Un metodo basato sull'impedenza in tempo reale e senza marcatori per lo screening antivirale ad alta produttività

Ashley Zolfaghari; Naveenchandra Suryadevara; Jing Zhang; Nancy Li; Li Leyna Zhao; James E. Crowe; Xiaoyu Zhang; Robert H. Carnahan

doi:10.3791/72539

Articolo metodologico

Un metodo basato sull'impedenza in tempo reale e senza marcatori per lo screening antivirale ad alta produttività

0 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

3 settembre 2026

Ashley Zolfaghari¹ , Naveenchandra Suryadevara¹ , Jing Zhang² , Nancy Li² , Li Leyna Zhao² , James E. Crowe¹^,³^,⁴ , Xiaoyu Zhang² , Robert H. Carnahan¹^,⁴

¹Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, ²Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, ³Department of Pathology, Microbiology and Immunology, ⁴Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

In questo articolo

Sommario

L'approccio basato sull'impedenza per l'analisi cellulare in tempo reale (RTCA) consente la quantificazione in tempo reale e senza marcatura degli effetti citopatici indotti dai virus, fornendo un metodo rapido per valutare composti antivirali e anticorpi monoclonali attraverso un flusso di lavoro integrato per saggi guidato da software.

Abstract

Le tecnologie basate sull'impedenza forniscono un metodo solido e oggettivo per quantificare gli effetti citopatici (CPE) nei monoculti cellulari, superando i limiti dei saggi tradizionali a punto fisso o soggettivi basati sull'osservazione visiva. I virus citolitici inducono tipicamente marcanti cambiamenti morfologici e morte cellulare nelle colture infette, rendendo le misurazioni di impedenza, che riflettono variazioni nell'adesione, nella morfologia e nella vitalità cellulare, un indicatore sensibile e dinamico dell'infezione virale e della sua progressione. Di conseguenza, le rilevazioni basate sull'impedenza offrono un approccio potente ed efficiente per valutare gli effetti protettivi di interventi antivirali. Questo studio presenta una piattaforma di screening in tempo reale e senza marcatura, che sfrutta sistemi avanzati di misurazione dell'impedenza per monitorare in modo continuo il CPE indotto dai virus. Questo approccio consente una valutazione rapida e quantitativa dell'efficacia antivirale sia di farmaci a piccole molecole che di anticorpi monoclonali, senza necessità di ulteriori passaggi di marcatura o colorazione. Il protocollo descrive l'intero flusso operativo del saggio, dalla semina cellulare e l'infezione virale fino all'acquisizione e all'analisi dei dati. Inoltre, il software integrato nel sistema, progettato specificamente per applicazioni virologiche, semplifica l'elaborazione e l'interpretazione dei dati, facilitando la determinazione della potenza neutralizzante degli anticorpi monoclonali e l'attività di composti antivirali.

Introduzione

Quando ci si trova di fronte alla minaccia di un'epidemia virale, i vaccini e i farmaci antivirali rappresentano le strategie principali per limitare la trasmissione virale e trattare i pazienti infetti¹. I vaccini prevengono l'infezione attivando il sistema immunitario affinché riconosca i patogeni, offrendo una protezione proattiva e a lungo termine. I farmaci antivirali hanno diverse applicazioni a seconda della modalità e della formulazione del farmaco. Analogamente ai vaccini, gli anticorpi monoclonali possono fornire una protezione proattiva e prolungata (settimane fino a molti mesi) e possono essere utilizzati anche come strumento per il controllo post-esposizione. Sia gli anticorpi monoclonali che i farmaci antivirali a base di piccole molecole vengono impiegati per trattare infezioni conclamate, agendo direttamente sui componenti virali o inibendoli, riducendo così la gravità della malattia e costituendo un intervento reattivo a breve termine.

L'approccio convenzionale per la valutazione funzionale dell'attività antivirale in sistemi biologici è il test di neutralizzazione per riduzione del virus (virus reduction neutralization test, VRNT), che quantifica la riduzione della formazione di placche nei test di neutralizzazione per riduzione delle placche (plaque reduction neutralization tests, PRNT) e nei foci tramite immunostaining nel test di riduzione delle placche (FRNT, focus reduction neutralization test) o effetti citopatici (CPE, cytopathic effects) mediante saggi basati sulla vitalità cellulare. Il test di neutralizzazione con riduzione delle placche (PRNT) è considerato il metodo fenotipico di riferimento per determinare l'attività inibitoria di agenti antivirali contro un'ampia gamma di infezioni virali²Tuttavia, il test PRNT è lungo e laborioso, e l'interpretazione dei risultati può essere soggettiva, in particolare quando si verifica una sovracrescita o fusione delle placche durante un'incubazione prolungata. L'oggettività della lettura dei risultati può essere migliorata mediante il test FRNT, che si basa sulla rilevazione di antigeni specifici per il virus o sull'espressione di un gene reporter. Tuttavia, questo approccio può essere limitato dalla disponibilità e dalle prestazioni di anticorpi di alta qualità o di enzimi di rilevamento. Diversi reagenti e protocolli sperimentali sono ben consolidati e ampiamente utilizzati per la valutazione della vitalità cellulare, misurando determinati aspetti del CPE. La riduzione enzimatica del sale mono-tetrazolio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro), un reagente colorimetrico, operata dalle deidrogenasi mitocondriali delle cellule vive produce un segnale colorimetrico quantificabile dovuto al prodotto colorato formazano. Il reagente per il saggio di vitalità cellulare (che lisa le cellule e rilascia l'ATP intracellulare, il quale alimenta una reazione catalizzata dalla luciferasi che converte il substrato luciferina in oxiluciferina) costituisce un saggio luminoso omogeneo. Tali saggi di vitalità cellulare possono essere impiegati per quantificare la riduzione del CPE durante lo screening di agenti antivirali.³Tuttavia, questi metodi richiedono anche numerose fasi di lavaggio e di colorazione e, come i saggi PRNT e FRNT, sono saggi a punto finale. Di conseguenza, agenti antivirali parzialmente efficaci che esercitano effetti ritardati sull'infezione virale potrebbero essere trascurati se il saggio antivirale viene interrotto in un punto temporale non ottimale. Pertanto, sussiste la necessità di un saggio automatizzato, da medio ad alto rendimento, che consenta il monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari alle infezioni virali.

I sistemi di analisi cellulare in tempo reale (RTCA) consentono il monitoraggio continuo dello sviluppo del CPE e delle risposte antivirali in modelli cellulari permissivi attraverso una rilevazione basata sull'impedenza elettrica, priva di marcatori e non invasiva. Il CPE indotto dal virus comprende non solo la morte cellulare, ma anche alterazioni della morfologia e dell'adesione cellulare, tutti fenomeni che possono essere rilevati con sensibilità attraverso variazioni dell'impedenza elettrica⁴^,⁵. Queste misurazioni di impedenza vengono effettuate mediante sensori a microelettrodi d'oro integrati in una piastra speciale per colture cellulari a 96 pozzetti, permettendo una valutazione quantitativa delle risposte cellulari dinamiche senza necessità di marcatori o espressione di geni reporter. La tecnologia RTCA è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento del CPE in diversi modelli cellulari infettati da virus appartenenti a molteplici famiglie, nonché per la valutazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi^6–10.

Qui, i passaggi critici di questo metodo in tempo reale e senza etichette basato sull'impedenza in vitro I saggi antivirali sono stati definiti. Questo approccio si è basato su studi precedenti che prevedevano lo screening di composti antivirali in cellule HEK293A infettate da adenovirus 5 e la valutazione di anticorpi neutralizzanti mediante un virus della stomatite vescicolare ricombinante in grado di replicarsi e che esprime la glicoproteina di Lassa (rVSV-LASV(Lin IV)) in cellule Vero CCL-81.¹¹. Tutti questi esperimenti sono stati eseguiti su un sistema RTCA MP, che consente di eseguire fino a 6× Piastre a 96 pozzetti contemporaneamente. L'obiettivo di questo lavoro era stabilire le basi per lo screening antivirale basato sull'impedenza. Il metodo può essere facilmente esteso a un'ampia gamma di modelli virus-cellula, una volta definite le condizioni ottimali del saggio utilizzando il protocollo qui descritto.

Protocollo

I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura e passaggio di cellule permissive

NOTA: in questo protocollo, le cellule Vero CCL-81 vengono utilizzate per la neutralizzazione degli anticorpi, mentre le cellule HEK293A vengono utilizzate per lo screening di composti antivirali. Per ridurre le variazioni tra esperimenti, si raccomanda vivamente di creare una banca cellulare di cellule permissive alla stessa passaggio per il saggio.

Riscaldare in anticipo il mezzo di crescita cellulare — Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l’1% di penicillina-streptomicina — in un bagno termostatato a 37 °C prima dell’uso.
Scongelare un’ampolla di cellule permissive criopreservate in un bagno termostatato a 37 °C fino a quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio; non immergere il tappo nel bagno d’acqua.
Posizionare l’ampolla contenente le cellule rivitalizzate nella cappa a sicurezza biologica (BSC) dopo averne asciugato l’esterno con etanolo al 70%.
Trasferire delicatamente le cellule in un nuovo tubo conico da 50 mL e aggiungere goccia a goccia 9 mL di mezzo di crescita tiepido alle cellule. Mescolare dolcemente.
Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
Trasferire le cellule risospese in 5 mL di mezzo di crescita preriscaldato in una nuova fiasca T-25.
Fare crescere le cellule fino a una confluenza dell’80%–90% in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂prima del successivo passaggio cellulare.
Effettuare il passaggio delle cellule.
1. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente lo strato monocellulare due volte con 3 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) priva di calcio e magnesio 1× per rimuovere il mezzo di crescita residuo.
2. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,25% alla fiasca in modo da ricoprire le cellule.
3. Dopo un’incubazione di 2–5 minuti a 37 °C, neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume pari a 5 volte quello di mezzo di crescita preriscaldato.
4. Risospendere le cellule pipettando delicatamente la sospensione su e giù contro la parete della fiasca.
5. Sezionare le cellule alla densità di semina desiderata o al rapporto di suddivisione scelto, utilizzando mezzo fresco.
  NOTA: La densità di semina desiderata viene determinata empiricamente in base alla velocità di crescita delle cellule, alla frequenza di passaggio e alla confluenza target al momento del passaggio. Ad esempio, seminando le cellule Vero CCL-81 con una densità minima di 0,4 × 10⁴ cellule/cm², è possibile effettuare il passaggio ogni 3 giorni prima che raggiungano il 90% di confluenza.

2. Screening di agenti antivirali

NOTA: Figura 1 illustra il flusso di lavoro del saggio di screening antivirale basato sull'impedenza. In breve, cellule permissive vengono seminate in micropiastre da 96 pozzetti integrate con microelettrodi e la performance cellulare viene monitorata per circa 24 ore prima dell'inizio del saggio. Per i test di neutralizzazione con anticorpi, i virus a una multiplicità di infezione (MOI) fissa vengono mescolati con gli anticorpi e preincubati per 1 ora prima di essere aggiunti alle cellule. Al contrario, per lo screening di composti antivirali, i virus a MOI fisso e i composti vengono aggiunti contemporaneamente alle cellule. Il CPE (effetto citopatico) indotto dai virus viene monitorato continuamente mediante letture basate sull'impedenza e l'analisi dei dati può essere eseguita sia durante che al termine del saggio.

Giorno 0: Misurare il fondo della piastra e seminare le cellule permissive
1. Per iniziare un esperimento, aprire il software dello strumento (RTCA Pro) e selezionare la staffa desiderata per il saggio. Successivamente, scegliere la Virologia modulo prima di avviare l'esperimento.
2. Inserire eventuali note pertinenti nel Appunti sperimentali scheda (ad es. Nome dell'esperimento, Numero di serie del dispositivo, Tipo di dispositivoo altri dettagli pertinenti). Questi campi sono opzionali e possono essere lasciati vuoti se non applicabili.
3. Passare a Layout scheda e definire le pozzette utilizzate nell'esperimento. Se alcune pozzette non verranno utilizzate, selezionare le pozzette non utilizzate, fare clic con il tasto destro all'interno dell'interfaccia di layout della piastra e selezionare Spegnere il/i pozzetto/i dal menu a discesa per escluderli dal saggio.
4. Misurazione del fondo della micropiastra da 96 pozzetti con microelettrodi integrati
  1. Distribuire 50 µL di mezzo di saggio in ciascun pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale in modalità di pipettaggio inverso per minimizzare la formazione di bolle.
    NOTA: La scelta del mezzo per il saggio dovrebbe essere ottimizzata prima dello screening al fine di minimizzare interferenze con la sensibilità del saggio e garantire una valutazione accurata dell'efficacia del trattamento. Ad esempio, i saggi di neutralizzazione degli anticorpi sono stati eseguiti in DMEM contenente il 2% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina, mentre i saggi di screening di composti antivirali hanno utilizzato il mezzo di crescita cellulare, DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Posizionare la piastra nel supporto dello strumento situato all'interno di un 37 °C incubatrice con 5% CO₂₂Assicurarsi che la piastra sia orientata correttamente con la pozzetta A1 posizionata come indicato. Successivamente, verificare la scheda Messaggio per eventuali notifiche di errore.
    NOTA: Ogni volta che la piastra viene inserita nel supporto, verificare che venga visualizzato il messaggio «Piastra scansionata. Connessioni a posto». In caso di errore, rimuovere la piastra e reinserirla nel supporto.
  3. Passare al Programma scheda; il passaggio 1 appare per impostazione predefinita, poiché è un passaggio obbligatorio per la misurazione dello sfondo della piastra. Fare clic su Avviare pulsante per avviare la registrazione dalle pozzette. Il passaggio si conclude automaticamente dopo aver registrato una singola misurazione dell'impedenza di fondo.
    NOTA: Questo passaggio preliminare deve essere eseguito prima di ogni esperimento. Tutti i pozzetti utilizzati nell'esperimento devono contenere esclusivamente mezzo di saggio (ovvero, prima della semina delle cellule).
5. Semina permissiva di cellule nella piastra a 96 pozzetti integrata con microelettrodi
  1. Ibridi le cellule permissive nel flask T25 seguendo i passaggi descritti nella sezione di passaggio delle cellule permissive.
  2. Contare le cellule risospese nel mezzo dell'assay ed eseguire i seguenti calcoli:
    1. Calcolare il numero totale di cellule vitali nella sospensione utilizzando la densità di cellule vitali: Numero totale di cellule vitali = densità di cellule vitali × volume del sospensione
    2. Regolare la sospensione cellulare a una densità finale (ad esempio, 0,30–0,35 × 10⁶ cellule/mL per Vero CCL-81, equivalente a circa 15.000–18.000 cellule per 50 µL, oppure 0,12 × 10⁶ cellule/mL per HEK293A, equivalenti a 6.000 cellule per 50 µL).
      NOTA: Queste densità di semina sono state precedentemente determinate come ottimali per ciascun modello virus-cellula. Una corretta densità di semina delle cellule è essenziale, poiché l'uso di un numero eccessivo o insufficiente di cellule potrebbe influenzare la sensibilità del saggio.
  3. Rimuovere la micropiastra contenente 50 µL del mezzo di saggio dallo strumento e trasferirlo nella cappa a flusso laminare per la semina cellulare.
  4. Distribuire 50 µL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale in modalità di pipettaggio inverso per minimizzare la formazione di bolle, portando il volume finale di ogni pozzetto a 100 µL.
6. Dopo l'aggiunta delle cellule, lasciare la piastra nella cappa a flusso laminare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire una distribuzione uniforme delle cellule sul fondo di ogni pozzetto.
7. Riportare la piastra nel supporto dello strumento situato all'interno di un 37 °C incubatrice con 5% CO₂₂.
  NOTA: Se si utilizzano più piastre, etichettare chiaramente ciascuna piastra e assicurarsi che venga riposizionata nello stesso alloggiamento usato durante la misurazione del fondo.
8. Passare al Layout scheda e apri la Cellula sottotab. Selezionare le pozzette appropriate, inserire la cellula permissiva Nome e Numeroe fare clic su Applicare per salvare le informazioni. Le informazioni relative alle cellule possono essere inserite o aggiornate in qualsiasi momento durante l'esperimento.
9. Aggiungere il passaggio 2 al Programma scegliere la scheda utilizzando le impostazioni di registrazione predefinite (100 scansioni e un intervallo di 15 minuti), quindi fare clic su Avviare per avviare il monitoraggio continuo notturno dell'adesione e della proliferazione cellulare.
  NOTA: Questo passaggio rappresenta una misura di controllo qualità (QC) delle cellule prima dell'inoculazione virale. Poiché l'indice cellulare (Cell Index, CI) riflette l'adesione e la proliferazione cellulare, i valori di CI ottenuti nel periodo compreso tra 18 e 24 ore dal seeding vengono utilizzati come parametro chiave di controllo qualità. Un comportamento cellulare riproducibile tra esperimenti diversi è essenziale per garantire l'ottimale riproducibilità del saggio. In particolare, sia l'ampiezza che il profilo cinetico del CI sono specifici del tipo cellulare. Ad esempio, dopo una coltura notturna, linee cellulari Vero CCL-81 sane seminate a 18.000 cellule/pozzetto mostrano tipicamente un indice cellulare compreso tra 6 e 8, mentre linee cellulari HEK293A sane seminate a 6.000 cellule/pozzetto presentano generalmente un indice cellulare compreso tra 0,8 e 1,2.
Giorno 1: Screening di agenti antivirali basato sull'impedenza
NOTA: prima di eseguire il saggio di screening, il virus deve essere opportunamente titolato al fine di determinare la diluizione di lavoro ottimale. Questo passaggio consente di stabilire una concentrazione di virus in grado di garantire prestazioni del saggio robuste e riproducibili, soddisfacendo al contempo requisiti definiti dall'utente, come la durata desiderata del saggio. Ad esempio, nel protocollo di neutralizzazione da anticorpo¹¹, è stato scelto un indice di infezione (MOI) di 0,01 per il saggio di neutralizzazione, poiché ha prodotto una CPE completa (100%) entro 40 h dal inoculo. Nel saggio basato sull'impedenza, la CPE completa è indicata dalla riduzione dell'indice cellulare o dell'indice cellulare normalizzato a zero. Durante lo screening di composti antivirali, è stato utilizzato un MOI di 1 ed è stata osservata una CPE del 100% entro 70 h dal inoculo. Il protocollo di titolazione virale ha seguito procedure consolidate descritte in un precedente studio¹²Se nel saggio vengono utilizzati virus infettivi, assicurarsi di seguire tutte le precauzioni di sicurezza applicabili. Consultare la sezione relativa alle indicazioni di sicurezza per la manipolazione di virus infettivi.
1. Preparare il virus alla concentrazione predeterminata e preparare diluizioni seriali dell'anticorpo o del composto antivirale nel mezzo di saggio.
2. Per i saggi di neutralizzazione con anticorpi monoclonali, mescolare 60 µL di virus a 4× la concentrazione finale nel saggio con 60 µL di anticorpo a 4× la concentrazione finale del saggio e incubare a 37 °C per 1 h prima dell'aggiunta alle cellule permissive. Dopo il mescolamento, il virus e l'anticorpo sono presenti a 2× le loro concentrazioni finali nel saggio. Al contrario, non è richiesta alcuna preincubazione virus-composto per i saggi di screening di composti antivirali.
3. Passare a Layout scheda e selezionare il Trattamento sottotab per inserire le informazioni sul trattamento relative agli agenti antivirali nelle pozzette appropriate.
4. Selezionare le pozzette con lo stesso trattamento, quindi inserire il Nome degli agenti e inserire l'inizio Diluizione o Concentrazione. Ad esempio, se la concentrazione iniziale è 10 µg/mL, inserire 10 e selezionare µg/mL come il “Unità. Inserire 3 come il Fattore di diluizione e specificare il Direzione di diluizione (ad esempio, dall'alto verso il basso).
  NOTA: Dopo aver fatto clic su Applicare, le concentrazioni o le diluizioni degli agenti antivirali verranno calcolate e salvate automaticamente in base all'input del layout della piastra e visualizzate nei pozzetti corrispondenti. I valori calcolati vengono inoltre salvati per successive analisi dei dati. Inserimento delle informazioni sul virus (ad esempio, Nome e Diluizione) è facoltativo, poiché il saggio utilizza un MOI fisso singolo per tutte le pozzette trattate con il virus.
5. Assegnare le pozzette trattate solo con il virus come controlli positivi selezionando le pozzette appropriate e scegliendo Controllo positivo sotto Tipo di pozzetto.
6. Assegnare le pozzette non infette come controlli negativi seguendo il passaggio descritto sopra e verificando Controllo negativo sotto Tipo di pozzetto.
  NOTA: Assegnazione corretta delle pozzette con solo virus e di quelle non infette come Controllo positivo e Controllo negativo, rispettivamente, utilizzando il Tipo di pozzetto l'impostazione è fondamentale, poiché i valori di CI provenienti da queste pozzette vengono utilizzati in tutti i calcoli relativi alla neutralizzazione (ad es., %Neutralizzazione). Per i calcoli relativi al CPE (ad es., %CPE), sono necessarie pozzette di controllo negativo esplicitamente designate. Per i saggi di neutralizzazione degli anticorpi, si raccomanda fortemente l'inclusione, nella stessa piastra, sia di anticorpi di controllo positivo che negativo, al fine di garantire un'interpretazione accurata dei dati. Tuttavia, questi anticorpi di controllo devono essere designati come Campioni sotto Tipo di pozzetto.
7. Quando il saggio è pronto per l'aggiunta dell'agente antivirale, premere il Interrompi il passaggio corrente pulsante per saltare le rimanenti scansioni al Passo 2 e passare al passo successivo.
8. Fare clic su Sblocca piastra pulsante, quindi rimuovere la piastra dal supporto e posizionarla nella cappa a flusso laminare.
9. Distribuire delicatamente 100 µL del miscuglio virus-anticorpo o del miscuglio virus-composto antivirale in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale, ottenendo un volume finale nel pozzetto di 200 µL. L'inoculo contiene il virus e l'anticorpo o il composto antivirale a 2× le loro concentrazioni finali nel saggio, che vengono diluite alla concentrazione lavorativa finale al momento dell'aggiunta alle cellule.
10. Dopo aver rimesso la piastra nel supporto, procedere al Programma scheda e aggiungere il passaggio 3. Specificare il numero di Scansioni e il Interval tra le scansioni. Assicurarsi che la durata totale della scansione (numero di scansioni × intervallo) supera la durata prevista del trattamento. Fare clic su Avviare riprendere l'acquisizione dei dati e proseguire il saggio.
  NOTA: L'assegnazione di un passaggio separato (ad esempio, Passaggio 3) successivamente all'aggiunta dell'agente antivirale facilita l'identificazione immediata del periodo di monitoraggio post-trattamento. Programmare sempre ciascun passaggio (tranne il Passaggio 1) con una durata superiore alla durata prevista del saggio. Se viene raggiunto il tempo di esecuzione programmato, lo strumento interromperà l'acquisizione delle misurazioni, con conseguente mancata registrazione di punti dati.
Giorno 1 e oltre: Analisi dei dati
1. Per esaminare la registrazione in tempo reale e/o l'analisi delle risposte cellulari durante l'acquisizione dei dati, accedere a Analisi dei dati nella scheda, selezionare un punto temporale specifico o un intervallo di tempo, quindi selezionare e aggiungere le pozzette da includere nell'analisi per la visualizzazione sul grafico.
2. Selezionare i parametri dalla Asse Y menu a tendina. Quando Indice di Cellule Normalizzato (NCI) viene selezionato, specificare il Tempo di Normalizzazioneil punto temporale immediatamente precedente il trattamento, dall'elenco a discesa dei tempi. %CPE o %Neutralizzazione può anche essere visualizzato selezionando l'opzione corrispondente dal menu a discesa dell'asse Y.
  NOTA: Lo strumento utilizza un parametro adimensionale, l'Indice Cellulare (CI), per rappresentare l'impedenza. Si raccomanda l'utilizzo dell'Indice Cellulare Normalizzato (NCI) per valutare le differenze tra i trattamenti, riducendo al minimo l'impatto della variabilità intrinseca tra pozzetti.
3. Vai a Parametro sezione sulla Analisi dei Dati passare a calcolare e generare diversi tipi di grafici, come un istogramma e curve di regressione dose-risposta logistica a quattro parametri (4PL, pendenza variabile) in un determinato punto temporale (ad esempio, al punto medio o al termine del saggio). In alternativa, l'IC₅₀ derivato dall'area sotto la curva (AUC) dell'indice cellulare o dell'indice cellulare normalizzato dopo il trattamento fornisce una misura della risposta complessiva dose-dipendente degli agenti antivirali durante l'intero periodo di trattamento.
4. Al termine del test, fare clic su Pausa, quindi premere il Sblocca piastra pulsante. Rimuovere la piastra dal supporto e in modo elettronico Rilascio esso tramite il Piastra menu

3. Istruzioni per la sicurezza nel manipolamento di virus infettivi

Indossare idonei DPI con doppio guanto, schermo facciale e camice da laboratorio. Questo è fortemente raccomandato per la manipolazione di virus.
Manipolare i materiali contenenti virus e aggiungerli alle piastre esclusivamente all'interno di una cappa a flusso laminare in funzione.
Trasportare le provette contenenti virus e qualsiasi piastra con virus verso e dalla cappa all'interno di un contenitore sigillato per la sicurezza biologica.
Prima e dopo la manipolazione di materiali contenenti virus nella cappa, spruzzare accuratamente tutte le superfici interne con un disinfettante e lasciare agire per 5 minuti per garantire l'inattivazione completa del virus. Pulire le superfici e quindi disinfettarle con etanolo al 70% per rimuovere eventuali residui di disinfettante.
Al termine del saggio di screening antivirale basato sull'impedenza, rimuovere tutte le piastre dallo strumento e trasportarle con un contenitore sigillato per la sicurezza biologica direttamente in una cappa pulita.
Preparare una soluzione fresca di candeggina al 20% e aggiungerla in ogni pozzetto delle piastre del saggio. Lasciare agire la candeggina per 10 minuti prima di aspirare da tutti i pozzetti e smaltire le piastre.
Decontaminare tutte le piastre del saggio, pipette serologiche, punte di pipetta, provette e altre plastiche monouso che potrebbero essere venute a contatto con il virus mediante candeggina, e smaltirle in appositi sacchetti per rifiuti biologici.
Spruzzare le plastiche non monouso, come i portaprovette e le pipette, con un disinfettante e pulirle con un panno.

Risultati

Lettura in tempo reale, senza etichette, dell'impedenza che rivela il CPE indotto dal virus e la protezione antivirale
Come mostrato in Figura 2A, le cellule ospiti HEK293A sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti integrata con microelettrodi a una densità di 6.000 cellule per pozzetto¹³. Dopo un'incubazione di 24 ore, il virus adenovirus di tipo 5 è stato aggiunto a un MOI di 1 in presenza o assenza di composti antivirali. Le risposte cellulari all'infezione virale e al trattamento antivirale sono state monitorate continuamente mediante misurazioni in tempo reale dell'impedenza senza etichette. In assenza del virus, le cellule si sono proliferate in modo continuo durante il periodo di monitoraggio di 80 ore, raggiungendo la confluenza come indicato da un aumento costante dell'impedenza seguito da un plateau. L'infezione da adenovirus inizialmente ha permesso la crescita cellulare per circa 20 ore, dopo di che è stato osservato un marcato CPE, con conseguente rapido calo del segnale di impedenza al valore di base entro circa 65 ore dall'infezione. Il trattamento con stavudina (50 µM) o ribavirina (20 µM) ha avuto un impatto minimo sul CPE indotto dal virus, con tracciati di impedenza simili a quelli delle cellule infette solo con il virus. Il ganciclovir (50 µM) ha mostrato un'attività antivirale modesta, evidenziata da un parziale recupero dell'indice cellulare normalizzato. Al contrario, la cidofovir (50 µM) e la brincidofovir (1 µM) hanno attenuato in modo significativo il CPE, producendo profili di impedenza paragonabili a quelli osservati nelle cellule di controllo negative non infette. Da notare che nessuno dei composti ha influenzato significativamente l'indice cellulare rispetto ai controlli trattati con veicolo alle concentrazioni testate in studi preliminari (dati non mostrati).

In un saggio di neutralizzazione anticorpale basato sull'impedenza, le cellule Vero CCL-81 sono state seminate a una densità di 18.000 cellule per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti con microelettrodi integrati e coltivate per 24 h prima dell'infezione. Nel giorno del saggio, gli anticorpi monoclonali sono stati preincubati con rVSV–LASV a un MOI di 0,01 per 1 h prima dell'aggiunta alle cellule. Sono stati osservati profili di neutralizzazione distinti tra gli anticorpi monoclonali testati (mAb). Per chiarezza, Figura 2B mostra risultati rappresentativi di anticorpi che mostrano attività neutralizzante potente, parziale o nulla. Gli anticorpi non neutralizzanti hanno indotto una CPE completa, con tracce di impedenza sovrapposte a quelle dei controlli con solo virus. Gli anticorpi con attività neutralizzante intermedia hanno ridotto parzialmente la citotossicità indotta dal virus, determinando una CPE ridotta ma rilevabile. Al contrario, gli anticorpi completamente neutralizzanti hanno inibito completamente la CPE, mantenendo segnali di impedenza paragonabili a quelli dei controlli con cellule non infette. Nel complesso, questi profili di impedenza hanno permesso una chiara differenziazione tra anticorpi monoclonali non neutralizzanti, parzialmente neutralizzanti e completamente neutralizzanti.

Quantificazione e caratterizzazione dell'attività antivirale
Dopo aver dimostrato la capacità del saggio RTCA basato sull'impedenza di identificare i "hit" da una libreria di farmaci e di mAb, lo studio ha successivamente cercato di caratterizzare l'efficacia dei composti e degli anticorpi principali. Aumentando progressivamente la concentrazione del farmaco antivirale brincidofovir da 15,6 nM a 1.000 nM si osserva un incremento graduale del segnale di impedenza; più alta è la concentrazione del farmaco, più le cellule si comportano come il controllo non infetto (Figura 3A). Inoltre, il trattamento con brincidofovir da solo ha determinato un lieve aumento dell'NCI solo alla concentrazione più elevata testata (1100 nM). Tuttavia, a concentrazioni inferiori a 1100 nM, l'NCI è moderatamente diminuito, sebbene l'effetto non fosse dipendente dalla dose. Questo risultato indica che il recupero dell'indice cellulare è attribuibile esclusivamente all'attività antivirale del farmaco e non a un potenziamento diretto della proliferazione o dell'adesione cellulare (Figura 3B). Riportando su un grafico l'area sotto l'indice cellulare normalizzato (AUC) in funzione della concentrazione di brincidofovir si ottiene la curva dose-risposta, che mostra un ottimo adattamento (R² pari a 0,99) e indica un IC₅₀ di 265 nM (Figura 3C). Nel saggio di neutralizzazione con anticorpi, al termine del saggio (circa 50 h dopo il trattamento), il software del sistema ha calcolato automaticamente le percentuali di neutralizzazione per ciascuna concentrazione di mAb e successivamente sono stati ricavati i valori di IC₅₀. Come mostrato in Figura 3D, a differenza dell'anticorpo di controllo negativo rANDV-5, gli altri tre mAb, r37.2D, r25.1C e r12.1F, hanno dimostrato un'elevata potenza antivirale, con valori di IC₅₀ pari a 4.315 ng/mL, 83 ng/mL e 232 ng/mL, rispettivamente¹⁴^,¹⁵.

figure-results-1
Figura 1: Illustrazione schematica del flusso di lavoro per il saggio di screening antivirale basato sull'impedenza. Giorno 0, Passaggio 1: Le cellule permissive sono state seminate in micropiastre e la crescita cellulare è stata monitorata nel supporto dello strumento collocato in un incubatore a 37 °C con 5% di CO₂ per circa 24 ore. Giorno 1, Passaggio 2: Il virus è stato preparato a un MOI fisso e con diluizioni seriali di agenti antivirali. Per i saggi di neutralizzazione con anticorpi, il virus è stato preincubato con gli anticorpi a 37 °C per 1 ora prima di aggiungere la miscela alle cellule. Passaggio 3: Le miscele di virus e agente antivirale sono state aggiunte alle cellule. Giorno 1 e giorni successivi, Passaggio 4: Il CPE indotto dal virus è stato monitorato continuamente mediante misurazioni basate sull'impedenza per diversi giorni. Passaggio 5: I dati sono stati analizzati in tempo reale o al termine del saggio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Monitoraggio in tempo reale dell'attività antivirale mediante misurazioni dell'indice cellulare basate sull'impedenza. (A) Screening di farmaci antivirali valutato mediante analisi dell'impedenza. Tutti i composti sono stati testati a 50 µM, tranne ribavirina (20 µM) e brincidofovir (1 µM), in presenza di adenovirus di tipo 5 a un MOI di 1. I dati sono espressi come media ± DS di tre pozzetti replicati. La figura è adattata da Zhang et al.¹³. (B) Saggio di neutralizzazione con anticorpi monoclonali basato sull'impedenza. Sono mostrati profili rappresentativi dell'indice cellulare per anticorpi monoclonali che mostrano assenza di neutralizzazione (CPE completa, rosso), neutralizzazione parziale (CPE parziale, arancione) o neutralizzazione potente (nessun CPE rilevabile, nero). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Quantificazione dell'attività antivirale mediante impedenza. (A) Variazioni dinamiche dell'indice cellulare normalizzato in tempo reale dopo trattamento con concentrazioni crescenti di brincidofovir in combinazione con infezione da adenovirus di tipo 5 a un MOI di 1. (B) Variazioni dinamiche dell'indice cellulare normalizzato in tempo reale dopo trattamento con concentrazioni crescenti di brincidofovir da solo. (C) L'area sotto le tracce di impedenza è stata riportata in funzione del brincidofovir per ottenere una curva dose-risposta. (A) e (C) sono adattate da Zhang et al.¹³. (D) Curve rappresentative di neutralizzazione di rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) per gli anticorpi monoclonali r37.2D, r25.1C, r12.1F e rANDV-5, incluso come controllo negativo. Gli anticorpi monoclonali 37.2D, 25.1C, 12.1F e ANDV-5 sono stati prodotti in forma ricombinante sulla base della letteratura esistente (vedere la sezione Risultati). I dati mostrati sono curve rappresentative di due esperimenti indipendenti e sono riportati come media ± DS di tre pozzetti replicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Come tutti i saggi basati su cellule, il saggio di screening antivirale RTCA richiede un'ottimizzazione specifica per ogni sistema virus-cellula. Poiché questo saggio rileva il CPE indotto dal virus attraverso variazioni dell'impedenza, dipende da un modello cellulare permissivo in grado di sostenere la replicazione virale e un CPE misurabile. I virus che non producono un CPE rilevabile tramite impedenza potrebbero non essere adatti a questo approccio; in tali casi, metodi alternativi come il FRNT possono essere utilizzati quando sono disponibili anticorpi specifici per il virus. Un'altra considerazione importante è che le variazioni dell'indice cellulare non sono causate esclusivamente dalla citolisi indotta dal virus. Alterazioni della morfologia cellulare, dell'adesione, della proliferazione e dell'attaccamento possono anch'esse influenzare i segnali di impedenza e potenzialmente interferire con la valutazione dell'attività antivirale. Pertanto, gli effetti degli agenti antivirali sull'indice cellulare devono essere valutati in studi preliminari o mediante opportuni controlli con l'agente da solo. Nello studio qui descritto, al fine di massimizzare il numero di agenti valutati per ogni piastra, i controlli con l'agente antivirale da solo sono stati testati prima del saggio di screening per stabilire gli effetti di base di ciascun candidato in assenza di infezione virale. Le prestazioni del saggio sono inoltre influenzate da fattori quali la densità di semina delle cellule, il momento dell'inoculazione del virus e le condizioni del mezzo, che possono influire sulla crescita cellulare, sulla replicazione virale, sullo sviluppo del CPE e sulla riproducibilità del saggio⁷^,¹⁰^,¹⁶. Di conseguenza, un'ottimizzazione sistematica è essenziale per uno screening antivirale robusto e affidabile basato sull'RTCA.

Dopo aver stabilito le condizioni ottimali del saggio, l'implementazione efficace di saggi antivirali in tempo reale basati sull'impedenza richiede un'accurata semina delle cellule, cellule sane e condizioni di saggio stabili. Una elevata variabilità da pozzetto a pozzetto è spesso causata da una distribuzione irregolare delle cellule o da pipettatura inaccurata; pertanto, le sospensioni cellulari devono essere mescolate accuratamente prima della semina e le piastre devono essere lasciate a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti dopo la semina per favorire un uniforme attaccamento cellulare e ridurre gli effetti di bordo. Si raccomanda un numero minimo di tre replicati per ogni trattamento, mentre è fortemente consigliato aggiungere replicati aggiuntivi per i controlli negativi (non infetti) e positivi (solo virus), poiché questi valori costituiscono i punti di riferimento per il calcolo del %CPE e del %Neutralizzazione in tutte le condizioni sperimentali. Se il CPE indotto dal virus è debole o inconsistente, verificare la qualità della scorta virale e lo stato di salute della linea cellulare permissiva. Per mantenere l'infecciosità virale, evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento preparando aliquote di virus monouso per ogni esperimento. Infine, si raccomanda vivamente l'uso di una banca cellulare contenente cellule permissive a un numero di passaggi costante per minimizzare la variabilità sperimentale e migliorare la riproducibilità del saggio. Se l'indice cellulare misurato immediatamente prima dell'infezione (tipicamente circa 24 h dopo la semina) risulta inferiore al valore di riferimento stabilito per la linea cellulare permissiva, indicando una salute o crescita cellulare subottimale, l'esperimento deve essere interrotto. In tali casi, si deve scongelare un'ampolla fresca di cellule criopreservate e ripetere il saggio di screening antivirale.

Quando il saggio di screening antivirale viene eseguito in condizioni ben controllate e ottimizzate, come dimostrato dai dati di screening presentati qui, il saggio basato sull'impedenza può quantificare con precisione in tempo reale la riduzione del CPE indotta dagli agenti antivirali. A differenza degli approcci tradizionali che si basano su misurazioni endpoint laboriose, la lettura continua e non invasiva dell'impedenza consente un monitoraggio longitudinale dell'intero spettro dei danni cellulari indotti dal virus e dei profili cinetici delle risposte antivirali. Questa capacità di misurazione in tempo reale facilita l'identificazione delle finestre temporali ottimali per rilevare non solo gli effetti antivirali precoci, ma anche quelli ritardati che potrebbero sfuggire ai saggi endpoint convenzionali.

Inoltre, il protocollo RTCA descritto in questo articolo offre un flusso di lavoro più rapido e notevolmente semplificato per lo screening antivirale rispetto ai metodi tradizionali. Il saggio richiede soltanto un'iniziale fase di semina cellulare, seguita dall'aggiunta del virus in presenza o assenza di agenti antivirali. Non sono necessarie ulteriori manipolazioni né operazioni di elaborazione post-saggio. La configurazione sperimentale e l'analisi dei dati sono ulteriormente ottimizzate dal modulo software specializzato in virologia del sistema, che consente il calcolo automatico di parametri comunemente utilizzati nei saggi di neutralizzazione virale (VRNT), inclusi il %CPE, il % di neutralizzazione e la diluizione più elevata o la concentrazione più bassa di un agente antivirale in grado di raggiungere un livello di neutralizzazione definito dall'utente. Nel complesso, questi vantaggi permettono uno screening rapido e parallelo di un numero molto maggiore di condizioni sperimentali (confronti tra farmaci, diluizioni estese, ecc.) rispetto a quanto generalmente possibile con i metodi tradizionali.

Sebbene il saggio descritto qui sia stato sviluppato in un formato a piastra da 96 pozzetti, con le opportune condizioni di saggio descritte sopra, può essere adattato a un formato a piastra da 384 pozzetti. Per supportare questo saggio basato sull'impedenza ad alto rendimento, può essere impiegato un sistema RTCA automatizzato basato sull'impedenza, che consente l'elaborazione simultanea di fino a quattro piastre da 384 pozzetti.

Oltre allo screening antivirale, questo metodo RTCA può essere applicato a studi di terapia combinata, sierologia e indagini sull'evasione immunitaria virale. Misurando la capacità di anticorpi terapeutici o sieri immuni di prevenire il CPE indotto dal virus, il saggio fornisce una valutazione in tempo reale e senza marcatura dell'attività neutralizzante e delle risposte immunitarie protettive successive a infezione o vaccinazione. Inoltre, il confronto dei profili di neutralizzazione tra varianti virali può rivelare cambiamenti nella suscettibilità associati all'evasione immunitaria. Quando abbinato al sequenziamento genomico, questo approccio potrebbe facilitare l'identificazione di varianti resistenti agli anticorpi e sostenere lo sviluppo di vaccini di nuova generazione, terapie a base di anticorpi e strategie antivirali.

Dichiarazioni

J.E.C. ha svolto attività di consulenza per Moderna e Merck, è fondatore di IDBiologics e riceve royalties da UpToDate. Il laboratorio di J.E.C. ha ricevuto accordi di ricerca sponsorizzata non correlati da IDBiologics durante lo svolgimento dello studio.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni U19 AI181979 e U19AI181930 dell'Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive (NIAID) dei National Institutes of Health degli Stati Uniti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060
Brincidofovir (CMX001)	AdooQ	A13326
CaviCide	Metrex	13-5024	disinfettante
Cidofovir	Selleck	S1516
Mezzo di Eagle Modificato di Dulbecco (DMEM)	ATCC	30-2002
E-Plate 96	Agilent	5232368001	piatto a 96 pozzetti con microelettrodi integrati
Serum fetale bovino	Avantor	97068-085
Ganciclovir Sodio	Selleck	S5065
Cellula HEK293A	Thermo Fisher Scientific	R70507
Multicanale Viaflo	INTEGRA	VIAFLO 96
Soluzione Penicillina-Streptomicina	Gibco	10378016
Soluzione salina tamponata al fosfato (1x)	HyClone	SH30256.01
mAbs ricombinanti	Crowe Lab	N/D
Ribavirina	Selleck	S2504
rVSV-LASV (Lin IV)	Crowe Lab	N/D
Stavudina	Selleck	S1398
Tripsina 0,25% 0,53 mM EDTA (1x)	ATCC	30-2101
Reservatoi reagenti a 12 canali	VistaLab Technologies	3054-1011
Vero CCL-81	ATCC	CCL-81
Modulo di Virologia	Agilent	S2807-90089
Sistema xCELLigence RTCA MP	Agilent	380601040

Riferimenti

Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID₅₀) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

Ristampe e permessi

Tag

Screening basato sull impedenza effetti citopatici monitoraggio in tempo reale monostrati di colture cellulari saggio di infezione virale screening ad alta produttivit efficacia antivirale anticorpi monoclonali vitalit cellulare