Qui viene delineata una procedura accurata per misurare il riconoscimento sociale tra relazioni nuove, a breve termine e a lungo termine mediante un paradigma sperimentale comportamentale a Quattro Ciotole. Vengono descritti i vantaggi e le possibili applicazioni di questo paradigma, insieme a informazioni importanti per interpretare correttamente i risultati.
Articolo metodologico
Paradigma di riconoscimento sociale nei topi per distinguere le relazioni a breve e a lungo termine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La memoria sociale è la capacità di ricordare e riconoscere conspecifici. È un aspetto fondamentale del comportamento dei mammiferi, con vantaggi dimostrati per la sopravvivenza nei mammiferi altamente sociali come i topi e gli esseri umani. I roditori, in particolare i topi, sono un modello animale consolidato ampiamente utilizzato per lo studio della memoria sociale e dei suoi meccanismi sottostanti. La maggior parte degli esistenti memoria sociale i paradigmi valutano principalmente il riconoscimento sociale a breve termine, in cui la durata della relazione e il livello di familiarità tra il soggetto e un agente è compresa tra 5 e 15 minuti. Pertanto, i paradigmi esistenti e studi precedenti non registrare i ricordi sociali derivanti da relazioni a lungo termine e concentrarsi sulla dicotomia tra novità e familiarità a breve termine, lasciando un ampio divario nella nostra comprensione meccanicistica delle memorie sociali. Per colmare questa lacuna, abbiamo progettato un saggio semplice che cattura le risposte del topo a diversi livelli di familiarità, collocando il richiamo complesso della memoria sociale in un contesto osservabile e quantificabile. Nel paradigma dei quattro bicchieri, un topo soggetto esplora liberamente un arena contenente quattro coppette forate posizionate in ogni angolo. Queste coppette contengono tre agente topi con diversi livelli di familiarità (stimoli sociali): un topo familiare a lungo termine (compagno di gabbia; convivenza di 1 mese), un topo familiare a breve termine (esposizione precedente di 10 minuti), un conspecifico nuovo e un bicchiere vuoto come controllo. I topi maschi CD-1 mostrano una preferenza per l'indagine del topo nuovo e di quello familiare a lungo termine rispetto allo studio di topi familiari a breve termine in questo paradigma. Questo compito dimostra riconoscimento del livello di familiarità e riduce al minimo i comportamenti aggressivi pur mantenendo controllando per anamnesi dell'esposizione. Questo nuovo saggio fornisce una piattaforma per il confronto diretto di i meccanismi neurali della socialità memoria a lungo termine, a breve termine e memoria per stimoli nuovi individui. Il paradigma delle quattro tazze funge da nuovo misurazione per riconoscimento di familiarità a lungo termine che completerà gli attuali saggi di riconoscimento a breve termine
Introduzione
La memoria sociale è una caratteristica fondamentale del comportamento sociale dei mammiferi ed è particolarmente sviluppata in specie altamente sociali come topi ed esseri umani. Nei roditori, il riconoscimento degli altri è alla base della dinamica comportamentale essenziale per la sopravvivenza all'interno di gruppi familiari e di conspecifici, inclusi coesione del gruppo, gerarchie di dominanza, comportamenti riproduttivi e cure parentali1,2. Oltre al suo ruolo evolutivamente vantaggioso per la sopravvivenza animale, la compromissione della memoria sociale nell'uomo rappresenta un tratto comune a diverse patologie neuropsichiatriche e neurologiche, tra cui il disturbo dello spettro autistico, la schizofrenia e la malattia di Alzheimer3,4,5,6. Poiché il riconoscimento sociale è fondamentale per il funzionamento quotidiano delle specie sociali e riveste un'importanza clinica evidente, è essenziale sviluppare saggi comportamentali in grado di cogliere accuratamente la sua natura multidimensionale e le basi neurali sottostanti. Sebbene i paradigmi esistenti misurino alcuni aspetti del riconoscimento sociale nei topi, la maggior parte dei saggi è progettata per valutare le preferenze per la novità confrontando interazioni con soggetti nuovi rispetto a relazioni a breve termine formate nell'arco di minuti o ore, piuttosto che quantificare il riconoscimento di relazioni sociali a lungo termine.
Approcci esistenti, come il paradigma della tre camere o i paradigmi di abituazione-disabituazione, valutano la preferenza per la novità sulla base di un'esposizione precedente limitata, spesso circoscritta a 5-15 minuti7,8,9,10,11. Questi metodi hanno fornito approfondita comprensione del meccanismi neurali di questi sociale a breve termine memorie nei topi12,13. Tuttavia, i ricordi sociali naturalistici e la funzione sociale devono incorporare i meccanismi distinti coinvolti nelle relazioni a lungo termine, costruito tramite convivenza, a lungo termine gerarchie sociali o partner di accoppiamento. Sebbene alcuni studi utilizzino il paradigma della tre camere con animali provenienti dalla stessa nidiata14 o topi familiari allevati insieme al soggetto per un periodo fino a 72 h15,16, l'uso principale del paradigma si concentra ancora sulla semplice dicotomia tra nuovo e familiare. Ciò limita i confronti tra più topi familiari diversi. Con i tradizionali paradigmi di riconoscimento sociale orientati verso studio relazioni a breve termine, identifichiamo un evidente vuoto nella nostra conoscenza dei meccanismi neurali alla base del riconoscimento sociale delle relazioni a lungo termine.
Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato il paradigma dei quattro bicchieri: un saggio semplice e flessibile progettato per differenziare il riconoscimento di diversi livelli di familiarità sociale all'interno di una singola sessione di prova. In questo paradigma, un topo soggetto esplora i quattro angoli di un'arena aperta, ognuno contenente un bicchiere forato che ospita un conspecifico o un bicchiere vuoto di controllo. I bicchieri contengono un conspecifico a lungo termine (compagno di gabbia), un conspecifico familiare a breve termine con limitata esposizione precedente (10 min), un topo nuovo e un controllo vuoto. Il tempo di investigazione funge da indice quantitativo di riconoscimento sociale e preferenza sociale. Questa configurazione permette confronti simultanei tra diversi livelli di familiarità, minimizzando al contempo l'interazione fisica diretta e il rischio di incontri aggressivi.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono animali devono essere eseguite in conformità con linee guida istituzionali e approvato dal comitato istituzionale dell'Università della Florida Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC)
1. Preparazione e alloggiamento degli animali
- Utilizzare topi adulti omosessuali allevati in gruppo per tutti gli esperimenti. Manipolare i topi per almeno 2 giorni per abituarli alla manipolazione e ridurre l'ansia prima dei test sperimentali.
- Allevare i topi in gabbie da laboratorio standard in un ciclo luce-buio invertito con accesso ad libitum a cibo e acqua.
NOTA: Per esperimenti rappresentativi sono stati utilizzati topi CD-1 e C57BL/6 adulti (età di 3–4 mesi). I topi sono stati allevati in gruppi di 3–4 animali per gabbia. I dataset rappresentativi includevano 10 topi maschi CD-1, 12 topi femmine CD-1 e 31 topi maschi C57BL/6. Il comportamento deve essere valutato nella fase attiva dell'animale (fase scura). I topi inclusi in questo studio sono stati testati tra le 9:00 e le 18:00 ed erano mantenuti in un ciclo luce-buio invertito (fase scura dalle 8:00 alle 20:00). - Definire un agente familiare a lungo termine come un compagno di gabbia omotipico e omosessuale che ha convissuto con il topo sottoposto al test nella stessa gabbia per un periodo minimo di 3–4 settimane prima del test.
- Selezionare agenti familiari a breve termine e conspecifici nuovi appartenenti allo stesso ceppo e sesso del topo sottoposto al test.
- Accertarsi che i topi nuovi non abbiano avuto alcun contatto fisico o olfattivo precedente con il topo sottoposto al test.
- Selezionare un agente nuovo e un agente familiare a breve termine da gabbie diverse per evitare simili stimoli olfattivi nei due agenti.
NOTA: Registrare l'età approssimativa di tutti gli animali utilizzati e ridurre al minimo il riutilizzo degli stessi agenti nuovi e a breve termine più volte al giorno. Se gli agenti devono essere riutilizzati, prevedere un intervallo di riposo di >2 h nella gabbia tra una prova e l'altra per evitare agenti stressati.
2. Configurazione dell'arena
- Posizionare un pulito, arena quadrata in campo aperto (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabella dei materialiin una stanza tranquilla per test comportamentali.
- Illuminare l'area utilizzando una singola lampada alta o sovrastante regolata su circa 8–20 lux
- Posizionare quattro coppette di plastica forata identiche nel peso in ciascun angolo dell'arena (Figura 1A).
- Utilizzare tazze visivamente identiche ogni volta che possibile. Se si utilizzano tazze di colori diversi, bilanciare opportunamente assegnamenti e posizioni delle tazze tra le prove.
- Premere due lati di ogni coppetta lavaggio contro le pareti dell'arena per limitarne l'accesso, riducendo al minimo il comportamento di nascondimento e standardizzando gli angoli di investigazione.
- Utilizzare bicchieri abbastanza pesanti da impedire la fuga e abbastanza alti da impedire l'arrampicata.
NOTA: In questo studio, le tazze rappresentative e la posizione dell'agente sono state pseudorandomizzate tra i soggetti ruotando in senso orario le tazze di plastica colorate, mentre il tipo di agente veniva spostato in senso antiorario tra le prove.
- Posizionare la telecamera sufficientemente alta da far sì che il intero saggio la scatola è inquadrata per evitare punti ciechi durante la codifica comportamentale. Mantenere al minimo i riflessi e un'illuminazione uniforme su tutta la superficie del pavimento della scatola (Figura 1A).
- Pulire accuratamente il pavimento dell'arena e le coppette tra un'esecuzione e l'altra utilizzando un disinfettante appropriato, seguito da acqua per rimuovere gli odori residui.
- Lasciare asciugare completamente l'arena prima di reinserire animali
3. Abituazione all'arena al Giorno 0
- Posizionare il soggetto e i suoi compagni di gabbia nell'arena contenente quattro coppette perforate vuote e consentire un'esplorazione libera per 20 min.
NOTA: Abituare i soggetti singolarmente per esperimenti con fissaggio. Potrebbero essere necessarie sessioni aggiuntive di abituazione. Si raccomanda di effettuare più giornate di abituazione se i topi non esplorano completamente l'intera arena dopo un solo giorno. - Rimuovere tutti i topi dall'arena e riportarli nella gabbia di provenienza.
- Posizionare tutti gli agenti sociali sotto le coppette per 10 min per abituarli al contenimento. Abituare contemporaneamente gli agenti provenienti dalla stessa gabbia di provenienza, uno per coppetta (Figura 1B).
- Pulire l'arena e le coppette prima di introdurre i topi da una nuova gabbia di provenienza.
NOTA: Consentire ai topi un periodo di riposo di almeno 15 min dopo il trasporto nella stanza prima di iniziare la sessione.
4. Linea di base
- Impostare l'arena secondo la sezione 2. Mantenere la stessa configurazione dell'arena in tutti i giorni sperimentali.
- Posizionare il soggetto nell'arena contenente quattro bicchieri vuoti e consentire un'esplorazione libera per 10 min.
NOTA: Non interrompere mai la registrazione, lasciandola procedere in modo continuo durante tutte le fasi dell'attuale prova.
5. Acquisizione a breve termine
- Utilizzare una coppetta forata pesata per contenere il soggetto durante il posizionamento del designato "breve familiarizzazione" agente In alternativa, esporre il soggetto all'agente a breve termine in una gabbia pulita.
- Se si sceglie di effettuare l'esposizione nell'arena, limitare un familiare designato a breve termine agente sotto una delle coppe forate nell'arena, lasciando libere le altre tre coppe vuoto.
- Rilascio il soggetto e permettere un'esplorazione libera per 10 min (Figura 1B).
NOTA: Se si utilizza il metodo di esposizione a un agente a breve termine in un'arena, alternare l'angolo utilizzato per l'agente familiare a breve termine tra i diversi soggetti per evitare bias spaziali.
6. Intervallo inter-trial (ITI)
- Recuperare il familiarizzazione a breve termine agente e riporlo nella sua gabbia di provenienza. Lasciare il topo sottoposto al test da solo nell'arena e muoversi liberamente per 10 min.
- Raccogliere nuovo e a lungo termine familiare topi trattati per il test fase.
NOTA: Restituire l'agente familiare a breve termine nella stessa coppa utilizzata durante l'acquisizione a breve termine (sezione 5). Si raccomanda questa procedura per evitare la novità nella posizione spaziale qualora l'acquisizione a breve termine venga effettuata in un'arena.
7. Fase di riconoscimento sociale
- Posizionare un'ulteriore coppetta forata pesata sul topo in esame.
- Posizionare un topo sotto ciascuno dei tre bicchieri forati pesati: un compagno di gabbia a lungo termine, un familiare a breve termine e un conspecifico nuovo Lasciare una quarta tazza designata vuota come controllo.
NOTA: Etichettare i coperchi dei bicchieri per identificare le posizioni degli agenti durante la valutazione del comportamento. - Rimuovere la coppetta perforata dal topo sottoposto all'esperimento al centro dell'arena e consentire un'esplorazione libera per 10 min (Figura 1A).
- Rimuovere tutti i topi alla fine del 10 min intervallo e interrompere la registrazione.
- Rimettere tutti i topi nelle loro gabbie di provenienza.
- Pulire accuratamente l'arena e le coppe prima della prova successiva.
NOTA: Tenere a disposizione coppe di ricambio in caso di danni.
8. Valutazione del comportamento
- Importare tutti i video registrati in un software di analisi comportamentale in grado di effettuare annotazioni manuali, come il Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS).
NOTA: La valutazione comportamentale non è stata eseguita in cieco rispetto alla posizione del compagno di gabbia, poiché etichette con l'ID dell'agente erano posizionate sopra ogni coppetta e visibili nei video, e il numero della gabbia poteva essere dedotto. Tuttavia, i valutatori non prestavano attivamente attenzione alle etichette visibili ed erano in cieco rispetto all'identità dell'agente nuovo e di quello a breve termine. Tutti i valutatori hanno seguito definizioni operative predefinite del comportamento investigativo e criteri standardizzati di valutazione. - Definire la matrice comportamentale prima della valutazione.
- Definire un episodio di investigazione come il posizionamento del naso del topo sperimentale all'interno 1 cm di una tazza mentre esibire posizione investigativa prolungata
NOTA: Includere i comportamenti di masticazione e rosicchiamento diretti verso il bicchiere come episodi di investigazione. - Annotare manualmente la durata totale dell'indagine per ogni coppa durante la fase del test di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. Assegnare un punteggio al basale e all'acquisizione secondo necessità.
NOTA: Il tracciamento automatico della posizione può essere utilizzato con una regione di interesse semicircolare di 1 cm di diametro attorno a ogni coppa. - Esporta i dati annotati per successivo analisi statistica
Risultati
Seguendo il protocollo del paradigma delle quattro tazze, topi maschi CD-1 hanno mostrato un comportamento differenziale di investigazione sociale nei confronti del compagno di gabbia (familiare a lungo termine), del conspecifico familiare a breve termine e del conspecifico nuovo (Figura 2). Per ogni agente, è stato calcolato un indice di discriminazione (DI) basato sui secondi spesi nell'investigazione dell'agente rispetto alla tazza vuota, calcolato come (agente − vuoto)/(agente + vuoto) durante la fase di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. Questo indice era distribuito normalmente in base al test di Shapiro-Wilk; pertanto, sono stati utilizzati test statistici che presuppongono la normalità dei dati. I topi hanno mostrato una discriminazione significativamente maggiore nei confronti del conspecifico nuovo rispetto al conspecifico familiare a breve termine (Figura 2; nuovo vs. breve termine t(9) = 3,70, p aggiustato con Bonferroni-Holm = 0,01). Il paradigma ha inoltre rivelato che i topi mostravano una discriminazione significativamente maggiore nei confronti del compagno di gabbia familiare a lungo termine rispetto al conspecifico familiare a breve termine (Figura 2; compagno di gabbia vs. breve termine t(9) = 2,87, p aggiustato con Bonferroni-Holm = 0,04). Non vi è stata alcuna differenza significativa nella discriminazione tra il conspecifico nuovo e il compagno di gabbia (Figura 2; nuovo vs. compagno di gabbia t(9) = -1,13, p aggiustato = 0,29), suggerendo che i topi hanno preferenzialmente investigato sia il conspecifico nuovo che quello familiare a lungo termine rispetto al conspecifico familiare a breve termine. Il tempo di investigazione in ciascuna posizione della tazza durante la fase iniziale con l'arena vuota non differiva in base a quale agente sociale avrebbe successivamente occupato quella specifica posizione, confermando l'assenza di una preferenza preesistente per la tazza che potesse influenzare i risultati (nuovo baseline vs. compagno di gabbia baseline t(9) = -1,99, p = 0,23; nuovo vs. baseline breve termine t(9) = -1,97, p = 0,23; compagno di gabbia vs. baseline breve termine t(9) = 0,54, p = 0,60).
Al contrario, le topoline CD-1 non hanno mostrato differenze significative nell'indice di discriminazione tra i conspecifici nuovi, familiari a breve termine e familiari a lungo termine (Figura 3). Non sono state osservate differenze significative tra nuovo e familiare a breve termine (p = 0.35), nuovo e compagno di gabbia (p = 0.69), né tra familiare a breve termine e compagno di gabbia (p = 0.70). Le topoline hanno esplorato in modo ampio tutti gli agenti rispetto al bicchiere vuoto, mostrando un pattern comportamentale distinto in questo compito, che potrebbe riflettere una maggiore socievolezza rispetto ai topi maschi.
Analogamente, i topi maschi C57BL/6 hanno mostrato una tendenza nella stessa direzione, con una maggiore discriminazione verso il conspecifico nuovo rispetto al conspecifico familiare a breve termine. Questa differenza si è avvicinata, ma non ha raggiunto, la significatività dopo la correzione di Bonferroni-Holm, suggerendo una maggiore varianza tra i soggetti in questo gruppo più ampio di C57BL/6 (n = 31) rispetto ai maschi CD-1 (Figura 4; p aggiustato = 0,055). Non sono state osservate differenze significative tra il conspecifico nuovo e il compagno di gabbia (p = 0,62) né tra il conspecifico familiare a breve termine e il compagno di gabbia (p = 0,62). Questi risultati indicano che il marcato comportamento investigativo dei compagni di gabbia osservato nei maschi CD1 varia tra ceppi e sessi.
Per determinare se la dominanza sociale influenzasse l'ispezione dei compagni di gabbia, i punteggi di marcatura urinaria di David sono stati correlati con l'indice di discriminazione dei compagni di gabbia. Nessuna correlazione significativa è stata osservata nei topi maschi CD-1 (r di Pearson) r = 0.28, p = 0,44) o topi maschi C57BL/6 (Pearson's r = 0.10, p = 0,57), suggerendo che il rango sociale non ha influenzato l'indice di discriminazione del compagno di gabbia.
Nel complesso, questi risultati dimostrano che il paradigma dei quattro contenitori può rilevare differenze nell'investigazione sociale valutando contemporaneamente la familiarità a lungo e a breve termine, nonché la novità sociale, all'interno di una singola sessione comportamentale. È importante sottolineare che il sesso e la linea genetica possono influenzare il comportamento in questo test.
Figura 1: Configurazione e procedura sperimentale del paradigma dei quattro bicchieri. (A) A sinistra, la scatola del paradigma dei quattro bicchieri con quattro bicchieri vuoti forati. A destra, l'animale in esame che esplora la scatola del paradigma con quattro bicchieri forati contenenti gli agenti. Le etichette indicano l'identità dell'agente sociale per facilitare una valutazione comportamentale accurata. (B) Schema comportamentale del Giorno 1 del paradigma. I colori dei topi indicano le diverse identità degli agenti. Si noti che le immagini sono state acquisite con il flash della fotocamera, il che rende l'arena particolarmente luminosa rispetto all'illuminazione effettivamente utilizzata durante gli esperimenti (8–20 lux). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Preferenza sociale nel paradigma dei quattro contenitori in topi maschi CD-1. Indice di discriminazione (ID) relativo all'interazione con conspecifici nuovi, familiari a breve termine e familiari a lungo termine (compagni di gabbia) durante la fase di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. L'ID è stato calcolato come (agente – vuoto)/(agente + vuoto). I topi hanno mostrato una discriminazione significativamente maggiore nei confronti dei conspecifici nuovi e dei compagni di gabbia rispetto a quelli familiari a breve termine (p < 0,05), mentre non è stata osservata alcuna differenza significativa tra la discriminazione verso l'individuo nuovo e quella verso il compagno di gabbia. I dati sono espressi come media ± errore standard di 10 topi. I confronti statistici sono stati effettuati mediante test t per campioni appaiati con correzione di Bonferroni-Holm per confronti multipli. *p < 0,05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Preferenza sociale nel paradigma dei quattro bicchieri in topi femmine CD-1. Indice di discriminazione (DI) per lo studio degli stimoli sociali conspecifici nuovi, familiari a breve termine e familiari a lungo termine (compagno di gabbia) durante la fase di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. Il DI è stato calcolato come (agente – vuoto)/(agente + vuoto). Non sono state osservate differenze significative nell'indice di discriminazione tra i tre stimoli sociali. I dati sono espressi come media ± errore standard della media su 12 topi. I confronti statistici sono stati effettuati mediante test accoppiato t-test con correzione di Bonferroni-Holm per confronti multipli. *p < 0.05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Preferenza sociale nel paradigma dei quattro bicchieri in topi maschi C57BL/6. Indice di discriminazione (DI) relativo all'interazione con conspecifici nuovi, familiari a breve termine e familiari a lungo termine (compagni di gabbia) durante la fase di riconoscimento sociale della durata di 10 minuti. Il DI è stato calcolato come (agente − vuoto)/(agente + vuoto). È stata osservata una tendenza a una maggiore discriminazione del conspecifico nuovo rispetto a quello familiare a breve termine, ma questa non è rimasta significativa dopo la correzione di Bonferroni-Holm (p = 0,055). Non sono state osservate differenze significative tra il nuovo e il compagno di gabbia né tra il familiare a breve termine e il compagno di gabbia. I dati sono espressi come media ± errore standard della media su 31 topi. I confronti statistici sono stati effettuati mediante test t per campioni appaiati con correzione di Bonferroni-Holm per confronti multipli. #p < 0,06. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
Esistono considerazioni fondamentali per applicare efficacemente e in modo affidabile il paradigma dei quattro bicchieri in altri contesti sperimentali al fine di misurare queste dinamiche sociali. L'abituazione al Giorno 0 riduce l'esplorazione dell'arena e dei bicchieri motivata dalla novità non sociale, che altrimenti potrebbe mascherare l'investigazione sociale durante il test7,8,9. È inoltre essenziale un controllo preciso della durata della familiarizzazione a breve termine, poiché piccole differenze nel tempo di esposizione possono alterare significativamente i successivi modelli di preferenza8,9,10. Il periodo di familiarizzazione di 10 minuti è stato scelto per stabilire una memoria sociale a breve termine robusta, mantenendosi coerente con i paradigmi di riconoscimento sociale precedentemente descritti, che utilizzano brevi periodi di esposizione per distinguere conspecifici familiari da quelli nuovi7,8,10. Inoltre, un periodo di convivenza di 3–4 settimane è stato scelto per stabilire una familiarità sociale a lungo termine attraverso una coabitazione prolungata piuttosto che esposizioni ripetute e brevi. Questa durata offre un'opportunità sufficiente per interazioni sociali sostenute e per lo sviluppo di una familiarità duratura tra i compagni di gabbia10. La distinzione tra il periodo di familiarizzazione di 10 minuti e il periodo di convivenza di 3–4 settimane è stata progettata intenzionalmente per creare due livelli qualitativamente diversi di familiarità (recente e a lungo termine) all'interno della stessa sessione comportamentale. Durante l'esperimento, è necessario bilanciare in modo incrociato l'identità degli agenti tra le posizioni dei bicchieri nei diversi trial, al fine di controllare eventuali bias spaziali intrinseci nei topi7,8. L'uso ripetuto degli animali agenti nei diversi trial potrebbe alterare i livelli di stress degli agenti e, di conseguenza, il comportamento di investigazione da parte dei soggetti. Per minimizzare potenziali fattori confondenti, gli animali agenti non sono stati utilizzati ripetutamente all'interno di una singola giornata di test, quando possibile, e l'identità degli agenti e la posizione dei bicchieri sono state bilanciate tra i soggetti. Inoltre, poiché la dominanza sociale potrebbe influenzare l'investigazione sociale, la gerarchia di dominanza è stata valutata mediante test di dominanza territoriale e punteggi di David. Non è stata osservata alcuna relazione significativa tra il punteggio di David e l'indice di discriminazione del compagno di gabbia nei topi maschi CD-1 e nei topi maschi C57BL/6, suggerendo che la preferenza osservata per i conspecifici familiari a lungo termine non fosse spiegata dallo stato di dominanza. Durante l'analisi, definizioni operative coerenti dei comportamenti investigativi, in particolare della durata dell'investigazione, sono necessarie per garantire la riproducibilità tra diversi osservatori e coorti sperimentali. Una potenziale difficoltà comune a tutti i paradigmi sociali basati sull'investigazione è rappresentata dagli "effetti pavimento", ovvero tempi di investigazione prossimi allo zero che impediscono i confronti. Per ceppi di topi che mostrano livelli ridotti di investigazione sociale, una ulteriore riduzione dell'illuminazione visibile e l'uso del tracciamento video a infrarossi potrebbero ridurre l'ansia e aumentare il comportamento esplorativo.
Il protocollo consente flessibilità e modifiche in base agli obiettivi sperimentali, ma alcune adattamenti richiedono un'attenta considerazione. Il materiale delle coppe rappresenta una variabile fondamentale nel saggio. Sebbene questo protocollo utilizzi coppe di plastica perforate, coppe metalliche pesate con fori metallici più piccoli potrebbero ridurre il comportamento di masticazione e i tentativi di fuga rispetto alle coppe di plastica leggere. L'uso di coppe di plastica potrebbe aumentare i comportamenti di manipolazione, inclusi rosigliamenti o arrampicate, che devono essere monitorati e annotati durante la valutazione. Un approccio alternativo consiste nel sostituire le coppe perforate con divisori verticali alti e perforati che separano ogni angolo dall'area centrale, mantenendo al contempo la comunicazione olfattiva e una limitata comunicazione visiva. Sebbene questo design possa ridurre ulteriormente il comportamento di arrampicata, l'uso di coppe perforate rimovibili offre il vantaggio pratico di trasformare rapidamente un'arena standard per campo aperto nel paradigma delle quattro coppe senza richiedere modifiche permanenti. Le interazioni eccessive con le coppe possono essere ridotte aumentandone il peso, modificando la dimensione delle perforazioni e mantenendo un colore costante per limitare le fonti di bias. Inoltre, i topi agenti devono essere bilanciati e non riutilizzati all'interno della stessa giornata di test per ridurre effetti indesiderati di familiarità.
Vanno riconosciuti diversi limiti del paradigma dei quattro bicchieri. Poiché l'interazione sociale è limitata da barriere forate, il saggio valuta principalmente un'indagine avviata dal soggetto, non reciproca, basata su stimoli olfattivi e visivi limitati piuttosto che su un contatto fisico diretto8,9. Inoltre, l'utilizzo dei bicchieri come barriera fisica e visiva introduce un'ambiguità potenziale nell'interpretazione del comportamento investigativo. Nei casi in cui si osserva un aumento dell'indagine verso i compagni di gabbia, in particolare nei maschi CD-1, non è chiaro se questo rifletta semplicemente il riconoscimento sociale o una combinazione di indagine e motivazione affiliativa, inclusi comportamenti legati all'aiuto verso un conspecifico familiare (ad esempio, tentativi di aiutare il compagno di gabbia a uscire mordendo il bicchiere di plastica). Queste considerazioni sottolineano l'importanza di un'interpretazione cauta e, ogni volta che possibile, dell'utilizzo di saggi comportamentali complementari. Le relazioni sociali preesistenti tra i compagni di gabbia, inclusa la gerarchia di dominanza, le interazioni affiliative e le esperienze sociali precedenti, possono inoltre influenzare le preferenze di indagine. Tuttavia, non abbiamo osservato una relazione evidente tra il rango di dominanza e il comportamento investigativo dei compagni di gabbia. Nonostante ciò, questi fattori possono variare tra ceppi diversi, condizioni di alloggio e paradigmi sperimentali e dovrebbero essere presi in considerazione nell'interpretazione delle preferenze legate alla familiarità a lungo termine.
Rispetto ai saggi di riconoscimento sociale esistenti, il paradigma dei quattro contenitori consente il confronto simultaneo di più agenti, come un conspecifico familiare a lungo termine, uno familiare a breve termine e uno nuovo, all'interno di una singola sessione comportamentale. I paradigmi tradizionali, come il test a tre camere e i saggi di abituazione–disabituazione, valutano principalmente la preferenza per la novità a breve termine dopo brevi periodi di esposizione7,8,9,10. Studi precedenti hanno inoltre incluso conspecifici familiari a lungo termine insieme a conspecifici nuovi, utilizzando paradigmi di interazione sociale libera e arene multicamera modificate progettate per valutare la familiarità sociale17,18. Tuttavia, questi approcci non confrontano simultaneamente stimoli sociali familiari a lungo termine, familiari a breve termine e nuovi all'interno dello stesso saggio. Incorporando conspecifici familiari a lungo termine insieme ad agenti a breve termine, il paradigma dei quattro contenitori offre un mezzo per indagare i ricordi sociali duraturi derivanti da una convivenza prolungata. Dati rappresentativi ottenuti sia da topi maschi che femmine CD-1 dimostrano che il paradigma dei quattro contenitori può essere applicato con successo in entrambi i sessi, evidenziando pattern comportamentali specifici per sesso. Analogamente, dati rappresentativi provenienti sia da topi CD-1 che da topi C57BL/6 dimostrano ulteriormente che il paradigma dei quattro contenitori può essere implementato con successo in diverse linee di laboratorio comunemente utilizzate. Sebbene il riconoscimento sociale e la preferenza per la novità spesso varino tra le diverse linee di topi7,19, il modello generale di discriminazione della familiarità osservato nei maschi di entrambe le linee suggerisce che il saggio è ampiamente applicabile. Tuttavia, poiché i comportamenti di riconoscimento sociale possono variare in base alla linea, al sesso, all'età e al contesto sperimentale, i ricercatori dovrebbero validare il saggio nel modello animale specifico rilevante per la loro domanda. Inoltre, sebbene questo paradigma possa essere adattato in un'arena a quattro bracci o a quattro camere, l'utilizzo in un'arena di campo aperto permette una maggiore dissociazione tra memoria di navigazione e spaziale e memoria sociale. Il carico di memoria spaziale è maggiore quando si naviga tra compartimenti o bracci distinti; pertanto, nello studio dei meccanismi della memoria sociale, la memoria spaziale dovrebbe essere una variabile importante da valutare. Netser et al. (2017) discutono anche di queste limitazioni relative all'arena tipica del saggio a tre camere, proponendo un'alternativa analoga con due camere, che riduce al minimo la necessità di navigazione spaziale20. Questo metodo è particolarmente adatto per studi che esaminano la rappresentazione neurale della familiarità sociale, i cambiamenti longitudinali nella cognizione sociale e le condizioni in cui la memoria sociale a lungo termine potrebbe essere alterata in modo selettivo.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal premio McKnight Neuroscience e dal premio Klingenstein Neuroscience assegnati a NPC.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software per la valutazione comportamentale | Software interattivo per la ricerca osservazionale comportamentale | Versione 9.12.7 | Software per l'annotazione manuale degli eventi |
| Arena di campo aperto | Rafferty Machine and Tool | Prodotto su misura | Foglio strutturale in fibra di vetro FRP, arena quadrata (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); pareti non trasparenti, se l'arena è trasparente, coprire le pareti esterne con carta per ridurre al minimo le distrazioni per l'animale |
| Telecamera sopraelevata | Logitech | Logitech C920x HD Pro PC Webcam | Telecamera in grado di effettuare registrazioni video continue; montata sopra il centro dell'arena |
| Bicchieri forati | Chinco Store | ONG-Chinco-0279 | dimensioni dei bicchieri: 4,01"L x 4,01"L x 4,52"H; bicchieri forati in plastica o metallo, di forma quadrata o cilindrica |
| Prism | Graph Pad | Versione 10.6.0 | Software per l'analisi dei dati; può essere eseguito con altri software |
Riferimenti
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