza, alle opzioni di pianificazione riproduttiva e al test genetico presintomatico per i parenti a rischio.

4. Istruzione del paziente: Consigliare di evitare farmaci neurotossici e affaticamento eccessivo; fornire supporto psicologico per affrontare l'ansia correlata alla malattia.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Provinciale di Medicina Tradizionale Cinese di Yunnan (numero di approvazione: YYLW-2026-006). Il consenso informato scritto è stato ottenuto dal probando e da tutti i membri della famiglia partecipanti prima dell'arruolamento.

1. Preparazione del partecipante e valutazione clinica

1. Il probando e i membri della famiglia disponibili sono stati arruolati dopo aver ottenuto il consenso informato scritto.
2. Sono state raccolte informazioni demografiche dettagliate, la storia della malattia, l’anamnesi familiare e i dati sulla consanguineità mediante un questionario standardizzato.
3. È stata effettuata un’esame neurologico sistematico, comprendente la valutazione della forza muscolare, del tono muscolare, dei riflessi tendinei, della funzione sensitiva, della coordinazione, dell’andatura e della funzione dei nervi cranici.
4. La forza di tutti i principali gruppi muscolari è stata documentata utilizzando la scala del Medical Research Council (MRC).
5. Sono state ottenute fotografie cliniche degli arti dopo aver ricevuto il consenso scritto dal partecipante.
   NOTA: Tutte le valutazioni cliniche sono state eseguite da un neurologo certificato da collegio specializzato in disturbi neuromuscolari, al fine di garantire coerenza diagnostica.

2. Esame neurofisiologico

1. Preparazione del paziente
   1. È stato chiesto al partecipante di evitare caffeina ed esercizio fisico intenso per almeno 2 h prima dell'esame.
   2. La temperatura della stanza dell'esame è stata mantenuta a 24–26ºC e la temperatura cutanea dell'arto è stata mantenuta superiore a 32ºC mediante l'uso di una lampada riscaldante, se necessario.
   3. Il partecipante è stato posizionato in posizione supina in una stanza d'esame tranquilla e scarsamente illuminata.
2. Studio della velocità di conduzione nervosa
   1. La cute nei punti di posizionamento degli elettrodi è stata pulita con tamponi alcolici per ridurre l'impedenza.
   2. Gli elettrodi di registrazione di superficie sono stati posizionati sul punto motore del muscolo bersaglio, mentre l'elettrodo di riferimento è stato posizionato in modo distale sul tendine corrispondente.
   3. Gli elettrodi di stimolazione sono stati posizionati lungo il decorso del nervo in corrispondenza di punti anatomici standard.
   4. Sono stati eseguiti studi di conduzione motoria bilaterali sui nervi mediano, ulnare, tibiale e peroniero comune. Sono state registrate la latenza distale, l'ampiezza del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) e la velocità di conduzione motoria.
   5. Sono stati eseguiti studi di conduzione sensitiva bilaterali sui nervi mediano, ulnare, peroniero superficiale e surale, utilizzando tecniche ortodromiche o antidromiche, a seconda dei casi. Sono state registrate l'ampiezza del potenziale d'azione del nervo sensitivo (SNAP) e la velocità di conduzione sensitiva.
   6. La banda passante del filtro è stata impostata a 20 Hz–10 kHz per gli studi motori e a 20 Hz–2 kHz per gli studi sensitivi. Sono state utilizzate velocità di scansione di 2 ms/divisione e 1 ms/divisione rispettivamente per gli studi motori e sensitivi.
3. Eleteromiografia con ago
   1. Un elettrodo concentrico a ago è stato inserito in ciascun muscolo bersaglio in condizioni sterili.
   2. È stata valutata l'attività spontanea a riposo, inclusi onde positive acute, potenziali di fibrillazione e potenziali di fascicolazione.
   3. La morfologia del potenziale unitario motorio (MUP) è stata valutata durante una contrazione volontaria lieve. Sono state misurate durata, ampiezza e polifasia.
   4. Il pattern di reclutamento è stato valutato durante una contrazione volontaria massimale.
   5. Sono stati esaminati bilateralmente i muscoli tibiale anteriore, gastrocnemio mediale, abduttore dell'alluce, primo interosseo dorsale, deltoide e retto femorale. Sono stati inoltre esaminati i muscoli sternocleidomastoideo e paravertebrali a livello T10.
      NOTA: Tutti gli esami neurofisiologici sono stati eseguiti da un elettromiografo esperto. L'impedenza cutanea è stata mantenuta al di sotto di 5 kΩ per garantire la qualità della registrazione. La riproducibilità di tutte le forme d'onda è stata confermata in almeno due stimolazioni consecutive.

3. Raccolta del campione di sangue periferico ed estrazione del DNA genomico

1. È stato prelevato sangue venoso periferico (3–5 mL) da ogni partecipante in un tubo con anticoagulante etilendiamminotetraacetico (EDTA).
2. I campioni di sangue sono stati conservati immediatamente a 4ºC dopo il prelievo ed elaborati entro 24 h.
3. Il DNA genomico è stato estratto dai leucociti del sangue periferico utilizzando un kit per l'estrazione del DNA genomico.
4. La concentrazione e la purezza del DNA sono state misurate mediante spettrofotometro.
5. L'integrità del DNA è stata valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1%.
   NOTA: Sono stati accettati campioni di DNA con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 e una concentrazione di ≥50 ng/µL. I campioni che non soddisfacevano i criteri di controllo qualità sono stati sottoposti nuovamente a estrazione.

4. Sequenziamento dell'esoma completo

1. Preparazione della libreria
   1. Il DNA genomico (1 μg) è stato frammentato in frammenti di 150–200 bp mediante sonificazione.
   2. Sono state eseguite la riparazione dei capi, l'aggiunta della coda poli-A e la ligazione dell'adattatore seguendo il protocollo del kit per la preparazione della libreria.
   3. Le regioni esoniche sono state arricchite utilizzando un kit di cattura dell'esoma umano completo, secondo le istruzioni del produttore.
   4. La libreria catturata è stata amplificata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e i prodotti ottenuti sono stati purificati.
2. Sequenziamento
   1. È stato effettuato un sequenziamento a estremità accoppiate su una piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento, con una lunghezza di lettura di 150 bp.
   2. È stato impostato un valore medio di profondità di sequenziamento di ≥100 Χ sull'intero esoma bersaglio, con ≥98% delle basi bersaglio coperte a una profondità di ≥10Χ e ≥95% coperte a una profondità di ≥20Χ.
   3. NOTA: Prima del sequenziamento, è stata confermata una concentrazione della libreria di ≥2 nM e una distribuzione delle dimensioni dell'inserto compresa tra 250–350 bp. Dopo il sequenziamento, sono stati valutati i punteggi Q30, il contenuto di GC e la profondità di copertura per verificare la qualità dei dati.

5. Analisi bioinformatica e filtraggio delle varianti

1. È stata eseguita l'analisi primaria dei dati, inclusa la chiamata delle basi, la valutazione della qualità e la rimozione degli adattatori.
2. Le letture pulite sono state allineate al genoma di riferimento umano GRCh37 (hg19) utilizzando un software di allineamento di sequenze.
3. È stata effettuata la chiamata delle varianti per identificare le varianti singole di nucleotide (SNV) e le piccole inserzioni e delezioni (indel).
4. Le varianti sono state annotate utilizzando database pubblici, tra cui il Genome Aggregation Database (gnomAD), il Progetto 1000 Genomi, ClinVar e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).
5. Le varianti sono state filtrate e priorizzate utilizzando i seguenti criteri.
   1. Sono state mantenute le varianti localizzate in regioni esoniche o nei siti di splicing canonici.
   2. Sono state escluse le varianti comuni con una frequenza dell'allele minore (MAF) di >0,01 nei database di popolazione.
   3. Sono state priorizzate le varianti nonsenso, frameshift, di splicing e le varianti missenso previste come dannose.
   4. I geni candidati sono stati confrontati con elenchi noti di geni associati a disturbi neuromuscolari. Sono stati ulteriormente prioritizzati i geni compatibili con un modello di ereditarietà autosomica recessiva.
   5. Il trascritto VRK1 NM_003384.3 è stato utilizzato come sequenza di riferimento per la nomenclatura delle varianti.

6. Validazione mediante sequenziamento Sanger e analisi di segregazione familiare

1. Sono stati progettati primer per PCR che delimitano il sito della variante candidata, utilizzando un software di progettazione di primer.
2. La regione genomica bersaglio è stata amplificata mediante PCR partendo dal DNA di ciascun membro della famiglia.
3. I prodotti di PCR sono stati purificati ed è stata eseguita una sequenza di Sanger bidirezionale.
4. I cromatogrammi di sequenza sono stati allineati alla sequenza di riferimento utilizzando un software di allineamento delle sequenze.
5. È stato verificato il genotipo di ciascun membro della famiglia e valutata la co-segregazione della variante con il fenotipo della malattia all'interno del pedigree.
   NOTA: Sono stati confermati cromatogrammi puliti, con picchi singoli e privi di rumore di fondo. L'amplificazione mediante PCR e il sequenziamento sono stati ripetuti per i campioni che hanno prodotto risultati ambigui.

7. Classificazione della patogenicità delle varianti e conferma diagnostica

1. La variante verificata è stata classificata secondo gli standard e le linee guida del 2015 del Collegio Americano di Genetica Medica e Genomica (ACMG).
2. I fenotipi clinici, i reperti neurofisiologici, i risultati dei test genetici e i dati di segregazione familiare sono stati integrati per stabilire la diagnosi molecolare finale.
3. È stata fornita alla famiglia una consulenza genetica riguardo al rischio di ricorrenza, alle opzioni riproduttive e alla prognosi a lungo termine.

Risultati

Risultati genetici

È stato eseguito il WES sul probando, con una profondità media della regione target di 112 ×; il 98,7% delle basi target è stato coperto a una profondità ≥10 × e il 96,2% a una profondità ≥20 ×. Dopo il filtraggio e la priorizzazione delle varianti, è stata identificata una variante nonsense omozigote c.1124G>A (p.Trp375Ter) nel gene VRK1 (trascritto NM_003384.3, costruzione del genoma GRCh37/hg19) come variante patogena candidata.

Discussione

In questo studio, abbiamo applicato un flusso di lavoro diagnostico integrato che combina fenotipizzazione clinica, esame neurofisiologico, sequenziamento dell'esoma (WES) e analisi di segregazione familiare per identificare una variante patogena omozigote VRK1 c.1124G>A in una famiglia consanguinea cinese con dHMN ad esordio nell'età adulta. Questa famiglia allarga lo spettro fenotipico delle malattie correlate a VRK1 e fornisce dati di riferimento per la diagnosi del dHMN nella popolazione cinese.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti & Consumabili
Tubo sottovuoto per prelievo ematico con anticoagulante EDTA (5 mL)	BD Biosciences (Becton, Dickinson and Company)	367861
Kit per l'estrazione di DNA genomico (formato spin-column) per sangue periferico	QIAGEN; Kit Mini QIAamp DNA Blood	51106
Kit per l'amplificazione multiplex dipendente dalla ligazione di sonde (MLPA)	MRC Holland	Set personalizzato di sonde per il gene bersaglio
Kit per amplificazione PCR (contenente Taq polimerasi, dNTPs, buffer di reazione)	Takara Bio; Kit PCR LA Taq	RR002A
Polvere di agarosio (grado elettroforesi)	Biowest	111860
Kit per reazione di sequenziamento Sanger (BigDye Terminator v3.1)	Thermo Fisher Scientific; Applied Biosystems	4337455
Kit per la purificazione del prodotto di sequenziamento	Thermo Fisher Scientific; BigDye XTerminator Purification Kit	4376484
Tampone elettroforetico TAE	Grado commerciale / Preparato in laboratorio	—
Tubi PCR da 8, provette per centrifuga e altri materiali di consumo di routine	Axygen	—
Strumenti &e attrezzature
Analizzatore genetico per elettroforesi capillare (piattaforma di sequenziamento Sanger)	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	3500 Dx
Termociclatore a gradiente (strumento PCR)	Bio-Rad Laboratories	C1000 Touch
Spettrofotometro ultramicro (per la quantificazione degli acidi nucleici)	NanoDrop One, Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
Sistema orizzontale di elettroforesi su gel di agarosio	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C
Sistema di documentazione e analisi di gel	Bio-Rad Laboratories	GelDoc Go
Centrifuga refrigerata ad alta velocità da banco	Eppendorf	5424 R
Sistema di velocità di conduzione nervosa / elettromiografia (NCV/EMG)	Natus Medical	Keypoint 9033A07
Bagno termostatato in metallo / bagno termostatato ad acqua	DLAB Scientific	—
Software di analisi
Software per l'analisi dei dati MLPA (Coffalyser.Net)	MRC Holland	v140
Analisi dei picchi del sequenziamento Sanger e software per l'allineamento delle sequenze	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	Analisi di sequenziamento v6.0
Software per la progettazione di primer	Premier Biosoft	Primer Premier 6
Allineamento delle sequenze e strumenti per l'interpretazione delle varianti	NCBI BLAST (online), database ClinVar	—