Articolo metodologico

Modello murino di co-colonizzazione vaginale da Candida albicans e Streptococcus agalactiae

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DOI:

10.3791/72557

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21 agosto 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per co-colonizzare per via vaginale i topi con Candida albicans e Streptococcus agalactiae. Può essere utilizzato per studiare le interazioni polimicrobiche, le interazioni ospite-microbo e le risposte dell'ospite a questi organismi.

Abstract

Diversi microrganismi sono stati isolati dal tratto vaginale umano, e molti degli organismi che colonizzano questa nicchia possono passare da uno stile di vita commensale a uno patogeno. Fattori come la composizione della comunità microbica e l'ambiente dell'ospite influenzano gli esiti della malattia; tuttavia, i meccanismi che determinano tali esiti non sono ancora ben compresi. In questo manoscritto, descriviamo un modello murino per studiare le interazioni interregno e la risposta dell'ospite a Candida albicans e Streptococcus agalactiae (Gruppo B Streptococcus, GBS), patobionti che colonizzano il tratto genitale femminile (FGT). Evidenze emergenti suggeriscono che C. albicans la colonizzazione rappresenta un fattore di rischio per il porteggio di GBS a causa della loro frequente co-isolazione. Durante la gravidanza, la colonizzazione da GBS può portare a esiti avversi inclusa la corioamnionite e la morte fetale. Il GBS può essere trasmesso anche a un feto in utero o a un neonato durante il parto e rappresenta una causa preminente di meningite neonatale. La colonizzazione del tratto vaginale è un precursore fondamentale della malattia da GBS, e questo nicchia esercita numerose pressioni selettive, alcune delle quali potrebbero essere influenzate da C. albicans colonizzazione. Questo protocollo descrive un modello di infezione contemporanea C. albicans- Co-colonizzazione vaginale da GBS mediante trattamento antibiotico e una singola dose di 17β-estradiolo per stabilire C. albicans colonizzazione, seguita dalla rimozione degli antibiotici e dall'inoculazione con GBS. Il carico microbico nel lume vaginale viene quantificato nel corso dell'esperimento mediante lavaggio, mentre il carico microbico nell'intero tratto genitale femminile viene quantificato mediante dissezione, omogeneizzazione e semina di vagina, cervice e utero. Questo metodo permetterà di indagare i meccanismi attraverso cui le interazioni polimicrobiche dirette e indirette influenzano lo stile di vita e la patogenesi di questi due organismi, nonché il paesaggio immunitario dell'ospite nel tratto genitale femminile.

Introduzione

Streptococcus agalactiae (Streptococcus di gruppo B, GBS) è un patobionte batterico Gram-positivo che colonizza diversi siti polimicrobici, inclusi il tratto gastrointestinale e quello vaginale. Mentre la colonizzazione vaginale è tipicamente asintomatica, durante la gravidanza il GBS può risalire dal tratto vaginale fino all'utero e attraversare membrane integre, causando infezione del liquido amniotico e della placenta. Pertanto, rappresenta un fattore di rischio primario per esiti avversi della gravidanza, infezioni fetali e malattie neonatali1,2. Essendo una delle principali cause di infezione invasiva nei neonati, è fondamentale caratterizzare i fattori che influenzano il rischio di trasmissione e infezione. La profilassi antibiotica intraparto può ridurre la trasmissione verticale e la malattia da GBS a insorgenza precoce nei neonati3,4; tuttavia, è stata associata a un aumento dei tassi di resistenza agli antibiotici e a potenziali effetti a lungo termine legati all'amministrazione prenatale o nell'infanzia precoce5,6,7,8. Tali fattori rendono necessario lo sviluppo di interventi preventivi e terapeutici più mirati.

Evidenze emergenti hanno dimostrato che la composizione del microbioma e le interazioni polimicrobiche influenzano l'omeostasi e la probabilità di sviluppare malattie9. Il predominio di GBS nel microbioma vaginale umano è stato associato a una riduzione dell'abbondanza di Lactobacillus, e sono state osservate interazioni specifiche a livello di specie e di ceppo che possono avere effetti diversi sulla colonizzazione in vitro e in vivo10,11. In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato un modello murino di colonizzazione vaginale da GBS per studiare i correlati dell'ospite e batterici dell'idoneità del GBS12. Questo approccio prevede il trattamento dei topi con una singola dose di 17β-estradiolo, seguito dall'inoculazione intravaginale con GBS il giorno successivo. Questo modello è stato utilizzato per caratterizzare l'importanza delle proteine di superficie del GBS, delle reti di segnalazione regolatorie e della secrezione di tossine nel mantenimento della colonizzazione e nell'invasione dei tessuti del tratto genitale femminile. Inoltre, abbiamo scoperto che il GBS mostra interazioni complesse con altri batteri nel tratto vaginale, inclusi Akkermansia muciniphila e Enterococcus faecalis13,14,15, dimostrando come lo stile di vita e la persistenza del GBS siano influenzati dalla presenza di microrganismi vicini.

Sebbene questo modello esistente sia stato adattato per lo studio delle interazioni interbatteriche, sono state necessarie ulteriori modifiche per studiare altri microrganismi. I funghi rappresentano una componente poco studiata del microbioma vaginale e, grazie al modello qui presentato, abbiamo cercato di sviluppare uno strumento per analizzare la colonizzazione fungina insieme alle interazioni fungo-batteriche in vivo. Il fungo più comunemente isolato dal tratto vaginale umano è Candida albicans, che colonizza oltre il 70% degli individui16. C. albicans è polimorfo e può subire morfogenesi, passando tra forme lievitate e forme filamentose. La filamentazione è associata a un repertorio distinto di espressione genica17,18. Alcuni di questi geni specifici per l'ifa sono stati recentemente segnalati come responsabili di un vantaggio in termini di fitness nel contesto della colonizzazione polimicrobica19,20,21.

Diversi studi hanno riportato l'isolamento concomitante di C. albicans e GBS in tamponi vaginali umani, e il nostro gruppo di ricerca ha recentemente scoperto che gli individui colonizzati da C. albicans presentano tassi significativamente più elevati di colonizzazione da GBS22. Abbiamo sviluppato un in vivo sistema per lo studio delle interazioni tripartite tra funghi commensali, batteri e l'ospite. Gli studi sui funghi nei topi convenzionali richiedono tipicamente un trattamento antibiotico per superare la resistenza alla colonizzazione mediata dai batteri e stabilire una colonizzazione persistente23. Per ottenere questo senza compromettere la capacità di GBS di colonizzare, trattiamo i topi con un cocktail antibiotico e li inoculiamo con C. albicans, e dopo che il colonizzazione è stabilita, rimuoviamo l'esposizione all'antibiotico per consentire al GBS di colonizzare successivamente. Questo è stato ottimizzato in modo che entrambi C. albicans e GBS colonizzano il tratto vaginale con cariche simili e su tempistiche analoghe, permettendo interazioni dirette all'interno del tratto vaginale. Questo protocollo descrive un metodo per pretrattare i topi con antibiotici, somministrare 17β-estradiolo, stabilire la colonizzazione sia da funghi che da batteri e raccogliere campioni di lavaggio e di tessuto per analisi successive.

Protocollo

I lavori sugli animali presentati in questo manoscritto sono stati approvati e condotti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Colorado Anschutz secondo il protocollo n. 00316. Nella cronologia riportata di seguito, il giorno 0 indica il giorno dell'inoculazione con S. agalactiae.

1. Somministrare antibiotici prima dell'inoculazione.

  1. Preparare una soluzione concentrata di 50 mg/mL ciascuna di ampicillina, neomicina e gentamicina disciolta nell'acqua potabile per topi. Sterilizzare la soluzione antibiotica mediante un filtro da 0,22 µm.
  2. Aggiungere la soluzione antibiotica all'acqua potabile per topi in una diluizione 1:100, aggiungendo 1 mL di soluzione ogni 99 g di acqua.
  3. Dopo 7 giorni, sostituire l'acqua ripetendo i passaggi 1.1 e 1.2.
  4. Mantenere gli antibiotici per almeno 7–10 giorni prima di iniziare l'esperimento, senza superare complessivamente 14 giorni di trattamento antibiotico.

2. Sincronizzare i cicli estrali del topo (giorno -3).

  1. Aggiungere 0,5 mg per topo di 17β-estradiolo, più un piccolo eccesso per compensare l'adesione della sospensione alle pareti dei tubi, in un tubo conico sterile da 50 mL. Chiudere ermeticamente il tubo conico e vorticare brevemente per rompere gli agglomerati.
    ATTENZIONE: Poiché il 17β-estradiolo può penetrare nell'organismo attraverso il contatto dermico o mucoso, manipolare questo reagente con attenzione e utilizzare idonei dispositivi di protezione individuale.
  2. Utilizzare un filtro da 0,45 µm per sterilizzare 100 µL di olio di sesamo per ogni 0,5 mg di 17β-estradiolo direttamente nel tubo conico contenente il 17β-estradiolo. La concentrazione è di 5 mg/mL. Chiudere ermeticamente e vorticare la soluzione accuratamente per ottenere una sospensione omogenea.
  3. Preparare siringhe sterili da 1 mL (una per topo) arretrando lo stantuffo fino al segno di 0,15 mL e posizionandole con lo stantuffo rivolto verso il basso e la punta a bloccaggio luer rivolta verso l'alto.
  4. Aspirare la sospensione di 17β-estradiolo in una nuova siringa sterile da 10 mL munita di ago sterile da 18G, 1,5”, e utilizzarla per riempire le siringhe da 1 mL preparate con 100 µL di sospensione.
  5. Applicare su ciascuna siringa da 1 mL un ago sterile da 26G, 0,5”.
  6. Preparare una sospensione di 100 µL di olio di sesamo contenente 0,5 mg di 17β-estradiolo ed eseguire un'iniezione intraperitoneale per ogni topo un giorno prima dell'inoculazione con C. albicans.

3. Inoculare i topi con C. albicans (giorno -2).

  1. Un giorno prima dell'inoculo (lo stesso giorno dell'amministrazione di 17β-estradiolo), coltivare una cultura notturna di 5 mL di C. albicans in brodo Yeast Peptone Dextrose in un incubatore a 30 °C agitato a 250 rpm.
  2. Nel giorno dell'inoculo, trasferire un'aliquote della cultura notturna in una provetta sterile per microcentrifuga e centrifugare a ≤10.000 × g per 7–8 s o fino alla formazione di un pellet.
  3. Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS).
  4. Utilizzare un emocitometro per calcolare la concentrazione della sospensione.
  5. Trasferire un'aliquote della sospensione in una nuova provetta sterile per microcentrifuga, ricentrifugare e risospendere in PBS sterile fresco per raggiungere una concentrazione finale di 109 cellule di C. albicans/mL in un volume finale di almeno 10 µL per topo. Ad esempio, se la concentrazione è di 2 × 108 cellule/mL e si hanno 10 topi, pellettare 500 µL e risospendere in 100 µL.
  6. Inoculare ogni topo per via intravaginale con 10 µL di C. albicans sospeso in PBS alla concentrazione di 109 cellule/mL (107 cellule/topo).
    1. Trattenere ogni topo afferrando la pelle sulla nuca tra il pollice e l'indice della mano non dominante, quindi ruotare il polso in modo che la schiena del topo poggia sul palmo della mano. Utilizzare l'anulare e il mignolo per immobilizzare la coda.
    2. Aspirare 10 µL della sospensione di C. albicans in una punta sterile per pipetta. Inserire la punta per circa 5–10 mm all'interno della cavità vaginale, regolando la profondità in base all'anatomia del topo.
    3. Rilasciare l'inoculo di C. albicans nella vagina ed estrarre la punta della pipetta.
    4. Dopo aver rilasciato la presa sulla nuca, tenere il topo per la coda in modo da sollevare le zampe posteriori. Far camminare il topo sulle due zampe anteriori per circa 1 minuto o fino a quando l'inoculo di C. albicans non è più visibile.

4. Sostituire l'acqua da bere (giorno -1).

  1. Un giorno dopo l'inoculo di C. albicans, che coincide con il giorno precedente all'inoculo di S. agalactiae, trasferire i topi in gabbie pulite.
  2. Assicurarsi che i topi ricevano acqua fresca senza antibiotici.

5. Quantificare il carico di C. albicans nella luce vaginale (giorno -1).

  1. Al giorno -1, preparare un tubo sterile per microcentrifuga e 100 µL di PBS sterile per ogni topo.
  2. Trattenere ogni topo come descritto al punto 3.6.1.
  3. Aspirare 50 µL di PBS in una punta sterile per pipetta. Inserire la punta approssimativamente da 1 a 5 mm nel lume vaginale ed eseguire un'aspirazione e un rilascio del volume totale di PBS da 3 a 5 volte. Rilasciare il PBS in un tubo sterile per microcentrifuga.
  4. Ripetere il passaggio 5.3 per ottenere un volume totale di 100 µL di liquido di lavaggio.
  5. Vortexare il tubo per microcentrifuga, quindi effettuare diluizioni seriali decimali fino a una diluizione 1:10.000 in PBS sterile.
  6. Piastrare 10 µL delle sospensioni diluite e 25 µL del liquido di lavaggio non diluito su piastre di agar cromogenico selettivo per Candida.
  7. Incubare le piastre a 30 °C per 48 h. Le colonie di C. albicans appariranno lisce e di colore turchese o verde.

6. Inoculare i topi con S. agalactiae (giorno 0).

  1. Un giorno prima dell'inoculazione (lo stesso giorno della sostituzione dell'acqua da bere), coltivare una cultura notturna di 3 mL di S. agalactiae in brodo Todd Hewitt (THB) in condizioni statiche a 37 °incubatrice C
  2. Il giorno dell'inoculo, diluire la coltura ottenuta in coltivazione notturna 1:10 in 4 mL di THB e incubare in condizioni statiche a 37 °incubatore C fino a quando non raggiunge la fase esponenziale media (densità ottica a 600 nm [OD600] di 0,4–0,5 in circa 1,5–2 h.
  3. Trasferire la coltura in fase esponenziale in un tubo conico sterile da 15 mL e centrifugare a 3.000 × g per 5 min o fino alla formazione di un pellet.
  4. Rimuovere il soprannatante per aspirazione, quindi sospendere il pellet in 300 µL di PBS sterile.
  5. Utilizzare il pellet risospeso per preparare almeno 100 µL di S. agalactiae sospensione per topo, più ulteriori 500 µL, in PBS sterile a OD600 0,4 (circa 108 unità formanti colonie [UFC]/mL; ≥1,5 mL totali per 10 topi
    NOTA: Alcuni S. agalactiae i ceppi possono differire nel loro OD600-rapporto da a UFC/mL. Determinare quale OD600 corrisponde a 108 CFU/mL in anticipo.
  6. Trasferire la sospensione in un nuovo tubo conico sterile da 15 mL e centrifugare a 3.000 × g per 5 min o fino alla formazione di un pellet.
  7. Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 1/10th del volume iniziale di PBS sterile (se è stato centrifugato 1,5 mL della sospensione, risospendere in 150) µL). Questa sospensione sarà a 109 CFU/mL e fungono da inocolo batterico.
  8. Diluire in serie e piastrare 50 µL dell'inoculo su agar Todd Hewitt, quindi incubare le piastre a 37 °C per 24 h per determinare la concentrazione esatta dell'inoculo.
  9. Inoculare intravaginalmente ogni topo con 10 µL di S. agalactiae sospeso in PBS a 109 CFU/mL (107 CFU/topo) utilizzando la stessa tecnica descritta nei passaggi 3.6.1–3.6.4.

7. Quantificare i carichi di C. albicans e S. agalactiae nella luce vaginale (a partire dal giorno +1).

  1. A partire da un giorno dopo l'inoculazione di S. agalactiae, raccogliere 100 µL di liquido di lavaggio vaginale e diluirlo in serie utilizzando la stessa tecnica descritta nei passaggi 5.1–5.5.
  2. Piastrare in duplicato 10 µL delle sospensioni diluite e 25 µL del liquido di lavaggio non diluito su piastre di agar cromogenico selettivo per Candida e per StrepB.
  3. Incubare le piastre per Candida a 30 °C per 48 h. Le colonie di C. albicans appariranno lisce e di colore turchese o verde.
  4. Incubare le piastre per StrepB a 37 °C per 24 h. Le colonie di S. agalactiae appariranno lisce e di colore rosa o malva.
  5. Ripetere i passaggi 7.1–7.4 quotidianamente, o a un intervallo di tempo appropriato, per monitorare il carico microbico nella cavità vaginale.

8. Quantificare i carichi di C. albicans e S. agalactiae nei tessuti del tratto genitale femminile (punto terminale sperimentale).

  1. Preparare tre provette con tappo a vite da 2 mL contenenti circa 0,4–0,5 g di perle di zirconia da 1 mm e 500 µL di PBS sterile per topo, per raccogliere i tessuti (vagina, collo dell'utero e utero). Preparare inoltre una provetta sterile microcentrifuga e 100 µL di PBS sterile per topo per raccogliere il lavaggio. Registrare il peso di ciascuna provetta con tappo a vite da utilizzare come riferimento per il calcolo del peso dei tessuti.
  2. Sacrificare il topo utilizzando un metodo approvato dall'istituzione, come l'asfissia da CO2 e la dislocazione cervicale. Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare forbici e pinze.
  3. Sollevare l'estremità posteriore del topo per la coda e raccogliere il lavaggio vaginale utilizzando la tecnica descritta nei passaggi 5.3–5.4.
  4. Spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70% e utilizzare le forbici sterilizzate per aprire la cavità addominale. Utilizzare le pinze per sollevare all'indietro la pelle e spostare il tratto gastrointestinale al fine di esporre i tessuti del tratto genitale.
  5. Utilizzare le forbici sterilizzate per rimuovere la vescica, nonché il grasso viscerale e le membrane che oscurano l'utero. Separare le corna uterine dalle ovaie tagliando tra il corpo uterino e ciascuna ovaia.
  6. Utilizzando pinze sterilizzate, afferrare il tratto vaginale nel punto inferiore al collo dell'utero. Sollevare fino a quando l'intero tratto vaginale diventa visibile e utilizzare le forbici sterilizzate per effettuare un taglio trasversale il più vicino possibile alla vulva, evitando qualsiasi tessuto cutaneo. Rimuovere l'intero tratto genitale e posizionarlo in una piastra di Petri sterile da 10 cm.
  7. Utilizzare una lametta sterile per effettuare due tagli trasversali inferiori e superiori rispetto al collo dell'utero, separando vagina, collo dell'utero e utero. Triturare ciascun tessuto effettuando ulteriori 2–5 tagli sagittali e trasversali su ciascuno. Posizionare ciascun tessuto nella rispettiva provetta con tappo a vite precedentemente preparata.
  8. Pesare ciascuna provetta con tappo a vite e calcolare il peso di ciascun tessuto sottraendo il valore ottenuto al passaggio 8.1. Chiudere ermeticamente ogni provetta, sottoporla a bead-beating a 3.450 giri/min per 1 minuto, posizionare le provette sul ghiaccio per 1 minuto, quindi sottoporle nuovamente a bead-beating a 3.450 giri/min per 1 minuto.
  9. Diluire in serie e piastrare ciascun omogeneato di tessuto e campione di lavaggio utilizzando il metodo descritto nei passaggi 5.5–5.6. Incubare le piastre come descritto nei passaggi 7.3–7.4.

Risultati

Per caratterizzare la colonizzazione vaginale da GBS e C. albicans, i topi sono stati inoculati per via intravaginale con il ceppo SC5314 di C. albicans o con un controllo veicolare di PBS, seguito dall'inoculazione con il ceppo COH1 di GBS. Questo ceppo rappresenta gli isolati ipervirulenti del sierotipo capsulare III, tipo di sequenza 17, che sono associati più frequentemente a malattie invasive neonatali e meningite1. I topi non colonizzati da GBS un giorno dopo l'inoculazione sono stati esclusi dall'analisi. In un arco temporale sperimentale di quattro giorni, i topi colonizzati solo da GBS eliminano progressivamente il microrganismo dalla cavità vaginale. La maggior parte dei topi co-colonizzati con C. albicans mantiene carichi elevati di GBS (Figura 1A,B). Anche C. albicans colonizza la cavità vaginale del topo per circa quattro giorni prima di essere eliminato (Figura 1C). Studi precedenti che hanno utilizzato questo modello hanno dimostrato che i carichi di GBS nei tessuti del tratto genitale femminile, inclusi vagina, cervice e utero, sono anch'essi più elevati nei topi co-colonizzati rispetto agli animali mono-colonizzati22.

Grafici di colonizzazione da GBS; confronto statistico, curva di sopravvivenza, analisi dati in scala logaritmica di CFU/mL.
Figura 1. Quantificazione della colonizzazione da Streptococcus di gruppo B. Topi CD-1 sono stati colonizzati con C. albicans (SC5314) o trattati con soluzione salina fosfato come controllo, seguiti da inoculo vaginale di GBS (COH1). (A) Carichi di GBS nel liquido di lavaggio vaginale, mostrate le mediane. (B) Percentuale di topi colonizzati nel tempo, valutata mediante rilevamento di GBS nel liquido di lavaggio vaginale. (C) Carichi di C. albicans nel liquido di lavaggio vaginale, mostrate le mediane. Tre esperimenti indipendenti. n = 26-27 topi per gruppo. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 mediante test t multipli con correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (A) o test log-rank (B). Abbreviazioni: GBS = Streptococcus di gruppo B, Ca = Candida albicans, CFU = unità formanti colonie. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

La colonizzazione vaginale da GBS rappresenta un rischio critico per la salute materno-fetale e neonatale. I modelli in vivo sono fondamentali per comprendere i determinanti della colonizzazione e per sviluppare terapie preventive. In questo manoscritto, descriviamo un modello murino per co-colonizzare per via vaginale i topi con GBS e C. albicans, valutare il carico microbico nella luce vaginale e nell'apparato genitale femminile (FGT) e raccogliere i tessuti pertinenti per ulteriori analisi successive. Questo modello è stato sviluppato per studiare le interazioni fungo-batteriche e ospite-microbo nel contesto della colonizzazione vaginale polimicrobica. Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato questo modello per chiarire i meccanismi attraverso cui C. albicans favorisce la colonizzazione vaginale da GBS e l'infezione ascendente22.

I modelli animali sono stati utilizzati con successo per comprendere le interazioni tra ospite e microrganismi; tuttavia, l'inclusione di comunità polimicrobiche in questi modelli può presentare diverse sfide uniche. Gli obiettivi principali nello sviluppo di questo modello erano stabilire la colonizzazione fungina, consentire il tempo necessario affinché C. albicans formasse ife, e inoculare con GBS per monitorare la dinamica della colonizzazione prima che uno dei microrganismi fosse eliminato dall'ospite. Essendo un fungo polimorfo, C. albicans può rispondere a diversi segnali ambientali legati all'ospite avviando la morfogenesi ifale17. La filamentazione in vivo è stata privilegiata in questo modello a causa delle crescenti evidenze che indicano come le interazioni specifiche delle ife con GBS guidino la simbiosi nel tratto genitale femminile. Utilizzando una ceppo di C. albicans che esprime NRG1 sotto il controllo del promotore reprimibile TetO, il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato che GBS mostra una maggiore co-aggregazione e un'adesione epiteliale più elevata con C. albicans bloccato in forma ifale rispetto a quello bloccato in forma lievito22. La co-aggregazione con C. albicans e l'associazione con cellule epiteliali vaginali umane sono determinanti importanti per la fitness di GBS in questo ambiente ospite. Altri batteri tra cui Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e diverse specie di Streptococcus sono stati dimostrati in grado di modulare l'espressione genica associata alla morfogenesi in C. albicans, oltre a interagire preferenzialmente con le ife24. In futuro, le implicazioni della filamentazione in vivo potranno essere indagate utilizzando questo modello per colonizzare topi con ceppi di C. albicans bloccati in forma ifale o lievito.

I modelli murini esistenti che prevedono l'inoculazione intravaginale di C. albicans si sono concentrati principalmente sulla candidosi vulvovaginale (VVC)25 e sono stati utilizzati per caratterizzare lo stato iperinflammatorio associato all'infezione sintomatica26. Il nostro modello, descritto in questo manoscritto, rappresenta in modo più accurato uno stato di colonizzazione. Studi precedenti del nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato che, utilizzando questo modello, la co-colonizzazione con C. albicans riduce l'abbondanza di citochine pro-infiammatorie come IL-6, CXCL1, CXCL2 e TNFα rispetto alla colonizzazione con GBS da solo, e che i livelli di queste proteine nei topi co-colonizzati sono paragonabili a quelli osservati negli animali naïve22. Ciò indica che non osserviamo l'ambiente iperinflammatorio tipico della VVC, nonostante la filamentazione fungina nella cavità vaginale. Si è riportato che i topi CD-1 outbred sono resistenti alla VVC, probabilmente a causa di un controllo immunitario adeguato della proliferazione fungina27. Inoltre, i topi CD-1 attivano una segnalazione immunitaria robusta in risposta all'inoculazione intravaginale di GBS, sufficiente a controllare la popolazione batterica entro circa una settimana in assenza di C. albicans28,29,30, sebbene in precedenza abbiamo studiato la colonizzazione vaginale da GBS in altri ceppi murini12. Il modello descritto in questo manoscritto rispecchia la natura transitoria sia della colonizzazione da C. albicans che da GBS osservata negli esseri umani. Inoltre, negli esseri umani esiste una notevole variabilità sia nel pH che nella composizione del microbioma. Questo modello presenta condizioni di pH quasi neutro (~6,5)31. Il microbioma vaginale di topi CD-1 è dominato da specie di Enterobacteriaceae e Proteus13, associate agli stessi tipi di stato comunitario microbico vaginale del GBS9,32.

Trattando i topi con antibiotici e una singola dose di 17β-estradiolo prima dell'inoculazione fungina, prepariamo l'ambiente rendendolo ricettivo per C. albicans, facilitando così la colonizzazione. Il trattamento con estradiolo migliora inoltre la riproducibilità tra esperimenti sincronizzando la fase del ciclo estrale e, di conseguenza, l'ambiente immunitario locale al momento dell'inoculazione. Sincronizziamo i topi nella fase di proestro all'atto dell'inoculazione con C. albicans, fase che coincide con una ridotta abbondanza di neutrofili ed è stata dimostrata favorire il carico fungino nel tratto genitale femminile33,34. La rimozione degli antibiotici e la sostituzione con acqua potabile fresca nelle prime fasi della sperimentazione non solo facilita la colonizzazione da parte di GBS, ma permette anche ai microrganismi nativi di ripopolare il tratto vaginale. Inoltre, limitando il trattamento con estradiolo a una singola dose iniziale, i topi riescono a riprendere la normale dinamica del ciclo estrale, anche se è stato dimostrato che un'amministrazione continua di estradiolo favorisce la colonizzazione12. La composizione delle cellule immunitarie nel tratto genitale femminile murino varia durante il ciclo estrale e le risposte immunitarie mucosali sono altamente sensibili agli ormoni steroidei sessuali35,36,37. Pertanto, evitiamo la variabile confondente rappresentata dall'amministrazione ripetuta di estradiolo, al fine di analizzare specificamente gli effetti della colonizzazione microbica sull'ambiente dell'ospite.

I dati presentati in questo studio riguardano il ceppo C. albicans SC5314 e il ceppo GBS COH1. È stato selezionato SC5314 per sviluppare il modello a causa del suo frequente utilizzo in micologia, della disponibilità di numerosi strumenti genetici in questo ceppo e di una solida base di conoscenze sulla sua biologia e dinamica in vitro e in vivo. Il nostro gruppo di ricerca ha inoltre dimostrato che il ceppo C. albicans 529L può aumentare il carico di GBS nel tratto genitale femminile22. Il ceppo GBS COH1 è stato utilizzato come rappresentante della linea sierotipo III, tipo di sequenza 17, associata a resistenza agli antimicrobici e a malattie invasive neonatali1,2. Questo modello impiega terreni selettivi e differenziali per quantificare l'abbondanza di GBS e C. albicans nei lavaggi vaginali e nei tessuti. Per adattare questo modello all'uso con altre specie batteriche e fungine, sarà necessario ottimizzare condizioni di crescita selettive adeguate.

Le interazioni fungo-batteriche stanno emergendo come importanti mediatori degli stili di vita microbici38,39. Diversi studi hanno dimostrato che tali interazioni possono modellare in modo significativo il commensalismo e il potenziale di virulenza. Inoltre, l'ambiente dell'ospite impone pressioni uniche e può influenzare fattori come la programmazione metabolica, i reguloni dei fattori di trascrizione e i profili di resistenza agli antimicrobici. Pertanto, è essenziale utilizzare modelli in vivo rappresentativi per caratterizzare come i microrganismi interagiscono tra loro. Il modello murino descritto in questo manoscritto può essere impiegato per studiare in che modo la colonizzazione vaginale con batteri e funghi di interesse possa influenzare il carico microbico, l'espressione genica e la risposta dell'ospite.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'Ufficio delle Risorse per gli Animali da Laboratorio dell'Università del Colorado Anschutz, inclusi il responsabile della struttura e il personale specializzato del vivario. Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni NIH R01AI153332 e R21AI188719 assegnate a K.S.D.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro da 0,22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
Filtro da 0,45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
Siringa da 1 mL con attacco luer lockMcKesson16-S1C
Perle di zirconia da 1,0 mmResearch Products International9835
Siringa da 10 mL con attacco luer lockMcKesson16-S10C
17β-estradioloSigma-AldrichE8875ATTENZIONE: il 17β-estradiolo può essere assorbito attraverso la pelle e le superfici mucose. Indossare idonei dispositivi di protezione individuale (DPI) ed esercitare cautela durante l'uso.
Ago da 18G, 1,5"BD305196
Tubo da 2 mL con tappo a viteFisher Scientific02-681-374
Ago da 26G, 0,5"McKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicillinaResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamicinaVWR Life Science0304
NeomicinaResearch Products InternationalN20040
Soluzione salina tamponata al fosfatoFisher ScientificBP2944
Olio di sesamoSigma-AldrichS3547
Brodo Todd HewittResearch Products InternationalT47500
Brodo Yeast Peptone DextroseBD242810

Riferimenti

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