Paradigma di riconoscimento sociale nei topi per distinguere le relazioni a breve e a lungo termine

Sommario

Qui viene delineata una procedura accurata per misurare il riconoscimento sociale tra relazioni nuove, a breve termine e a lungo termine mediante un paradigma sperimentale comportamentale a Quattro Ciotole. Vengono descritti i vantaggi e le possibili applicazioni di questo paradigma, insieme a informazioni importanti per interpretare correttamente i risultati. 

Abstract

La memoria sociale è la capacità di ricordare e riconoscere conspecifici. È un aspetto fondamentale del comportamento dei mammiferi, con vantaggi dimostrati per la sopravvivenza nei mammiferi altamente sociali come i topi e gli esseri umani. I roditori, in particolare i topi, sono un modello animale consolidato ampiamente utilizzato per lo studio della memoria sociale e dei suoi meccanismi sottostanti. La maggior parte degli esistenti memoria sociale i paradigmi valutano principalmente il riconoscimento sociale a breve termine, in cui la durata della relazione e il livello di familiarità tra il soggetto e un agente è compresa tra 5 e 15 minuti. Pertanto, i paradigmi esistenti e studi precedenti non registrare i ricordi sociali derivanti da relazioni a lungo termine e concentrarsi sulla dicotomia tra novità e familiarità a breve termine, lasciando un ampio divario nella nostra comprensione meccanicistica delle memorie sociali. Per colmare questa lacuna, abbiamo progettato un saggio semplice che cattura le risposte del topo a diversi livelli di familiarità, collocando il richiamo complesso della memoria sociale in un contesto osservabile e quantificabile. Nel paradigma dei quattro bicchieri, un topo soggetto esplora liberamente un arena contenente quattro coppette forate posizionate in ogni angolo. Queste coppette contengono tre agente topi con diversi livelli di familiarità (stimoli sociali): un topo familiare a lungo termine (compagno di gabbia; convivenza di 1 mese), un topo familiare a breve termine (esposizione precedente di 10 minuti), un conspecifico nuovo e un bicchiere vuoto come controllo. I topi maschi CD-1 mostrano una preferenza per l'indagine del topo nuovo e di quello familiare a lungo termine rispetto allo studio di topi familiari a breve termine in questo paradigma. Questo compito dimostra riconoscimento del livello di familiarità e riduce al minimo i comportamenti aggressivi pur mantenendo controllando per anamnesi dell'esposizione. Questo nuovo saggio fornisce una piattaforma per il confronto diretto di i meccanismi neurali della socialità memoria a lungo termine, a breve termine e memoria per stimoli nuovi individui. Il paradigma delle quattro tazze funge da nuovo misurazione per riconoscimento di familiarità a lungo termine che completerà gli attuali saggi di riconoscimento a breve termine 

Introduzione

La memoria sociale è una caratteristica fondamentale del comportamento sociale dei mammiferi ed è particolarmente sviluppata in specie altamente sociali come topi ed esseri umani. Nei roditori, il riconoscimento degli altri è alla base della dinamica comportamentale essenziale per la sopravvivenza all'interno di gruppi familiari e di conspecifici, inclusi coesione del gruppo, gerarchie di dominanza, comportamenti riproduttivi e cure parentali^1,2. Oltre al suo ruolo evolutivamente vantaggioso per la sopravvivenza animale, la compromissione della memoria sociale nell'uomo rappresenta un tratto comune a diverse patologie neuropsichiatriche e neurologiche, tra cui il disturbo dello spettro autistico, la schizofrenia e la malattia di Alzheimer^3,4,5,6. Poiché il riconoscimento sociale è fondamentale per il funzionamento quotidiano delle specie sociali e riveste un'importanza clinica evidente, è essenziale sviluppare saggi comportamentali in grado di cogliere accuratamente la sua natura multidimensionale e le basi neurali sottostanti. Sebbene i paradigmi esistenti misurino alcuni aspetti del riconoscimento sociale nei topi, la maggior parte dei saggi è progettata per valutare le preferenze per la novità confrontando interazioni con soggetti nuovi rispetto a relazioni a breve termine formate nell'arco di minuti o ore, piuttosto che quantificare il riconoscimento di relazioni sociali a lungo termine.   

Approcci esistenti, come il paradigma della tre camere o i paradigmi di abituazione-disabituazione, valutano la preferenza per la novità sulla base di un'esposizione precedente limitata, spesso circoscritta a 5-15 minuti^7,8,9,10,11. Questi metodi hanno fornito approfondita comprensione del meccanismi neurali di questi sociale a breve termine memorie nei topi^12,13. Tuttavia, i ricordi sociali naturalistici e la funzione sociale devono incorporare i meccanismi distinti coinvolti nelle relazioni a lungo termine, costruito tramite convivenza, a lungo termine gerarchie sociali o partner di accoppiamento. Sebbene alcuni studi utilizzino il paradigma della tre camere con animali provenienti dalla stessa nidiata¹⁴ o topi familiari allevati insieme al soggetto per un periodo fino a 72 h^15,16, l'uso principale del paradigma si concentra ancora sulla semplice dicotomia tra nuovo e familiare. Ciò limita i confronti tra più topi familiari diversi. Con i tradizionali paradigmi di riconoscimento sociale orientati verso studio relazioni a breve termine, identifichiamo un evidente vuoto nella nostra conoscenza dei meccanismi neurali alla base del riconoscimento sociale delle relazioni a lungo termine.   

Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato il paradigma dei quattro bicchieri: un saggio semplice e flessibile progettato per differenziare il riconoscimento di diversi livelli di familiarità sociale all'interno di una singola sessione di prova. In questo paradigma, un topo soggetto esplora i quattro angoli di un'arena aperta, ognuno contenente un bicchiere forato che ospita un conspecifico o un bicchiere vuoto di controllo. I bicchieri contengono un conspecifico a lungo termine (compagno di gabbia), un conspecifico familiare a breve termine con limitata esposizione precedente (10 min), un topo nuovo e un controllo vuoto. Il tempo di investigazione funge da indice quantitativo di riconoscimento sociale e preferenza sociale. Questa configurazione permette confronti simultanei tra diversi livelli di familiarità, minimizzando al contempo l'interazione fisica diretta e il rischio di incontri aggressivi. 

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono animali devono essere eseguite in conformità con linee guida istituzionali e approvato dal comitato istituzionale dell'Università della Florida Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) 

1. Preparazione e alloggiamento degli animali  

1. Utilizzare topi adulti omosessuali allevati in gruppo per tutti gli esperimenti.  Manipolare i topi per almeno 2 giorni per abituarli alla manipolazione e ridurre l'ansia prima dei test sperimentali.
2. Allevare i topi in gabbie da laboratorio standard in un ciclo luce-buio invertito con accesso ad libitum a cibo e acqua. 
   NOTA: Per esperimenti rappresentativi sono stati utilizzati topi CD-1 e C57BL/6 adulti (età di 3–4 mesi). I topi sono stati allevati in gruppi di 3–4 animali per gabbia. I dataset rappresentativi includevano 10 topi maschi CD-1, 12 topi femmine CD-1 e 31 topi maschi C57BL/6. Il comportamento deve essere valutato nella fase attiva dell'animale (fase scura). I topi inclusi in questo studio sono stati testati tra le 9:00 e le 18:00 ed erano mantenuti in un ciclo luce-buio invertito (fase scura dalle 8:00 alle 20:00).
3. Definire un agente familiare a lungo termine come un compagno di gabbia omotipico e omosessuale che ha convissuto con il topo sottoposto al test nella stessa gabbia per un periodo minimo di 3–4 settimane prima del test. 
4. Selezionare agenti familiari a breve termine e conspecifici nuovi appartenenti allo stesso ceppo e sesso del topo sottoposto al test. 
5. Accertarsi che i topi nuovi non abbiano avuto alcun contatto fisico o olfattivo precedente con il topo sottoposto al test. 
6. Selezionare un agente nuovo e un agente familiare a breve termine da gabbie diverse per evitare simili stimoli olfattivi nei due agenti.
   NOTA: Registrare l'età approssimativa di tutti gli animali utilizzati e ridurre al minimo il riutilizzo degli stessi agenti nuovi e a breve termine più volte al giorno. Se gli agenti devono essere riutilizzati, prevedere un intervallo di riposo di >2 h nella gabbia tra una prova e l'altra per evitare agenti stressati.

2. Configurazione dell'arena 

1. Posizionare un pulito, arena quadrata in campo aperto (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabella dei materialiin una stanza tranquilla per test comportamentali.
2. Illuminare l'area utilizzando una singola lampada alta o sovrastante regolata su circa 8–20 lux  
3. Posizionare quattro coppette di plastica forata identiche nel peso in ciascun angolo dell'arena (Figura 1A).
   1. Utilizzare tazze visivamente identiche ogni volta che possibile. Se si utilizzano tazze di colori diversi, bilanciare opportunamente assegnamenti e posizioni delle tazze tra le prove.
   2. Premere due lati di ogni coppetta lavaggio contro le pareti dell'arena per limitarne l'accesso, riducendo al minimo il comportamento di nascondimento e standardizzando gli angoli di investigazione. 
   3. Utilizzare bicchieri abbastanza pesanti da impedire la fuga e abbastanza alti da impedire l'arrampicata.
      NOTA: In questo studio, le tazze rappresentative e la posizione dell'agente sono state pseudorandomizzate tra i soggetti ruotando in senso orario le tazze di plastica colorate, mentre il tipo di agente veniva spostato in senso antiorario tra le prove.
4. Posizionare la telecamera sufficientemente alta da far sì che il intero saggio la scatola è inquadrata per evitare punti ciechi durante la codifica comportamentale. Mantenere al minimo i riflessi e un'illuminazione uniforme su tutta la superficie del pavimento della scatola (Figura 1A).
5. Pulire accuratamente il pavimento dell'arena e le coppette tra un'esecuzione e l'altra utilizzando un disinfettante appropriato, seguito da acqua per rimuovere gli odori residui. 
6. Lasciare asciugare completamente l'arena prima di reinserire animali 

3. Abituazione all'arena al Giorno 0

1. Posizionare il soggetto e i suoi compagni di gabbia nell'arena contenente quattro coppette perforate vuote e consentire un'esplorazione libera per 20 min.
   NOTA: Abituare i soggetti singolarmente per esperimenti con fissaggio. Potrebbero essere necessarie sessioni aggiuntive di abituazione. Si raccomanda di effettuare più giornate di abituazione se i topi non esplorano completamente l'intera arena dopo un solo giorno.
2. Rimuovere tutti i topi dall'arena e riportarli nella gabbia di provenienza.
3. Posizionare tutti gli agenti sociali sotto le coppette per 10 min per abituarli al contenimento. Abituare contemporaneamente gli agenti provenienti dalla stessa gabbia di provenienza, uno per coppetta (Figura 1B).
4. Pulire l'arena e le coppette prima di introdurre i topi da una nuova gabbia di provenienza.
   NOTA: Consentire ai topi un periodo di riposo di almeno 15 min dopo il trasporto nella stanza prima di iniziare la sessione.

4. Linea di base 

1. Impostare l'arena secondo la sezione 2. Mantenere la stessa configurazione dell'arena in tutti i giorni sperimentali. 
2. Posizionare il soggetto nell'arena contenente quattro bicchieri vuoti e consentire un'esplorazione libera per 10 min.
   NOTA: Non interrompere mai la registrazione, lasciandola procedere in modo continuo durante tutte le fasi dell'attuale prova.   

5. Acquisizione a breve termine 

1. Utilizzare una coppetta forata pesata per contenere il soggetto durante il posizionamento del designato "breve familiarizzazione" agente In alternativa, esporre il soggetto all'agente a breve termine in una gabbia pulita.
2. Se si sceglie di effettuare l'esposizione nell'arena, limitare un familiare designato a breve termine agente sotto una delle coppe forate nell'arena, lasciando libere le altre tre coppe vuoto. 
3. Rilascio il soggetto e permettere un'esplorazione libera per 10 min (Figura 1B).
   NOTA: Se si utilizza il metodo di esposizione a un agente a breve termine in un'arena, alternare l'angolo utilizzato per l'agente familiare a breve termine tra i diversi soggetti per evitare bias spaziali. 

6. Intervallo inter-trial (ITI) 

1. Recuperare il familiarizzazione a breve termine agente e riporlo nella sua gabbia di provenienza. Lasciare il topo sottoposto al test da solo nell'arena e muoversi liberamente per 10 min. 
2. Raccogliere nuovo e a lungo termine familiare topi trattati per il test fase.  
   NOTA: Restituire l'agente familiare a breve termine nella stessa coppa utilizzata durante l'acquisizione a breve termine (sezione 5). Si raccomanda questa procedura per evitare la novità nella posizione spaziale qualora l'acquisizione a breve termine venga effettuata in un'arena.

7. Fase di riconoscimento sociale 

1. Posizionare un'ulteriore coppetta forata pesata sul topo in esame.
2. Posizionare un topo sotto ciascuno dei tre bicchieri forati pesati: un compagno di gabbia a lungo termine, un familiare a breve termine e un conspecifico nuovo Lasciare una quarta tazza designata vuota come controllo.  
   NOTA: Etichettare i coperchi dei bicchieri per identificare le posizioni degli agenti durante la valutazione del comportamento.
3. Rimuovere la coppetta perforata dal topo sottoposto all'esperimento al centro dell'arena e consentire un'esplorazione libera per 10 min (Figura 1A).
4. Rimuovere tutti i topi alla fine del 10 min intervallo e interrompere la registrazione.
5. Rimettere tutti i topi nelle loro gabbie di provenienza. 
6. Pulire accuratamente l'arena e le coppe prima della prova successiva.  
   NOTA: Tenere a disposizione coppe di ricambio in caso di danni.

8. Valutazione del comportamento

1. Importare tutti i video registrati in un software di analisi comportamentale in grado di effettuare annotazioni manuali, come il Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS).
   NOTA: La valutazione comportamentale non è stata eseguita in cieco rispetto alla posizione del compagno di gabbia, poiché etichette con l'ID dell'agente erano posizionate sopra ogni coppetta e visibili nei video, e il numero della gabbia poteva essere dedotto. Tuttavia, i valutatori non prestavano attivamente attenzione alle etichette visibili ed erano in cieco rispetto all'identità dell'agente nuovo e di quello a breve termine. Tutti i valutatori hanno seguito definizioni operative predefinite del comportamento investigativo e criteri standardizzati di valutazione.
2. Definire la matrice comportamentale prima della valutazione.
3. Definire un episodio di investigazione come il posizionamento del naso del topo sperimentale all'interno 1 cm di una tazza mentre esibire posizione investigativa prolungata 
   NOTA: Includere i comportamenti di masticazione e rosicchiamento diretti verso il bicchiere come episodi di investigazione.
4. Annotare manualmente la durata totale dell'indagine per ogni coppa durante la fase del test di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. Assegnare un punteggio al basale e all'acquisizione secondo necessità.
   NOTA: Il tracciamento automatico della posizione può essere utilizzato con una regione di interesse semicircolare di 1 cm di diametro attorno a ogni coppa.
5. Esporta i dati annotati per successivo analisi statistica

Risultati

Seguendo il protocollo del paradigma delle quattro tazze, topi maschi CD-1 hanno mostrato un comportamento differenziale di investigazione sociale nei confronti del compagno di gabbia (familiare a lungo termine), del conspecifico familiare a breve termine e del conspecifico nuovo (Figura 2). Per ogni agente, è stato calcolato un indice di discriminazione (DI) basato sui secondi spesi nell'investigazione dell'agente rispetto alla tazza vuota, calcolato come (agente − vuoto)/(agente + vuoto) d...

Discussione

Esistono considerazioni fondamentali per applicare efficacemente e in modo affidabile il paradigma dei quattro bicchieri in altri contesti sperimentali al fine di misurare queste dinamiche sociali. L'abituazione al Giorno 0 riduce l'esplorazione dell'arena e dei bicchieri motivata dalla novità non sociale, che altrimenti potrebbe mascherare l'investigazione sociale durante il test^7,8,9. È inoltre essenziale un controllo preciso ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Software per la valutazione comportamentale	Software interattivo per la ricerca osservazionale comportamentale	Versione 9.12.7	Software per l'annotazione manuale degli eventi
Arena di campo aperto	Rafferty Machine and Tool	Prodotto su misura	Foglio strutturale in fibra di vetro FRP, arena quadrata (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); pareti non trasparenti, se l'arena è trasparente, coprire le pareti esterne con carta per ridurre al minimo le distrazioni per l'animale
Telecamera sopraelevata	Logitech	Logitech C920x HD Pro PC Webcam	Telecamera in grado di effettuare registrazioni video continue; montata sopra il centro dell'arena
Bicchieri forati	Chinco Store	ONG-Chinco-0279	dimensioni dei bicchieri: 4,01"L x 4,01"L x 4,52"H; bicchieri forati in plastica o metallo, di forma quadrata o cilindrica
Prism	Graph Pad	Versione 10.6.0	Software per l'analisi dei dati; può essere eseguito con altri software