Questo protocollo illustra la valutazione della Modificata Xiaoyao San in un modello murino di depressione indotta da stress cronico imprevedibile di lieve entità, comprendente valutazioni comportamentali, istologiche e molecolari della necroptosi neuronale.
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Articolo di ricerca
Il Xiaoyao San modificato migliora i comportamenti simil-depressivi e la necroptosi neuronale in un modello murino di stress cronico imprevedibile lieve
In questo articolo
Sommario
Abstract
La perdita e il danno neuronale sono caratteristiche patologiche importanti della depressione, e la necroptosi è stata proposta come un possibile meccanismo di morte cellulare neuronale. L'analisi dei dataset del Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE54565, GSE54566 e GSE54568) ha identificato un'associazione tra depressione e necroptosi, suggerendo che l'inibizione di questa via potrebbe rappresentare una potenziale strategia terapeutica. La formula modificata di Xiaoyao San (MXYS), una formulazione modificata della medicina tradizionale cinese Xiaoyao San, è stata sviluppata incorporando erbe con proprietà di eliminazione del calore, raffreddamento del sangue, potenziamento cognitivo e promozione della rianimazione, al fine di migliorare l'efficacia terapeutica. Tuttavia, i suoi effetti sulla necroptosi neuronale e i costituenti attivi che raggiungono il tessuto cerebrale rimangono poco chiari. La cromatografia liquida ad altissime prestazioni abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC-HRMS) è stata utilizzata per identificare in via preliminare i costituenti della MXYS rilevati nel tessuto cerebrale. L'efficacia terapeutica è stata valutata in un modello murino di depressione indotto da stress cronico imprevedibile e lieve (CUMS) mediante valutazioni comportamentali, esame istologico, immunofluorescenza, western blot e analisi bioinformatiche. L'amministrazione di MXYS è risultata associata a un miglioramento dei comportamenti simili alla depressione, ad attenuazione del danno cerebrale patologico e a una ridotta fosforilazione della proteina chinasi interagente con recettori di tipo 3 (RIPK3) e della proteina con dominio simile a quella delle chinasi di linea mista (MLKL). Questi risultati suggeriscono che la MXYS esercita effetti simili a quelli degli antidepressivi, associati a una riduzione dei marcatori di necroptosi neuronale, fornendo un supporto sperimentale per ulteriori indagini sulla MXYS come potenziale strategia terapeutica per la depressione.
Introduzione
La depressione, un disturbo mentale grave appartenente allo spettro dei disturbi dell'umore, è caratterizzata principalmente da un umore persistentemente depresso ed è influenzata da molteplici fattori1. Clinicamente, i pazienti affetti da depressione presentano comunemente sintomi come umore depresso, rallentamento cognitivo, riduzione della comunicazione verbale e dell'attività fisica e, nei casi più gravi, comportamenti autolesivi e ideazione suicidaria2. A causa dell'elevata prevalenza, ricorrenza, disabilità e tasso di suicidio, la depressione rappresenta una delle principali cause di disabilità a livello mondiale e comporta un notevole onere sociale ed economico3. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, entro il 2030 la depressione diverrà la principale causa del carico globale di malattia, superando il cancro e le malattie cardiovascolari e cerebrovascolari3. Inoltre, la pandemia di malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è stata associata a un aumento del 27,6% della prevalenza globale del disturbo depressivo maggiore4. In Cina, la prevalenza annuale della depressione è del 3,6%, con una prevalenza cumulativa nel corso della vita del 6,8%5. La patogenesi della depressione non è ancora completamente compresa a causa della sua eziologia complessa e dei numerosi fattori coinvolti. Di conseguenza, le opzioni terapeutiche rimangono limitate e circa il 30%–40% dei pazienti sviluppa una depressione resistente al trattamento a causa di una risposta inadeguata agli antidepressivi attualmente disponibili6. Inoltre, il ritardo nell'insorgenza dell'effetto terapeutico, i sintomi residui, la neurotossicità e gli effetti avversi associati agli antidepressivi esistenti continuano a rappresentare sfide terapeutiche significative7.
La morte cellulare programmata è da tempo un importante focus della ricerca biomedica. Sempre più evidenze suggeriscono che la depressione è associata alla necroptosi8,9,10,11. La necroptosi, come l'apoptosi, è una forma di morte cellulare programmata; tuttavia, a differenza dell'apoptosi, induce risposte immunitarie e infiammatorie marcate12. In assenza di attività della caspasi-8, il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) si lega al recettore 1 del fattore di necrosi tumorale (TNFR1), portando all'attivazione della chinasi 1 associata al recettore che interagisce con le proteine (RIPK1)13. La RIPK1 attivata interagisce con la chinasi 3 associata al recettore che interagisce con le proteine (RIPK3) per formare il complesso necrosoma, che successivamente attiva la proteina simile alla chinasi con dominio di linea mista (MLKL)14. Dopo l'oligomerizzazione, la MLKL si trasloca dal citoplasma alla membrana plasmatica, causando gonfiore degli organelli15,16, compromissione dell'integrità della membrana cellulare e rilascio di contenuti intracellulari, inclusi i pattern molecolari associati al danno (DAMPs) e mediatori infiammatori come il TNF-α, l'interleuchina (IL)-1 e l'IL-6, aggravando così le risposte infiammatorie17. La necroptosi è stata implicata in numerose malattie infiammatorie e neurodegenerative, tra cui sclerosi multipla, depressione, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Parkinson e malattia di Alzheimer18,19,20. Analisi proteomiche hanno mostrato che la depressione indotta da stress cronico imprevedibile e lieve (CUMS) è associata a un aumento dell'espressione di RIPK3 e MLKL e all'attivazione della via della necroptosi2. In un altro modello murino di depressione CUMS, la fluoxetina ha esercitato effetti simili a quelli degli antidepressivi, associati all'inibizione della necroptosi mediata da RIPK110. Inoltre, il Nec-1s, un inibitore della necroptosi, ha dimostrato di migliorare i comportamenti simili alla depressione indotti dal lipopolisaccaride (LPS)21. Poiché il danno neuronale rappresenta una caratteristica patologica importante della depressione, il targeting della necroptosi potrebbe costituire una strategia terapeutica promettente per il trattamento della depressione.
La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia nell'uso per il trattamento della depressione. Secondo la teoria della MTC, il fegato regola il libero flusso del qi; pertanto, la depressione è principalmente attribuita a uno stato di afflizione emotiva che conduce a una stasi del qi epatico. Di conseguenza, la strategia terapeutica principale consiste nel rasserenare il fegato e alleviare la depressione. Xiaoyao San (XYS) è una ricetta erboristica classica ampiamente utilizzata a tale scopo, e numerose evidenze ne supportano l'applicazione nel trattamento della depressione22. Inoltre, si è riportato che XYS possiede proprietà anti-necroptotiche23,24. Sulla base dei concetti della MTC della "trasformazione della depressione epatica in fuoco" e della "salita chiara del yang al cervello", XYS è stato modificato aggiungendo Moutan Cortex (Mudan Pi) e Gardeniae Fructus (Zhizi) per eliminare il calore e raffreddare il sangue, insieme ad Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) e Polygalae Radix (Yuan Zhi) per promuovere la funzione cognitiva e favorire il risveglio. La formulazione risultante è stata denominata Xiaoyao San Modificato (MXYS) ed è stata sviluppata per ottenere effetti terapeutici potenziati in base ai principi della MTC. Tuttavia, in questo studio non è stato effettuato un confronto diretto con la formulazione originale di XYS25. Studi clinici hanno dimostrato l'efficacia antidepressiva di MXYS26,27,28, e i suoi effetti terapeutici potrebbero essere associati alla regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) e all'inibizione della neuroinfiammazione29,30,31. Tuttavia, non è ancora chiaro se MXYS sia associato a una riduzione della necroptosi neuronale.
Nel presente studio, la cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC-HRMS) è stata utilizzata per identificare in via preliminare composti derivati da MXYS rilevati nel tessuto cerebrale. Sono stati utilizzati dataset pubblicamente disponibili del Gene Expression Omnibus (GEO) e analisi bioinformatiche, inclusa l'analisi della rete di co-espressione genica pesata (WGCNA), l'analisi dell'espressione differenziale e l'analisi di arricchimento, per indagare le associazioni tra MXYS, depressione e necroptosi. Sulla base di questi risultati, abbiamo formulato l'ipotesi che MXYS possa esercitare effetti simili a quelli antidepressivi associati a una riduzione dei marcatori di necroptosi neuronale, con il percorso del fattore di trascrizione attivante 4 (ATF4)/proteina legante l'elemento di risposta al cAMP (CREB)/fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) che rappresenta un possibile meccanismo correlativo. Per valutare questa ipotesi, i composti rilevati nel tessuto cerebrale sono stati identificati in via preliminare mediante UHPLC-HRMS, sono state effettuate analisi bioinformatiche per individuare potenziali bersagli terapeutici ed esperimenti in vivo sono stati condotti per verificare se il trattamento con MXYS sia associato a modifiche nei marcatori di necroptosi e nel percorso ATF4/CREB/BDNF. Questi risultati forniscono evidenze preliminari a sostegno della possibile applicazione terapeutica di MXYS nella depressione, riconoscendo al contempo che sono necessari studi comparativi con la formulazione originale di XYS e una validazione della risposta alla dose.
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Protocollo
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Università di Medicina Cinese di Henan (numero di approvazione: DWLLGZR202200023). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il benessere degli animali e hanno rispettato le linee guida ARRIVE. Ratti maschi Sprague–Dawley (SD) sono stati ottenuti da un fornitore autorizzato di animali da laboratorio. Gli animali sono stati allevati in condizioni controllate di temperatura e umidità, con un ciclo luce/buio di 12 ore, e hanno ricevuto cibo standard e acqua ad libitum.
Identificazione dei componenti di MXYS presenti nel tessuto cerebrale
Preparazione della polvere liofilizzata di MXYS:
Gli 11 ingredienti vegetali di MXYS sono stati macerati in 10 volumi di acqua distillata per 2 h e successivamente bolliti per 40 min. La menta è stata aggiunta negli ultimi 5 min della decottura. Una seconda decottura è stata preparata nello stesso modo utilizzando 8 volumi di acqua distillata. Le due decotture sono state unite, filtrate attraverso garza, concentrate sotto pressione ridotta fino a una concentrazione di 1 g/mL (equivalente di droga grezza) e liofilizzate sotto vuoto per 48 h per ottenere la polvere liofilizzata di MXYS. La resa di estrazione è stata del 21,7% (p/p)25,29,31.
Animali e somministrazione di MXYS:
Dodici ratti maschi SD sono stati assegnati casualmente a due gruppi e trattati due volte al giorno per gavaggio orale con MXYS o acqua purificata. Le due somministrazioni giornaliere sono state effettuate alle 8:00 e alle 20:00 (intervallo di 12 ore). La polvere di MXYS è stata sciolta in acqua purificata e somministrata alla dose di 24,4 g/kg (circa il doppio della dose clinica per i ratti)25. Il gruppo di controllo ha ricevuto acqua purificata in volume equivalente (10 mL/kg).
Preparazione del tessuto cerebrale contenente MXYS:
Dopo 14 giorni, tutti i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico (40 mg/kg, per via intraperitoneale) 2 ore dopo l'amministrazione finale di MXYS. I tessuti cerebrali sono stati raccolti dopo perfusione transcardiaca con soluzione fisiologica. I cervelli interi sono stati immediatamente escissi e posti sul ghiaccio per ottenere campioni di tessuto cerebrale di controllo e di tessuto cerebrale trattato con MXYS.
Condizioni cromatografiche/spettrometriche di massa e database:
La polvere liofilizzata di MXYS, tessuto cerebrale privo di analita aggiunto con polvere di MXYS, tessuto cerebrale privo di analita e estratti di tessuto cerebrale contenenti MXYS sono stati analizzati utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni dotato di una colonna HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) mantenuta a 35 °C. Le fasi mobili consistevano in acqua contenente acido formico allo 0,1% (fase mobile A) e acetonitrile contenente acido formico allo 0,1% (fase mobile B). I campioni sono stati separati a una portata di 0,3 mL/min utilizzando un gradiente di 5% di B per 1 min, aumentando fino a 98% di B in 16 min, ritornando a 5% di B in 0,5 min e mantenendo al 5% di B per 2,5 min.
Gli spettri di massa sono stati acquisiti in modalità di ionizzazione elettrospray positiva e negativa utilizzando un'acquisizione dipendente dai dati su un intervallo di m/z compreso tra 90 e 1.300. Gli spettri MS/MS sono stati generati a partire dai 10 ioni precursori più intensi, utilizzando energie di dissociazione collisionale ad alta energia a gradino di 20, 40 e 60 eV. La temperatura del capillare è stata mantenuta a 320°C, mentre la temperatura del riscaldatore della sonda è stata impostata a 350°C.
L'annotazione dei composti è stata eseguita confrontando la massa esatta, la distribuzione isotopica e gli spettri MS/MS con un database interno di medicina tradizionale cinese e con i database pubblici GNPS32, ReSpect33 e MassBank34. Sono stati mantenuti i composti con un confronto affidabile degli spettri MS/MS e forme cromatografiche di picco coerenti. L'elenco completo dei composti identificati in via preliminare è riportato nella Tabella Supplementare 1.
Bioinformatica
Selezione e pre-elaborazione dei set di dati dal database GEO:
Il possibile coinvolgimento della necroptosi nella patologia della depressione è stato indagato effettuando una ricerca nel database GEO utilizzando la parola chiave "depressione". Sulla base dei criteri di selezione, sono stati identificati tre set di dati (GSE54566, GSE54565 e GSE54568) per ulteriori analisi. I set di dati derivavano da diverse regioni cerebrali: GSE54565 (corteccia cingolata anteriore), GSE54566 (amigdala) e GSE54568 (corteccia prefrontale dorsolaterale, BA9). Tutti i set di dati sono stati generati utilizzando la piattaforma Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) e comprendevano campioni di tessuto cerebrale post-mortem provenienti da pazienti affetti da disturbo depressivo maggiore (MDD) e da controlli non psichiatrici. Le caratteristiche dettagliate dei campioni per ciascun set di dati sono riassunte nella Tabella Supplementare 2. Questi set di dati comprendevano dati trascrittomici provenienti da tre regioni cerebrali coinvolte nella depressione. È stata eseguita un'analisi dell'espressione genica differenziale tra i gruppi MDD e controllo per ciascun set di dati, e i geni costantemente sovraespressi e sottoregolati sono stati integrati utilizzando il pacchetto R Robust Rank Aggregation (RRA).
Tutti i set di dati sono stati preelaborati utilizzando l'algoritmo robust multi-array average (RMA) per la correzione del fondo e la normalizzazione. Dopo la normalizzazione RMA, l'algoritmo ComBat implementato nel pacchetto R sva è stato applicato per correggere gli effetti di lotto tra i set di dati, considerando l'origine del set di dati come covariata di lotto. Questa procedura ha ridotto la variabilità tecnica tra i set di dati e migliorato la comparabilità per le analisi successive.
Le analisi bioinformatiche sono state eseguite utilizzando il software R (versione 4.2.1). I principali pacchetti R inclusi erano ClusterProfiler (versione 4.8.2) per le analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), WGCNA (versione 1.72) per l'analisi della rete di co-espressione genica pesata, RRA per l'integrazione dei geni differenzialmente espressi e sva (versione 3.48.0) per la correzione batch con ComBat. Il flusso di lavoro analitico comprendeva l'acquisizione dei dati, la normalizzazione RMA, la correzione batch con ComBat, l'analisi dell'espressione differenziale con integrazione RRA, la costruzione del modulo WGCNA, le analisi di arricchimento GO e KEGG con una false discovery rate (FDR) < 0,05 e la previsione dei bersagli mediante analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI).
Utilizzo di WGCNA per la costruzione di reti geniche di co-espressione e identificazione di moduli significativamente associati alla depressione e alla necroptosi:
WGCNA costruisce reti di co-espressione genica pesate applicando una potenza di soglia morbida (valore β) per approssimare una topologia senza scala. Il valore β è stato scelto quando il coefficiente di correlazione tra log(k) e log(p(k)) ha raggiunto almeno 0,9. Dopo aver selezionato il valore β, i moduli genici sono stati identificati utilizzando il metodo di taglio dinamico dell’albero. I parametri aggiuntivi sono stati impostati come segue: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 e deepSplit = 2. Il valore β è stato selezionato quando il coefficiente di correlazione tra log(k) e log(p(k)) ha raggiunto almeno 0,9. È stata utilizzata una potenza di soglia morbida di β = 7 per la costruzione della rete. L’Eigen gene del modulo (ME) è stato calcolato per ciascun modulo per riassumere i modelli di espressione genica e valutare le associazioni con i tratti biologici. Successivamente sono stati calcolati il Significato del Gene (GS) e l’Appartenenza al Modulo (MM), e le relazioni tra modulo e tratto sono state valutate utilizzando il coefficiente di correlazione (cor) e il corrispondente valore p. Coefficienti di correlazione più elevati e valori p più bassi indicavano associazioni più forti tra i moduli genici e i tratti biologici.
Analisi di arricchimento funzionale e costruzione della rete PPI:
ClusterProfiler è stato utilizzato per eseguire l'analisi di arricchimento dei percorsi KEGG. Per la correzione della multipla verifica è stato applicato il metodo FDR di Benjamini–Hochberg, e un valore p corretto (FDR) < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Dopo aver identificato il modulo bersaglio, i geni chiave all'interno del modulo sono stati incrociati con i geni associati a MXYS e necroptosi. Successivamente, una rete PPI è stata costruita utilizzando il database STRING.
Previsione dei bersagli per i composti rilevati nel tessuto cerebrale:
I 143 composti identificati in via preliminare nel tessuto cerebrale di ratto dopo la somministrazione di MXYS sono stati utilizzati per la previsione dei bersagli. Per ciascun composto, i potenziali bersagli sono stati recuperati dal database GeneCards mediante la funzione "Related Targets" con un punteggio di rilevanza > 5. I bersagli duplicati sono stati uniti e sono stati mantenuti solo i geni umani con simboli ufficiali, ottenendo 3.164 bersagli unici. Questi bersagli sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento GO e KEGG utilizzando il pacchetto R ClusterProfiler, considerando statisticamente significativi i valori di FDR < 0,05. L'insieme genico di riferimento comprendeva tutti i geni umani codificanti proteine annotati nel database KEGG.
Verifica sperimentale
Coltura cellulare:
Le cellule HT-22 sono state ottenute da Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) e coltivate in mezzo di crescita integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10% e penicillina/streptomicina 100 U/mL. Le cellule sono state mantenute a 37°C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
Attività anti-necroptotica di MXYS:
La polvere liofilizzata di MXYS è stata ricostituita nel mezzo di crescita cellulare fino a una concentrazione di 1,0 g/mL, sterilizzata mediante un filtro a membrana da 0,22 μm e conservata a −20°C fino all'uso. Le cellule HT-22 sono state seminate a una densità di 8.000 cellule per pozzetto in piastre a 96 pozzetti, con tre pozzetti per gruppo. MXYS è stato diluito nel mezzo di crescita fino a concentrazioni finali di 2, 4 e 6 mg/mL. Dopo un'incubazione di 12 h, le cellule sono state trattate con cloridrato di SM-164 (10 nM) e l'inibitore delle caspasi z-VAD-fmk (20 μM) per 30 minuti, seguita da stimolazione con fattore di necrosi tumorale-α umano (h-TNF-α; 20 ng/mL) per ulteriori 12 h. La vitalità cellulare è stata valutata mediante un saggio di vitalità cellulare luminescente secondo le istruzioni del produttore. La luminescenza è stata misurata utilizzando un lettore per micropiastre. La morfologia cellulare è stata esaminata al microscopio invertito, e sono state acquisite immagini rappresentative per l'analisi.
Animali:
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per l'uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Henan (numero di approvazione DWLLGZR202200023). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il benessere degli animali e hanno rispettato le linee guida ARRIVE. Sono stati utilizzati esclusivamente topi maschi BALB/c di età compresa tra 6 e 8 settimane per la creazione del modello CUMS. Gli animali sono stati allevati in condizioni controllate di temperatura e umidità, con un ciclo luce/buio di 12 ore, e hanno ricevuto cibo standard e acqua ad libitum.
Modello di Depressione Indotta da CUMS:
I topi sono stati assegnati casualmente a un gruppo di controllo o a un gruppo CUMS. Dopo una settimana di ambientamento, i topi del gruppo CUMS sono stati sottoposti a stress leggeri intermittenti e imprevedibili, mentre i topi di controllo sono rimasti indisturbati. Il paradigma di stress comprendeva 13 diversi stressori, tra cui inclinazione della gabbia, scuotimento della gabbia, cambio della gabbia, lettiera bagnata, privazione d'acqua, illuminazione stroboscopica, esposizione al rumore, luce continua, buio continuo, illuminazione intermittente, nuoto in acqua fredda (4°C), nuoto in acqua calda (40°C), stress da immobilizzazione e altri stress leggeri. Ogni stressore è stato applicato per 2–6 h per sessione in una sequenza randomizzata per mantenere l'imprevedibilità. I topi sono stati esposti ogni giorno a uno o due stressori diversi secondo un programma randomizzato.
Gruppi e trattamento farmacologico:
Dopo sei settimane di esposizione al CUMS, i topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi di trattamento CUMS, MXYS, paroxetina o Nec-1. Il gruppo MXYS ha ricevuto polvere liofilizzata di MXYS per somministrazione orale a 35,2 g/kg/giorno. Il gruppo paroxetina ha ricevuto paroxetina (20 mg/kg) per via orale, mentre il gruppo Nec-1 ha ricevuto Nec-1 (10 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale per quattro settimane consecutive. Nello stesso periodo, ai gruppi controllo e CUMS è stata somministrata una quantità equivalente di soluzione salina fisiologica per via orale.
Esperimenti Comportamentali:
I topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi sperimentali utilizzando una sequenza di numeri casuali generata al computer prima dell'inizio della somministrazione del farmaco. La sequenza di randomizzazione è stata generata da un ricercatore indipendente che non ha partecipato ai successivi esperimenti né all'analisi dei dati.
I test comportamentali sono stati condotti da un ricercatore in cecità rispetto ai gruppi di trattamento. Lo stesso ricercatore ha effettuato la valutazione comportamentale basata su video (tempo di immobilità, distanza percorsa e tempo trascorso al centro) utilizzando un software automatizzato di tracciamento per ridurre al minimo i bias soggettivi. Il ricercatore in cecità non ha avuto accesso ai codici di assegnazione dei gruppi fino a quando tutti i dati comportamentali non sono stati raccolti e registrati.
Le analisi di immunofluorescenza sono state eseguite da un ricercatore indipendente, anch'egli a conoscenza cieca dei gruppi sperimentali. I campioni sono stati etichettati mediante identificatori codificati e l'assegnazione ai gruppi è stata rivelata solo dopo il completamento delle misurazioni densitometriche o dell'intensità di fluorescenza. Le analisi statistiche sono state effettuate da un terzo ricercatore, a conoscenza cieca sia dell'assegnazione ai gruppi che dei corrispondenti risultati sperimentali, fino a quando tutti i dati quantitativi non sono stati raccolti.
Test di Preferenza per il Saccarosio (SPT): Il test comportamentale è stato eseguito dopo l'ultima somministrazione del farmaco. Prima del test, i topi sono stati abituati a una soluzione di saccarosio all'1% fornendo loro due bottiglie contenenti soluzione di saccarosio all'1% per 12 h, seguite da una bottiglia contenente soluzione di saccarosio all'1% e una bottiglia contenente acqua potabile per ulteriori 12 h. Successivamente, i topi sono stati privati di cibo e acqua per 12 h prima del test formale. Durante il test, a ciascun topo è stata fornita una bottiglia contenente soluzione di saccarosio all'1% e una bottiglia contenente acqua potabile. Dopo 12 h, il volume consumato da ciascuna bottiglia è stato misurato. La preferenza per il saccarosio è stata calcolata come:
Test di sospensione per la coda (TST): La coda di ciascun topo veniva fissata alla sommità dell'apparato sperimentale utilizzando nastro adesivo. Il comportamento del topo veniva registrato per 6 minuti mediante software di registrazione e analisi video del comportamento. La durata dell'immobilità durante gli ultimi 4 minuti del test veniva quantificata.
Test del campo aperto (OFT): Ogni topo è stato posizionato singolarmente al centro dell'apparato del campo aperto. L'attività comportamentale è stata registrata e analizzata per 5 minuti mediante un software di tracciamento comportamentale, inclusi la distanza percorsa e l'attività motoria. Al termine di ogni test, l'apparato è stato pulito con etanolo al 75%.
Raccolta dei campioni:
I topi deceduti durante la procedura CUMS o che mostravano segni di malattia grave (ad esempio, perdita di peso corporeo >20%, infezione visibile o incapacità di muoversi) sono stati esclusi dallo studio. L'eutanasia è stata eseguita da personale certificato mediante somministrazione di overdose di pentobarbital sodico (150 mg/kg, per via intraperitoneale). Dopo la perdita di coscienza, è stata effettuata una dislocazione cervicale come metodo secondario per garantire la morte. Per le analisi con colorazione di Nissl e immunofluorescenza, sono stati selezionati casualmente tre topi da ciascun gruppo. I tessuti ippocampali destinati all'analisi mediante western blot sono stati dissecati immediatamente su ghiaccio e congelati rapidamente in azoto liquido.
Colorazione di Nissl:
Per le analisi di colorazione di Nissl e immunofluorescenza, i topi sono stati profondamente anestetizzati con pentobarbital sodico (150 mg/kg, per via intraperitoneale) e decapitati senza perfusione transcardiale. I cervelli sono stati rapidamente rimossi e fissati in paraformaldeide al 4% per 24–48 h prima dell'inclusione in paraffina. Le sezioni in paraffina sono state tagliate con uno spessore di 3 μm. Le sezioni in paraffina sono state deparaffinizzate mediante incubazione sequenziale in soluzione disincrostante, etanolo assoluto ed etanolo al 75%, prima del risciacquo con acqua corrente. Le sezioni congelate, quando applicabile, sono state portate a temperatura ambiente, fissate con fissativo per tessuti per 15 min e risciacquate con acqua corrente. Le sezioni di tessuto sono state colorate con soluzione di colorazione di Nissl per 2–5 min, risciacquate con acqua, differenziate con acido acetico glaciale allo 0,1%, lavate per interrompere la reazione, monitorate al microscopio per controllare la differenziazione, essiccate, chiarificate in xilene per 10 min e montate con mezzo di montaggio neutro.
Immunofluorescenza:
Le procedure di immunofluorescenza sono state eseguite utilizzando metodi standard. Il tessuto cerebrale è stato fissato in paraformaldeide al 4% e incluso in paraffina per la colorazione mediante immunofluorescenza. Le sezioni di tessuto sono state incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari contro NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) e CREB (1:1000). Dopo l'incubazione con gli anticorpi primari, le sezioni sono state lavate quattro volte con PBS e incubate per 1 h al buio con i corrispondenti anticorpi secondari fluorofori: IgG caprina anti-topo coniugata a CY3 (1:300, Servicebio, GB21301) per l'anti-ATF4 di topo; IgG caprina anti-topo coniugata ad Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25301) per l'anti-MLKL di topo; IgG caprina anti-coniglio coniugata a CY3 (1:300, Servicebio, GB21303) per l'anti-NeuN di coniglio; e IgG caprina anti-coniglio coniugata ad Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25303) per l'anti-CREB di coniglio. Successivamente, le sezioni sono state colorate con DAPI per 10 min a temperatura ambiente, lavate con PBS, montate con un mezzo di montaggio antifade e le immagini di fluorescenza sono state acquisite mediante microscopia confocale.
Western Blot:
I tessuti cerebrali sono stati omogeneizzati in tampone di lisi RIPA (radioimmunoprecipitation assay). Le concentrazioni proteiche sono state determinate e 20 μg di proteina totale per corsia sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide contenente dodecilsolfato di sodio al 10% (SDS-PAGE), quindi trasferiti su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Dopo il blocco, le membrane sono state incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari (1:1000), seguiti da incubazione con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) per 1 h. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante un sistema di imaging chemiluminescente e le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando il software ImageJ. Per l’analisi del western blot dei tessuti ippocampali, sono stati analizzati due topi per gruppo e sono mostrati immunoblot rappresentativi. Per gli esperimenti sulle cellule HT-22, l’analisi del western blot è stata eseguita una volta come esperimento rappresentativo. Questi dati sono presentati come osservazioni qualitative delle tendenze piuttosto che come risultati quantificati statisticamente.
Analisi statistica:
Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Disponibilità dei dati:
I set di dati generati e analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e nei materiali supplementari. I risultati dell'identificazione dei composti mediante UHPLC-HRMS sono forniti nella Tabella Supplementare 1, mentre le caratteristiche dei set di dati GEO utilizzati per le analisi bioinformatiche sono riassunte nella Tabella Supplementare 2. Ulteriori dati di supporto, inclusa l'immunofluorescenza per GFAP (Figura Supplementare 1), la colorazione immunofluorescente di p-RIPK3 e p-MLKL (Figura Supplementare 2), il disegno sperimentale e la tempistica di assegnazione degli animali (Figura Supplementare 3) e le immagini originali non ritagliate dei western blot (Figura Supplementare 4), sono disponibili nei materiali supplementari.
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Risultati
WGCNA identifica un modulo genico associato alla depressione arricchito nel percorso della necroptosi
Il pacchetto RRA è stato utilizzato per integrare i geni differenzialmente espressi costantemente sovraespressi e sottoregolati nei set di dati GSE54566, GSE54565 e GSE54568, portando all'identificazione di 2.513 geni. Una mappa termica di questi geni è mostrata in Figura 1A. I tre set di dati derivavano da regioni cerebrali distinte—la corteccia cingolata anteriore, l'a...
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Discussione
La morte neuronale anomala svolge un ruolo cruciale nella patogenesi della depressione8. La necroptosi, una forma di morte cellulare programmata, è stata ampiamente studiata, portando a significativi progressi nello sviluppo di inibitori mirati a questa via39. Dall'identificazione dell'inibitore della necroptosi Nec-1 nel 200540, sono stati compiuti notevoli passi avanti nello sviluppo di composti che agiscono su componenti chiave della via di segnal...
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Dichiarazioni
Conflitti di interessi:
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Scientifico Chiave di Ricerca delle Istituzioni di Istruzione Superiore dell'Henan, Cina (n. 26A360008), dal Progetto di Ricerca Scientifica sulla Medicina Tradizionale Cinese della Provincia dell'Henan (n. 2025ZY3152), dal Fondo Nazionale delle Scienze Naturali della Cina (n. 82274496), dal Progetto di Ricerca Scientifica e Tecnologica della Provincia dell'Henan (n. 232301420018) e dal Progetto di Eredità e Innovazione Zhang Zhongjing del Dipartimento di Scienza e Tecnologia dell'Amministrazione Nazionale della Medicina Tradizionale Cinese (n. GZY-KJS-2022-044-1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rizoma di Acori Tatarinowii (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 231001 | Ingrediente erboristico (12 g) |
| Nastro adesivo | Non applicabile | Non applicabile | Test di sospensione della coda |
| Radice di Angelica Sinensis (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | G01230507-16 | Ingrediente erboristico (10 g) |
| Anticorpo anti-ATF4 (immunofluorescenza) | Servicebio | GB111137 | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-ATF4 (western blot) | MedChemExpress | HY-P80486 | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-BDNF | MedChemExpress | HY-P80567 | Anticorpo primario per western blot |
| Anticorpo anti-CREB | Beyotime | AF1018 | Anticorpo primario per western blot e immunofluorescenza |
| Anticorpo anti-GAPDH | Abcam | ab181602 | Controllo di caricamento |
| Anticorpo anti-MLKL | Proteintech | 66675-1-Ig | Anticorpo primario per western blot e immunofluorescenza |
| Anticorpo anti-NeuN | Servicebio | GB11138 | Anticorpo primario per immunofluorescenza |
| Anticorpo anti-CREB fosforilato | Beyotime | AF5785 | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-MLKL fosforilato | Bioss | bsm-54104R | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-RIPK1 fosforilato | Biolynx | BX60008 | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-RIPK3 fosforilato | Abcam | ab195117 | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-RIPK1 | Cell Signaling Technology | 3493S | Anticorpo primario |
| Anticorpo anti-RIPK3 | Proteintech | 17563-1-AP | Anticorpo primario |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 230801 | Ingrediente erboristico (10 g) |
| Software automatizzato di tracciamento del comportamento | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | Software di tracciamento video SMART 3.0 per test del campo aperto e test di sospensione della coda |
| Kit per saggio proteico BCA | CWBIO | CW0014S | Quantificazione proteica |
| Sistema di registrazione del comportamento | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Test del campo aperto e test di sospensione della coda |
| Sistema di imaging chemiluminescente Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | Sistema di imaging ChemiDoc MP per rilevamento chemiluminescente del western blot |
| Kit per saggio di vitalità cellulare luminescente CellTiter-Lumi II | Beyotime | C0056XL | Saggio di vitalità cellulare |
| Microscopio confocale | Nikon Eclipse C1 | N/A | Acquisizione di immagini mediante immunofluorescenza |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Colorante nucleare |
| Soluzione deparaffinizzante ambientale | Servicebio | G1128 | Deparaffinizzazione |
| Serum bovino fetale (FBS) | BI | C04001-500 | Supplemento per colture cellulari |
| Frutto di Gardenia (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 22102109 | Ingrediente erboristico (12 g) |
| Radice di Glycyrrhiza (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 230301 | Ingrediente erboristico (3 g) |
| Secondario anticorpale caprino anti-topo IgG coniugato con CY3 | Servicebio | GB21301 | Anticorpo secondario fluorescente per anti-ATF4 da topo (IF, CY3, 1:300) |
| Secondario anticorpale caprino anti-topo IgG coniugato con Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25301 | Anticorpo secondario fluorescente per anti-MLKL da topo (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Secondario anticorpale caprino anti-coniglio IgG coniugato con CY3 | Servicebio | GB21303 | Anticorpo secondario fluorescente per anti-NeuN da coniglio (IF, CY3, 1:300) |
| Secondario anticorpale caprino anti-coniglio IgG coniugato con Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25303 | Anticorpo secondario fluorescente per anti-CREB da coniglio (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Secondario anticorpale caprino anti-coniglio IgG coniugato con HRP | Absin | abs20040 | Anticorpo secondario per western blot |
| Secondario anticorpale anti-catena leggera IgG da topo anti-coniglio coniugato con HRP | ABclonal | AS061 | Anticorpo secondario per western blot |
| TNF-α umano | Novoprotein | C008 | Induttore di necroptosi |
| Cellule HT-22 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| Mezzo di crescita HyClone | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Mezzo per colture cellulari |
| ImageJ | NIH | Software gratuito | Quantificazione delle bande |
| Microscopio invertito | Nikon | Eclipse Ti-SR | Morfologia cellulare |
| Azoto liquido | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/A | Conservazione dei tessuti |
| Lettore di micropiastre Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Misurazione della luminescenza |
| Corteccia di Moutan (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 22121714 | Ingrediente erboristico (12 g) |
| Necrostatina-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | Inibitore di RIPK1 |
| Paraformaldeide | Servicebio | G1101-500ML | Fissazione dei tessuti |
| Cloridrato emiidrato di paroxetina | Aladdin | P129711 | Controllo positivo |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Tampone di lavaggio |
| Menta (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 230101 | Ingrediente erboristico (6 g) |
| Penicillina–streptomicina | Gibco | 15140-122 | Antibiotico per colture cellulari |
| Radice di Polygala (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 20221101 | Ingrediente erboristico (12 g) |
| Membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | D23070601 | Ingrediente erboristico (15 g) |
| Tampone di lisi RIPA (radioimmunoprecipitazione) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Estrazione proteica |
| Radice di Bupleuro (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Cina | 230801 | Ingrediente erboristico (12 g) |
| Reagenti per SDS-PAGE | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Non applicabile | Acrylamide, bis-acrylamide, Tris, SDS, APS e TEMED preparati in laboratorio |
| Pentobarbital sodico | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Anestetico |
| Sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC System | Analisi LC-MS |
| Colonna UHPLC HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) | Waters | 186003539 | Separazione cromatografica |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Inibitore pan-caspasi |
Riferimenti
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