Questo studio suggerisce che il dimetilsulfossido (DMSO) potrebbe attenuare l'infiammazione polmonare e la fibrosi indotta da silice nei topi. Analisi trascrittomiche e sperimentali indicano che i suoi effetti protettivi potrebbero coinvolgere la soppressione della via di segnalazione IL-6/STAT3 e la riduzione dell'espressione di MMP12, offrendo potenziali spunti terapeutici per il trattamento della silicosi.
Rapporto rapido
Possibile coinvolgimento dell'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12 negli effetti antifibrotici mediati da DMSO nella silicosi sperimentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio mira a indagare gli effetti antinfiammatori e antifibrotici del dimetilsulfossido (DMSO) in un modello murino di silicosi, esplorandone così il potenziale valore terapeutico.
È stato stabilito un modello murino di silicosi mediante instillazione intranasale, e il trattamento con DMSO è stato somministrato tramite iniezione intraperitoneale. L'esperimento è stato condotto per un periodo di 1 mese. I tessuti polmonari sono stati prelevati da tutti i topi; un sottoinsieme è stato sottoposto ad analisi trascrittomica, e i geni differenzialmente espressi sono stati identificati utilizzando il pacchetto limma. Sono state effettuate analisi di arricchimento per l'ontologia genica (GO) e per la Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) mediante ClusterProfiler per indagare le funzioni geniche e i percorsi associati. I campioni rimanenti sono stati sottoposti a valutazione istopatologica mediante colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e colorazione con tricromia di Masson, mentre è stata eseguita un'analisi mediante Western blot per convalidare i risultati trascrittomici.
Questo studio suggerisce che il DMSO potrebbe attenuare il processo fibrotico nella silicosi modulando l'asse di segnalazione IL-6/STAT3-MMP12. Nel modello murino di silicosi indotta da biossido di silicio, il DMSO ha attenuato la perdita di peso associata alla malattia e ridotto il deposito di collagene. L'analisi trascrittomica ha indicato che il DMSO sopprime l'attività di diversi percorsi correlati alla fibrosi e ha identificato 51 geni chiave, tra cui MMP12, che risultava significativamente downregolato. L'analisi mediante Western blot ha ulteriormente confermato una ridotta espressione di MMP12, accompagnata da livelli notevolmente diminuiti di IL-6 e p-STAT3, suggerendo che il percorso IL-6/STAT3 possa svolgere un ruolo cruciale nel regolare l'espressione di MMP12.
Il DMSO può attenuare le risposte infiammatorie e la fibrosi polmonare nella silicosi inibendo l'attivazione della via di segnalazione IL-6/STAT3, riducendo così l'espressione di MMP12.
Introduzione
La silicosi è una delle principali forme di pneumoconiosi professionale1, caratterizzata da un'infiammazione polmonare persistente e da una fibrosi polmonare irreversibile causate da un'esposizione prolungata alla polvere di silice2,3. La patogenesi di questa silicosi è altamente complessa. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato un'attivazione aberrante dei macrofagi4, la proliferazione eccessiva dei fibroblasti, la transizione epitelio-mesenchimale e il deposito anomalo di componenti della matrice extracellulare (ECM) sono fattori critici nello sviluppo della fibrosi5,6. I meccanismi molecolari alla base del circolo vizioso infiammazione-fibrosi non sono ancora completamente compresi. In particolare, la famiglia delle metalloproteasi della matrice (MMP) svolge un ruolo cruciale nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e nella progressione della fibrosi patologica.7Tra queste, la metalloproteasi della matrice 12 (MMP12), specificamente secreta dai macrofagi, degrada componenti chiave della matrice extracellulare come l'elastina, la fibronectina e il collagene di tipo IV, e svolge un ruolo importante nella patogenesi di malattie fibrotiche, tra cui la malattia polmonare ostruttiva cronica8Studi recenti suggeriscono inoltre che la MMP12 derivata dai macrofagi possa ulteriormente promuovere la fibrosi danneggiando le cellule endoteliali durante il processo di fibrosi polmonare.9.
Il dimetilsolfossido (DMSO), un composto a basso peso molecolare con svariate attività biologiche10, ha dimostrato effetti antinfiammatori in diverse malattie infiammatorie, tra cui la cistite, ed è stato approvato dalla Food and Drug Administration statunitense per il trattamento della cistite interstiziale11. Studi recenti suggeriscono che il DMSO potrebbe rallentare in una certa misura la progressione della fibrosi inibendo il rilascio di fattori infiammatori e riducendo le risposte allo stress ossidativo12. Ricerche condotte da Ingrid Elisia e colleghi hanno riportato che il DMSO inibisce specificamente l'attivazione delle vie di segnalazione ERK1/2, p38 MAPK, JNK e PI3K/Akt nei monociti umani in modelli di sangue intero, esercitando così i suoi effetti antinfiammatori13.
Sebbene si sia dimostrato che la famiglia delle MMP svolge un ruolo fondamentale nel processo di fibrosi della silicosi, nessuno studio ha finora dimostrato in modo conclusivo se il DMSO possa influenzare l'evoluzione patologica della silicosi attraverso la regolazione dell'espressione delle MMP. Pertanto, questo studio rappresenta l'indagine degli effetti antinfiammatori e antifibrotici del DMSO in un modello murino di silicosi, con l'obiettivo di evidenziare la rete genica regolatoria chiave e il meccanismo molecolare dell'intervento con DMSO, fornendo un supporto teorico per strategie terapeutiche innovative basate sulle MMP.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali condotti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico per la Scienza e la Tecnologia dell'Università di Scienza e Tecnologia dell'Anhui (Numero di approvazione: GZ2025-048) e hanno rigorosamente rispettato gli standard nazionali cinesi per il benessere degli animali da laboratorio (GB/T 35892-2018). Figura 1 mostra il disegno dello studio.
Preparazione delle soluzioni
Preparazione della sospensione di silice:
La silice cristallina (SiO₂, 80%, dimensione delle particelle 1–5 µm) è stata sterilizzata mediante autoclave. La polvere sterile di silice è stata quindi dispersa in soluzione salina sterile per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL, e la sospensione è stata accuratamente omogeneizzata utilizzando un omogeneizzatore a ultrasuoni immediatamente prima della somministrazione, al fine di garantire una sospensione uniforme delle particelle.
Preparazione della soluzione di DMSO:
In condizioni asettiche, il DMSO (≥99,9%) è stato diluito con soluzione fisiologica sterile per preparare una soluzione di DMSO al circa 10% (v/v), che è stata omogeneizzata mediante agitazione ultrasonica. A ciascun mouse è stata somministrata la soluzione di DMSO a un dosaggio di 0,9 g/kg, come descritto in precedenza14,15.
Animali sperimentali
Trentadue topi maschi sani della linea C57BL/6J, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono stati utilizzati in questo studio e acclimatati per 1 settimana prima degli esperimenti. I topi sono stati assegnati casualmente a quattro gruppi sperimentali (n = 8 per gruppo) mediante un metodo di randomizzazione generato al computer: gruppi controllo, DMSO, silice e silice+DMSO. La dimensione del campione è stata determinata sulla base di studi precedenti che utilizzavano lo stesso modello murino di silicosi e della nostra esperienza sperimentale preliminare, che indicava come 8 animali per gruppo fossero sufficienti a rilevare differenze istopatologiche e molecolari tra i gruppi. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni standard di laboratorio, con temperatura controllata, ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso a cibo e acqua. Prima dello studio sono stati stabiliti endpoint umani, e nessun animale ha soddisfatto i criteri predeterminati per l'eutanasia precoce.
Stabilimento del modello di silicosi e intervento farmacologico
La silicosi è stata indotta mediante instillazione intranasale singola di 60 µL di sospensione sterile di silice cristallina (10 mg/mL). Dopo l'induzione dell'anestesia, i topi sono stati posizionati in posizione supina. Una volta osservata una respirazione profonda e lenta, 60 µL della sospensione di silice sono stati instillati con cautela goccia a goccia nelle narici, consentendo l'inalazione spontanea della sospensione nei polmoni16. I topi del gruppo trattato con DMSO hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di soluzione di DMSO a dose fissa due volte alla settimana, con un intervallo di 3–4 giorni tra le iniezioni, per un mese consecutivo. I topi negli altri gruppi sono stati trattati in modo identico con un volume equivalente di soluzione salina sterile. È stato effettuato un monitoraggio giornaliero del peso corporeo per tutta la durata dell'esperimento. Al trentesimo giorno dopo la modellizzazione, tutti i topi sono stati soppressi e i tessuti polmonari sono stati raccolti in condizioni sterili. La soppressione è stata eseguita mediante dislocazione cervicale dopo somministrazione intraperitoneale di tribromoetanolo (0,2 mL/10 g) per indurre l'anestesia. Porzioni di tessuto polmonare sono state conservate in azoto liquido per il sequenziamento del trascrittoma. Una parte dei tessuti è stata fissata in paraformaldeide al 4% per 48 h prima della colorazione istopatologica, mentre i tessuti rimanenti sono stati conservati a -80 °C per successivi esperimenti molecolari. Tutte le procedure sugli animali hanno rispettato le linee guida istituzionali per l'etica animale.
La valutazione istopatologica, compreso il punteggio di fibrosi di Ashcroft, è stata eseguita indipendentemente da due ricercatori a conoscenza cieca dell'assegnazione al gruppo sperimentale.
Esame patologico polmonare
I tessuti polmonari fissati sono stati disidratati, resi trasparenti e inclusi in blocchi di paraffina, quindi tagliati in sezioni spesse 5 µm.
colorazione con ematossilina ed eosina (HE): i campioni sono stati colorati con ematossilina per 3–5 minuti, differenziati in soluzione acida, bluati sotto acqua corrente e controstainati con eosina per 5 minuti. Dopo la disidratazione mediante etanolo a gradazione crescente, i campioni sono stati chiarificati nello xilene e sigillati con resina neutra17.
Colorazione con tricromia di Masson: le sezioni sono state colorate in sequenza con ematossilina, Rosso Lichene–fucsina acida, acido fosfomolibdico e Verde Brillante. Dopo la differenziazione acida, le sezioni sono state disidratate, chiarite in xilene e montate con resina neutra18,19.
Sequenziamento del trascrittoma
I tessuti polmonari di topo dei quattro gruppi sperimentali sono stati raccolti immediatamente dopo l'eutanasia e congelati rapidamente in azoto liquido. L'RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol seguendo le istruzioni del produttore. Sono state valutate la concentrazione e la purezza dell'RNA, e l'integrità dell'RNA è stata analizzata mediante un Bioanalyzer con software integrato. I campioni con valori di RIN superiori a 8,0 sono stati considerati accettabili. La preparazione delle librerie ha incluso l'arricchimento di mRNA poli(A) mediante perline Oligo(dT), frammentazione dell'RNA, sintesi di cDNA, ligazione degli adattatori e amplificazione mediante PCR. Il sequenziamento è stato eseguito su una piattaforma Illumina, generando circa 6,2–6,4 Gb di dati puliti per campione. Tutti i dati grezzi di sequenziamento generati in questo studio sono stati depositati nel database Gene Expression Omnibus (GEO) con numero di accesso GSE311671.
Le letture pulite sono state allineate al genoma di riferimento di Mus musculus (mm8) utilizzando l'allineatore STAR. I livelli di espressione genica sono stati quantificati come conteggi grezzi di letture. L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita utilizzando il pacchetto limma in R. Prima della modellizzazione lineare, i dati grezzi dei conteggi sono stati trasformati mediante la funzione voom per stimare la relazione tra media e varianza e generare pesi di precisione. I valori P grezzi sono stati corretti per i test multipli utilizzando il metodo di Benjamini-Hochberg (BH), e i geni con |log₂FoldChange| > 1,5 e tasso di falsa scoperta (FDR) < 0,05 sono stati considerati differenzialmente espressi. Le analisi di arricchimento funzionale sono state eseguite utilizzando il pacchetto clusterProfiler in R. L'analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) è stata condotta per identificare categorie significativamente arricchite nei processi biologici (BP), componenti cellulari (CC) e funzioni molecolari (MF), mentre l'analisi di arricchimento dei percorsi metabolici del Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) è stata effettuata per identificare i percorsi di segnalazione significativamente arricchiti. Il significato dell'arricchimento è stato valutato mediante un test ipergeometrico, e i valori P sono stati corretti per confronti multipli utilizzando il metodo di Benjamini-Hochberg. I termini GO e i percorsi KEGG con un valore P aggiustato (padj) < 0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti20,21,22,23.
Rilevamento mediante Western blot
Il tessuto polmonare fresco di topo è stato raccolto e omogeneizzato con un volume appropriato di buffer di lisi RIPA (radioimmunoprecipitation assay). Dopo la centrifugazione, è stato raccolto il sopranatante e la concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit per saggio proteico BCA. I campioni sono stati quindi mescolati con buffer di caricamento e riscaldati a 100 °C per 10 min. La separazione delle proteine è stata eseguita su gel di elettroforesi in poliacrilamide contenenti dodecilsolfato di sodio al 10% (SDS-PAGE) a una corrente di 200 V per 30 min. Successivamente, le proteine sono state trasferite elettroforeticamente su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) con una corrente costante di 300 mA per 30 min. La membrana è stata bloccata con latte scremato al 5%, quindi incubata tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) e MMP12 (1:800). Il giorno seguente, la membrana è stata lavata con TBST e incubata con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 h, seguito da ulteriori lavaggi con TBST. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente e la quantificazione proteica è stata effettuata mediante software ImageJ.
L'analisi mediante Western blot è stata eseguita utilizzando tre replicati biologici indipendenti per ciascun gruppo sperimentale. I campioni proteici sono stati preparati da tessuti polmonari di singoli topi, e ciascun replicato biologico rappresentava un animale indipendente.
Analisi statistica
Tutti i dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism 9.5. Prima dell'analisi, sono stati eseguiti test di normalità e di omogeneità della varianza. Per il confronto tra due gruppi è stato utilizzato il test t di Student, mentre per il confronto multiplo tra gruppi è stata adottata l'analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) combinata con il test post-hoc di Tukey. Un valore di P ≤ 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
DMSO allevia la fibrosi polmonare indotta da silice nei topi (Figura 2)
Per valutare gli effetti del DMSO sui processi patologici e sulle alterazioni del tessuto polmonare in un modello di silicosi, sono stati costituiti quattro gruppi sperimentali (Figura 2A). Le variazioni del peso corporeo sono state monitorate per un periodo di 1 mese.
I risultati hanno dimostrato che i topi nel gruppo Silicosi hanno mostrato un declino continuo del peso corporeo, mentre il gruppo Silice+DMSO ha evidenziato una perdita di peso iniziale seguita da un recupero dopo l'intervento con DMSO (Figura 2F). Dopo 30 giorni di esposizione alla silice, i tessuti polmonari sono stati raccolti e valutati per le alterazioni infiammatorie e fibrotiche mediante colorazione con ematossilina-eosina (Figura 2B) e colorazione con tricromio di Masson (Figura 2C). La fibrosi polmonare è stata valutata su sezioni colorate con ematossilina-eosina utilizzando il metodo di Ashcroft24, che ha rivelato un punteggio di fibrosi inferiore nel gruppo Silice+DMSO rispetto al gruppo Silice (Figura 2D). La colorazione di Masson ha ulteriormente indicato che il deposito di fibre collagene nel gruppo Silice era esteso e denso, occupando circa il 40% dell'area del tessuto polmonare, valore superiore al 10% osservato nel gruppo di controllo (Figura 2E), suggerendo che l'esposizione alla silice induce una fibrosi polmonare grave. Al contrario, il deposito di collagene nel gruppo Silice+DMSO si è ridotto al 20%, indicando che il DMSO potrebbe attenuare la fibrosi polmonare indotta dalla silice inibendo l'accumulo eccessivo di collagene.
L'analisi del trascrittoma identifica geni differenzialmente espressi associati al trattamento con DMSO in topi esposti alla silice
Per studiare gli effetti antinfiammatori e antifibrotici del dimetilsulfossido (DMSO) in un modello di silicosi, è stata eseguita una sequenza trascrittomica su campioni di tessuto polmonare prelevati da topi sperimentali (Figura 3). I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati utilizzando l'algoritmo limma, con criteri di selezione definiti come |log2(variazione di espressione)| > 1,5 e un valore P corretto (tasso di falsa scoperta [FDR]) < 0,05.
L'analisi del trascrittoma ha dimostrato che, rispetto al gruppo di controllo, il gruppo Silica ha mostrato 132 geni espressi in modo significativamente differenziale (Figura 3A), di cui 117 sovraespressi e 15 sottoregolati. In particolare, geni come Saa3 e MMP12 sono risultati marcatamente sovraespressi. Questo profilo di espressione è stato ulteriormente confermato dall'analisi gerarchica della mappa termica (Figura 3C), che ha evidenziato profili di espressione genica coerenti tra i singoli campioni.
Nel confronto tra i gruppi Silica+DMSO e Silica, sono stati identificati complessivamente 3.054 geni espressi in modo significativamente differenziale (Figura 3B), di cui 1.399 sovraespressi e 1.655 sottoregolati. La mappa termica corrispondente (Figura 3D) ha rivelato sostanziali alterazioni trascrittomiche dopo il trattamento con DMSO, con una marcata sottoregolazione di geni come Lcn2 e MMP12. In particolare, geni chiave sovraespressi nel gruppo Silica, come MMP12, Saa3 e Spp1, hanno mostrato un evidente sottoregolazione nel gruppo Silica+DMSO. Questi risultati suggeriscono che il DMSO potrebbe attenuare la patologia correlata alla silicosi inibendo l'espressione di mediatori pro-infiammatori e pro-fibrotici.
L'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12 potrebbe essere coinvolto negli effetti protettivi del DMSO nella fibrosi polmonare indotta da silice
Per studiare le relazioni tra geni diversamente espressi (DEG), è stata costruita una rete di interazione genica basata sui dati trascrittomici (Figura 4A). MMP12 sembrava occupare una posizione centrale all'interno della rete. Per analizzare ulteriormente le potenziali associazioni a livello proteico, è stata generata una rete predetta di interazioni proteina-proteina (PPI) utilizzando il database STRING (Figura 4B). L'analisi STRING ha suggerito possibili associazioni funzionali tra MMP12 e diversi DEG chiave, tra cui IL-6, STAT3, SPP1 e MMP19. Poiché STRING integra prove provenienti da diverse fonti, queste associazioni rappresentano relazioni funzionali predette.
È stata eseguita un'analisi di Western blot per quantificare i livelli di espressione proteica di IL-6, STAT3, p-STAT3 e MMP12 (Figura 4C–F). I risultati hanno mostrato che, rispetto al gruppo Controllo, i livelli di espressione proteica di IL-6 e p-STAT3 erano significativamente aumentati nel gruppo Silice, e l'espressione proteica di MMP12 mostrava una tendenza all'aumento. Dopo il trattamento con DMSO, i livelli di espressione di queste tre proteine sono risultati significativamente ridotti. In particolare, l'espressione proteica totale di STAT3 è rimasta relativamente costante in tutti i gruppi sperimentali.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati grezzi di sequenziamento generati in questo studio sono stati depositati nel database Gene Expression Omnibus (GEO) con il numero di accessione GSE311671. Le immagini grezze dello studio sono disponibili in una cartella supplementare (File Supplementare 1).
Figura 1: Schema del disegno dello studio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il DMSO attenua la fibrosi polmonare nei topi con silicosi. (A) Diagramma schematizzato del disegno sperimentale. Frecce di colori diversi rappresentano diversi regimi di somministrazione. (B) Colorazione con ematossilina ed eosina del tessuto polmonare. Con un ingrandimento di 200×, la barra della scala è di 50 µm; con un ingrandimento di 400×, la barra della scala è di 20 µm. (C) Colorazione di Masson del tessuto polmonare (blu: fibre collagene; rosso: fibre muscolari). Con un ingrandimento di 200×, la barra della scala è di 50 µm; con un ingrandimento di 400×, la barra della scala è di 20 µm. (D) Punteggi di fibrosi dei diversi gruppi basati sui risultati della colorazione ematossilina-eosina. n = 8, P ≤ 0.0001. (E) Area relativa di collagene nella colorazione di Masson nel tessuto polmonare dei diversi gruppi. n = 8, P ≤ 0.0001. (F) Variazioni del peso corporeo dei topi entro 30 giorni. I dati sono espressi come media ± SEM. Il confronto di più gruppi di dati è stato effettuato mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), e i test post hoc sono stati eseguiti utilizzando il metodo di Tukey. n = 8, P(tempo) ≤ 0.0001, P(gruppo) ≤ 0.0001. N: gruppo controllo; S: gruppo silice; SD: gruppo silice + DMSO; D: gruppo DMSO. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Il sequenziamento del trascrittoma rivela la regolazione genica mediata dal DMSO nell'attenuazione della silicosi. (A,B) Diagramma a vulcano dei geni differenzialmente espressi tra il gruppo Silice (S) e il gruppo Controllo (N), e tra il gruppo Silice + DMSO (SD) e il gruppo Silice (S). (C,D) Mappa termica del gruppo Silice (S) confrontato con il gruppo Controllo (N), e del gruppo Silice + DMSO (SD) confrontato con il gruppo Silice (S). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Il DMSO riduce l'espressione proteica di IL-6 e STAT3. (A) Diagramma della rete dei geni espressi in modo significativamente differenziale. (B) Diagramma dell'interazione della rete STRING per MMP12 e geni correlati. (C–F) Analisi Western blot dell'espressione proteica di β-Actin, IL-6, MMP12, STAT3 e p-STAT3. Analisi dei valori di densità (gray value) di β-Actin, IL-6 (*P = 0.0257, *P = 0.0195), MMP12 (**P = 0.0013, *P = 0.0318), STAT3 (P = 0.3205, P = 0.2347) e p-STAT3 (*P = 0.0123, **P = 0.0096) mediante Western blotting. L'analisi di immunoblotting è stata eseguita in triplicato (n = 3). N: gruppo controllo; S: gruppo silice; SD: gruppo silice + DMSO; D: gruppo DMSO. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Dati grezzi di questo studio.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
La silicosi rimane una delle malattie polmonari professionali più gravi a livello mondiale, caratterizzata da un'infiammazione persistente e da una fibrosi polmonare progressiva, che compromettono in modo significativo la funzionalità polmonare e la qualità della vita del paziente25. In questo studio, utilizzando un modello murino indotto da silice, esaminiamo sistematicamente gli effetti protettivi potenziali del dimetilsulfossido (DMSO) durante la fase iniziale. I risultati ottenuti indicano che il trattamento con DMSO attenua l'infiltrazione di cellule infiammatorie e riduce le alterazioni patologiche fibrotiche, suggerendo che il DMSO possa svolgere un ruolo modulatore nelle fasi iniziali della silicosi. Studi sperimentali precedenti hanno dimostrato che il DMSO esercita effetti protettivi contro la fibrosi polmonare sia nei ratti che nei topi. Haschek et al. hanno riportato che il DMSO attenua le alterazioni fibrotiche polmonari nei modelli animali sperimentali, sebbene i meccanismi molecolari sottostanti non fossero chiari26. In linea con questi risultati, le nostre analisi trascrittomiche ed espressive delle proteine suggeriscono ulteriormente che il DMSO possa alleviare la fibrosi polmonare indotta dalla silice attraverso la modulazione di vie di segnalazione infiammatoria, fornendo così ulteriori approfondimenti meccanicistici sulla sua attività antifibrotica potenziale.
Il DMSO, un solvente polare aprotico con elevata permeabilità tissutale27, possiede proprietà antinfiammatorie ed analgesiche ben documentate ed è stato utilizzato in diverse patologie correlate all'infiammazione, tra cui cistite interstiziale, artrite reumatoide e artrosi28,29,30. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che il DMSO attenua la fibrosi polmonare e il danno polmonare in modelli animali sperimentali, suggerendo che possa esercitare effetti protettivi contro le malattie polmonari fibrotiche, probabilmente grazie alle sue proprietà antinfiammatorie e antiossidanti26. A livello molecolare, si è riportato che il DMSO inibisce le vie di segnalazione NF-κB e MAPK, portando a una ridotta espressione di IL-6 in macrofagi RAW264.7 stimolati con LPS31. È importante notare che dosi elevate di DMSO possono causare tossicità sistemica, con danni multiorgano osservati a dosi superiori a 8 g/kg14; pertanto, è stato adottato un protocollo di somministrazione ripetuta a basso dosaggio per ottimizzare gli effetti terapeutici e minimizzare la tossicità.
Integrando analisi trascrittomica e istopatologica, abbiamo osservato che il trattamento con DMSO attenua l'infiammazione e la fibrosi polmonare nei topi esposti alla silice, accompagnato da una downregolazione dell'espressione di IL-6. Il profilo trascrittomica ha inoltre indicato una riduzione dell'espressione di MMP12 in seguito al trattamento con DMSO. MMP12, secreta principalmente dai macrofagi32, è implicata nella progressione fibrotica della silicosi, della BPCO e del danno polmonare indotto da bleomicina, attraverso la regolazione di vie pro-fibrotiche come TGF-β1, EGR1 e CYR6133,34,35. Nello studio attuale, la downregolazione osservata di MMP12 suggerisce il suo potenziale coinvolgimento negli effetti anti-infiammatori e anti-fibrotici associati al trattamento con DMSO. In particolare, MMP12 facilita la degradazione dei depositi eccessivi di matrice extracellulare durante la risoluzione della fibrosi, promuovendo così il rimodellamento del tessuto e la rimozione delle cicatrici36.
I macrofagi sono elementi chiave nella produzione di citochine pro-infiammatorie nella silicosi indotta da silice37. I macrofagi attivati secernono IL-6 e TNF-α, che contribuiscono all'infiammazione e alla fibrosi38. L'IL-6 si lega al complesso recettoriale gp130 attivando la via JAK–STAT, in particolare STAT3, influenzando così il fenotipo dei macrofagi e promuovendo processi pro-fibrotici39,40,41,42. In questo studio, il trattamento con DMSO ha ridotto in modo significativo i livelli di espressione di IL-6, STAT3 e MMP12, indicando che il DMSO potrebbe modulare l'asse IL-6/STAT3 e ridurre indirettamente l'espressione di MMP12. Studi precedenti hanno dimostrato che l'asse IL-6–STAT3 svolge un ruolo regolatorio centrale in diversi modelli di fibrosi polmonare e che la sua attivazione prolungata è strettamente associata alla gravità della fibrosi e al decorso della malattia43,44. STAT3 è stato proposto come un importante centro di segnalazione che collega le risposte infiammatorie al rimodellamento fibrotico, e la sua attivazione potrebbe regolare MMP12, aumentandone l'attività trascrizionale45. Inoltre, la segnalazione di STAT3 è coinvolta nella polarizzazione dei macrofagi, inducendo la transizione dai macrofagi con fenotipo pro-infiammatorio M1 a quelli con fenotipo pro-fibrotico M246,47, mentre i macrofagi M2 rappresentano una delle principali fonti cellulari di MMP1248. Pertanto, la contemporanea riduzione dell'espressione di STAT3 e MMP12 osservata nel presente studio suggerisce che il DMSO potrebbe diminuire l'espressione di MMP12, almeno in parte, attraverso la modulazione della segnalazione di STAT3. Tuttavia, va precisato che lo studio attuale è stato progettato principalmente per identificare potenziali meccanismi molecolari basandosi su un profilo trascrittomico combinato con una validazione in vivo. Sebbene le variazioni coordinate di IL-6, STAT3 e MMP12 supportino il coinvolgimento dell'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12 negli effetti anti-fibrotici del DMSO, le evidenze attuali non dimostrano una relazione causale diretta tra l'attivazione di STAT3 e la regolazione di MMP12. Sono pertanto necessari ulteriori studi meccanicistici per chiarire meglio le interazioni regolatorie dirette all'interno di questa via di segnalazione.
Questo studio presenta diversi limiti. Innanzitutto, le conclusioni si basano su un profilo trascrittomico combinato ad analisi istopatologiche ed espressione proteica in un modello murino di silicosi. Sebbene questi risultati supportino il coinvolgimento dell'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12, non stabiliscono una relazione causale diretta tra l'attivazione di STAT3 e la regolazione di MMP12. In secondo luogo, non è stata effettuata una validazione meccanicistica, inclusi studi in vitro su macrofagi ed esperimenti di recupero mediante manipolazione genetica o farmacologica della via IL-6/STAT3 e di MMP12. Inoltre, non è stato incluso alcun controllo positivo antifibrotico, il che limita il confronto diretto tra DMSO e terapie consolidate. Studi futuri che includano una validazione meccanicistica e farmaci antifibrotici clinicamente rilevanti, come la pirfenidone o il nintedanib, chiariranno ulteriormente il meccanismo molecolare e il potenziale terapeutico del DMSO nella silicosi.
In conclusione, i risultati suggeriscono che il DMSO attenua l'infiammazione e la fibrosi mediate dai macrofagi nella silicosi indotta da silice, probabilmente modulando l'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12. Questi risultati forniscono evidenze preliminari a sostegno del possibile coinvolgimento dell'asse di segnalazione IL-6/STAT3/MMP12 negli effetti antifibrotici del DMSO e indicano MMP12 come un potenziale bersaglio molecolare per future indagini.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano sinceramente la piattaforma della Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. e i professori Deyong Ge e Lei Xu per il supporto tecnico.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| SDS-PAGE al 10% | Servicebio | G2177 | |
| Kit per saggio proteico BCA | Servicebio | G2026 | |
| Topi C57BL/6J | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Silice cristallina | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| buffer di caricamento | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| buffer di lisi RIPA | Servicebio | G2002 | |
| anticorpo secondario | Servicebio | GB23303 | |
| latte scremato | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actina | Servicebio | GB11001 |
Riferimenti
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